Method Article

كوبفر عزل الخلايا للجسيمات متناهية الصغر سمية اختبار

DOI:

10.3791/52989

⸱

August 18th, 2015

 ,  , 
1Institute of Pharmaceutical Science, King's College London

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

البلاعم الكبدية ، المسماة خلايا Kupffer ، هي المسؤولة عن التقاط الجسيمات النانوية المنتشرة. نصف هنا طريقة عالية النقاء والمحصول للخلايا لعزل خلايا كوبفر. يتم استخدام مقايسة LDH المعدلة هنا لقياس السمية التي تسببها الأنابيب النانوية الكربونية في خلايا Kupffer.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الغالبية العظمى من الدراسات في المختبر nanotoxicological استخدمت خطوط الخلايا خلد عن التطبيق العملي لها. ومع ذلك، فقد أظهرت النتائج من جسيمات متناهية الصغر اختبار السمية في خطوط الخلايا خلد أو الخلايا الأولية التناقضات، مما يبرز الحاجة إلى توسيع استخدام الخلايا الأولية للفحوصات في المختبر. يصف هذا البروتوكول عزلة الضامة كبد الفأر، وخلايا كوبفر اسمه، واستخدامها لدراسة سمية جسيمات متناهية الصغر. خلايا كوبفر هي السكان بلعم الأكثر وفرة في الجسم، وتشكل جزءا من الجهاز الشبكي البطاني (RES)، المسؤولة عن القبض على تعميم النانوية. ويستند كوبفر طريقة عزل الخلايا ذكرت هنا على طريقة التروية 2-خطوة تليها تنقية على التدرج الكثافة. طريقة، بناء على الهضم كولاجيناز والكثافة الطرد المركزي، ومقتبسة من البروتوكول الأصلي الذي وضعته Smedsrød وآخرون. مصممة للفئران خلايا الكبد isolatioن ويقدم عالية الغلة (ما يصل إلى 14 × 10 6 خلايا لكل الماوس) ونقاء عالية (> 95٪) من خلايا كوبفر. هذه الطريقة العزلة لا يتطلب معدات متطورة أو باهظة الثمن، وبالتالي يمثل حلا وسطا مثاليا بين التعقيد والعائد الخلية. استخدام الفئران أثقل (35-45 ز) يحسن العائد من طريقة العزل ولكن أيضا يسهل بشكل ملحوظ الإجراء من الوريد البابي إقناء؛ إدخال القنية. وقد تم قياس سمية أنابيب الكربون النانوية functionalized و -CNTs في هذا النموذج من قبل فحص LDH تعديلها. هذا الأسلوب يقيم بقاء الخلية عن طريق قياس انعدام السلامة الهيكلية للغشاء الخلية كوبفر بعد الحضانة مع -CNTs و. سمية الناجم عن -CNTs و يمكن قياسها باستمرار باستخدام هذا الاختبار، مشددا على أن خلايا كوبفر معزولة مفيدة لاختبار السمية جسيمات متناهية الصغر. الفهم الشامل للnanotoxicology يمكن أن تستفيد من هذه النماذج، مما يجعل اختيار جسيمات متناهية الصغر للترجمة السريرية أكثر ايفيcient.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويهدف مجال البحث nanotoxicology لوصف التأثير البيولوجي للجزيئات النانوية. لا تزال الدراسات السمية بناء على التحقيقات المجراة الطرق الأكثر دقة. ومع ذلك، فإن استخدامها محدود بسبب التكلفة والعمل والوقت متطلباتهم 1. كما تم استخدام البدائل، فحوصات في المختبر بسبب بساطتها وإمكانية تطوير الإنتاجية العالية في منصات اختبار المختبر 2 - حتى تمديد عدد من الشروط التي تم اختبارها. يتم تنفيذ معظم الدراسات nanotoxicological استخدام في فحوصات المختبر مع خطوط الخلايا خلد. ومع ذلك، هناك مخاوف بشأن استقراء هذه النتائج التجريبية لفي الجسم الحي الآثار السمية 3. في الواقع، يمكن أن خصائص خطوط الخلايا خلد تكون مختلفة كثيرا عن الأنسجة كانوا المتأتي من مثل التحول الجيني 4، وتدهور الخصائص المورفولوجية الرئيسية5، وفقدان قطبية الخلوية 6 والتعديلات الفنية مثل تنظيم وسطاء التهابات 7.

خلايا كوبفر هي السكان بلعم الأكثر وفرة في الجسم، وهي على اتصال مباشر مع الدم عن طريق المبطنة لجدار الجيوب الكبد. كجزء من الجهاز الشبكي البطاني (RES)، وهذه البلاعم هي المسؤولة عن القبض على تعميم النانوية، وبالتالي، تشكل نموذجا مناسبا للغاية لدراسة سمية جسيمات متناهية الصغر. في الجسم الحي 8 وفي المختبر وقد نشرت دراسات 9 من الاستجابات الالتهابية المرتبطة مع خلايا كوبفر تتعرض لالنانوية في مكان آخر. كما شاركت خلايا كوبفر في التسبب في أمراض الكبد مثل أمراض الكبد الكحولية 10، تليف الكبد أو التهاب الكبد الفيروسي 11 12. وأفيد أن خلايا كوبفر معزولة توفر البصيرة مفيدة لوصف الآليات الخلوية الجردolved في اضطراب الكبد 13،14.

