الميكروية مزدوجة الماسورة والمركزة لقياس خارج الخلية ايون إشارات في أنسجة المخ

ملخص

< p class = 'jove_content'> نثبت تصنيع ومعايرة وخصائص نوعين من الأقطاب الكهربائية الدقيقة الانتقائية للأيونات (مزدوجة الماسورة ومتحدة المركز) لقياس تركيزات الأيونات في أنسجة المخ. ثم يتم استخدامها في تحضير شريحة الحصين للفأر لإظهار أن النشاط الاستثاري يغير تركيزات البوتاسيوم والصوديوم خارج الخلية.

الملخص

يصاحب النشاط الكهربائي في الدماغ تدفقات أيونية كبيرة عبر الأغشية ، مما يؤدي إلى تغيرات معقدة في التركيز خارج الخلية لجميع الأيونات الرئيسية. نظرا لأن هذه التحولات الأيونية تحمل عواقب وظيفية كبيرة ، فغالبا ما يكون تحديدها الكمي مطلوبا لفهم وظيفة الشبكات العصبية واختلالها في ظل الظروف الفسيولوجية والفيزيولوجية المرضية. في هذه الدراسة ، نوضح تصنيع ومعايرة الأقطاب الكهربائية الدقيقة الانتقائية للأيونات مزدوجة الماسورة ، والتي أثبتت أنها أدوات ممتازة لمثل هذه القياسات في أنسجة المخ. علاوة على ذلك ، يتم أيضا وصف ما يسمى بالأقطاب الكهربائية الدقيقة الانتقائية للأيونات "متحدة المركز" ، والتي ، بناء على تصميمها المختلف ، توفر دقة زمنية أفضل بكثير للتغيرات السريعة في الأيونات. ثم نوضح كيف يمكن استخدام هذه الأقطاب الكهربائية في مستحضرات شرائح الدماغ الحادة لحصين الفأر. باستخدام أقطاب كهربائية دقيقة مزدوجة الماسورة وانتقائية للبوتاسيوم ، يتم إظهار التغيرات في تركيز البوتاسيوم خارج الخلية ([K ⁺]_o) استجابة للتطبيق الخارجي لناهضات مستقبلات الغلوتامات أو أثناء نشاط الصرع. علاوة على ذلك ، نوضح خصائص استجابة الأقطاب الكهربائية الحساسة للصوديوم ، مزدوجة الماسورة ومتحدة المركز ونقارن اكتشافها للتغيرات في تركيز الصوديوم خارج الخلية ([Na ⁺] _o) الناتجة عن تطبيق الحمام أو الضغط للأدوية. تظهر هذه القياسات أنه في حين أن اتسعات الاستجابة متشابهة ، فإن أقطاب الصوديوم الدقيقة متحدة المركز تعرض نسبة إشارة إلى ضوضاء ووقت استجابة فائق مقارنة بالتصميم مزدوج الأسطوانة. بشكل عام ، ستكون الإجراءات المثبتة قابلة للتحويل بسهولة لقياس أنواع الأيونات الأخرى ، بما في ذلك الأس الهيدروجيني أو الكالسيوم ، وستكون قابلة للتطبيق أيضا على المستحضرات الأخرى.

المقدمة

تعتمد الإشارات الكهربائية في الدماغ على تدفق الأيونات عبر أغشية البلازما. لا يتم التوسط في حركات الأيونات الرئيسية داخل وإلى الفضاء خارج الخلية فقط عن طريق المرور عبر القنوات الأيونية ذات الجهد الكهربائي ، ولكن أيضا عن طريق المستقبلات الموجهة للأيونات بعد المشبكي وكذلك ناقلات الأيونات. وبالتالي ، فإن النشاط العصبي مصحوب بتغيرات معقدة في التركيز خارج الخلية لجميع الأيونات الرئيسية ¹. على سبيل المثال ، ثبت أن تدفق الصوديوم إلى الخلايا العصبية أثناء النشاط المثير يؤدي إلى انخفاض في تركيز الصوديوم خارج الخلية ([Na ⁺]_o) ². وينطبق الشيء نفسه على تركيز الكالسيوم خارج الخلية لأن أيونات الكالسيوم تدخل بسرعة في كل من الهياكل قبل وبعد ^{المشبكي 3}. في الوقت نفسه ، يتحرك البوتاسيوم في الاتجاه المعاكس وهذا يتوسط في زيادة تركيز البوتاسيوم خارج الخلية ([K ⁺]_o) في نطاق mM المنخفض ^4,5. يتسبب النشاط المشبكي أيضا في حدوث تغيرات في درجة الحموضة خارج الخلية يتم تخفيفها جزئيا عن طريق تدفقات الغشاء الدبقي المصاحبة التي تغير درجة الحموضة داخل الخلايا ^{الدبقية 6،7}. هذه التغييرات المرتبطة بالنشاط في تركيزات الأيونات خارج الخلية لها عواقب وظيفية كبيرة. على سبيل المثال ، حتى الزيادات الصغيرة في [K ⁺] _o تزيل استقطاب الخلايا العصبية وكذلك الخلايا الدبقية وبالتالي تغير استثارة الخلايا العصبية ، وتوجد العديد من الآليات لإزالة البوتاسيوم ^{الزائد 8}. قد يؤدي فشل هذه إلى نشاط الصرع للخلايا العصبية أو ظواهر مثل انتشار الاكتئاب ¹.

نظرا لأهميتها الحاسمة ، غالبا ما يكون التحديد الكمي لتركيزات الأيونات خارج الخلية ضروريا ومطلوبا لفهم وظيفة وخلل الشبكات العصبية في ظل الظروف الفسيولوجية والفيزيولوجية المرضية. لعقود من الزمان ، أثبتت الأقطاب الكهربائية الدقيقة الانتقائية للأيونات مزدوجة الماسورة أنها أدوات ممتازة لمثل هذه القياسات في أنسجة المخ ⁹. بالنسبة للعديد من الأيونات ، تتوفر أجهزة استشعار عالية التحديد ذات تفاعل متقاطع منخفض للأيونات الأخرى. بالإضافة إلى الأقطاب الكهربائية الكلاسيكية ذات الماسورة المزدوجة ، تم مؤخرا إدخال ما يسمى بالأقطاب الكهربائية متحدة المركز. يوفر هذا الأخير دقة زمنية فائقة ، ولكن يستغرق مزيدا من الوقت والجهد لبناء ¹⁰.

في ما يلي ، سنصف تحضير ومعايرة هذين النوعين من الأقطاب الكهربائية الدقيقة الانتقائية للأيونات. ثم نوضح كيف يمكن استخدام هذه الأقطاب الكهربائية في مستحضرات شرائح الدماغ لقياس التغيرات في [K ⁺] _o أو [Na ⁺] _o الناجم عن النشاط المثير بعد نماذج التحفيز المختلفة بما في ذلك تطبيق الاستحمام والضغط للأدوية.

البروتوكول

وقد أجريت هذه الدراسة بما يتفق تماما مع المبادئ التوجيهية المؤسسية للهاينريش هاينه جامعة دوسلدورف، ألمانيا، فضلا عن توجيه الجماعة الأوروبية المجلس (86/609 / EEC). وقد أبلغت جميع التجارب لوالموافقة عليها من قبل مكتب رعاية الحيوان في مرفق رعاية الحيوان واستخدام هاينريش هاينه جامعة دوسلدورف، ألمانيا (عدد الفعل المؤسسي: O52 / 05). وفقا لقانون رعاية الحيوان الألمانية (Tierschutzgesetz، المادتين 4 و 7)، وكان لا موافقة رسمية إضافية لإزالة ما بعد الوفاة من أنسجة المخ اللازمة.

