مقالة منهجية

القوارض الدماغ Microinjection لدراسة ركائز الجزيئي للسلوك الدوافع

DOI:

10.3791/53018

⸱

سبتمبر 16, 2015

 ,  ,  , 
1Virginia Institute for Psychiatric and Behavioral Genetics, Department of Psychiatry, Virginia Commonwealth University School of Medicine, 2Institute for Drug and Alcohol Studies, Departments of Psychiatry, Pharmacology, and Neuroscience, Virginia Commonwealth University School of Medicine

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

القوارض هي نموذج مناسب للتحقيق في الركائز الجزيئية للسلوك والاضطرابات النفسية المعقدة. يمكن استخدام الحقن المجهري للدماغ في القوارض المستيقظة لتوضيح ركائز المرض. يتم تقديم طريقة حقن مجهري فعالة وقابلة للتخصيص للدماغ بالإضافة إلى تنفيذ نموذج فعال يحدد الدافع.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يمكن أن يساعد الحقن المجهري للدماغ في توضيح الركائز الجزيئية للسلوكيات المعقدة ، مثل التحفيز. لهذا الغرض ، يمكن أن تكون القوارض بمثابة نماذج مناسبة ، ويرجع ذلك جزئيا إلى أن الاستجابة للمنبهات ذات الصلة سلوكيا ونتائج عمل التحفيز التي تحلل الدوائر متشابهة بشكل مذهل بين البشر والقوارض. عند دراسة الركائز الجزيئية للسلوكيات المعقدة ، يعد الحقن المجهري للكواشف التي تعدل أو تزيد أو تسكت أنظمة معينة تقنية لا تقدر بثمن. ومع ذلك ، من الأهمية بمكان أن يتم استهداف موقع الحقن المجهري بدقة من أجل المساعدة في تفسير النتائج. نقدم طريقة لتصنيع الأدوات الجراحية وإبر الحقن المجهري التي تتيح الحقن الدقيق والتخصيص غير المحدود بأقل تكلفة. الأهم من ذلك ، يمكن إكمال هذه التقنية بنجاح في القوارض المستيقظة إذا تم إجراؤها جنبا إلى جنب مع مقالات JoVE الأخرى التي غطت الإجراءات الجراحية المطلوبة. بالإضافة إلى ذلك ، هناك العديد من النماذج السلوكية المناسبة تماما لقياس الدافع. النسبة التدريجية هي طريقة شائعة الاستخدام تحدد فعالية المعزز للحفاظ على الاستجابة على الرغم من متطلبات العمل المتزايدة (غالبا بشكل كبير). هذا الاختبار حساس لحجم المعزز والتلاعب الدوائي ، مما يسمح بتحديد فعالية التعزيز و / أو الدافع. نقدم أيضا نهجا مباشرا لبرنامج تشغيل البرنامج لاستيعاب جدول تعزيز النسبة التدريجية.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تستجيب القوارض والبشر بطرق متشابهة بشكل ملحوظ مع المحفزات ذات الصلةسلوكيا 1-3. يشير هذا إلى أن القوارض هي مواضيع مناسبة لتوضيح الركائز الجزيئية للسلوك والحالات النفسيةالمعقدة 4. يتطلب فهم الركائز الجزيئية للعمليات السلوكية المعقدة ، مثل الدافع ، في كثير من الأحيان الحقن المجهري للدماغ. سيتم تقديم كل من تقنية الحقن المجهري للدماغ ومقايسة الدافع الأساسي هنا. سيتم استخدام الفئران كموضوعات ، ولكن يمكن بسهولة تكييف هذه الإجراءات مع الفئران التي يتم التعامل معها جيدا. تتضمن هنا إجراءات تصنيع القنيات المطلوبة ، والسدادات (القنيات الوهمية أو الأنماط الوهمية) ، والحقن الدقيقة. الطريقة المقدمة أكثر مرونة وأكثر فعالية من حيث التكلفة من الأدوات الجاهزة. ستثبت هذه المرونة قيمتها عند تحسين الظروف. الأهم من ذلك ، لأنه يمكن استخدام إجراء الحقن المجهري لاختبار عدد لا يحصى من الفرضيات. وينبغي أن تكون التقنيات المعروضة هنا قابلة للتطبيق على نطاق واسع. على سبيل المثال ، يمكن حقن روابط المستقبلات بشكل دقيق لفهم الكيمياء العصبية3،5،6 ؛ يمكن حقن الببتيدات المنفذة للخلايا والجزيئات الصغيرة لفهم مسارات الإشارات داخل الخلايا7-10 ؛ يمكن حقن السموم أو حاصرات القنوات الأيونية أو الكوكتيلات المضادة لفهم الدوائر1،11،12.

في حين أن البروتوكول العام المقدم هنا يمكن تكييفه بسهولة من قبل المستخدم لتلبية احتياجاته الخاصة ، فإن الإجراء مناسب بشكل خاص للمقايسات السلوكية نظرا لأن الحقن المجهري يحدث في القوارض المستيقظة التي تخضع فقط لقيود اليد الخفيفة. لا يلزم تخدير أو قيود خاصة. هذا ممكن لأن الدماغ نفسه يفتقر إلى الإحساس بالألم. ومع ذلك ، إذا لم يتم استخدام التخدير ، فيجب أن يحدث الحقن المجهري من خلال القنيات التي تم زرعها مسبقا بشكل تجسيمي. وذلك لأن مستقبلات الألم موجودة على فروة الرأس ، والسحايا ، 13 وهي الأغشية المحيطة بالدماغ ، والسمحاق ،14 وهو الغشاء الذي يغطي الجمجمة. وتجدر الإشارة إلى أن الحقن المجهري تحت التخدير أمر مرغوب فيه في بعض الأحيان. أحد الأمثلة على ذلك هو عندما يتم حقن الفيروس ، وقد يرغب المرء في حقن الفيروس مباشرة إما من خلال إبر سرقة غير قابلة للصدأ15 أو ماصات زجاجية لأن هذا يمكن أن يقلل من تلف الأنسجة ويحسن كفاءة النقل. 16،17 يمكن تعديل الحاقنات الدقيقة الموضحة أدناه لهذا الغرض ويمكن العثور على اقتراحات حول كيفية القيام بذلك في المناقشة. نظرا لأن مقالات JoVE الأخرى قد أظهرت زرع قنية الدماغ التجسيمية ، 18-20 لن يتم تغطية هذه الإجراءات هنا.

نقدم إجراءات الحقن المجهري هذه جنبا إلى جنب مع مقايسة تحدد الدافع. يتم حاليا استخدام العديد من نماذج القوارض للسلوك المحفز ، مثل صندوق المدرج وقياس الحاجز. هنا ، نصف كيفية استخدام جدول النسبة التقدمية الفعالة للتعزيز لتحديد الدافع حيث يتم الحفاظ على الاستجابة الفعالة بواسطة معزز. الاستجابة على النسبة التدريجية تستجيب لحجم المعزز. 21،22 وفقا لذلك ، يتم استخدام هذا الاختبار بشكل روتيني كبديل للتحفيز و / أو تعزيز الفعالية. 21، 23-30 نظرا لأن العديد من المراجعات الممتازة قد غطت هذا الموضوع بالتفصيل،21، 24 سنركز بشكل أساسي على الاهتمامات العملية.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد تمت الموافقة على الإجراءات التي تجرى على الحيوانات من قبل اللجنة المؤسسية رعاية الحيوان واستخدام (IACUC) في جامعة فرجينيا كومنولث والانضمام إلى دليل المعاهد الوطنية للصحة للرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية.