وقد تم الإبلاغ عن عدة طرق لعزل وتنقية خلايا كوبفر. عزل الخلايا يمكن أن تنجم عن ميكانيكي أو الأنزيمية التفكك 15. يظهر الهضم كولاجيناز ميزة الحفاظ على سلامة الوظيفية للخلايا كوبفر، في حين يؤدي إلى ارتفاع كوبفر الخلايا العائد 16. مناهج تجريبية عديدة، متفاوتة في التعقيد والتكاليف، وقد استخدمت لفصل خلايا كوبفر من غيرهم من السكان خلايا الكبد. على سبيل المثال، لا يمكن أن يتحقق كوبفر نقاء الخلية immunoaffinity 17، وتدفق الكهربائي 18، التصاق الانتقائي 16 أو من خلال تقنيات الطرد المركزي 16، والذي حدد الخلايا وفقا لحجمها وكثافة. مزيج من هذه الطرق يمكن اختيار لزيادة نقاء من السكان 16. لا يوجد إجماع حول الأسلوب الأمثل لعزل الخلايا كوبفر، لأنها تعتمد في الغالب على تطبيق والمعدات المتاحةر. ومع ذلك، في حالة اختبار السمية جسيمات متناهية الصغر، وبساطة وإنتاجية عالية من التقنية المرتبطة الحفاظ الوظيفي للخلايا كوبفر يبدو أن الأكثر ملاءمة لهذا التطبيق.

ويستند كوبفر طريقة عزل الخلايا ذكرت هنا على طريقة التروية 2-خطوة تليها تنقية على التدرج الكثافة. تم تعديل طريقة من البروتوكول الأصلي الذي وضعته Smedsrød وآخرون 16 تصميم لعزل خلايا كبد الفئران. ذكرت معظم الدراسات وصفت عزل خلايا كوبفر من كبد الفئران. هنا، نحن تصف طريقة لعزل خلايا كوبفر من كبد الفأر، في ارتفاع العائد والنقاء. استخدام الفئران يقلل من تكلفة التجربة ويسمح بتجهيز عدة كبد للحصول على كميات كبيرة من خلايا كوبفر في اختبارات السمية جسيمات متناهية الصغر.

في بروتوكول التالية، وحضنت خلايا كوبفر مع أنابيب الكربون النانوية functionalized (و -CNTs). الخصائص الفيزيائية والكيميائية الفريدة من الأنابيب النانوية الكربونية - أي طول ارتفاع نسبة القطر ومساحة كبيرة، جعلت الأنابيب النانوية الكربونية المرشحين للاهتمام وهي الحاملة لأغراض العلاج والتشخيص. ومع ذلك، فقد أثيرت مخاوف بشأن سمية تشارك المركز الوطني 19، وتطوير جديدة في اختبارات المختبر يهدف إلى زيادة فهم تأثير بيولوجي CNT. ويرتبط سمية في خلية كوبفر مع عدم وجود السلامة الهيكلية للغشاء الخلية. يتم قياس ذلك من خلال فقدان إنزيم LDH حشوية من الخلية إلى طاف. مبدأ هذه الطريقة، لذلك، هو إزالة أي LDH صدر وقياس ما تبقى في خلايا 20. ويتم ذلك في الأفضلية لقياس LDH صدر في طاف لأن وجود الأنابيب النانوية الكربونية في طاف يتداخل مع مقايسة 21.

نقترح استخدام هذا فعال metho كوبفر العزلة خلية بسيطة والتكلفةد لعزل عدد كبير من خلايا كوبفر وظيفية. وهذا يسمح للفحص السمية من مجموعة من الجسيمات النانوية، في نموذج بلعم الأولية ذات الصلة.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وأعدم كل التجارب على الحيوانات في الامتثال لجميع المبادئ التوجيهية واللوائح والوكالات التنظيمية ذات الصلة. يتم شرحها بروتوكول أجريت تحت إشراف وموافقة من تنظيم مكتب المملكة المتحدة الرئيسية

1. الإرواء وجمع الخليوي (الشكل 1)

figure-protocol-1
الشكل 1: الكبد الإرواء بعد التخدير من الفأرة، يتم نقل الجهاز الهضمي أفقيا إلى اليسار من البطن من أجل جعل الوريد البابي (PV) للوصول. ومقنى الكهروضوئية باستخدام بطء تدفق (1-3 مل / دقيقة) من الحل EGTA / HBSS وveina الأجوف السفلي (IVC) هو تمزق على الفور لتجنب أي ضغط زائد داخل الكبد. في الدقيقة الاولى من نضح، يتم زيادة معدل تدفق تدريجيا إلى 7 مل / دقيقة. ثم يتم perfused لالحل كولاجيناز في 10 مل / دقيقة حتى يتم تحقيق الهضم الكامل.