1. إعداد مزدوجة الماسورة-الميكروية ايون انتقائية

1. إعداد اثنين من الشعيرات الدموية الزجاج البورسليكات مع خيوط: واحد يبلغ طوله 7.5 سم وقطرها الخارجي من 1.5 ملم إلى استخدامها للبرميل حساسة ليثيوم أيون، واحد يبلغ طوله 6.5 سم وقطرها الخارجي من 1.0 ملم لاحقا إشارة برميل.
2. تنظيف capil laries في الأسيتون لمدة 12 ساعة ثم شطف عدة مرات مع القيمة المطلقة. الإيثانول والسماح لهم الجافة. ويمكن الآن أن يتم تخزين الأقطاب في مجفف.
3. استخدام الغراء ثنائي مكون أو شريط صغير من رقائق الألومنيوم لإصلاح طويلة وقصيرة معا الشعرية عند كلا الطرفين. تسخين-الشعرية مزدوج في فرن عند 60 درجة مئوية لمدة 1 ساعة. هذا يسرع عملية الشفاء. تخزين الأقطاب الآن في مجفف.
4. توسيط المزدوج الشعرية في مجتذب العمودي مع تشاك revolvable. تسخين لفائف بلطف حتى الزجاج لينة بما يكفي للسماح تناوب الأفقي للتشاك revolvable بنسبة 180 درجة. خلال هذه الخطوة، ومنع استطالة الشعرية مع الساندة تحت ظرف.
5. بعد التبريد، وإزالة كسر الميكانيكية وتطبيق بروتوكول التدفئة الثاني لسحب الشعيرات الدموية، مما يؤدي إلى اثنين حادة، الشعيرات الدموية مزدوجة الماسورة (الشكل 1). يجب أن يكون قطر الحافة المزدوج الشعرية مقرب من 1 ميكرون.

ve_content ">
الشكل 1. العمارة من الميكروية ايون انتقائية. (A) صورة لمسرى مكروي مزدوجة الماسورة. لأغراض التوضيح وتحسين الرؤية، وملون السائل داخل برميل المرجعية. (B) صورة لمسرى مكروي متحدة المركز والقطب المرجعية المقابلة. يظهر غيض من مسرى مكروي متحدة المركز الموسع في يساره. في (A) و (B)، والحيز الذي تشغله استشعار أيون في نصائح من الماصات هو آخر الألوان. في الجزء السفلي، ويظهر الترتيب غيض من كلا النوعين القطب تخطيطي. انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

6. إذا مجتذب العمودي مع تشاك revolvable غير متوفر، وإعداد الماسورة انقر نقرا مزدوجا ايون SELECTIVE مسرى مكروي في مجتذب الأفقي باستخدام ثيتا الزجاج.
   1. تحقيقا لهذه الغاية، وسحب ثيتا الزجاج (القطر الخارجي من 1.5 ملم، وطول 7.5 سم) لينتج في قطبين بهدفين لكل برميل. علامة واحدة منها لتكون بمثابة برميل الرجوع إليه لاحقا. Silanized الآخر على غرار الإجراء الموضح أدناه لتكون بمثابة ايون انتقائية برميل في المستقبل.
      ملاحظة: على الرغم من إعداد أقطاب ثيتا زجاج مزدوجة الماسورة هو أسهل بكثير من إعداد أقطاب مزدوجة الماسورة الملتوية، هم أكثر عرضة للعمل المتبادل بين كلا برميل كما رقيقة الجدار الزجاجي الفاصل بينهما يميل إلى أن يكون مسامية في أقصى طرف بهم.
      ملاحظة: نظرا لأن كوكتيل الاستشعار (انظر أدناه) هو مسعور، والسطح الداخلي للحساسية ايون لاحق برميل يجب تقديم مسعور وكذلك عن طريق عملية تسمى silanization. لهذا، ويستخدم hexamethyldisilazane (HMDS) (الشكل 2) كما هو موضح في الخطوة التالية.

الشكل 2. Silanization من الماصات. (A) Hexamethyldisilazane (HMDS) يتفاعل مع مجموعة سي-OH من سطح الزجاج الداخلي ويجعلها مسعور. (B) وتظهر الصورة اليسرى وحدة silanization بأكملها. يتم وضع زجاجة واسعة الفم التي تحتوي على HMDS على رأس لوحة التدفئة وضعت في 40 ° C. على رأس الزجاجة، هي التي شنت حامل (PH) تحمل الشعيرات الدموية (كاب). وتظهر الصورة الصحيحة لتوسيع حامل ماصة (PH) تحمل الشعيرات الدموية (كاب). (C) عرض الجانب التخطيطي لأصحاب ماصة حسب الطلب (PH) ل(يمين) الشعيرات الدموية مزدوجة الماسورة (يسار) أو متحدة المركز (كاب)، والتي شنت على زجاجة واسعة الفم. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

7. فقط قبل بوأقطاب lling، وملء تقريبا. 20 مل HMDS في زجاجة واسعة الفم. انتباه: HMDS للاستخدام في غطاء الدخان فقط، الأبخرة الخطرة على الصحة! إغلاق زجاجة ووضعها على لوحة التدفئة، مسبقا إلى 40 درجة مئوية. سخن الفرن، وضعت تحت غطاء محرك السيارة وكذلك، ما يصل إلى 200 ° C.
8. ملء برميل إشارة إلى طرفها مع الماء المقطر لمنع silanization من خلال الإجراء التالي.
9. وضعت الشعرية مزدوجة الماسورة مع طرفها حتى على خاص، حسب الطلب حامل (الشكل 2B، 2C). نهاية مفتوحة حادة يجب أن تصل بحرية من خلال الجزء السفلي من حامل (الشكل 2C، يسار). بعد ذلك، ضع هذا حامل على زجاجة الفم واسعة تحتوي على HMDS قبل استعد لمدة 70 دقيقة.
   ملاحظة: تأكد من أن HMDS بخار يمكن أن تتدفق من خلال الشعيرات الدموية بحرية. خلال عملية silanization واحد، و20 مل من HMDS لا تتبخر تماما، ويمكن بالتالي زجاجة للاستخدام عدة مرات.
10. Afterwarس، ونقل الشعيرات الدموية إلى حامل معدني وإلى الفرن المسخن مسبقا لمدة ساعة. هذا وسوف تجف على حد سواء برميل.
11. بعد silanization، والحفاظ على الشعيرات الدموية الجافة حتى استخدامها. في حين أن الإجراء السابق يتطلب حوالي 3.5 ساعة في المجموع، الأقطاب الكهربائية يمكن الآن المخزنة في مجفف لعدة أسابيع.
12. في يوم من استخدامها التجريبية، وإعداد أقطاب ايون انتقائية عن طريق ملء غيض من برميل silanized مع 1-2 ميكرولتر من ايون انتقائية استشعار (الشكل 1A). لالميكروية حساسة والبوتاسيوم، استخدم valinomycin الناقل؛ والميكروية الحساسة الصوديوم، استخدام ETH 157 والناقل.
13. لاحظ أن أجهزة الاستشعار ايون الانتقائي هو لزج جدا مما يجعل من الصعب على طرف لملء بشكل صحيح.
14. ملء برميل المرجعية مع المياه المالحة HEPES مخزنة (انظر أدناه).
    ملاحظة: على الرغم أخرى، أكثر بساطة ايزو الاسموزي المالحة يمكن أن تستخدم أيضا، ونحن نفضل استخدام المياه المالحة تكوين الذي يشبه أساسا لالمالحة التروية (ACSF، انظر 3.6)، لأنه قد يتسرب ويتغلغل في الأنسجة أثناء التجارب. وبالتالي، فمن الضروري أيضا أن هذا المالحة لا يحتوي على تركيز أعلى من أيونات يتم تحديدها من ACSF المستخدمة.
15. الردم أجهزة الاستشعار مع المياه المالحة التي تحتوي على نسبة عالية من أيون ليتم الكشف. وهكذا، الردم أجهزة الاستشعار مع 100 ملي كلوريد الصوديوم المالحة (لالميكروية الحساسة الصوديوم) أو 100 ملي بوكل (لالميكروية الحساسة البوتاسيوم). تأكد من عدم إدراج فقاعات الهواء إضافية خلال هذا الإجراء.
16. وإذا كانت silanization ناجحة ويتم تعبئة استشعار بشكل صحيح، ومراقبة سطح جهاز الاستشعار تشكيل سطح مقعر واضحة للعيان ضد الردم (الشكل 1A). خلاف ذلك، واستشعار قد تراجع من جدار الشعيرات الدموية ولن يتم شغل الحافة. وهذه الأقطاب لا تكون وظيفية.
17. إدراج الأسلاك الفضة المكلورة في كل من برميل (يجب الحرص على عدم لمس صنسور) وختم كل برميل بالشمع الأسنان (الشكل 1A).