1. إعداد تطبيقات قبل الجراحة وMicroinjection

  1. التي أنشئت من أجل التحضير المادي:
    1. الحصول على 26 G قنية أنابيب، 33 G سلك مصراع، 33 G microinjection الإبرة أنابيب، أنابيب بلاستيكية microinjector (PE20 أو ما يعادلها)، واثنين من الوزن المتوسط ​​المرقأة على التوالي، شريط المختبر، والحاكم، علامة دائمة، و 70٪ من الإيثانول (ت / ت) والتخزين قارورة (على سبيل المثال، 20 مل الزجاج التلألؤ)، سوبر الغراء، صغيرة تزن القوارب، وأداة دوارة مجهزة واجب غير الثقيلة قطع القرص.
      ملاحظة: تأمين أداة دوارة إلى مربع ماصة باستخدام الأشرطة أو الشريط غير مفيدة، لأنها ترفع الأداة. ارتداء حماية العين من المهم تجنب الإصابة عند استخدام أداة دوارة.
    2. نعلق قطعةمعمل أو الشريط الأوتوكلاف على مقاعد البدلاء.
  2. إعداد القنيات:
    ملاحظة: يرجى ملء اثنين على الأقل حقنة عادية في الفئران لحقن الثنائي. وسوف تستخدم واحدة قنية إضافية في خطوة لاحقة.
    1. الحصول على جزء من قنية أنابيب بطول كاف لتجنب الانحناء أثناء عملية وضع العلامات والقطع.
    2. رسم خط المرجعية 15 ملم على الشريط من الخطوة 1.1.2 باستخدام قلم غرامة ذات الرؤوس. وهذا سيكون بمثابة دليل لوضع علامات على أقسام متتابعة 15 ملم على أنابيب باستخدام علامة دائمة حادة.
    3. لمس أنابيب قنية، في نقاط ملحوظة، إلى بطء القرص الغزل قطع من أداة دوارة من أجل تحقيقها الأنبوب. تدوير قنية 180˚ وتحقيقها الجانب الآخر من الأنبوب. لا قطع طريق الأنابيب تماما، لأنه قد يؤدي إلى انسداد.
    4. بشكل حاد ثني الأنابيب من أجل تقسيمه إلى أقسام ~ 15 ملم.
    5. عقد نهاية كل قطع من قنية عمودي على قطعالقرص بين الإبهام والسبابة. تدوير أنابيب قنية في حين لمس طرف على السطح الأمامي كبير من القرص قطع (أي ليس على حافة). هذا وسوف تولد طرف اضعافها. ملاحظة: لا ينحني قنية، لذلك يمكن أن تسفر عن حقن خارج الموقع.
    6. ماعون طرفي قنية مع 26 G إبرة مشطوف (محور البني) لضمان أن جميع نتوءات قد أزيلت وأن قنية هو دون عائق.
    7. تمرير عينة من قطع أسلاك مصراع إلى ~ 35 ملم من خلال خفض قنية للتحقق من عدم وجود عوائق داخلية.
    8. تلتقط كل قنية فردي باستخدام المرقأة غير مثبت وقياس كل قنية مع الانتهاء من مسطرة للتأكد من أنه هو بالضبط 14 ملم في الطول.
  3. إعداد obturators:
    1. المشبك واحدة قنية في حوالي نصف طول مع الوزن المتوسط، المرقأة على التوالي. وضع مرقئ مقفل على مقاعد البدلاء. يجب أن يكون قنية عمودي على مقاعد البدلاء.
      ملاحظة: هذا قنيةلا ينبغي أن تستخدم في جراحة بعد احتجازه من قبل المرقأة مقفلة، كما هو عازمة احتمالا.
    2. إطعام واحدة من نهاية سلك مصراع في قنية حتى أنها وصلت إلى مقاعد البدلاء. ترتد السلك في قنية لضمان أن لدغ لا يمنعه من الوصول إلى مقاعد البدلاء؛ أي الوصول إلى الجزء السفلي من قنية. سليم طول مصراع ومنع انسداد وتندب النسيج إضافية.
    3. ثني الأسلاك عن طريق معسر مع الأصابع حتى يتم التوصل إلى 30˚ زاوية ~ مع الحفاظ على الاتصال بين مصراع وعلى مقاعد البدلاء. تأكد من أن زاوية الانحناء هو من النوع الذي يضع مطاردة مع غطاء الرأس، ويواجه الفائض إلى الأمام، مما يجعل من الصعب على الفئران لإزالة.
    4. إزالة الأسلاك من حقنة عادية وقطع جزء الزائد في ~ 2.5 ملم من منعطف مع قطع صغيرة قطري (قطع الأسلاك).
      ملاحظة: سوف تكون هناك حاجة اثنين obturators على الاقل في الفئران لحقن الثنائي، كما تتطلب كل قنية مزروع على مصراع. خلقسوف إضافي في منتصف الطريق ~ 35˚ منحنى من خلال مصراع تساعد أيضا في منع إزالة من قبل الحيوانات. تخزين كل حقنة عادية وobturators في قارورة منفصلة (على سبيل المثال، 20 مل الزجاج التلألؤ) التي تحتوي على 70٪ من الإيثانول (ت / ت) حتى استخدامها، ولكن على الأقل O / N.
  4. إعداد واختبار microinjectors:
    1. الحصول على قطعة من microinjector إبرة الأنابيب هذا هو ~ 1 مترا.
    2. عقد واحد من نهاية الأنبوب microinjector عموديا مع المرقأة التوالي مؤمن.
    3. تحريف مرقئ مع الحفاظ على التوتر في أنابيب لفائف بإحكام حول مرقئ مرة واحدة على الأقل.
    4. قياس 32 ملم من العكس، نهاية فضفاضة من أنابيب microinjector وفهم هذه النقطة عموديا مع الثاني على التوالي، متوسطة مرقئ الوزن واحبسهم. فهم أنابيب microinjector مع المرقأة على جانب من 32 ملم علامة الأقرب إلى نهاية فضفاضة بدلا من التركيز على الجانب الأقرب إلى مرقئ مع سلك الجرح.
    5. بند الأنبوب ذهابا وإيابا مع الإبقاء على التوتر في الأنبوب حتى يكسر.
      ملاحظة: سوف واحد، حاد منحنى العلوي والسفلي تنتج استراحة حادة، مما هو مرغوب فيه للتأكد من أن microinjection يحدث في منطقة الدماغ المطلوبة.
    6. تفقد microinjector الأنابيب للتأكد من أن كلا الطرفين هي على التوالي وذلك القطر الداخلي هو دون عائق.
    7. الحصول على أنابيب قنية التي سيتم استخدامها لتصنيع طوق microinjector.
    8. قياس وعلامة متتابعة أقسام 5 ملم من قنية أنابيب باستخدام علامة دائمة وخط المرجعية 5 مم مرسومة على الشريط (الخطوة 1.1.2).
      ملاحظة: كل microinjector يتطلب طوق واحد. الياقات هي مجرد حقنة عادية قصيرة انضمت إلى سلك microinjector.
    9. لمس قنية الأنابيب، وعند نقاط ملحوظة، إلى بطء القرص الغزل قطع من أداة دوارة من أجل تحقيقها الأنبوب. تدوير قنية 180˚ وتحقيقها الجانب الآخر من الأنبوب. قطع تماما قد تسد الأنابيب.
    10. بحدةثني الأنابيب microinjector طوق من أجل تقسيمه إلى ~ 5 أقسام مم.
    11. احفر داخل القطر من طرفي من ذوي الياقات البيضاء مع 26 G إبرة مشطوف (محور البني) لضمان أن تم إزالة أكثر من نتوءات. وبعض نتوءات صغيرة انتزاع السلك microinjector وبالتالي تساعد في الإلتصاق.
    12. الشريحة طوق واحد على كل أنبوب microinjector ~ 2 سم من نهاية المباراة.
    13. إنشاء مجموعة صغيرة من الغراء عظمى في زاوية تزن قارب صغير.
    14. استخدام الخردة قنية أنابيب قطع ل~ 25 ملم إلى تطبيق كمية صغيرة من الغراء سوبر لأنبوب microinjector ~ 5 ملم من طرف واحد. بعد ذلك، حرك طوق على هذا حبة الغراء عظمى بحيث يكون ~ 1 ملم من نهاية الأنبوب microinjection. تغطية طرفي من ذوي الياقات البيضاء مع الغراء.
      ملاحظة: تجنب تراكم كبير من الغراء عظمى على ذوي الياقات البيضاء، كما أنه سيتم منع الأنابيب البلاستيكية من ختم حول microinjector. في حين أنه من المهم لتجنب الحصول على السوبر الغراء على نهاية مفتوحة من microinjector الأنابيب، وهذا سيجعلوmicroinjector غير صالحة للاستعمال، بل هو أيضا مهم لشريحة ذوي الياقات البيضاء وعلى مقربة من نهاية وقت ممكن لتقليل الفراغ (غير حقن) وحدة التخزين.
    15. العجاف microinjector الانتهاء من الخارج من وزن قارب آخر صغير مع الجانب طوق صعودا والسماح ليجف لمدة 24 ساعة.
    16. الحصول على سم قطعة من الأنابيب البلاستيكية microinjector ~ 8 (PE20 أو ما يعادلها)، 1 مل حقنة مملوءة بالماء المعقم، و 26 G إبرة مشطوف (محور البني).
    17. إرفاق 26 G (محور البني) الإبرة إلى حقنة وحرك قطع الأنبوب على الإبرة، وضمان عدم ثقب الأنبوب.
    18. حرك أنابيب من البلاستيك على نهاية طوق من المجفف، microinjector كاملة.
    19. ضغط على حقنة الغطاس مملوءة بالماء لاختبار المباح.
      ملاحظة: يجب رش المياه بعيدة جدا ومباشرة من طرف microinjector. إذا كان تيار ليس مستقيما، فإن موقع الحقن لا تكون صحيحة. مصدر رذاذ جانبية أو المنتشر هو كسر الفقراء (الخطوة 1.4.5). A microinjector ينبغي لاتي ان تستخدم اذا كان الرذاذ جانبية أو منتشر. لا ينبغي أن تستخدم المياه المالحة، لأنها يمكن أن تسد microinjector أو إبرة.
    20. سحب حقنة الظهر لإزالة المياه من microinjector. مخزن في منطقة جافة، مختومة قارورة، على سبيل المثال، 20 مل الزجاج التلألؤ القارورة.
      ملاحظة: Microinjectors يمكن تعقيمها بعد التصنيع مع معظم الغراء عظمى، 31 ولكن هذا يجب أن تحدد تجريبيا. وتشمل تقنيات التعقيم البديلة أكسيد الإيثيلين وأشعة جاما.