  1. استعداداتإعادة طازجة كل الكواشف هو موضح في الجدول المواد.
  2. تدفئة EGTA (جلايكول الإثيلين رباعي حمض الخل) / HBSS (محلول الملح المتوازن هانك) محلول (50 مل لكل الماوس)، والحل كولاجيناز (100 مل لكل الماوس) لمدة 30 دقيقة في 40 ° C.
  3. شطف ضخ أنابيب مرنة لأول مرة مع 70٪ من الإيثانول. صب 40 مل من EGTA / HBSS الحل في أنبوب الطرد المركزي مغمورة في حمام الماء وشطف ضخ أنابيب مرنة مع درجة حرارة ما قبل EGTA / HBSS الحل.
  4. أداء التخدير الطرفي باستخدام الباربيتورات لإنتاج موثوق اللاوعي قبل هبوط في التنفس والموت. حقن الفينوباربيتون في 1 مغ / كغ، والملكية الفكرية في الماوس CD1 الإناث أو الذكور (35-45 جم). تأكيد التخدير من أخمص القدمين معسر.
  5. حلق الشعر في البطن وتعقيم سطح البطن باستخدام 70٪ محلول الإيثانول.
  6. قطع طريق تجويف البطن وفضح الوريد البابي والوريد الأجوف السفلي عن طريق تحريك الأمعاء أفقيا إلى الجهة اليسرى من البطن.
  7. نجمةر المضخة بسرعة 1-3 مل / دقيقة مع الحل EGTA / HBSS ويقني؛ يدخل القنية الوريد البابي باستخدام إبرة 23 G فراشة (أجنحة قطع). المشبك الجزء من الوريد البابي مقنى مع إبرة 23 G والوجه ثم ملقط مليقط على سطح البطن الماوس فتح. الكبد يجب شاحب بسرعة داخل ثانية 30 الأول من نضح EGTA / HBSS الحل.
  8. شق بسرعة الجزء السفلي من الوريد الأجوف السفلي لتجنب بناء الضغط الزائد في الكبد، ومن ثم زيادة معدل تدفق تدريجيا إلى 7 مل / دقيقة، خلال الدقيقة الأولى من نضح. يموت الحيوان بسبب النزيف الثانوي إلى الوريد الأجوف بزل الوريد.
  9. عند أقل من 5 مل من EGTA / HBSS الحل باق في أنبوب الطرد المركزي، وملء هذا الامر مع كولاجيناز الحل (40-50 مل). زيادة معدل تدفق تدريجيا إلى 10 مل / دقيقة، وأكثر من 30 ثانية.
  10. جعل تضخم الكبد عن طريق الضغط على الوريد الأجوف السفلي، وذلك باستخدام الملقط، لمدة 5-10 فترات ثانية. ثيالصورة يمكن أن يتم بشكل دوري (5-10 مرات أثناء عملية الهضم). وهذه الخطوة تحسين تفكك خلية الكبد وتقليل الوقت نضح مع كولاجيناز.
  11. عندما يكون أقل من 10 مل من محلول كولاجيناز تبقى داخل أنبوب الطرد المركزي، صب 40-50 مل من قبل تحسنت حل كولاجيناز إلى أنبوب الطرد المركزي.
  12. بعد 10-15 دقيقة من نضح وحوالي 70-80 مل من كولاجيناز الحل perfused ل، وتطبيق ضغط صغيرة على سطح الكبد مع ملقط. A المطبوعة من الضغط تشير إلى أن خلايا الكبد يتم فصلها.
  13. إزالة الكبد من تجويف البطن كقطعة واحدة ووضعها في أنبوب الطرد المركزي التي تحتوي على 20-30 مل من كوبفر زنازين العزل متوسط. الحفاظ على خلايا الكبد على الجليد أو على 4 درجات مئوية لمدة لا تزيد على 3 ساعات لتجنب التأثير بقاء الخلية الكبد.
  14. كرر الإجراء نضح على العديد من الحيوانات إذا لزم الأمر، مع الحفاظ على الكبد perfused لعلى الجليد. تجمع 02:59 كبد لتنقية والمضي قدما في المرحلة 3.

2. إعداد التدرج الكثافة الطرد المركزي (الشكل 2)

figure-protocol-2
الشكل 2: إعداد التدرج الكثافة يتم تنفيذ جميع الإجراءات في ظل حالة معقمة. يتم تحضير SIP عن طريق خلط 15.3 مل من محلول السيليكا المغلفة الجسيمات مع 1.7 مل من 10 × برنامج تلفزيوني. يتم خلط A 5 مل من SIP مع 15 مل من برنامج تلفزيوني لجعل 20 مل من 25٪ من محلول SIP. يتم خلط 10 مل من SIP مع 10 مل من برنامج تلفزيوني لجعل 20 مل من 50٪ من محلول SIP. يضاف أنبوب الطرد المركزي التي تحتوي على حل 50٪ SIP (20 مل) يميل والحل SIP 25٪ (20 مل) ببطء باستخدام المصلية 25 مل ماصة.