2. الميكروية إعداد المركزة ايون انتقائية

1. للبرميل الخارجي، واستخدام الزجاج الشعيرات الدموية رقيقة الجدران مع خيوط (القطر الخارجي 2.0 ملم) وبطول 7.5 سم. للبرميل الداخلي، واتخاذ الشعيرات الدموية رقيقة الجدران مع خيوط، القطر الخارجي من 1.2 ملم وبطول 10 سم.
2. تنظيف الشعيرات الدموية في الأسيتون لمدة 12 ساعة. ثم شطف عدة مرات مع القيمة المطلقة. الإيثانول والسماح لهم الجافة. ويمكن الآن أن يتم تخزين الأقطاب في مجفف.
3. ملء تقريبا. 20 مل HMDS في زجاجة واسعة الفم. الحذر! HMDS للاستخدام في غطاء الدخان فقط، الأبخرة الخطرة على الصحة. إغلاق زجاجة ووضعها على لوحة التدفئة، مسبقا إلى 40 درجة مئوية. سخن الفرن، وضعت تحت غطاء محرك السيارة وكذلك، ما يصل إلى 200 ° C.
4. إدراج 2.0 ملم الشعرية في مجتذب الأفقي والخروج به أن يؤدي إلى الشعيرات الدموية مع التناقص التدريجي قصيرة وديامي طرفثالثا من ~ 4 ميكرومتر (الشكل 1B).
5. وضع سحبت من 2.0 ملم الشعرية مع طرفها حتى على من صنع العرف، حامل خاص (الشكل 2B، الشكل 2C) بحيث تفتح نهايته حادة إلى تجويف زجاجة (الشكل 2C، يمين). وضع بعد ذلك هذا حامل على زجاجة الفم واسعة تحتوي على HMDS قبل استعد لمدة 70 دقيقة. تأكد من أن HMDS بخار يمكن أن تتدفق من خلال جميع الشعيرات الدموية.
6. بعد ذلك، نقل الشعيرات الدموية إلى حامل معدني وإلى الفرن المسخن مسبقا لمدة ساعة.
7. بعد silanization، والحفاظ على الشعيرات الدموية الجافة حتى استخدامها. في حين أن الإجراء السابق يتطلب حوالي 3.5 ساعة في المجموع، وتخزين الآن الأقطاب في مجفف لعدة أسابيع.
8. فقط قبل الاستخدام، وملء كمية صغيرة من أجهزة الاستشعار (0.2 ميكرولتر) في الشعرية silanized (الشكل 1B).
9. لإعداد الشعرية الداخلي، اضافة الى وجود الشعرية قطرها صغير في مجتذب وسحب ليؤدي إلى اثنينالشعيرات الدموية مع التناقص التدريجي طويلة ونصائح حادة (الشكل 1B). ملء مع 100 ملي كلوريد الصوديوم (الميكروية الحساسة الصوديوم) أو 100 ملي بوكل (الميكروية الحساسة البوتاسيوم) المالحة.
10. وضع مليئة أجهزة الاستشعار ومليئة المالحة الشعرية مباشرة في خط مع بعضها البعض على سدادة بناء العرف من coverslips. تضاف الشعرية أصغر وسيلة قصيرة في شعري أكبر.
11. إصلاح الشعيرات الدموية على ساترة آخر باستخدام الصلصال، ونقل إلى مرحلة المجهر وتصور باستخدام التكبير 100X. مع مساعدة من قضيب من الزجاج هي التي شنت على micromanipulator وتحويل دفع غرامة من مرحلة المجهر، تقدم ببطء الشعرية الخارجي على شعري الداخلي حتى المسافة بين أطرافها هي تقريبا 5 ميكرون (الشكل 1B).
12. إصلاح نهاية مفتوحة للالشعرية الخارجي على شعري الداخلي باستخدام الشمع الأسنان. بدلا من ذلك، وتطبيق قطرة صغيرة من cyanoacrylate (مجنون الغراء) الإضافيةtead من الشمع.
    ملاحظة: سيتم إضافة قطرات صغيرة من الماء تتبلمر الغراء وإصلاح الأقطاب في المكان. إدراج سلك الفضة المعالجة بالكلور في برميل الداخلي وختم عليه بالشمع الأسنان (الشكل 1B).
13. لإعداد القطب إشارة، وإلقاء شعري 7.5 سم طويل مع خيوط ويبلغ قطرها الخارجي من 1.5 ملم وسحب مع مجتذب العمودي. تأكد من أن النصائح هي طويلة نسبيا ولكن ليس حاد جدا (نصيحة قطر ~ 1 ميكرون).
14. تجاهل ماصة العليا، افتح أقل تشاك ورفع أقل ماصة بنحو 5 مم. إغلاق تشاك مرة أخرى ورفعه حتى غيض من القطب السفلي يتوضع حوالي 5 مم فوق لفائف التدفئة. تسخين الملف واستخدام ملقط لثني طرف بنحو 45 درجة إلى الجانب. ماصة أقل حوالي 1-2 ملم. الانحناء مرة أخرى بنحو -45 درجة إلى توجيه نصيحة إلى الوراء بالتوازي مع رمح الرئيسي (الشكل 1B). هذا الإجراء ضروري لتمكين المواقع بالقرب من غيض من refereالامتحانات التنافسية الوطنية القطب إلى القطب متحدة المركز.
15. ملء برميل المرجعية مع المياه المالحة HEPES مخزنة (انظر أدناه)، اضافة الى وجود أسلاك الفضة المعالجة بالكلور وختم برميل بالشمع الأسنان (الشكل 1B).

3. ملاحات

1. إعداد المالحة لالردم من الأقطاب الكهربائية الحساسة البوتاسيوم (انظر 1.15) تتكون من 100 ملي بوكل. ويتكون محلول ملحي لالردم من الأقطاب الكهربائية الحساسة sodium- من 100 ملي كلوريد الصوديوم.
2. إعداد المالحة لالردم البراميل المرجعية (. المالحة HEPES مخزنة، راجع 1.16) يتكون من (مم): 125 كلوريد الصوديوم، و 2.5 بوكل، 2 CaCl _2، 2 MgSO _4، 1.25 ناه ₂ PO _4، و 25 HEPES، معاير مع هيدروكسيد الصوديوم لينتج في الرقم الهيدروجيني من 7.4.
3. إعداد المالحة لمعايرة تتكون من 25 ملي HEPES الأقطاب الكهربائية الحساسة للبوتاسيوم وما مجموعه 150 ملي كلوريد الصوديوم وبوكل، ودرجة الحموضة تعديلها إلى 7.4 مع NMDG-OH (N-ميثيل-D-glucamine). هنا، تم إجراء معايرة مع ملاحات تحتوي على 1، 2، 4 أو 10 مليبوكل؛ ACSF الواردة 2.5 ملي بوكل (الشكل 5).
4. إعداد المالحة للمعايرة من الأقطاب الكهربائية الحساسة الصوديوم على النحو التالي؛ (مم) 25 HEPES، 3 بوكل، أي ما مجموعه 160 كلوريد الصوديوم وNMDG-CL، ودرجة الحموضة تعديلها إلى 7.4 مع NMDG-OH. أداء المعايرة بمحلول ملحي يحتوي على (مم) 70، 100، 130 أو 160 كلوريد الصوديوم. ACSF الواردة 152 كلوريد الصوديوم (الشكل 6).
5. لتحديد رد فعل العرضي للاستشعار مع أيونات أخرى، على سبيل المثال.، ودرجة الحموضة، وإعداد ملاحات معايرة إضافية مع تركيز أيون ثابتة، ولكن درجة الحموضة متفاوتة.
   ملاحظة: في حين لا يتجلى هذا الإجراء في هذه الدراسة، يرجى أن أشير إلى العمل في وقت سابق معالجة هذه القضية (على سبيل المثال ^11،12).
6. إعداد الحادة شرائح أنسجة المخ في المياه المالحة مكونة من (مم): 125 كلوريد الصوديوم، و 2.5 بوكل، 0.5 CaCl _2، 6 MgCl _2، 1.25 ناه ₂ PO _{4 و 26} NaHCO _3، و 20 الجلوكوز، فقاعات مع 95٪ O ₂ و 5 ٪ CO _2، مما أدى إلى الرقم الهيدروجيني لل7.4.
7. إجراء تجارب في شرائح الدماغ في السائل الاصطناعي النخاعي (ACSF) تتكون من (مم): 125 كلوريد الصوديوم، و 2.5 بوكل، 2 CaCl _2، 1 MgCl _2، 1.25 ناه ₂ PO _{4 و 26} NaHCO _3، و 20 الجلوكوز، فقاعات مع 95 ٪ O ₂ و 5٪ CO2، مما أدى إلى الرقم الهيدروجيني من 7.4.
8. لتحفيز الخلايا العصبية والخلايا الدبقية، وإعداد الحلول التي تحتوي على 0.2، 0.3، 0.4 أو 0.5 ملم الغلوتامات أو 10 ملي L اسبارتاتي الذائبة في ACSF. لتطبيق الضغط، ويحل 10 ملم الغلوتامات في المياه المالحة HEPES مخزنة.
9. إعداد ماصة تطبيق لتطبيق الضغط. إدراج الزجاج الشعيرات الدموية رقيقة الجدران مع خيوط (القطر الخارجي 2.0 ملم) وبطول 7.5 سم إلى مجتذب الأفقي وسحب أن يؤدي إلى قطر غيض من ~ 1 ميكرومتر.
10. لتحريض نشاط صرعي، وإعداد خالية من المغنيسيوم ACSF تحتوي على 10 ميكرومتر bicuculline methiodide.
11. لمنع توليد إمكانات العمل، وإعداد 10 ملي الأسهم solutأيون من سم الأسماك الرباعية الأسنان (TTX) في الماء المقطر. وخلال التجارب، يضاف TTX مباشرة إلى ACSF أن يؤدي إلى تركيز النهائي من 0.5 ميكرومتر.
12. لمنع تفعيل أمبا مستقبلات، وإعداد 50 ملي حل الأوراق المالية من cyano-nitroquinoxaline-ديون (CNQX) في سلفوكسيد ثنائي ميثيل (DMSO). وخلال التجارب، ويضاف هذا مباشرة إلى ACSF أن يؤدي إلى تركيز النهائي من 100 ميكرومتر.
13. لمنع تفعيل NMDA مستقبلات، وإعداد 50 ملي حل سهم الأمينية phosphonopentanoate (APV) في 70 ملي NaHCO _3. وخلال التجارب، ويضاف هذا مباشرة إلى ACSF أن يؤدي إلى تركيز النهائي من 100 ميكرومتر.