2. إعداد لوالمسرحية إبر دقيقة جدا

  1. الحصول microinjectors الانتهاء، أنابيب بلاستيكية microinjector (PE20 أو ما يعادلها)، مضخة microinjection، وهما الصغيرة تزن القوارب والماء المعقم، و 70٪ من الإيثانول (ت / ت)، والأسيتون، واثنين من الحقن gastight 1 ميكرولتر الزجاج مع إبرة حادة (25 G)، القطن يميل تطبيقها خشبية، obturators الغيار، 1 مل حقنة، 26 G (محور البني) إبرة، ملقط الصغيرة المنحنية (ينصح أسلوب # 7)، ومختبر ثIPES.
  2. إعداد microinjectors للحقن:
    1. أكمل الانحناء microinjector 15 ملم من نهاية المقابلة لذوي الياقات البيضاء بحيث تكون زاوية بين الاثنين هو ~ 95˚.
      ملاحظة: موقع منحنى دقيق أمر حتمي لدقة موقع الحقن. باستخدام # 7 ملقط (أو ما شابه) للاستيلاء على microinjector والانحناء صعودا مفيد. دائما إعادة قياس طول قبل تنفيذ إبر دقيقة جدا.
    2. قطع الأنابيب البلاستيكية (PE20) إلى ~ 70 سم والانزلاق على microinjector طوق.
      ملاحظة: إضافة علامات تبويب الشريط لأنبوب بلاستيكي واحد بالقرب من كل من microinjector ونهاية فضفاضة غير مفيدة عند الانتهاء من الحقن، وخاصة عند حقن حلين مختلفة. لا ينصح علامات تبويب لكل من أنابيب عندما تصبح مرهقة خلال الحقن.
  3. إعداد مضخة للإبر دقيقة جدا:
    1. السلطة على مضخة.
    2. تعيين قطر microinjection الإبرة، ومعدل ضخ المطلوب، وتستهدف حجم الحقن.
      ملاحظة: الفئران التسريبه وحجم الحقن يتوقف على مطالب التجريبية. وضعت هذا في في مناقشة. بعض المضخات لديها جداول حقنة قبل تحميلها. إذا لم يكن كذلك، ويمكن الاطلاع على الجدول حقنة على موقع الصنع (ق).
    3. تعيين وضع مضخة إلى "وحدة تخزين" بحيث يتم تسليم حجم الدقيق تلقائيا. إذا تم تحديد وضع "مضخة" بدلا من ذلك، يجب أن المجرب تتوقف المضخة يدويا.
    4. ضبط مساندة مضخة للسماح للحقنة لملء إلى حجم الحقن بالإضافة إلى 0.2 ميكرولتر إضافية.
  4. إعداد حقنة microinjection وmicroinjector للحقن:
    1. قفل كل microinjection حقنة gastight في رف مضخة microinjection.
    2. وضع غيض من حقنة gastight في الماء المعقم الواردة في صغيرة تزن قارب وترفرف بلطف المكبس لتليين السلك الداخلي. سحب بالتساوي على المكبس إلى مساندة على مضخة لملء مع الماء.
    3. حرك أنابيب PE20 أن التعاونnnected إلى microinjector (في الخطوة 2.2) على 26 G (محور البني) إبرة تعلق على حقنة 1 مل مليء بالماء المعقم. رذاذ الماء المعقم خلال microinjector، وتفقد نمط الرش والمسافة.
      ملاحظة: يجب رش المياه بعيدة جدا ومباشرة من طرف microinjector. إذا كان تيار ليس مستقيما، فإن موقع الحقن لا تكون صحيحة.
    4. وضع microinjector تعقيمها على حقل معقمة.
    5. حرك أنابيب الخروج من إبرة، والحفاظ على أنابيب microinjector تستقيم لمنع المياه من يقطر من حين خفض أيضا أنابيب أسفل المنطقة التي تضررت من الإبرة.
    6. دفع microinjection حقنة المكبس قليلا إلى الأمام لخلق قطرة في نهاية الإبرة، وحرك PE20 أنابيب مملوءة بالماء (التي يتم توصيلها إلى microinjector) على الإبرة.
      ملاحظة: هذا سيخلق السائل إلى سائل الاتصال التي تسمح احداهما المناسب الذي يمكن أن طرد تسد التي يمكن أن تشكل فيغيض من microinjector.
    7. دفع المكبس إلى الأمام تماما للتحضير لعينة التحميل وضمان عدم الإيثانول أثر ولا يزال في microinjector.
    8. تحقق الإعداد للكشف عن التسربات عن طريق لمس قطرة الماء التي شكلت في طرف microinjector إلى مختبر نظيفة يمسح عدة مرات.
  5. ملاحظة: عندما لمس لمختبر مسح، ينبغي أن تشكل بقعة رطبة واحدة فقط. إذا كان هناك مزيد من قطرات، هناك تسرب في النظام.
  6. تجنب التسريبات عن طريق التحكم في تطبيق الغراء عظمى (الخطوة 1.4.14) وتقليم أنابيب PE20 مع مقص حاد أو شفرة حلاقة أي وقت أن تتم إزالة أنابيب PE20 من أي اتصال. بالإضافة إلى ذلك، كرر الخطوات من 2.4.3 خلال 2.4.8 لعلاج تسرب.
  7. سحب حقنة المكبس إلى الوراء 0.2 ميكرولتر. خلق فقاعة بين الماء المعقم في PE20 أنابيب / microinjector والحل ليتم حقنه.
  8. ملاحظة: هذه الفقاعة يمنع التخفيف من injectate، وتلوث المياه، وتتيحلرصد عملية الحقن لأنها سوف تتحرك خلال الحقن. يجب أن تنتج A، فقاعة واحدة صلبة. في حال كسره، تسرب موجود أو طرف microinjector هو المغطي. مشيرا إلى أن الخطوة 2.4.8 (والمذكرة المرفقة) يجب أن تتكرر.
  9. وضع microinjector إلى الكاشف ليتم حقنه وسحب ببطء المكبس المحقنة إلى مساندة.
  10. إعداد الحيوان للحقن:
  11. عقد الصدر الفئران ضد الصدر مجرب و. تنظيف المنطقة المحيطة حقنة عادية مع قضيب من القطن غارقة في الايثانول 70٪ (ت / ت).
  12. ملاحظة: مع التعامل السليم والفئران يمكن ضبط النفس بلطف في يد المقعر. خلاف ذلك، قد تكون هناك حاجة scruffing.
  13. إزالة obturators باستخدام ملقط صغير ومكان في وزن القارب مع 70٪ من الإيثانول (ت / ت).
  14. أداء الحقن:
  15. ضع شغل microinjector (الخطوة 2.4.10) في قنية. اضغط على بدء على مضخة microinjection وحركة مراقبة فقاعة.
  16. ملاحظة: من أماهذ يكون من الضروري تطبيق الضغط الخفيف لضمان microinjectors لا رفع. فقاعة (شكلت في الخطوة 2.4.9) يجب أن تقدم بشكل موحد ويدخل تماما في microinjector.
  17. إزالة microinjectors من قنية واستبدال obturators، وبمجرد أن حقن اكتمال واجتاز فترة نشر بعد الحقن.
  18. ملاحظة: مرات النموذجية نشرها بعد الحقن هي 2-4 دقيقة للمواد الدوائية، و2-10 دقيقة بحثا عن الفيروسات. ترك microinjector في خلال فترة ما بعد ضخ يمنع injectate من الرجوع الى الوراء حتى حقنة عادية بدلا من نشرها في الأنسجة. مكان obturators على جانب القارب مليئة الايثانول وزن للسماح للإيثانول لاستنزاف قبل إعادة إدراج في قنية.