  1. المضي قدما في الخطوات التالية (القسم 2.، 3. و5.) تحت ظروف معقمة والحفاظ على الخلايا على الجليد أو على 4 درجات مئوية. إعداد SIP (الحل من الجسيمات السيليكا متساوي التوتر مغلفة) عن طريق خلط 15.3 مل من محلول السيليكا المغلفة الجسيمات مع 1.7 مل من 10 × برنامج تلفزيوني.
    2. لجعل 20 مل من 25٪ من محلول SIP، مزيج 5 مل من SIP مع 15 مل من برنامج تلفزيوني. لجعل 20 مل من 50٪ من محلول SIP، مزيج 10 مل من SIP مع 10 مل من برنامج تلفزيوني.
  2. ملء واحدة أنبوب الطرد المركزي مع 20 مل من محلول SIP 50٪. إمالة أنبوب الطرد المركزي في زاوية قريبة من 90 درجة وإضافة ببطء الحل SIP 25٪ (20 مل) على الجدار الجانبي للأنبوب باستخدام 25 مل ماصة المصلية، من دون لمس سطح طبقة SIP 50٪. عند إضافة حل SIP 25٪، وخفض تدريجيا إلى زاوية من الأنبوب. الحفاظ على درجة الكثافة على الجليد حتى الاستخدام.

3. كوبفر تنقية الخليوي (الشكل 3)

figure-protocol-3
الرقم 3: تنقية خلايا كوبفر بواسطة الطرد المركزي كثافة التدرج والتصاق الخلايا يتم تنفيذ جميع الإجراءات في ظل حالة معقمة. (A) وبعد تمزق كبسولة غليسون، تتم تصفية خلايا الكبد من خلال 100 ميكرومتر مصفاة. يتم طرد تعليق في × 50 جم لتجاهل خلايا الكبد (الكريات) وجمع جزء الخلية غير متني (طاف). ويتكرر هذه الخطوة 3 مرات. تضاف الخلايا غير متني على رأس التدرج متساوي التوتر متقطع وطرد في 800 x ج لمدة 15 دقيقة. ويتم تنقية خلايا كوبفر التي تم جمعها من 25٪ وسادة SIP كذلك عن طريق الانتقاء التصاق الخلية. ومطلي (B) خلايا في 24 لوحة جيدا والمحتضنة في 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2 لمدة 30 دقيقة. تغسل الخلايا غير ملتصقة مرة واحدة مع 500 ميكرولتر من HBSS. خلايا كوبفر العرض الخاصة بها ملتصقة التشكل 4 ساعات بعد الطلاء، وعندما -CNTs و يمكن أن تضاف إلى الخلايا. ويمثل الشريط على نطاق و25 ميكرون. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

  1. وضع واحد الكبد perfused لفي طبق بيتري مع 15 مل من كوبفر عزل الخلايا المتوسطة. تمزق كبسولة غليسون (غشاء الكبد) باستخدام المقص والإفراج عن جميع خلايا الكبد في كوبفر عزل الخلايا المتوسطة. تصفية حل على الرغم من خلية مصفاة 100 ميكرون التي سيتم جمعها في أنبوب الطرد المركزي. كرر الإجراء نضح على الكبد perfused لإضافية وتجمع الخلايا في نفس أنبوب الطرد المركزي (15 مل من ماوس واحدة، وتصل إلى 45 مل من ثلاثة الفئران).
  2. الطرد المركزي تعليق خلية في 50 x ج لمدة 2 دقيقة على 4 درجات مئوية. والخلايا متني (خلايا الكبد) يكون في بيليه والخلايا غير متني (بما في ذلك خلايا كوبفر) سيكون في طاف.
  3. جمع طاف في أنبوب الطرد المركزي نظيفة وأجهزة الطرد المركزي في 50 x ج لمدة 2 دقيقة لكل منهما. كرر هذه الخطوة ثلاث مرات أكثر.
  4. أجهزة الطرد المركزي في 1350 x ج لمدة 15 دقيقة لتكوير الخلايا غير متني. تجاهل طاف و resuspend بيليه في 10 مل من كوبفر عزل الخلايا المتوسطة.
  5. إضافة محلول الخلايا غير متني على التدرج متساوي التوتر متقطع 25/50٪ كما هو موضح في 2.3. المائةrifuge في 850 x ج لمدة 15 دقيقة دون تسارع أو كسر.
  6. توطين المخصب جزء الخلية كوبفر الظهور عكر ضمن 25٪ SIP جزء قريب من واجهة SIP 25/50٪ (الشكل 3). باستخدام 10 مل ماصة المصلية، نضح حوالي 12 مل من أثرى جزء الخلية كوبفر. نقل الخلايا في أنبوب الطرد المركزي التي تحتوي على 35-40 مل من كوبفر عزل الخلايا المتوسطة. المزيج بلطف وأجهزة الطرد المركزي في 1350 x ج لمدة 15 دقيقة في 4 درجة مئوية لتكوير الخلايا.
  7. تجاهل الخلايا وطاف resuspend في 5-10 مل من قبل تحسنت كوبفر خلية الثقافة المتوسطة. عدد الخلايا (haemocytometer) وقياس الجدوى باستخدام تلطيخ التريبان الأزرق.
  8. لوحة الخلايا غير متني النقاء في 24 لوحات جيدة في كثافة 5 × 10 5 خلايا / جيد. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2 (الشكل 3). بعد 30 دقيقة، وإزالة بلطف والمتوسطة، ويغسل ما قبل درجة حرارة محلول الملح هانك المتوازن (HBSS) مرة واحدة ثم استبدالمع 500 ميكرولتر من الطازجة واستعد قبل خلية كوبفر الثقافة المتوسطة (لكل بئر).
  9. ترك خلايا كوبفر لا يقل عن 4 ساعة على 37 درجة مئوية و CO 2 5٪ قبل العلاج مع النانوية، لتمكينهم من الحصول على التشكل ملتصقة.