4. معايرة الميكروية ايون انتقائية

1. معايرة ايون انتقائية مسرى مكروي مباشرة قبل وبعد كل تجربة.
2. نعلق الأقطاب إلى micromanipulators وإدراجها إلى الغرفة التجريبية-perfused ACSF، وضعت تحت المجهر ستيريو (الشكل 3 ز>، 4). وضع القطب إشارة إلى ما قبل غرفة (الشكل 4A، B). التبديل على حمام نضح، وضمان أن تدفق حوالي 2 مل / دقيقة.

الشكل 3. مساحة العمل التجريبي. ويتكون تلاعب تسجيل جدول ثبط الاهتزاز تحمل المرحلة س / ص متعدية مع حمام تجريبي، micromanipulators، وstereomicroscope مع عدسات عالية الجودة. وقد تم تجهيز المجهر ستيريو أيضا مع كاميرا CCD لأغراض التوثيق. وبالإضافة إلى ذلك، يتم استخدام جهاز تطبيق ضغط لتطبيق المخدرات البؤري. تقترن الأقطاب تسجيل عبر مرحلة التوجه الى مكبر للصوت التفاضلية. يتم تسجيل البيانات الرقمية (A / D تحويل) مع جهاز الكمبيوتر. ويتحقق نضح حمام بواسطة مضخة صغيرة تحوي (لا يظهر).> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

3. تشغيل المحول A / D، ومكبر للصوت التفاضلية، والكمبيوتر، والبدء في تسجيل البرامج (الشكل 3، 4). بسبب مقاومة حساسة للبرميل أيون عالية جدا (10-20 GΩ؛ أنظر أدناه)، واستخدام مكبر للصوت الكهربية خاص مع مقاومة عالية المدخلات (R = 10 _في TΩ) وجود تحيز صغير التيار (I _التحيز = 50 فا - 1 السلطة الفلسطينية).

الرقم 4. الالكترونية والتصميم المكاني للالتجريبية اقامة. (A) عرض تخطيطي للترتيب تسجيل. يتم ترتيب نصائح لمسرى مكروي مزدوجة الماسورة (الأزرق) ومسرى مكروي متحدة المركز (الأحمر) في حمام التجريبية مليئة المالحة. يشار إلى القطب المرجع حمام تخطيطي. والهياج للمحاكمة الكشف عنها بواسطة برميل ايون الانتقائي (V ₁₎ يتكون من حقل كهربائي محتمل (V _{المرجع)} وإمكانية أيون (V _أيون)، في حين أن برميل المرجعية (V ₂₎ كشف فقط V _{المرجع.} عزل V _أيون، يتم طرح V _المرجع من V ₁ عن طريق مكبر للصوت التفاضلية (DA). (B) تضاريس المرحلة التجريبية مع مسرى مكروي مركزية في المكان. مركز للمرحلة التجريبية يتكون من حمام التجريبية التي تحتوي على إعداد شريحة. على أرض الواقع في حوض الاستحمام، والمغمورة الإشارة حمام الكهربائي في مرحلة ما قبل الدائرة التي تستضيف أيضا مدخل الارواء. ترتكز المرحلة نفسها عن طريق موصل الأرض منفصل. يتم تنفيذ مسرى مكروي متحدة المركز والقطب المرجعية من قبل أصحاب ماصة منفصلة يقودها micromanipulators. تقترن مسرى مكروي والقطب المرجع إلكترونيا إلى مرحلة رئيس مكبر للصوت.e.com/files/ftp_upload/53058/53058fig4large.jpg "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

4. قم بتوصيل أسلاك الفضة المكلورة إلى مدخلات كل من مرحلة رئيس مكبر للصوت التفاضلية (الشكل 4). تحديد مقاومة القطب. تأكد من أن مقاومة للبرميل الإشارة بين 30-100 MΩ ومقاومة للبرميل حساسة أيون ما بين 10-20 GΩ.
5. ضبط إشارات الجهد من الصفر وبدء التسجيل.
6. لاحظ أن إمكانية الكشف عنها من قبل برميل ايون الانتقائي (V ₁₎ يتكون من حقل كهربائي محتمل (V _{المرجع)} وإمكانية أيون (V _أيون)، في حين أن برميل المرجعية (V ₂₎ فقط الكشف عن V _{المرجع.} عزل V _أيون، يتم طرح V _المرجع من V ₁ عن طريق مكبر للصوت التفاضلية (DA) (الشكل 4A).
7. بعد الحصول على خط الأساس مستقرة،التبديل إلى ملاحات المعايرة التي تحتوي على تركيزات محددة من أيون إلى أن تقاس.
   ملاحظة: يبين الشكل 5A معايرة من مسرى مكروي الحساسة البوتاسيوم مزدوجة الماسورة. في الشكل 6A، معايرة كلا مزدوجة الماسورة وكذلك يتم إظهار نا ⁺ مسرى مكروي -sensitive متحدة المركز. في حين أننا لا تصف الإجراء هنا، لاحظ أن التدخلات الممكنة مع أيونات أخرى يجب أن يتم اختبار قبل استخدام حامل الأيون محدد (انظر أيضا 3.4).

الرقم 5. معايرة الميكروية والبوتاسيوم انتقائية مزدوجة الماسورة. (A) التغير في التيار الكهربائي من الإشارة برميل (V _{المرجع)} وK ⁺ -potential (V _{+ K)} في استجابة للتغيرات في حمام ⁺ K تركيز ( [K ^+] _ب) كما هو مبين. (B) نصفمؤامرة -logarithmic من [K ^+] _ب مقابل V _{K +.} مؤامرة خطية من البيانات تكشف عن المنحدر من حوالي 56 فولت. لأغراض التوضيح، وتلطيف آثار مع فلتر Sawitzky-غولي (عرض 20). يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

8. تحديد استجابة الجهد للبرميل ايون انتقائية في استجابة لتغير المعروفة في تركيز أيون. بيانات مؤامرة في مؤامرة لوغاريتمي واحدة (الشكل 5B، 6B) وتحديد المنحدر. جهاز استشعار المثالي يتبع العلاقة التي وصفها المعادلة نرنست (انظر على سبيل المثال ^13):

الخامس: قياس إمكانات الكهربائي.
V _0: إمكانات الكهربائي القياسية، على سبيل المثال لأجكل الأسلاك عند درجة حرارة 298.15 K والضغط الجزئي لل101.325 كيلو باسكال (مطلق)
R: ثابت الغاز (8.314 جول / كلفن درجة / مول)
T: درجة الحرارة المطلقة (كلفن في)
ض: تهمة على أيون (+ 1 لالبوتاسيوم والصوديوم)
F: ثابت فاراداي (96،500 كولوم)
ج ': تركيز أيون الخلية
ج '': تركيز أيون الخلايا

يتم تحويلها لأغراض عملية، واللوغاريتم الطبيعي إلى المنحدر الصورة نرنست الذي هو ثم صالحة لايون معين ودرجة الحرارة:

ملاحظة: للحصول على البوتاسيوم والصوديوم الأقطاب، استجابة الجهد مثالية من أجهزة الاستشعار وبالتالي يسلك منحدر الخطي نحو -58 بالسيارات في RT. بعض انحرافات هذا يمكن قبول (الشكل 5B، 6B). ومن الضروري، مع ذلك، أن خصائص استجابة قطب معين لا تتغير بشكل كبير (أكثر من 10٪، انظر أدناه) قبل وبعد التجربة.