3. بعد حقن تنظيف

  1. الحصول على واحد قنينة صغيرة من كل: الماء المعقم، و 70٪ ETOH، والأسيتون.
  2. تنظيف microinjector وmicroinjection حقنة:
    1. إزالة الزجاج حقنةالصورة من رف ضخ حقنة وmicroinjection أنابيب من الزجاج حقنة.
    2. قطع الاتصال أنابيب microinjector من الزجاج حقنة ونعلق حقنة 1 مل مملوءة بالماء المعقم في أنابيب microinjector عبر 26 G إبرة (محور البني). دفع 1 مل حقنة المكبس إلى الأمام لطرد ~ 0.3 مل. بعد ذلك، لمس غيض من microinjector إلى مختبر مسح وسحب الهواء مرة أخرى من خلال microinjector.
      ملاحظة: microinjector وأنابيب يمكن إعادة استخدامها لتجارب مماثلة إذا اقتضت الحكمة.
    3. وضع الزجاج حقنة إبرة في الماء المعقم ورسم الغطاس بالكامل مرة أخرى. بعد ذلك، دفع المكبس بشكل كامل إلى الأمام للقضاء. لمس طرف زجاج حقنة لمختبر مسح لضمان عدم السائل يبقى.
    4. كرر الخطوة 3.2.3 مع الماء المعقم، والهواء، و 70٪ ETOH، والأسيتون في الترتيب التالي: الماء المعقم، الماء المعقم، والهواء، والهواء، و 70٪ ETOH، 70٪ ETOH، والهواء، والهواء، والأسيتون، والأسيتون، والهواء، الهواء. وأداء كل من هذه الخطوات تنظيف مساعدة في الحفاظ على حقنة microinjection.
    5. وضع حقنة microinjector (ق) في التعبئة والتغليف وسحب الغواص إلى 0.05 ميكرولتر.
      ملاحظة: وهذا أمر مهم، لأنها تتيح للالمكبس ليتم دفعها أو سحبها من أجل إزاحة المكبس عالقا التي قد تحدث ينبغي أن تشكل أي رواسب الملح بعد التخزين.

4. برمجة الدافع الفحص

  1. تسجيل الدخول إلى الدولة الجرافيك بأوراق اعتماد مسؤول.
  2. تحديد أو إنشاء قاعدة بيانات ذات الصلة.
  3. خلق التدريجي الجدول الزمني نسبة التعزيز:
    1. حدد قوائم> قوائم مستوى قاعدة البيانات> حدث الانتقال معلمة قوائم.
    2. حدد "إضافة". أدخل العدد المناسب القائمة (L #) والوصف.
    3. اختر "إضافة أحداث.
    4. أدخل القيمة الأولى جدول التعزيز واختر 'إضافة'. تكرار.
      يمكن تحديد القيم باستخدام صيغة حيث الجدول الزمني نسبة التدريجي = 5E (ي * (معزز حصل + 1)) -5 7: مذكرة.من أجل تفصيل هذه المعادلة لاختبار الفرضية بشكل صحيح، وقيمة ي يجب أن تحدد تجريبيا أو التي تم الحصول عليها من الأدب.
    5. اختر 'في ترتيب "ضمن خانة" اختيار بالدفع.
    6. اختر 'امسك القيمة = ل: ____ "داخل منطقة الجزاء" عندما انتهى ". أدخل تعزيز قيمة الجدول الزمني في مربع النص الذي يتجاوز المتوقع الاستجابة حتى الآن. وسيكون هذا هو الجهد المطلوب لجميع مداخل اللاحقة مرة واحدة تم استنفاد القائمة.
  4. إنشاء البروتوكول التجريبي:
    ملاحظة: الدولة الجرافيك يتحرك هذا الموضوع من خلال سلسلة من الدول التي خرجت على أساس إما مرة أو معايير الأداء. تعيين كافة العظة والمعلمات منفصلة والسياقية ملحوظ أدناه باسم '$' لاختبار مناسب الفرضية قيد البحث والدراسة.
    1. اختر ملف> إنشاء بروتوكول التجربة.
    2. أدخل رقم البروتوكول المطلوب ووصف في مربع النص المناسب.
      3. اختر "إنشاء دولة".
  5. تعيين كافة المحفزات لكل من "RDY - الدولة جاهزة 'و' FIN - دولة مصنعة.
  6. حدد "الدولة الجديدة" وتسميته 'S2 - PR ردا.
  7. حدد "الدولة الجديدة" وتسميته 'S3 - PR معزز وجديلة ".
  8. حدد "الدولة الجديدة" وتسميته 'S4 - مهلة ".
  9. تسليط الضوء على "S1" وتسميته 'S1 - التعويد ".
    1. حدد إضافة "وقت الانتقال إلى. '
    2. دخول الوقت المناسب ($) وحدة ($)، على سبيل المثال، دقيقة وحدد "S2" من TO S المنسدلة مربع. تم تحديد وحدة "وحدات" الوقت عندما تم إنشاء قاعدة بيانات في البداية.
      ملاحظة: إن التحول وقت إنشاء يجب قراءة مماثلة ل[بعد $ دقائق GO P = 100٪، لS2] الشكل 1 مثال على هذا الحدث مرة واحدة تم إنشاؤها.

figure-protocol-1
الشكل 1. البرمجة التمثيلية سبيل المثال # 1. وفي هذه الحالة يتم توضيح الوقت حالة محدد فيه قيمة المعرفة من $، كما هو موضح هنا في دقائق، يشير متى يجب الحالة الراهنة خروج إلى حالة 2 (S2).