4. توصيف

  1. كوبفر الخلايا الطهارة
    1. إعداد الطازجة حل PBS / BSA تستخدم للحفاظ على بقاء الخلية كوبفر. غسل خلايا مرة واحدة مع 500 ميكرولتر من محلول PBS / BSA. إزالة حل PBS / BSA وفصل خلايا كوبفر في 500 ميكرولتر من الطازجة حل PBS / BSA باستخدام كشط لطيف. عندما يتم مطلي الخلايا في 24 لوحات جيدا، وتقصير القصوى من ريش مكشطة مع مقص لجعل الانفصال أسهل والمضي قدما. نقل الخلايا في أنابيب التدفق الخلوي.
    2. عد خلايا كوبفر باستخدام haemocytometer وأجهزة الطرد المركزي 1 × 10 5 خلايا في 1350 ز س. Resuspend الخلايا كوبفر في 30 ميكرولتر من F4 / 80 الأضداد (أنيق). تخلط جيدا واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. الحفاظ على الخلايا غير ملوثين (لا حضنت مع الأجسام المضادة) على الجليد.
    3. إضافة 2 مل من محلول PBS / جيش صرب البوسنة في الخلايا الملون، الطرد المركزي في 1350 ز لمدة 5 دقائق وتجاهل طاف الناتجة عن ذلك. الخلايا resuspend الملون في 200 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني / BSA.
    4. لتحليل التدفق الخلوي، بوابة 10000 غير ملوثين خلايا كوبفر وفقا لحجمها (مبعثر إلى الأمام) وتحبب (الجانب مبعثر). تحليل مضان من الخلايا المغلقة في FL-1 القناة.
    5. كرر الإجراء لخلايا كوبفر الملون الحفاظ على نفس الإعدادات المستخدمة لتحليل التدفق الخلوي للخلايا كوبفر غير ملوثين. تحديد وقياس مضان من الخلايا الملون لتقييم نقاء خلية كوبفر.
  2. كوبفر خلية أكلة آخر
    1. استبدال وسائل الإعلام مع 0.5٪ (V / V) حبات الفلورسنت في كوبفر خلية الثقافة المتوسطة واحتضان لمدة 4 ساعات في 37 ° C وCO 2 5٪.
    2. من أجل إزالة حبات غير المنضوية، الطرد المركزي خلايا كوبفر في 1350 x ج، ديscard الخلايا وطاف resuspend في 500 ميكرولتر PBS / BSA الحل. كرر هذه الخطوة 2 مرات أكثر.
    3. خلايا كوبفر كشط في 500 ميكرولتر من الحل ونقل الخلايا PBS / BSA إلى التدفق الخلوي الأنبوب.
    4. خلايا كوبفر أجهزة الطرد المركزي في 1350 x ج، تجاهل الخلايا وطاف resuspend في 200 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني / BSA الحل.
    5. لتحليل التدفق الخلوي، بوابة 10000 غير ملوثين خلايا كوبفر وفقا لحجمها (مبعثر إلى الأمام) وتحبب (الجانب مبعثر). تحليل مضان من الخلايا المغلقة في FL-2 القناة.

5. حضانة كيميائيا Functionalized أنابيب الكربون النانوية (و -CNTs)

  1. إعداد تشتت -CNTs و (1 ملغ / مل) في المياه عن طريق صوتنة لمدة 15 دقيقة قبل الاستخدام. وتعد -CNTs و في المنزل 22.
  2. إعداد 2X الأنابيب النانوية الكربونية -و تتركز تشتت في كوبفر خلية الثقافة المتوسطة. الأنابيب النانوية الكربونية -و يصوتن فرقت في وسط ل2 دقيقة قبل الشروع في الخطوة 5.3).
  3. لكل بئر، واستبدال 250 ميكرولتر من وسائل الإعلام القديمة مع 250 ميكرولتر من 2X -CNTs و التشتت. تستخدم الآبار غير المعالجة (250 ميكرولتر من مشروط المتوسطة + 250 ميكرولتر من خلية كوبفر الطازجة الثقافة المتوسطة) والآبار التي تمت معالجتها مع 10٪ DMSO كما المراقبة السلبية والإيجابية، على التوالي.
  4. احتضان خلايا كوبفر عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2 لمدة 24 أو 72 ساعة.

