استخدام الأنزيمية أجهزة الاستشعار لقياس الذاتية ATP أو H 2 O 2 في الكلى

Summary

تتيح المستشعرات الحيوية للأقطاب الكهربائية الدقيقة الأنزيمية < p class = 'jove_content'> قياسات في الوقت الفعلي لإشارات الخلية خارج الخلية بتركيزات ذات صلة بيولوجيا. توسع البروتوكولات التالية تطبيقات أجهزة الاستشعار الحيوية إلى خارج الجسم الحي والكشف في الجسم الحي عن ATP و H₂O₂ في الكلى.

Abstract

وقد استخدمت على نطاق واسع أجهزة الاستشعار مسرى مكروي الأنزيمية لقياس إشارات الخلية في الوقت الحقيقي. أكثر من استخدامها قد اقتصر على شرائح الدماغ والخلايا العصبية الثقافات. في الآونة الأخيرة، وقد تم تطبيق هذه التكنولوجيا إلى الأجهزة كلها. وقد أحرز تقدم في تصميم أجهزة الاستشعار ممكن قياس الإشارات الخلوية في الكلى في الجسم الحي perfused الدم. تسرد البروتوكولات الحالية الخطوات اللازمة لقياس ATP وH _{2 O 2} الإشارات في الخلالي الكلى الفئران. وتستخدم تصميمين استشعار منفصلة للخارج الحي والبروتوكولات الجسم الحي. والمغلفة كلا النوعين من أجهزة الاستشعار مع biolayer الأنزيمية رقيقة فوق طبقة permselectivity لإعطاء الاستجابة بسرعة، أجهزة الاستشعار الحساسة وانتقائية. طبقة permselectivity يحمي إشارة من interferents في الأنسجة البيولوجية، وطبقة الأنزيمية تستخدم للتفاعل محفز متتابعة من كيناز الجلسرين والجلسرين-3-فوسأوكسيديز الفوسفات في وجود ATP لإنتاج H _{2 O 2.} مجموعة من أجهزة الاستشعار المستخدمة في السابق الدراسات المجراة الكشف عن مزيد من تحليلها عن طريق أكسدة H _{2 O 2 على} البلاتين / الايريديوم (PT-IR) سلك كهربائي. أجهزة الاستشعار للدراسات في الجسم الحي وتقوم بدلا من ذلك على الحد من H _{2 O 2 على} الوسيط الذهب المطلي القطب مصممة للالأنسجة perfused الدم. تم الكشف عن التغييرات تركيز النهائية amperometry الوقت الحقيقي تليها معايرة لتركيزات معروفة من تحليلها. بالإضافة إلى ذلك، خصوصية إشارة amperometric يمكن التأكد من خلال إضافة الانزيمات مثل الكاتلاز وآبيراز التي كسر H _{2 O 2 و} ATP تبعا لذلك. هذه المجسات أيضا تعتمد بشكل كبير على المعايرة دقيقة قبل وبعد كل تجربة. البروتوكولات التاليين تضع دراسة كشف في الوقت الحقيقي من ATP وH _2O 2 في أنسجة الكلى، ويمكن تعديل أيضا على تمديد الطريقة الموصوفة لاستخدامها في المستحضرات البيولوجية الأخرى أو الهيئات كلها.

Introduction

وكانت أجهزة الاستشعار مسرى مكروي الأنزيمي (المشار إليها أيضا باسم أجهزة الاستشعار في هذا المخطوط) أداة قيمة لدراسة العمليات الإشارات الحيوية في الخلايا والأنسجة الحية. أجهزة الاستشعار بتوفير المزيد من قرار الزمني والمكاني من الخلايا الجزيئات يشير في تركيزات ذات الصلة من الناحية البيولوجية. بدلا من أخذ العينات وتحليل سوائل خارج الخلية التي اتخذت في فترات على مدى فترات طويلة من الزمن، هذه المجسات تستجيب بالسرعة تتفاعل الانزيمات لتحليلها، وبالتالي إنتاج قياسات الوقت الحقيقي ^1،2. كشف سريع من تركيزات فراغي من العوامل autocrine ونظير الصماوي، مثل البيورينات أو بيروكسيد الهيدروجين، وديناميات الإفراج عنهم يمكن استخدامها لإنش....

Protocol

إجراءات الحيوانات التالية انضمت إلى دليل المعاهد الوطنية للصحة للرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية. تم الحصول على موافقة مسبقة من اللجنة المؤسسية رعاية الحيوان واستخدام (IACUC).
وينبغي أن يتم استعراض تعليمات الشركة الاستشعار خلال تصميم التجربة وقبل استخدامها: ملاحظة. وباتباع هذه التعليمات تنتج أفضل النتائج عند استخدام أجهزة الاستشعار.