  1. تسليط الضوء على 'S2 - PR ردا.
    1. اختر أضف 'الحدث الانتقال إلى.'
    2. أدخل اسم قائمة تحتوي على جدول زمني نسبة التدريجي الذي تم إنشاؤه في الخطوة 4.3 في مربع النص الأول كما L $ (على سبيل المثال، L1)، حدد operandum المناسب (على سبيل المثال، ذراع أو كزة الأنف) من أول المنسدلة مربع، واختار ' S3 "من TO S المنسدلة مربع.
      ملاحظة: هذا الحدث تم إنشاؤها قد قراءة مماثلة ل[IF 1 L $ - النشطة GO P = 100٪، لS3]. عين النشطة أثناء إنشاء قاعدة البيانات - معرف 1. هنا، 1 - نشطيشير إلى operandum موصول مفتاح واحد.
    3. اختر "إضافة وقت الانتقال إلى. '
    4. تحقق مربع 'R'، أدخل الوقت وحدات المناسب ($)، وحدد "FIN" من TO S المنسدلة مربع.
      ملاحظة: الحدث وقت إنشاء قد قراءة مماثلة ل[R (محددة) IF $ دقائق GO P = 100٪، لFIN]. وهذا يضمن أن الدورة ستنتهي إذا كان هناك أي نشاط على أن operandum بعد عتبة مجموعة؛ أي أن الدورة المهلة بعد يحجب الحيوان الاستجابة على operandum-يقترن معزز للفترة معينة من الزمن.
    5. اختر أضف 'الحدث الانتقال إلى.'
    6. ضع علامة في المربع 'R'، أدخل 1 في مربع النص الأول، حدد الإفراج عن operandum مناسبا من إسقاط أول ما نزل مربع، وحدد "S2" من TO S المنسدلة مربع.
      ملاحظة: هذا الحدث تم إنشاؤها قد قراءة مماثلة ل[R (محددة) بعد $ [1] النشطة GO P = 100٪، لS2]. هذه الخطوة تضمن أنه عند الافراج عن operandum(المشار إليها بين قوسين أعلاه)، أن الدولة دخلت مرة أخرى، وبالتالي إعادة عتبة الدورة مهلة (4.4.9.4). عند هذه النقطة، فإن الدولة سوف يخرج عند اكتمال نسبة التقدمية الواردة في قائمة (الخطوة 4.4.9.2) أو العصر جلسة من أصل (الخطوة 4.4.9.4). وهكذا، في كل مرة أن operandum يتم تنشيط، فإنه بحساب نحو نسبة التقدمية. . و، في كل مرة أن operandum هو المعطل، على سبيل المثال، يتم تحرير ذراع أو خرجت من كزة الأنف، وعتبة الدورة مهلة (الخطوة 4.4.9.4) هي إعادة يمثل الشكل 2 كل التحولات المبرمجة ل"S2 - PR ردا. '

figure-protocol-2
الشكل 2. البرمجة التمثيلية سبيل المثال رقم 2، وهنا خرجت الدولة على أي من المعيارين. L $ هو الجدول الزمني نسبة التدريجي تم إنشاؤه في الخطوة 4.3. على جدول الإنشائيةأيون، يخرج من ولاية إلى أخرى 3 (S3). لاحظ أن هذا المعيار ليس لديها R، والذي يسمح للجدول الزمني للتقدم بدلا من البداية مرة أخرى على كل العائدة إلى هذه الدولة. الدولة يمكن أيضا للخروج في الدقيقة '$' لتذكر FIN. هذا هو عتبة مهلة محددة سلفا وبعد ذلك الدورة ستنتهي إذا لم يستجيب يحدث داخل هذا الإطار. ويفسر هذا أيضا في مناقشة. وأخيرا، تتم إعادة تعيين عتبة المهلة الدورة على الافراج عن كل operandum. وبالتالي، '[1]' يشير إلى الإفراج عن operandum '1'.

  1. تسليط الضوء على 'S3 - PR معزز وجديلة ".
    1. اختر "إضافة وقت العودة إلى '
    2. دخول الوقت وحدات المناسب لتقديم معزز ($)، وحدد "S4" من TO S مربع القائمة المنسدلة.
      ملاحظة: الحدث وقت إنشاء قد قراءة مماثلة ل[بعد $ ثواني GO P = 100٪، لS4].
  2. تسليط الضوء على 'S4 - مهلة ".
      حدد أضف 'الوقت العودة إلى'
  3. دخول الوقت وحدات المناسب أن تبقى في حالة غير نشطة ($) بعد الولادة معزز، وحدد "S2" من TO S مربع القائمة المنسدلة.
    ملاحظة: الحدث وقت إنشاء قد قراءة مماثلة ل[بعد $ ثواني GO P = 100٪، لS2]. الدولة 'S4 - مهلة "قد لا تكون هناك حاجة لجميع التصاميم.
  • اختيار الدول عزيمة.
    ملاحظة: هذا البروتوكول هو الآن على استعداد لتشغيل.

    • النتائج

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    نحن هنا توضيح أمثلة من النتائج التي يمكن الحصول عليها مع الإجراء أعلاه. عرض لأول مرة هي منطقة النموذجية التي يتم transfected بواسطة ناقلات فيروسية (الشكل 3). بشكل عام، يتم الحصول على حجم transfected من ~ 1 مم 3 في أنسجة الجسم المخطط. حجم المنطقة transfected يمكن قياسها كميا عبر مسلسل أقسام باستخدام طريقة كافاليري في 32 الأهم من ذلك أن حجم transfected يعتمد على العديد من العوامل مثل نوع من الأنسجة التي transfected؛ المصلي الفيروسي. المروج. معدل وحجم حقن. عدد الجسيمات حقن. injectate درجة الحموضة. وعما إذا كان الكواشف فرط، مثل مانيتول، استخدمت. 33،34 عادة، ونحن microinject 10 12 الجسيمات / مل، 1 ميكرولتر / الجانب أكثر من 10 دقيقة، والسماح 7 دقيقة إضافية قبل استبدال obturators. بالإضافة إلى ذلك، injectate عموما حول درجة الحموضة 8. التالي، وتبين لنا أن الدافع يمكن التلاعب بها من قبل أي من التعبير التحوير (الشكل 4)أو الدوائية microinjection كاشف (الشكل 5).