6. تقييم سمية -CNTs و في خلايا كوبفر من اللاكتات هيدروجيناز (LDH) الفحص التعديل

  1. تجاهل طاف.
  2. إضافة 200 ميكرولتر (لكل بئر من 24 لوحة جيدا) من الاحتياطي تحلل واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة، 1 ساعة.
  3. بعد إجراء pipetting لقوي، وجمع هي lysed خلايا كوبفر في أنابيب microcentrifuge وأجهزة الطرد المركزي في 40000 x ج لمدة 10 دقيقة لتكوير -CNTs و التي تم تناولها من قبل الخلايا والحطام الخلية.
  4. جمع supernatants (ƒ-CNT مجاني) إلىأنابيب microcentrifuge وتخزينها في -20 ° C أو انتقل إلى الخطوة 6.5).
  5. نقل 50 ميكرولتر إلى لوحة 96-جيدا وإضافة حجم مساو من الحل مزيج الركيزة (مجموعة LDH) إلى كل بئر. تغطية لوحة ويحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة قبل أن يضيف 50 ميكرولتر من الحل محطة (مجموعة LDH). إضافة يثلث الآبار فارغة تحتوي على 50 ميكرولتر من تحلل العازلة، 50 ميكرولتر من محلول مزيج الركيزة و 50 ميكرولتر من محلول توقف.
  6. قراءة الامتصاصية في 490 نانومتر في قارئ صفيحة ميكروسكوبية واستخدام الصيغة التالية لحساب (٪) بقاء الخلية.

figure-protocol-4

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وكان عدد الخلايا متني غير النقاء بما يتفق وتراوحت ما بين 8 و 14 × 10 6 خلايا في الماوس (تم تنفيذ 17 العزلة). وكانت كل العزلة الماوس كافية لوحة 16-28 الآبار. وأظهرت بقاء الخلية التي تلطيخ التريبان الأزرق بقاء الخلية ~ 95٪. أظهرت خلايا كوبفر شكل دائري غضون 30 دقيقة من الحضانة عند 37 درجة مئوية، المتعلقة بهم التشكل ملتصقة غير مكتمل (الشكل 4A). في 4 ساعات من الحضانة وبعد ذلك، تم نشر الخلايا وبدأت مجموعات الخلايا لتشكيل.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الخطوات التالية هي حاسمة لتحقيق عائدات عالية وقابلية عالية للخلايا كوبفر. وينبغي أن تستخدم ظروف معقمة للحد من مخاطر التلوث الجرثومي والفطري. يتعين على جميع الأدوات اللازمة لتعقيمها قبل استخدامها. الكواشف يجب الطازجة قبل تنفيذ إجراء العزل.