الرقم 6. معايرة الميكروية الصوديوم انتقائية ومقارنة مزدوجة الماسورة مع أقطاب متحدة المركز (A) الأعلى يتتبع: التغير في الجهد للبرميل المرجعية (V _{المرجع)} من القطب مزدوجة الماسورة (تتبع منقط أسود) و القطب متحدة المركز (تتبع الرمادي) في استجابة للتغيرات في الحمام نا ⁺ تركيز ([نا ^+] _ب) كما هو مبين. لاحظ أن استجابات الجهد من كل من الأقطاب الكهربائية متطابقة تقريبا. آثار أسفل: التغيرات في التيار الكهربائي من نا ⁺ -potential (V _{+ نا)} من القطب مزدوجة الماسورة (تتبع الأسود) والقطب متحدة المركز (تتبع الرمادي) في استجابة للتغيرات في [نا ^+] _ب. (B) قطع نصف لوغاريتمي من [نا ^+] _ب مقابل V _{+ نا} من كل من الأقطاب الكهربائية. قطع خطية من البيانات تكشف عن المنحدر من حوالي 48 فولت لكل من الأقطاب الكهربائية.(C) الاستجابة للV _{نا +} ل(تتبع الأسود) مزدوجة الماسورة والقطب متحدة المركز (تتبع الرمادي) إلى تغير سريع في [نا ^+] _ب من 152 ملم إلى 70 ملم. لاحظ أن زمن الاستجابة من القطب متحدة المركز هو أسرع بكثير. لأغراض التوضيح، وتلطيف آثار مع فلتر Sawitzky-غولي (عرض 20). يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

9. تحديد زمن الاستجابة للأقطاب، الذي يعتمد على قطر الحافة، شكل غيض فضلا عن سمك مرحلة استشعار في طرف القطب.
   وصلت في هذا التجريبية انشاء وتوظف التغير السريع بين ملاحات نضح مختلفة (تبادل أنجزت في طرف القطب في غضون 500 مللي ثانية)، الماسورة انقر نقرا مزدوجا الميكروية الحساسة الصوديوم إمكانية مستقرة داخل 9.7 ± 4.5 ثانية عند ملاحظة:التحول من 152 ملم إلى 70 ملم [نا ^+] (ن = 6). في نفس الإطار، بلغت متحدة المركز الميكروية الحساسة الصوديوم إمكانية مستقرة داخل فقط 0.8 ± 0.3 ثانية (ن = 6) (الشكل 6C). وهذا يؤكد القرار مرة أعلى من متحدة المركز بالمقارنة مع الميكروية مزدوجة الماسورة.

5. تشريح الأنسجة

1. لجيل من شرائح الحادة، وتخدير الفئران أيام بعد الولادة 16-20 مع CO ₂ وبسرعة مقطوعة الرأس (بناء على توصية من المفوضية الأوروبية نشرت في: القتل الرحيم للحيوانات التجارب، لوكسمبورغ: مكتب المنشورات الرسمية للجماعات الأوروبية، 1997؛ ISBN 92-827-9694-9).
2. تحضير شرائح الأنسجة قرن آمون (سمك 250 ميكرون)، وبعد إجراء القياسية (انظر على سبيل المثال ^14).

6. الإجراءات التجريبية

1. نقل شريحة في الغرفة التجريبية واصلاحها معالشبكة.
2. خفض معايرة ايون انتقائية مسرى مكروي على سطح شريحة وأسعد المشععة طبقة من المنطقة CA1 على عمق حوالي 50 ميكرون مع القطب.
   ملاحظة: لمس سطح شريحة مع مسرى مكروي يؤدي إلى تقلبات مميزة في برميل حساسة ليثيوم أيون. وعلاوة على ذلك، تلف الخلايا خلال التطويق من الأنسجة يسبب تقلبات كذلك. انتظر حتى استقر خط الأساس.
3. لتطبيق ضغط منبهات الارسال، ملء ماصة التطبيق مع مركب (على سبيل المثال 0.5 ملي الصوديوم). إرفاق ماصة إلى micromanipulator والزوجين لجهاز تطبيق الضغط.
4. أقل ماصة التطبيق في الأنسجة وبعناية وضعه على مقربة من غيض من مسرى مكروي ايون الانتقائي (~ 20-40 ميكرون). بدء تطبيق الضغط (على سبيل المثال 10 ثانية، 40 مليبار) وتسجيل التغيرات الجهد كما رصدتها مسرى مكروي ايون انتقائية.
5. لتطبيق حمام المخدرات، SWحكة بين ملاحات نضح مختلفة لمدة محددة.
6. لإنهاء التجربة، سحب بعناية مسرى مكروي ايون انتقائية من النسيج وتسجيل أي انحراف في الإمكانيات من القيمة صفر الأصلية التي قد حدثت أثناء فترات تسجيل لفترات طويلة.
7. إزالة إعداد شريحة من الحمام وإجراء معايرة الثانية من مسرى مكروي ايون انتقائية.
   ملاحظة: هذا أمر ضروري لأن طرف القطب يمكن الحصول على انسداد أثناء حركتها من خلال الأنسجة. وبالتالي، فمن الضروري للتأكد من أن القطب يزال يستجيب بشكل صحيح لتغييرات في تركيزات أيون. ينبغي رفض التجارب إذا انخفض استجابة القطب لتغيير عشرة أضعاف في تركيز أيون بأكثر من 10٪. الأقطاب الكهربائية تعمل بشكل جيد، يمكن من حيث المبدأ أن إعادة استخدامها في العديد من التجارب. هذا ينطبق بشكل خاص لأقطاب متحدة المركز، والتي يمكن أن تستمر لعدة أيام حتى هذا. ومن الضروري، مع ذلك، أن إجراءات المعايرة هي إعادةpeated قبل وبعد كل تجربة واحدة لضمان حسن سير العمل في الأقطاب.

تحليل 7. البيانات

1. لتحويل الجهد استجابة لايون الانتقائي القطب إلى التغيرات في تركيز أيون خارج الخلية، أولا تحويل المعادلة 2 لتحديد التغير في ΔV _أيون المحتملين (بالسيارات) على النحو التالي (تظاهر هنا لK ⁺ أقطاب -sensitive، ينطبق الإجراء التناظرية ل غ ⁺ أقطاب -sensitive):

V _{+ K:} التغيرات في إمكانات برميل valinomycin (السيارات)

الصورة: منحدر نرنست

K ^+] _B: التركيز الأساسي للبوتاسيوم (في حالتنا 2.5 ملي K ⁺⁾

K ^+] _س: التغيرات في [K ^+] _س خلال التجربة

2. حساب المتوسط ​​الحسابي لالمنحدرات المستمدة من المؤامرات لوغاريتمي واحدة سو المعايرة قبل وبعد التجربة (راجع الشكل 5B، 6B؛ انظر النقطة 4.8) لاسترداد "الصورة".
3. لحساب التغييرات [K ^+] _{س (Δ} [K ^+] _س، مم)، وإعادة ترتيب المعادلة 3 إلى:

النتائج

لرصد [K ^+] _س والتغييرات التي تطرأ عليها ردا على نشاط مثير، تم إدخال مسرى مكروي والبوتاسيوم انتقائية مزدوجة الماسورة في المشععة طبقة من المنطقة CA1. بعد بضع دقائق التطويق، وصل برميل ايون انتقائية من القطب خط أساس مستقر (الشكل 7A)، المقابلة ل[K ^+] _س من حوالي 2.8 ملم، قيمة قريبة من [K ^+] من ACSF المستخدمة ( 2.5 ملم). تطبيق حمام من 0.5 ملي الصوديوم لمدة 10 ثانية التي يسببها زيادة عكسها في [K ^+] _س بنحو 4 ملم، تليها الرمية دون خط الأساس البالغة ~ 0.7 مم (الشكل 7A). خفض تركيز الصوديوم إلى 0.4، 0.3، 0.2 مم وتسبب انخفاض مماثل في السعة لكل من زيادة عابرة والرمية في [K ^+] _{س (الشكل} 7A).