    في الشكل (4)، أعربنا عن مستقبلات مصمم المنشط حصريا من قبل مصمم المخدرات (DREADDs). وأعقب المنطقة الترميز مستقبلات DREADD قبل دخول موقع الريبوسوم الداخلية وكاسيت mCitrine. وmCitrine يسمح التصور مناسب من الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل. وقد رافق DREADD إلى heterotrimeric G-بروتين Gαq. تفعيل DREADD Gαq الديناميكي يمكن أن تحفز الخلايا النجمية، 28،35 وDREADD نفسها يمكن تفعيلها من خلال الإدارة الشاملة للكلوزابين-N-أكسيد (CNO، 3 ملغ / كغ، والملكية الفكرية). وقد تم تدريب 14،22،36 الجرذان ل رافعة تستجيب لتعزيز الايثانول، حيث حققت 3 المطابع رافعة 1 فرصة للشرب يوميا خلال جلسات ساعة 1 أكثر من 60 يوما متواصلة. بعد ذلك، اضطر الفئران إلى الامتناع عن ممارسة الجنس، وأعرب عن DREADDs Gαq الديناميكي في النواة المتكئة النجمية الأساسية. بعد 3 الامتناع الاسبوع، والدافع لADMI الذاتي وقد تم قياس nister الإيثانول عن طريق نقطة. 21،27-30 تفعيل النواة المتكئة النجمية الأساسية، عن طريق إدارة CNO النظامية، وانخفاض الدافع من الفئران لاستئناف الإيثانول الإدارة الذاتية بعد الامتناع عن ممارسة الجنس مقارنة مع السيارة. الأهم من ذلك، كان CNO أي تأثير في فوج المدربين على حد سواء أن كان يعبر عن البروتين الفلوري الأخضر بدلا من DREADD.

    figure-results-1
    الشكل 3. ممثل منطقة الجسم المخطط البطني transfected بفيروس microinjected. توضح هذه الصورة منطقة النواة المتكئة الخلايا النجمية التي و transfected باتباع الأسلوب أعلاه. وطبع البيانات من بول وآخرون 13 بإذن من صاحب حقوق الطبع والنشر. يمكن الاطلاع على التفاصيل في هذا المنشور والمواد التكميلية المرفقة.على بياض "> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

    figure-results-2
    تم تخفيض الرقم 4. الدافع من الفئران لإدارة الذات الايثانول من خلال تفعيل التحوير الذي كان الإفراط في المعبر عنها في النواة المتكئة النجمية الأساسية. تم microinjected الفيروسات والدافع قياس عبر نقطة بعد السماح أسبوع واحد للفيروس للتعبير. أعرب التحوير ومصمم مستقبلات المنشط حصريا من قبل مصمم المخدرات (DREADDs). A-اتجاه واحد ANOVA (F (2،30) = 3.29، P = 0.04) تليها شفيه بعد خاصة كشفت أن تفعيل DREADD من قبل الإدارة الشاملة للكلوزابين-N-أكسيد (CNO، 3 ملغ / كغ، والملكية الفكرية ) إلى خفض كبير في تحفيز الفئران لإدارة الذات الإيثانول بعد الامتناع عن ممارسة الجنس مقابل سيارة كان CNO أي تأثير في فوج المدربين على حد سواء أن كان يعبر عن البروتين الفلوري الأخضر (GFP) بدلا من DREADD. وطبع البيانات من بول وآخرون 13 بإذن من صاحب حقوق الطبع والنشر. يمكن الاطلاع على التفاصيل في هذا المنشور والمواد التكميلية المرفقة.

    figure-results-3
    الرقم 5. Microinjection من الفجوة حاصرات تقاطع زيادة الحافز من الفئران في تقرير المصير، إدارة الإيثانول بعد الامتناع عن ممارسة الجنس قيمت اثنين من حاصرات الفجوة تقاطع للتأثير على الدافع (قياس عبر نقطة) من الفئران في تقرير المصير، إدارة الإيثانول: ميفلوكين و18- ألفا glycyrrhetinic حمض (18-α). وكشفت ذات اتجاهين ANOVA التي Microinjection من حاصرات الفجوة تقاطع في النواة المتكئة زاد الأساسية الدافع من الفئران في تقرير المصير، إدارة الإيثانول بعد الامتناع عن ممارسة الجنس (F (3،40) = 5.56، P = 0.003). وطبع البيانات من بول وآخرون 13 بإذن من صاحب حقوق الطبع والنشر. يمكن الاطلاع على التفاصيل في هذا المنشور والمواد التكميلية المرفقة.

    المناقشة

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    الإجراء المقدمة هنا هو وسيلة فعالة لتصنيع حقنة عادية microinjection وmicroinjectors التي من شأنها أن تساعد في توضيح ركائز الجزيئية للسلوك دوافع. يوفر هذا الأسلوب عدة مزايا. أولا، من خلال تصنيع يزرع وmicroinjectors الخاصة واحد، والمعلمات التجريبية رواية يمكن أن يكون الأمثل بسرعة، أي واحدة لا تحتاج إلى الانتظار لمكونات العرف للوصول. ثانيا، نظرا لقطرها صغير من قنية، والمزيد من حقنة عادية يمكن زرعها في وقت واحد. هذا تقصير الوقت الجراحية المطلوبة، التي يمكن أن تحسن البقاء على قيد الحياة، ويسمح أيضا يزرع متعددة لكل حيوان. ثالثا، البرمجيات المستخدمة للتحكم في غرف استثابي يستوعب بسهولة جداول نسبة التقدمية منذ نسبة نموذج ثابت يمكن تحويلها بسرعة إلى نسبة التدريجي نموذج ببساطة عن طريق تطبيق قائمة المعلمة انتقال الحدث الذي يحتوي على جدول التعزيز المطلوب.

    أن تكونمفيدة على نطاق واسع، وعرضت إجراء microinjection العامة التي يجب أن تكون قابلة للتطبيق على نطاق واسع لMicroinjection من ما يقرب من أي كاشف المتاحة حاليا. وبالتالي، فإننا نتوقع أن هذه التقنية سوف تستمر في أن تكون ذات فائدة عالية مماثلة في المستقبل مع تعديلات طفيفة. عن طريق تغيير سوى عدد قليل من المتغيرات، وهذا النهج يمكن تطبيقها على عدد كبير من المواد الكيميائية. المعلمات التي من شأنها أن الأكثر شيوعا معالجته تشمل طول أن يبرز على microinjector من قنية، وحجم الحقن، ومعدل الحقن. على سبيل المثال، يمكن للمرء تريد حاقن لزيادة تبرز من طرف قنية لتجنب ندبة الدبقية التي تشكل عادة حوالي يزرع المزمنة. بالإضافة إلى ذلك، قد ترغب احدة لحقن حجم أكبر. لإبر دقيقة جدا الفيروس الجسم المخطط، وعادة ما تستخدم لحجم 1 ميكرولتر ويتم حقن هذا الحجم عادة على مدى فترة أطول من الزمن (في كثير من الأحيان 7-10 دقيقة بالإضافة إلى 3-10 دقيقة إضافية الوقت نشرها) مقارنة بما كان عليه استخدامد للمواد الدوائية (عادة 0،3-0،5 ميكرولتر أكثر من 2-3 دقيقة زائد 1-3 دقيقة وقت الانتشار إضافية). يجب على المستخدم أن تتشاور مع الأدب و / أو تجريبيا تحديد المعايير الأنسب لاحتياجاتهم. بغض النظر، فإن نجاح هذا الإجراء يعتمد بشكل حاسم على 4 المتغيرات: 1) طول قنية، 2) طول microinjector، 3) نوعية نمط الرش microinjector، و4) سلامة النظام قبل الحقن. لأن موقع microinjection يعتمد على عمق يبرز في microinjector من قنية، لا بد من أن كلا من حقنة عادية (الخطوة 1.2.8) وطول microinjector (آخر الانحناء، الخطوة 2.2.1) وكلاهما يعرف على وجه التحديد وموحدة بين جميع المواد الدراسية . هذا يمكن بسهولة أن يسيطر عليها بسهولة رفض أي تنفيذ هذا ليس هو طول المطلوب في النهائي إعادة القياس. وعلاوة على ذلك، لا يمكن توقع موقع الحقن في حال حدوثه على الفور تحت قنية دليل. وبالتالي، فإن أي microinjector أن ظبيةق تقم برش طويل، تيار غرامة على اختبار (خطوات 2.4.6) يجب رفضه. ويرتبط حقن الجودة أيضا لسلامة النظام قبل الحقن. إذا بعد الاستغناء عن المياه من حاقن (قبل ملء مع كاشف) لوحظت بقع متعددة على مسح المختبر، ثم يحتاج إلى تسرب لمعالجتها (ملاحظة على الخطوة 2.4.8). وعلاوة على ذلك، إذا كان فقاعة (الخطوة 2.4.9) الذي يفصل الدواء من الماء في أنابيب PE20 ليست واحدة، فقاعة واحدة (بعد ملء microinjector مع كاشف)، ومن ثم انسداد حاقن جزئيا. هذا تسد إما أن يمنع أو يحول الحقن. هذا أيضا يمكن معالجتها بسهولة (ملاحظة على الخطوة 2.4.8).