اختيار كولاجيناز الرابع، مع انخفاض النشاط زيتية، أمر بالغ الأهمية. الكثير مختلفة من نفس المورد لها النشاط الأنزيمي مختلفة، وأنها قد تحتاج إلى مقارنة في البداية لتحديد الدفعة الأ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعلن المؤلفون أنه ليس لديهم مصالح مالية متنافسة.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم هذا العمل من قبل برنامج شبكة الاتحاد الأوروبي FP7-ITN Marie-Curie Network RADDEL. تود MB و KAJ أن تعرب عن تقديرهما لجو فارغيز وروي سيرا مايا على مساعدتهما واقتراحاتهما على طول تحسين عزل خلية Kupffer.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Euthatal (بنتوباربيتال الصوديوم)Merial
CD1 الفئرانتشارلز ريفر   -يجب أن يتراوح وزن الفأر من 35 إلى 45 جم. ننصح باستخدام ذكور الفئران CD1 حيث يزداد وزنها بسرعة ( على سبيل المثال < / em> فأر CD1 ذكر يبلغ من العمر 7 أسابيع يتجاوز وزنه 35 جراما). ينصح أيضا بالاتصال بمورد مسبقا لترتيب تسليم الأكبر سنا. بدلا من ذلك ، يمكن أن تكون في المنزل للوصول إلى الوزن المطلوب.
HBSS (Ca2+ < / sup> و Mg2+ < / sup>free ، مع البيكربونات)   ؛  لايف تكنولوجيز   14175-053يجب أن يكون HBSS  Ca2+ مجانا. 
حمض رباعي الأسيتيك جلايكول الإيثيلين (EGTA) ملح رباعي الصوديوم سيجما ألدريتش   E8145   يمكن أيضا استخدام EDTA ولكن EGTA لديها ميزة مخلب Ca2+ < / sup>بشكل انتقائي.
HEPES (1 M) لايف تكنولوجيز   15630-056 100 مل  
الكولاجيناز النوع IV   ؛ورثينجتون CSL-4 ينصح باختبار دفعات مختلفة من الكولاجيناز أو على الأقل ذكر للمورد أن المنتج يجب أن يكون مناسبا لعزل خلايا الكبد  
  انخفاض الجلوكوز DMEM سيجما ألدريتش   D5523 500 مل  
RPMI (مع بيروفات الصوديوم والجلوتاماكس)  لايف تكنولوجيز   12633-012 500 مل
البنسلين / ستيبتومايسين  لايف تكنولوجيز   15140-122100 مل
مصل الأبقار الجنينية الرابط الأول   60-00-850 500 مل  
محلول تريبان الأزرق سيجما ألدريتش T8154 100 مل  
محلول جزيئات السيليكا المطلي (Percoll) GEHealtcare   ؛  17-0891-02 Percoll & reg مستقر للغاية ويمكن الاحتفاظ به لعدة سنوات   ;
1x محلول ملحي مخزن بالفوسفات   ؛  لايف تكنولوجيز   10010-023500 ml 
10x فوسفات مخزن ملحي   ؛  لايف تكنولوجيز   70011-036500 مل
ثنائي ميثيل سلفوكسيد   ؛فيشر D/4120/PB08 500 مل  
مجموعة LDH (CytoTox 96)  Promega G1781 حافظ على الحماية من الضوء 
DMEM الفينول الأحمر الحرةLife Technologies   31053-028 500 مل  
الجسم المضاد F4 / 80 (Alexa 488)AbD SerotecMCA497A488لا تمييع ، تستخدم بشكل أنيق لقياس التدفق
الخلوي حبات الفلورسنتSigmaL2778حبات اللاتكس ، البوليسترين المعدل بالأمين ، أحمر الفلورسنت. 1 مل
اسم شركة المواد  ؛رقم الفهرس تعليقات / وصف  
مجموعة جمع دم الفراشة (أنابيب بطول 23 جم / 305 مم)   ؛  BD 367288
مرشحات الحقن (0.22 & mu; م حافة زرقاء) Minisart 16534-K 
أنابيب الطرد المركزي (50 مل غطاء أزرق)  BD Biosciences, Falcon 35 2070 
طبق بتري (90 × 15 مم)  ثيرمو فيشر العلمية   BSN 101VR20 
100 مو ؛ مصفاة الخلايا المم   BD   352360
المضخة التمعجية Watson Marlow SciQ 300   اشطف الأنبوب قبل وبعد كل استخدام باستخدام PBS معقم و 70٪ إيثانول.
24 بئر لوحاتCorning   3526
ألواح 96 بئر  كورنينج   3595
أجهزة الطرد المركزي Eppendorf5810R
قارئ لوحةBMG LabtechFLUOstar ملقط أوميغا
SerrefineHammacher GmbH المادة رقم HSE 004-35 / Cat. Nr. 221-0051تسمح الملقطات المتنقية بتثبيت الوعاء المقنن بإبرة 23 G دون الحاجة إلى إمساك الملقط أثناء إجراء التروية. الموقع: (http://www.hammacher.de/Laboratory-Products/Clamps-forceps/Serrefines/HSE-004-35-Serrefine::25126.html) 
أنابيب قياس التدفق الخلويBD Biosciences, Falcon 352052
أنابيب الطرد المركزي الدقيقة (1.5 مل)Elkay  000-MICR-150
مكشطة خليةBD Biosciences، Falcon353086قطع أطراف الشفرة بمقص لكشط الخلايا في ألواح 24 بئرا.
اسم شركة الكاشف رقم الفهرس تعليقات / وصف  
  EGTA (حمض الإيثيلين جلايكول رباعي الأسيتيك) / HBSS (محلول الملح المتوازن من هانك) محلول يحتوي HBSS على 0.5 ملي EGTA و 25 ملي HEPES. اضبط الرقم الهيدروجيني على 7.4. تحضير 50 مل لكل كبد لتصفيره.  
محلول الكولاجيناز DMEM منخفض الجلوكوز يحتوي على الكولاجيناز من النوع الرابع عند 100 UI / مل و 15 ملي مولار HEPES و 1٪ بنكلين / ستربتامايسين (v / v). اضبط الرقم الهيدروجيني على 7.4. تحضير 100 مل لكل كبد لنفخ. بعد إضافة الكولاجيناز ، ينصح بتسخين المحلول لمدة 30 دقيقة قبل الاستخدام. هذا يسمح لنشاط الكولاجيناز بأن يكون مثاليا.
Kupffer Cell Isolation Medium يحتوي RPMI على 1٪ أحماض أمينو غير أساسية (v / v) ، 1٪ جلوتاماكس & ريج ؛ (v / v) و 1٪ Penicllin / Streptomycin (v / v). تحضير 100 مل على الأقل ل 1-3 كبد.  
Kupffer Cell Culture Medium RPMI يحتوي على 10٪ مصل بقري للجنين ، 1٪ أحماض أمينو غير أساسية (v / v) ، 1٪ جلوتاماكس & ريج. (حجم حجم / حجم) و 1٪ بنكلين / ستربتامايسين (حجم / حجم). تحضير 100 مل على الأقل ل 1-3 كبد.  
SIP (محلول جزيئات السيليكا المطلية متساوية التوتر)امزج 1.7 مل من محلول ملحي مخزن ب 10x فوسفات مع 15.3 مل من Percoll & reg للحصول على 17 مل من SIP.
25٪ حل SIP امزج 5 مل من SIP مع 15 مل من 1x محلول ملحي مخزن بالفوسفات   ؛  
حل SIP بنسبة 50٪ امزج 10 مل من SIP مع 10 مل من 1x محلول ملحي مخزن بالفوسفات   ؛
وسائط Lysis BufferDMEM مع محلول
PBS / BSA٪ تحضير محلول ملحي مخزن من الفوسفات الطازج درجة الحموضة 7.4 مع 1٪ ألبومين مصل البقري.
Triton X-100 بنسبة 0.9