OAD / 53058 / 53058fig7.jpg "/>
الرقم 7. العابرين البوتاسيوم خارج الخلية ردا على نشاط مثير. (A) [K ^+] _يا العابرين، وتتألف من زيادة يعقبه الرمية دون خط الأساس، الناجمة عن تطبيق حمام تركيزات مختلفة من الغلوتامات لمدة 10 ثانية كما هو مبين. (B) تأثير نضح مع حاصرات مستقبلات الغلوتامات (CNQX، و 100 ميكرومتر؛ APV، و 100 ميكرومتر) وسم الأسماك الرباعية الأسنان (TTX؛ 0.5 ميكرومتر) على [K ^+] _س العابرين الناجمة عن تطبيق حمام من 0.5 ملي الصوديوم لمدة 10 ثانية. (C) العفوي [K ^+] _س العابرين في وجود 0Mg ²⁺ / BIC. وأجريت التجارب هو مبين في AC باستخدام أقطاب كهربائية مزدوجة الماسورة. لأغراض التوضيح، وتلطيف آثار مع فلتر Sawitzky-غولي (عرض 20). يرجى CLإك هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

وقد أظهرت التجارب السابقة أن هذه الغلوتامات التي يسببها [K ^+] _س الإشارات لم تغير بشكل ملحوظ خلال تطبيق TTX، وبالتالي فهي مستقلة إلى حد كبير على فتح قنوات الصوديوم الجهد بوابات وعمل الخلايا العصبية بتولد ^15،16. لدراسة الآليات الكامنة وراء احظ [K ^+] _س التغييرات استجابة لالغلوتامات، طبقنا حاصرات مستقبلات الغلوتامات، وهي CNQX (100 ميكرومتر، مانع مستقبلات أمبا) وAPV (100 ميكرومتر؛ مانع من المستقبلات NMDA) في وجود TTX (0.5 ميكرومتر). على حمام نضح مع هذه حاصرات، كانت الغلوتامات التي يسببها [K ^+] _س التغييرات الملغاة تقريبا، مما يؤكد اعتمادهم على افتتاح ionotropic قنوات مستقبلات الغلوتامات كما ذكرت من قبل (على سبيل المثال ^17؛ الشكل 7B).

ولتوضيح رانه أهمية glutamatergic الإثارة لجيل من خارج الخلية [K ^+] إشارات، تم perfused شرائح مع اسميا المغنيسيوم ²⁺ المالحة خالية تحتوي على 10 ميكرومتر bicuculline methiodide (0Mg ²⁺ / BIC). هذا يخفف تعتمد على الجهد المغنيسيوم ²⁺ بلوك مستقبلات NMDA ويخفف من حدة تثبيط عن طريق منع GABA _A المستقبلات، مما تسبب عفوية النشاط صرعي المتكررة في الشبكة (على سبيل المثال ^18،19). كما هو متوقع ^20، عفوية، والمتكررة [K ^+] _س العابرين والبالغة نحو 1.5 ملي تم الكشف في 0Mg ²⁺ / BIC المالحة (الشكل 7C). في ما بين هذه الاستجابات، أصغر [K ^+] _س العابرين مع اتساع متوسط ​​حوالي 0.2 ملي حدث (الشكل 7C).

في المجموعة الثانية من التجارب، كنا [نا ^+] الميكروية -sensitive لتحديد [نا ^+] _س التغييرات التي حركها تطبيقمنبهات الغلوتامات. هنا، ونحن أيضا مقارنة خصائص استجابة الميكروية مزدوجة الماسورة ومركزية توظيف اثنين من نماذج التطبيقات المختلفة. [نا ^+] تم وضع الميكروية -sensitive في المشععة طبقة على عمق حوالي 50 ميكرومتر. بعد أن حصل على خط الأساس مستقرة، تم تطبيق الغلوتامات ناهض L اسبارتاتي في نضح حمام (10 ملم، 120 ثانية، وحمام نضح في 2.5 مل / دقيقة). كما لوحظ في وقت سابق ^21، تسبب تطبيق اسبارتاتي انخفاضا بطيئا في [نا ^+] _س بنحو 15 ملم، والتي استمرت حوالي 5 دقائق وبعد ذلك بدأ لاسترداد العودة إلى خط الأساس (الشكل 8A). والجدير بالذكر، في حين أن سعة الذروة وحركية إشارات [نا ^+] _س يحدده كل من الأقطاب الكهربائية متطابقة تقريبا في ظل هذه الظروف، أظهرت أقطاب متحدة خط أساس أكثر استقرارا وأقل مستوى الضوضاء (الشكل 8A).

لاختبار ص esponse خصائص الأقطاب المختلفة في إطار نموذج طلب أكثر سرعة، ونحن الغلوتامات الضغط المطبق من خلال ماصة الزجاج غرامة المتمركزة في المشععة الطبقة على مسافة 20-40 ميكرومتر من غيض من مسرى مكروي ايون انتقائية. كما هو متوقع ^21، تسبب تطبيق الغلوتامات (10 ملم) 200 مللي قطرة في [نا ^+] _{س (الشكل} 8B). كانت سعة ذروة [نا ^+] _س انخفاض في نفس النطاق لكلا النوعين من الأقطاب الكهربائية (الماسورة المزدوج: 4،5 حتي 13،5 ملم، ن = 14؛ متحدة المركز: 2،0 حتي 19،1 ملم، ن = 15). ومع ذلك، وعلى النقيض من النتائج التي تم الحصول عليها مع بطء نضح حمام (انظر أعلاه)، فإن نسبة لا إشارة إلى الضوضاء، ولكن أيضا مدار الساعة من [نا ^+] _س إشارات الكشف عنها من قبل هذين النوعين من الأقطاب الكهربائية تختلف بشكل كبير. وكان متوسط ​​الوقت لذروة 3.5 ثانية ليتجاوز 1.3 ثانية مزدوجة الماسورة وللالميكروية متحدة المركز.

نظرائهم ve_content "> وهكذا، فإن هذه النتائج تثبت وتؤكد حركية استجابة أسرع للمتحدة المركز مقابل نا ⁺ الميكروية -selective مزدوجة الماسورة، (راجع الشكل 6C و8B)، كما لوحظ أيضا ل Ca ²⁺ ودرجة الحموضة انتقائية ¹⁰ وعلى النقيض من الدراسة السابقة، التي تم بها تنفيذ التحفيز متشابك القصير انفجر لاستحضار العابرين أيون بسرعة بفعل synaptically، لم يكن هناك سوى ميل، ولكن لا يوجد فرق كبير في سعة الذروة متوسط ​​بين أقطاب متحدة المركز ومزدوجة الماسورة مع تطبيقنا النموذج. وكان هذا ربما يرجع ذلك إلى حقيقة أن المسافة من ماصة التطبيق من غيض من مسرى مكروي ايون انتقائية تفاوتت من قبل عامل من اثنين (20-40 ميكرون)، وبالتالي، أن تركيز الصوديوم القصوى في المنطقة المستهدفة لم يكن هو نفسه في تجارب مختلفة، وعرقلة أي الفرق الموجودة في سعة الذروة.

(A) الأعلى يتتبع: تغيير في فولتاجنرال الكتريك للبرميل المرجعية (V _{المرجع)} من القطب مزدوجة الماسورة (تتبع منقط الأسود) والقطب متحدة المركز (تتبع الرمادي) في استجابة للتغيرات في الحمام نا ⁺ تركيز ([نا ^+] _ب) كما هو مبين. لاحظ أن استجابات الجهد من كل من الأقطاب الكهربائية متطابقة تقريبا. آثار أسفل: التغيرات في التيار الكهربائي من نا ⁺ -potential (V _{+ نا)} من القطب مزدوجة الماسورة (تتبع الأسود) والقطب متحدة المركز (تتبع الرمادي) في استجابة للتغيرات في [نا ^+] _ب. (B) قطع نصف لوغاريتمي من [نا ^+] _ب مقابل V _{+ نا} من كل من الأقطاب الكهربائية. قطع خطية من البيانات تكشف عن المنحدر من حوالي 48 فولت لكل من الأقطاب الكهربائية. (C) الاستجابة للV _{نا +} ل(تتبع الأسود) مزدوجة الماسورة والقطب متحدة المركز (تتبع الرمادي) إلى تغير سريع في [نا ^+] _ب من 152 ملم إلى 70 ملم. لاحظ أن زمن الاستجابة من القطب متحدة بشكل ملحوظ فاسثالثا. لأغراض التوضيح، وتلطيف آثار مع فلتر Sawitzky-غولي (عرض 20).