    ينبغي للمرء أن ترغب في microinject في حين أن الحيوان هو في إطار التجسيمي هناك ثلاثة بدائل. أولا، يمكن للمرء أن زيادة طول طوق microinjector بحيث يمكن عقد بحزم إلى جانب تتلاعب التجسيمي، وكذلك تمديد بعيدا بما فيه الكفاية للسماح للاتصال PE20 أنابيب. ثانيا، علىه يمكن زرع زمنيا قنية واستخدام microinjector القياسية المعروضة هنا. ثالثا، يمكن للمرء أن استخدام المرسومة، والماصات الزجاج المصقول. 16،17

    وجود قيود كبير من الإجراء المقدمة هنا هو أن أفضل أجريت في الفئران التعامل معها بشكل جيد والتي هم على دراية الإجراء. الفئران المستخدمة للبيانات الموضحة في قسم النتائج المطلوبة أي إجراءات معالجة خاصة لنفس محقق التعامل مع الفئران على أساس يومي لأكثر من 2 أشهر. وشملت هذه الملاحظة اليومية والتلاعب في عملية الزرع الجراحي لمدة 2 أسابيع على الأقل. ومع ذلك، الفئران يمكن اعتادوا بسرعة عن طريق عدد من التقنيات التي تستخدم لقبل قبل نبض تثبيط الفحص، التي يمكن أن تتأثر الإجهاد. تم هذه التقنيات التعود الخاصة مفصل بشكل جيد في السابق. 43 وبالإضافة إلى هذه الإجراءات، فإنه من المستحسن أن الفئران أن تعود على الإجراء microinjection حيث يتم استخدام microinjectors تقصير دوحلقة حقن "صورية". خلال هذه الحقن الشام، فمن الأهمية بمكان أن microinjector لا تبرز في الأنسجة من أجل الحد من تلف الأنسجة. وبعبارة أخرى، يجب أن تكون عازمة على microinjector لم يعد من 14 ملم. وهكذا، فإن التعود شامل اللازمة لتنفيذ الأمثل لهذه التقنية يمكن أن ينظر إليه القيد.

    ورغم وجود العديد من النماذج السلوكية لقياس الدافع، يتم استخدام نسبة التقدمية عادة لقياس جهد أن هذا الموضوع هو على استعداد لبذل للحصول على معزز. وتدريجيا نسبة نموذج تنتج قدرا تعرف باسم نقطة، والتي غالبا ما تعرف بأنها أقصى عدد من المطابع رافعة في نسبة الانتهاء الماضية؛. أي القصوى الاستجابة التي ولدت معزز 21 ونسبة التقدمية حساسة للمعزز الحجم. على سبيل المثال، أعلى الكوكايين (أو السكروز) جرعات ينتج نقطة توقف ارتفاع وانخفاض الكوكايين (أو السكروز) جرعات تسفر عن breakp أقلoint. 21،22 وبناء على ذلك، توقف هو وكيل تستخدم بشكل روتيني لالدافع و / أو تعزيز الفعالية. 21،23-26 لأن القصد من نقطة هي لتحديد متى يتوقف الحيوان الاستجابة، معلمة هامة من نسبة التقدمية النموذج هو طول الدورة. يمكن أطوال جلسة محدود وضع غطاء زائف على القيم نقطة توقف وهذا يمكن أن تتفاقم كل العلاجات السابقة التي تقلل بشكل غير طبيعي معدل الإدارة الذاتية أو أن التوقف زيادة ما بعد التعزيز. هذا الخلط يمكن التغلب على أي عدد من النهج؛. على سبيل المثال، جلسات العمل التي تنتهي عند حجب الحيوان الاستجابة من قبل بعض متعددة من متوسط ​​الفترة الفاصلة بين ضخ 44 A البديل أكثر تطبق عادة لهذا النهج هو إنهاء جلسات عمل مرة واحدة الاستجابة له تم حجب بعض قيمة محددة تجريبيا، والذي يقام ثابت عبر المواضيع. قدمنا ​​طريقة لتطبيق هذا النهج في الخطوة 4.4.9.11.

    الإفصاحات

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    لا يوجد لدى أي من المؤلفين مصالح متنافسة أو متضاربة.

    شكر وتقدير

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    MSB مدعومة من قبل مؤسسة البحوث الطبية للمشروبات الكحولية ، وجائزة مركز البحوث الانتقالية (UL1 TR000058) ، والمعاهد الوطنية لتعاطي الكحول وإدمان الكحول (P50 AA022537) ، وصناديق بدء التشغيل التي يوفرها الصندوق الاستئماني لمعدات التعليم العالي في فرجينيا وكلية الطب بجامعة فرجينيا كومنولث كومنولث.

    المواد

    قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
    الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
    أنابيب القنيةتوريد أمازون / أجزاء صغيرةHTXX-26T-6026 جم ، Hypotube S / S 316-TW 26GA
    ObturatorAmazon Supply / أجزاء صغيرةGWXX-0080-30-0533 مقياس ، سلك S / S 316LVM 0.008 IN
    سلك حاقن دقيقMicroGroup33RW 30433 مقياس
    Super GlueLoctite3924ACسائل ، غير هلامي ، يمكن تعقيمه
    حاقن دقيق أنابيب بلاستيكيةبيكتون ديكسون427406PE20
    الوزن Hemostatsأدوات الدقة العالمية501241-G
    حاكمفيشر09-016150 مم
    # 7 ملقطStoelting52100-77Dumont ، Dumostar
    Rotary ToolDremmel285قرص قطع بسرعتين
    McMaster Carr360215/16 "× 0.025"
    مضخة الحقن الدقيقهارفارد جهازدكتوراه 2000
    1ul حقنة زجاجيةهاميلتون7001KHنمط الإبرة: 25 ثانية / 2.75 بوصة / 3
    قطني مائلفيشر23-400-101
    مناديل مختبرKimwipes34133
    برنامج عاملكولبورنالرسم الدولة
    المشغلة الغرفكولبورونهابيتست
    متوسط قضيب