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hoffmann, D., et al. Performance of novel kidney biomarkers in preclinical toxicity studies. Toxicol Sci. 116 (1), 8-22 (2010).
  2. Nel, A., et al. Nanomaterial Toxicity Testing in the 21st Century: Use of a Predictive Toxicological Approach and High-Throughput Screening. Accounts of Chemical Research. 46 (3), 607-621 (2013).
  3. Bregoli, L., et al. Toxicity of antimony trioxide nanoparticles on human hematopoietic progenitor cells and comparison to cell lines. Toxicology. 262 (2), 121-129 (2009).
  4. Yamasaki, K., et al. Genomic Aberrations and Cellular Heterogeneity in SV40-Immortalized Human Corneal Epithelial Cells. Investigative Ophthalmology, & Visual Science. 50 (2), 604-613 (2009).
  5. Motoyoshi, Y., et al. Megalin contributes to the early injury of proximal tubule cells during nonselective proteinuria. Kidney International. 74 (10), 1262-1269 (1038).
  6. Prozialeck, W. C., Edwards, J. R., Lamar, P. C., Smith, C. S. Epithelial barrier characteristics and expression of cell adhesion molecules in proximal tubule-derived cell lines commonly used for in vitro toxicity studies. Toxicology in Vitro. 20 (6), 942-953 (2006).
  7. Chamberlain, L. M., Godek, M. L., Gonzalez-Juarrero, M., Grainger, D. W. Phenotypic non-equivalence of murine (monocyte-) macrophage cells in biomaterial and inflammatory models. J Biomed Mater Res A. 88 (4), 858-871 (2009).
  8. Kermanizadeh, A., et al. The role of Kupffer cells in the hepatic response to silver nanoparticles. Nanotoxicology. , (2013).
  9. Fischer, H. C., Hauck, T. S., Gomez-Aristizabal, A., Chan, W. C. W. Exploring Primary Liver Macrophages for Studying Quantum Dot Interactions with Biological Systems. Advanced Materials. 22 (23), 2520-2524 (2010).
  10. Wan, J. H., et al. M2 Kupffer Cells Promote M1 Kupffer Cell Apoptosis: A Protective Mechanism Against Alcoholic and Nonalcoholic Fatty Liver Disease. Hepatology. 59 (1), 130-142 (2014).
  11. Matsuoka, M., Tsukamoto, H. Stimulation of hepatic lipocyte collagen production by Kupffer cell-derived transforming growth factor β: Implication for a pathogenetic role in alcoholic liver fibrogenesis. Hepatology. 11 (4), 599-605 (1990).
  12. Polakos, N. K., et al. Kupffer Cell-Dependent Hepatitis Occurs during Influenza Infection. The American Journal of Pathology. 168 (4), 1169-1178 (2006).
  13. Tanner, A., Keyhani, A., Reiner, R., Holdstock, G., Wright, R. Proteolytic enzymes released by liver macrophages may promote hepatic injury in a rat model of hepatic damage. Gastroenterology. 80 (4), 647-654 (1981).
  14. Knittel, T., et al. Expression patterns of matrix metalloproteinases and their inhibitors in parenchymal and non-parenchymal cells of rat liver: regulation by TNF-α and TGF-β1. Journal of Hepatology. 30 (1), 48-60 (1999).
  15. Branster, M. V., Morton, R. K. Isolation of Intact Liver Cells. Nature. 180 (4597), 1283-1284 (1038).
  16. Smedsrød, B., Pertoft, H. Preparation of pure hepatocytes and reticuloendothelial cells in high yield from a single rat liver by means of Percoll centrifugation and selective adherence. Journal of Leukocyte Biology. 38 (2), 213-230 (1985).
  17. Morin, O., Patry, P., Lafleur, L. Heterogeneity of endothelial cells of adult rat liver as resolved by sedimentation velocity and flow cytometry. J Cell Physiol. 119 (3), 327-334 (1984).
  18. Miller, S. B., et al. Purification of cells from livers of carcinogen-treated rats by free-flow electrophoresis. Cancer Res. 43 (9), 4176-4179 (1983).
  19. Firme, C. P., Bandaru, P. R. Toxicity issues in the application of carbon nanotubes to biological systems. Nanomedicine. 6 (2), 245-256 (2010).
  20. Ali-Boucetta, H., Al-Jamal, K. T., Kostarelos, K. Cytotoxic assessment of carbon nanotube interaction with cell cultures. Methods in Molecular Biology. 726, 299-312 (2011).
  21. Wang, G., et al. Understanding and correcting for carbon nanotube interferences with a commercial LDH cytotoxicity assay. Toxicology. 299 (2-3), 99-111 (2012).
  22. Wang, J. T. -W., et al. Magnetically Decorated Multiwalled Carbon Nanotubes as Dual MRI and SPECT Contrast Agents. Advanced Functional Materials. 24 (13), 1880-1894 (2014).
  23. Li, P. Z., Li, J. Z., Li, M., Gong, J. P., He, K. An efficient method to isolate and culture mouse Kupffer cells. Immunol Lett. 158 (1-2), 52-56 (2014).
  24. Froh, M., Konno, A., Thurman, R. G. Isolation of liver Kupffer cells. Curr Protoc Toxicol. Chapter 14, Unit14 14(2003).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Kupffer Cell IsolationNanoparticle Toxicity TestingMouse Liver MacrophagesCollagenase DigestionDensity Gradient CentrifugationFlow Cytometry AnalysisFunctionalized Carbon NanotubesModified LDH AssayNon Parenchymal CellsPortal Vein Cannulation

Related Articles