الرقم 8: العابرين الصوديوم خارج الخلية كما الكشف عنها بواسطة أقطاب كهربائية مزدوجة الماسورة ومتحدة المركز.
(A) تغيرات عابرة في V _المرجع و[نا ^+] _س الناجمة عن حمام نضح مع 10 ملي اسبارتاتي لمدة 120 ثانية كما يتبين من شريط. تظهر آثار العليا لتسجيل يؤديها مع القطب مزدوجة الماسورة، تم تسجيل انخفاض آثار استخدام القطب متحدة المركز. (B) التغييرات عابر _في المرجع V و [نا ^+] _س الناجمة عن تطبيق ضغوط محلية مع 10 ملي الغلوتامات عن 0.2 ثانية كما يتبين من رأس السهم. تظهر آثار العليا لتسجيل يؤديها مع القطب مزدوجة الماسورة، تم تسجيل انخفاض آثار استخدام القطب متحدة المركز.خطوط حمراء منقطة تمثل نوبات خطية من الفترة ما بين بداية الإشارة إلى الحد الأقصى. لاحظ أن زمن الاستجابة من القطب متحدة المركز هو أسرع بشكل ملحوظ تحت هذا الشرط. لأغراض التوضيح، وتلطيف آثار مع فلتر Sawitzky-غولي (عرض 20). يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

المناقشة

استنادا السائل الناقل، وقد استخدمت أقطاب ايون انتقائية بنجاح لعقود وبالنسبة للعديد من الأيونات، هي مجسات محددة للغاية المتاحة ^22-26. عندما تستخدم في الفضاء خارج الخلية (ECS) الاستعدادات المخ الفقاريات، لا بد من أن نضع في اعتبارنا، بيد أن هذا هو أسلوب الغازية تماما: ففي حين أن عرض ECS هو فقط حوالي 20-50 نانومتر، وقطر أيون انتقائي الميكروية حوالي 1 ميكرون (أقطاب مزدوجة الماسورة) أو أكبر (أقطاب متحدة المركز). سوف نصائح من الميكروية ايون انتقائية تلف وبالتالي ليس فقط الأنسجة أثناء التطويق من الأنسجة، ولكن أيضا تكبير ECS، لصالح التقليل من العابرين أيون. على الرغم من هذه المزالق، العابرين أيون الخلية ردا على نشاط الخلايا العصبية متسقة بشكل ملحوظ بين مختلف المختبرات ^7،8، مما يدل على مصداقية هذا الأسلوب.

أداء وملاءمة أقطاب ايون انتقائيةيعتمد على حساسيتها والانتقائية، والذي تم تعريفه من قبل كوكتيل الاستشعار ('السائل حامل الأيون غشاء') المستخدمة. الكوكتيلات استشعار تحتوي على جزيء الناقل خاص، على سبيل المثال valinomycin لK ⁺ الميكروية -selective الذي يسلك الانتقائية العالية للحصول على البوتاسيوم ^27. بالرغم من ذلك، يمكن أن يحدث عبر التفاعل مع أيونات أخرى، ويجب أن يتم اختبار. Valinomycin يسلك عبر التفاعل الكبير لالأمونيوم، والتي لابد من أخذها في الاعتبار عند تفسير النتائج (على سبيل المثال ^11،12). وعلاوة على ذلك، لأن الجهد للاستجابة للionophores تتبع سلوك Nernstian (راجع المعادلة 1)، ونسبة الإشارة إلى الضوضاء وعتبة الكشف تعتمد على تركيز أيون المراد قياسها. وهكذا، في حين صغير [K ^+] _س العابرين تثير التغيرات الجهد كبيرة ضد خط الأساس منخفضة [K ^+] _س، صغيرة [نا ^+] _س العابرين هم أكثر صعوبة للكشف ضد مرحباخط الأساس GH [نا ^+] _{س (انظر} الشكل 5 و 6).

يتم تحديد أداء أقطاب ايون انتقائية أيضا بقرار الزمني، الذي يخضع إلى حد كبير ثابت وقته الكهربائية. يتم تحديد هذا الأخير أساسا من قبل المقاومة المحوري من أجهزة الاستشعار، والسعة وزعت على طول ماصة، بين الحلول الداخلي والخارجي السائل. في تكوين مزدوج الماسورة، ومقاومة عالية، نظرا لعمود طويل من ردم استشعار أيون. لعازلة العازلة معين (في هذا البورسليكات الزجاج حالة)، ويخضع السعة من سمك العزل. في أقطاب مزدوجة الماسورة، وعرض عازل يصل إلى الجدار الزجاجي من ماصة. كما يخفف الزجاج بالقرب من الحافة، ويندرج عرض عازلة، وزيادة السعة. هذه العوامل تتضافر لإنتاج الأقطاب مع أوقات الاستجابة التي تتراوح من عدة مئات إلى عدة ميلي ثانيةثانية، وهذه العوامل هي متنوعة.

والميزة الرئيسية لتصميم متحدة المركز هي أن كلا من المقاومة المحوري والسعة إلى الحمام تتضاءل إلى حد كبير. ويحول ماصة متحدة معظم المقاومة للمبادل أيون ردم، ولم يتبق سوى بقايا في ميكرومتر القليلة الماضية قبل طرف. وبالإضافة إلى ذلك، فإن الحل ملء داخل ماصة متحدة المركز ونأى جسديا من الحمام، مفصولة سمك جدارين الزجاج، والحد بشكل كبير من السعة. كما هو مبين في وقت سابق ^10، التأثير المشترك لخفض المقاومة والسعة تحسنا في القرار الزماني لاثنين من حيث الحجم. في حالة متحدة المركز الكالسيوم ²⁺ ودرجة الحموضة الميكروية، وكانت أوقات الاستجابة 90٪ منخفضة تصل إلى 10-20 مللي ثانية ^10. وهناك ميزة ذات الصلة لتصميم متحدة المركز هي أقل مستوى الضوضاء (راجع الشكل 8). نظرا لتقلص إلى حد كبير مقاومة، العابرين الجهد من أي أمبينيتم الحد من الضوضاء ر. وعلاوة على ذلك، التعافي من هذا العابرين سريعا، بسبب الوقت ثابت سريع. هذه التحف بالتالي فهي صغيرة وسريعة، ولها تأثير أقل التخريبية على التسجيلات الفسيولوجية (راجع الشكل 8).

هناك أيضا عيوب تقنية متحدة المركز. أولا، جمعيتهم هو أكثر تعقيدا، وتستغرق وقتا طويلا. والعيب الثاني هو الحاجة لوضع مسرى مكروي إشارة منفصلة مع طرفها، مما يستتبع استخدام إما micromanipulator منفصل أو مناور المزدوج المتخصصة. وأخيرا، الميكروية مزدوجة الماسورة يمكن أن تمتد إلى تصميم ثلاثي الماسورة، مما يسمح للكشف عن نوعين أيون مختلفة في نفس الوقت ^28، وهو أمر غير ممكن لأقطاب متحدة المركز.

المزالق الأكثر شيوعا

silanization غير فعالة.

أهم خطوة، والعقبة الرئيسية في تلفيق أي-السيناتور السائلأو المستندة إلى أيون انتقائية مسرى مكروي هو الإجراء silanization. عندما تفشل الأقطاب الكهربائية على الاستجابة للتغيرات في تركيز أيون معين، أو الاستجابة مع استجابة الفرعية Nernstian (أي بشكل جيد أقل من 58 فولت لكل الفرق تركيز عشرة أضعاف)، فعالية سوء silanization هي عادة السبب. في تجربتنا، ويمكن أن يحدث هذا إذا رطوبة الجو مرتفعة جدا، أو منخفضة جدا، نموذجية من الشروط في ذروة فصل الصيف، أو الشتاء، على التوالي. إذا كان من الممكن لممارسة بعض السيطرة على غرفة الرطوبة، ويمكن التغلب على هذه المشاكل.