    المراجع

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
    1. Koob, G. F., Volkow, N. D. Neurocircuitry of addiction. Neuropsychopharmacology. 35 (1), 217-238 (2010).
    2. Kalivas, P. W., Peters, J., Knackstedt, L. Animal models and brain circuits in drug addiction. Mol Interv. 6 (6), 339-344 (2006).
    3. Bossert, J. M., Marchant, N. J., Calu, D. J., Shaham, Y. The reinstatement model of drug relapse: recent neurobiological findings, emerging research topics, and translational research. Psychopharmacology (Berl). 229 (3), 453-476 (2013).
    4. Connor, E. C., Chapman, K., Butler, P., Mead, A. N. The predictive validity of the rat self-administration model for abuse liability). Neurosci Biobehav Rev. 35 (3), 912-938 (2011).
    5. Watson, D. J., et al. Selective blockade of dopamine D3 receptors enhances while D2 receptor antagonism impairs social novelty discrimination and novel object recognition in rats: a key role for the prefrontal cortex. Neuropsychopharmacology. 37 (3), 770-786 (2012).
    6. Takahashi, A., Shimamoto, A., Boyson, C. O., DeBold, J. F., Miczek, K. A. GABA(B) receptor modulation of serotonin neurons in the dorsal raphe nucleus and escalation of aggression in mice. J Neurosci. 30 (35), 11771-11780 (2010).
    7. Spencer, R. C., Klein, R. M., Berridge, C. W. Psychostimulants act within the prefrontal cortex to improve cognitive function. Biol Psychiatry. 72 (3), 221-227 (2012).
    8. Bowers, M. S., et al. Activator of G protein signaling 3: a gatekeeper of cocaine sensitization and drug seeking. Neuron. 42 (2), 269-281 (2004).
    9. Abudara, V., et al. The connexin43 mimetic peptide Gap19 inhibits hemichannels without altering gap junctional communication in astrocytes. Front Cell Neurosci. 8, 306(2014).
    10. Cahill, E., et al. D1R/GluN1 complexes in the striatum integrate dopamine and glutamate signalling to control synaptic plasticity and cocaine-induced responses. Mol Psychiatry. 19 (12), 1295-1304 (2014).
    11. McFarland, K., Kalivas, P. W. The circuitry mediating cocaine-induced reinstatement of drug-seeking behavior. J Neurosci. 21 (21), 8655-8663 (2001).
    12. Fuchs, R. A., Branham, R. K., See, R. E. Different neural substrates mediate cocaine seeking after abstinence versus extinction training: a critical role for the dorsolateral caudate-putamen. J Neurosci. 26 (13), 3584-3588 (2006).
    13. Ebersberger, A. Physiology of meningeal innervation: aspects and consequences of chemosensitivity of meningeal nociceptors. Microsc Res Tech. 53 (2), 138-146 (2001).
    14. Netter, F. H. Musculoskeletal System Part I: Anatomy; Physiology, and Metabolic Disorders. 8, 1st ed, CIBA-Geigy. Summit, New Jersey. (1987).
    15. Ferguson, S. M., Eskenazi, D., Ishikawa, M., Wanat, M. J., Phillips, P. E., Dong, Y., Roth, B. L., Neumaier, J. F. Transient neuronal inhibition reveals opposing roles of indirect and direct pathways in sensitization. Nat Neurosci. 14 (1), 22-24 (2011).
    16. Gonzalez-Perez, O., Guerrero-Cazares, H., Quinones-Hinojosa, A. Targeting of deep brain structures with microinjections for delivery of drugs, viral vectors, or cell transplants. J Vis Exp. (46), (2010).
    17. Inquimbert, P., Moll, M., Kohno, T., Scholz, J. Stereotaxic injection of a viral vector for conditional gene manipulation in the mouse spinal cord. J Vis Exp. (73), (2013).
    18. Schier, C. J., Mangieri, R. A., Dilly, G. A., Gonzales, R. A. Microdialysis of ethanol during operant ethanol self-administration and ethanol determination by gas chromatography. J Vis Exp. (67), (2012).
    19. Fornari, R. V., et al. Rodent stereotaxic surgery and animal welfare outcome improvements for behavioral neuroscience. J Vis Exp. (59), e3528(2012).
    20. Geiger, B. M., Frank, L. E., Caldera-Siu, A. D., Pothos, E. N. Survivable stereotaxic surgery in rodents. J Vis Exp. (20), e880(2008).
    21. Richardson, N. R., Roberts, D. C. Progressive ratio schedules in drug self-administration studies in rats: a method to evaluate reinforcing efficacy. J Neurosci Methods. 66 (1), 1-11 (1996).
    22. Cheeta, S., Brooks, S., Willner, P. Effects of reinforcer sweetness and the D2/D3 antagonist raclopride on progressive ratio operant performance. Behav Pharmacol. 6 (2), 127-132 (1995).
    23. Roberts, D. C., Morgan, D., Liu, Y. How to make a rat addicted to cocaine. Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry. 31 (8), 1614-1624 (2007).
    24. Arnold, J. M., Roberts, D. C. A critique of fixed and progressive ratio schedules used to examine the neural substrates of drug reinforcement. Pharmacol Biochem Behav. 57, 441-447 (1997).
    25. Hodos, W. Progressive ratio as a measure of reward strength. Science. 134 (3483), 943-944 (1961).
    26. Depoortere, R. Y., Li, D. H., Lane, J. D., Emmett-Oglesby, M. W. Parameters of self-administration of cocaine in rats under a progressive-ratio schedule. Pharmacol Biochem Behav. 45 (3), 539-548 (1993).
    27. Bowers, M. S., et al. Nucleus accumbens AGS3 expression drives ethanol seeking through G betagamma. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (34), 12533-12538 (2008).
    28. Bull, C., et al. Rat Nucleus Accumbens Core Astrocytes Modulate Reward and the Motivation to Self-Administer Ethanol after Abstinence. Neuropsychopharmacology. 39 (12), 2835-2845 (2014).
    29. Hopf, F. W., Chang, S. J., Sparta, D. R., Bowers, M. S., Bonci, A. Motivation for alcohol becomes resistant to quinine adulteration after 3 to 4 months of intermittent alcohol self-administration. Alcohol Clin Exp Res. 34 (9), 1565-1573 (2010).
    30. Hopf, F. W., et al. Reduced nucleus accumbens SK channel activity enhances alcohol seeking during abstinence. Neuron. 65 (5), 682-694 (2010).
    31. Salerni, C. M. Engineering Adhesives for Repeated Sterilization. , Henkel. Available from: http://www.henkelna.com/us/content_data/99736_Engineering_Adhesives_for_Repeated_Sterilization.pdf (2015).
    32. Gundersen, H. J., Jensen, E. B. The efficiency of systematic sampling in stereology and its prediction. J Microsc. 147 (Pt 3), 229-263 (1987).
    33. Mastakov, M. Y., Baer, K., Xu, R., Fitzsimons, H., During, M. J. Combined injection of rAAV with mannitol enhances gene expression in the rat brain. Mol Ther. 3 (2), 225-232 (2001).
    34. Burger, C., Nguyen, F. N., Deng, J., Mandel, R. J. Systemic mannitol-induced hyperosmolality amplifies rAAV2-mediated striatal transduction to a greater extent than local co-infusion. Mol Ther. 11 (2), 327-331 (2005).
    35. Agulhon, C., et al. Modulation of the autonomic nervous system by acute glial cell Gq-GPCR activation in vivo. J Physiol. 591 (22), 5599-5609 (2013).
    36. Armbruster, B. N., Li, X., Pausch, M. H., Herlitze, S., Roth, B. L. Evolving the lock to fit the key to create a family of G protein-coupled receptors potently activated by an inert ligand. PNAS. 104 (12), 5163-5168 (2007).
    37. Cruikshank, S. J., et al. Potent block of Cx36 and Cx50 gap junction channels by mefloquine. PNAS. 101 (33), 12364-12369 (2004).
    38. Miguel-Hidalgo, J., Shoyama, Y., Wanzo, V. Infusion of gliotoxins or a gap junction blocker in the prelimbic cortex increases alcohol preference in Wistar rats. J Psychopharmacol. 23 (5), 550-557 (2008).
    39. Bowers, M. S., Lake, R. W., Rubinchik, S., Dong, J. Y., Kalivas, P. W. Elucidation of Homer 1a function in the nucleus accumbens using adenovirus gene transfer technology. Ann N Y Acad Sci. 1003, 419-421 (2003).
    40. Mackler, S. A., et al. NAC-1 is a brain POZ/BTB protein that can prevent cocaine-induced sensitization in the rat. J Neurosci. 20 (16), 6210-6217 (2000).
    41. Geyer, M. A., Swerdlow, N. R. Measurement of startle response, prepulse inhibition, and habituation. Curr Protoc Neurosci. 8, Unit 8.7(2001).
    42. Bedford, J. A., Bailey, L. P., Wilson, M. C. Cocaine reinforced progressive ratio performance in the rhesus monkey. Pharmacol Biochem Behav. 9 (5), 631-638 (1978).

    إعادة الطباعة والأذونات

    طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

    طلب إذن

    الوسوم

    مقالات ذات صلة