المقاومة القطب مرتفعة جدا.

إذا لزم الأمر، ومقاومة للبرميل حساسة أيون يمكن تخفيضه عن طريق شطف. تحقيقا لهذه الغاية، فضح طرفها لطائرة قوية من جلخ العالقة في الماء لبضع ثوان. وهذا سوف يسبب طرف أقصى درجات لكسر وانخفاض المقاومة إلى القيمة المطلوبة.

الجسور الملح.

ملحالجسور بين أيون والمرجعية برميل ينتج في أقطاب سيئة أو الاستجابة لا شيء، وبالتالي يمكن أيضا خلطا بين الأداء بشكل كبير في المعايرة. كما ذكر أعلاه (انظر النقطة 1.6.)، وهذا هو أساسا قضية عند اختيار مزدوجة الماسورة الزجاج ثيتا، بل هو نادر الحدوث عند استخدام الإزاحة، تقنية برميل الملتوية هو موضح هنا.

مع سهولة تلفيق في الاعتبار، وتصميم مزدوج الماسورة الأصلي لوكس ²⁹ كثيرا ما يمكن استخدام مربح. يستخدم هذا الأسلوب قبل ملء أيون والمرجعية برميل مع حلول الملح، والتعرض السريع إلى حل سيلاني عن طريق الشفط والطرد من طرف، وبعد بواسطة إدماج ايون مبادل، أيضا عن طريق طرف (انظر ^30،31) . يمكن أن تكون ملفقة هذه الأقطاب في ما يقرب من 10 دقيقة، ولكن حجم غيض من عادة 4 ميكرون أو أكثر وتكون أكثر عرضة للفشل أثناء التجربة. في المقابل، طرق silanization التي تنطوي على التعرض لبخار سيلاني والحرارةجي يمكن أن تنتج الأقطاب مع نصائح الأصغر التي تستمر يوما، وأحيانا أسابيع.

معا، وهناك العديد من بروتوكولات والنهج على كيفية إعداد الميكروية ايون انتقائية. هنا، التي وصفناها إجراءين الرئيسية لتصنيع الميكروية الماسورة المزدوج وكذلك متحدة المركز الملتوية التي تعمل بشكل جيد وموثوق بها في مختبراتنا، مع معدل النجاح العام ما يقرب من 100٪. الأهم من ذلك، فإن هذه التقنيات قابلة للتحويل إلى قياس أنواع الأيونات الأخرى، بما في ذلك درجة الحموضة أو الكالسيوم، وستكون تنطبق أيضا على الاستعدادات الأخرى من الدماغ، بما في ذلك تجاويف مملوءة بسائل أو السوائل بشكل عام. وأخيرا، وليس آخرا، الميكروية ايون انتقائية تسمح تحديد تركيزات الأيونات داخل الخلايا. بسبب حجمها نسبيا حجم غيض (~ 1 ميكرون)، هذه الإرادة، ومع ذلك، لن يكون ممكنا إلا في الخلايا مع خلايا الجسم كبير، على سبيل المثال مثل الموجودة في الاستعدادات اللافقارية ^28،32.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
جلخ	MicroPolish	Buehler GmbH	مذابة في
الشعيرات الدموية الزجاجية البورسليكات	A.dest 1405059	Hilgenberg	ماصة التطبيق; 75 مم × 2 مم, سمك الجدار 0.3 مم
الشعيرات الدموية الزجاجية البورسليكات مع خيوط	GC 150 F-15	كلارك للأدوات الطبية الكهروبية ، جهاز هارفارد	لجهاز استشعار الأقطاب الكهربائية الدقيقة ذات الماسورة المزدوجة   ؛
الشعيرات الدموية الزجاجية البورسليكات مع خيوط	GC100-F-15	كلارك للأدوات الطبية الكهروبية ، جهاز هارفارد	للإشارة إلى الأقطاب الكهربائية الدقيقة ذات الماسورة المزدوجة   ؛
الشعيرات الدموية الزجاجية البورسليكات مع خيوط	GB-200TF-15 & nbsp ؛	منتجات علمية	متحدة المركز ، قناة خارجية. OD 2.0 مم   ؛
الشعيرات الدموية الزجاجية البورسليكات مع خيوط	GB-120TF-10	منتجات علمية	متحدة المركز ، قناة داخلية. OD 1.2 مم
Digidata	1322A	Axon Instruments
مضخم كهربائي مع مسرح		الرأس Rin المصنوع حسب الطلب	= 10 T & Omega ؛ و Ibias = 50 fA-1pA (متوفر تجاريا   ؛ البدائل: على سبيل المثال < / i> Dagan IX2-700 ، مع مسرح الرأس (مقاوم التغذية المرتدة 10 Gig) أو EPMS-07 ، NPI ، Tamm ، ألمانيا)
غرفة		تجريبية حسب الطلب	متاحة تجاريا من e.g.< / i>   ؛ وارنر إنسترومنتس، الولايات المتحدة الأمريكية.   Scientifica ، فرن المملكة المتحدة
		يجب أن	يظل Heraeus ثابتا عند 200 درجة ؛ C
الشمع الصلب لزجة / شمع الأسنان	Deiberit 502	Siladent Dr. Boehme & يجب أن تظل لوحة ساخنة Schoeps GmbH
	مصنوعة حسب الطلب		حامل
الأقطاب الكهربائية الدقيقة C مصنوع من زجاج		شبكي مصنوع حسب الطلب	مزدوج الأسطوانة: OD   ؛ الشعيرات الدموية 1.5 مم ، متحدة المركز: OD   ؛ الشعيرات الدموية 2 مم
Micromanipulator		Leitz
Micromanipulator	MD4R	Leica
مجهر ستيريو	M205C	Leica
Objective	Plan 0.8xLWD	Leica
Pipette	Puller نموذج PP-830	Narishige	الأقطاب الكهربائية الدقيقة متحدة المركز
مجتذب الماصة	نموذج P-97	Sutter Instruments	مستشعر الأقطاب الكهربائية الدقيقة متحدة المركز
نظام طرد المخدرات الهوائية	Picospritzter Type II	General Valve TM Corporation
Travel Intervetail stage	DT 25 / M	Thorlabs
الغراء المكونين	؛ Araldite	Huntsman Advanced Materials GmbH	قد يستخدم المرء أيضا شريطا صغيرا من رقائق الألومنيوم لإلصاق الشعيرات الدموية معا
سيلفرواير	99.9٪	Wieland Edelmetalle
Slicer / Vibratome	Microm HM 650 V	Thermo Scientific
Software	AxoScope 8.1	Axon Instruments
مجتذب عمودي	اكتب PE-2	Narishige الأدوات العلمية	مع ظرف قابل للدوران ل   أقطاب كهربائية مزدوجة الماسورة
x / y المرحلة		حسب
1 (S) ، 9 (R) - (& ناقص ؛)-Bicuculline methiodide	Sigma aldrich	14343	مضاد تنافسي لمستقبلات GABAA (حساس للضوء) ؛ تحذير مضاد مستقبلات
CNQX	Sigma aldrich	C-127	AMPA / kainate السامة. تنبيه
ميثيل سلفوكسيد سام (DMSO)	سيجما ألدريتش	D5879
DL-AP5	ألفا إيسار	J64210	مضاد مستقبلات NMDA. تنبيه
Hexamethyldisilazane السام (HMDS)	Sigma aldrich	440191	تنبيه: قابلة للاشتعال ، سمية حادة (عن طريق الفم ، جلدية ، استنشاق) وأكالة للمعادن والجلد حمض
الأسبارتيك	Sigma aldrich	A9256	ينشط NMDA وغير NMDA و EAATs
حمض L-Glutamic أحادي الصوديوم الملح هيدرات	Sigma aldrich	G1626	ينشط NMDA-R ، AMPA-R ، QA-R و KA-R) ،   mGluRs و EAATs
أيونوفور البوتاسيوم الأول - كوكتيل B	Fluka	60403	على أساس فالينومايسين. تنبيه
أيونوفور الصوديوم السام II - كوكتيل A	Fluka & nbsp ؛	71178	استنادا إلى مثبط ETH 157
TTX	Ascent Scientific	Asc-055	لقنوات Na + المعتمدة على الجهد ؛ تحذير
مياه سامة ، نقية	فائقة نقاء سيجما ألدريتش	W3500 & nbsp ؛