1. الاستشعار المعايرة

1. إعداد الحلول الأسهم الجديدة قبل بدء التجربة.
2. إنشاء مخزن وت....

Results

تصميم مسرى مكروي جهاز الاستشعار البيولوجي الأنزيمية يسمح للكشف في الوقت الحقيقي من التحاليل في الكلى كلها. ويتضح تصميم تجربة العام إما خارج الجسم الحي أو الدراسات المجراة في الشكل 1. وأجهزة الاستشعار المستخدمة وتختلف الإجراءات الجراحية اعتمادا على ما إذا كانت الدراسة هو الجسم الحي السابقين أو في الجسم الحي.

للحصول على نتائج قابلة للتكر.......

Discussion

وقد وضعت البروتوكولات الحالية لتعزيز والقرار الزماني والمكاني للATP وH _{2 O 2} الإشارات على الكلى-perfused الدم خارج الجسم الحي معزولة، perfused والحية. الاختلافات بين البروتوكولات وأجهزة الاستشعار المستخدمة هنا توفر الحصول على البيانات الأمثل لأي كلاء الدوائية أو الدراسات الفسيولوجية. تتكون بروتوكولات 1) استشعار المعايرة، 2) إجراء العمليات الجراحية، 3) إعداد الحصول على البيانات، و4) تحليل البيانات. أنها تمكن القياسات في الوقت الحقيقي من التحاليل للعديد .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
طقم الاستشعار	Sarissa Biomedical	SBK-ATP-05-125	تشتمل المجموعة على زجاجة تخزين وغرفة تجفيف وأسلاك قطب كهربائي وأقطاب كهربائية مرجعية. كما تشتمل المجموعة على اختيار المستخدم لأجهزة الاستشعار.
Sarissaprobe ATP Biosensor 125 & mu ؛ م	ساريسا بيوميديكاليك	SBS-ATP-05-125	مخزن في 2-8 o< / sup>C قبل الاستخدام
Sarissagold ATP Biosensor 50 & mu ؛ م	ساريسا بيوميديك	SGS-ATP-10-50	مخزن في 2-8 o< / sup>C قبل الاستخدام
Sarissaprobe مستشعر فارغ 125 & mu ؛ م	ساريسا بيوميديك	SBS-NUL-20-125	مخزن في 2-8 o< / sup>C قبل استخدام
Sarissagold مستشعر فارغ 50 & mu; م	Sarissa Biomedical	SGS-NUL-10-50	store في 2-8 o< / sup>C قبل الاستخدام
Sarissaprobe ATP Manual	Sarissa Biomedical		http://www.sarissa-biomedical.com/media/31563/instructions-atp.pdf< / a>
Faraday cage   ؛	TMC
مزدوج القناة potentiostat	Digi-Ivy	DY2021	النوع الثاني قفص فاراداي
برنامج الحصول على البيانات	Digi-Ivy	DY2000
مضخة التروية	Razel Scientific Instruments	نموذج R99E
إضاءة الألياف	البصرية Schott	ACE 1
micromanipulator	Narishige	MM-3
حامل مغناطيسي micromanipulator	Narishige	GJ-8
طاولة هواء	TMC	63-500
جهاز تهوية الأيزوفلوران	LEI Medical	M2000
3 مل طبق بتري	إبرة فيشر S3358OA
	سانتا كروز		26-30 جرام
دبابيس			تشريح قياسية
قسطرة			أنابيب البولي إيثيلين (PE50)
القسطرة الأنسجة الغراء	Vetbond	1469SB
خياطة	نظرة	SP117
الأربطة			أي 2-4 مم أشرطة مطاطية بعرض 2-4 مم
سيليكون	Momentive	RTV-615 Clear 1 #
المشبك	أدوات العلوم الدقيقة	18052-03
		التشريح القياسية	على مشرط وتشريح المشرط   ؛
كوب			من المواد
الكيميائية القياسية	الخاص سيجما ألدريتش
ATP	سيجما-ألدريتش	A6559-25UMO	100 ملي مولار محلول ATP
بيروكسيد الهيدروجين	سيجما ألدريتش	216763
الجلسرين	سيجما ألدريتش	G9012
أبيراز	سيجما ألدريتش	A7646
كاتالاز	سيجما-ألدريتش	C40
إيزوفلوران	كليبر	10250
إينكتين	سيجما ألدريتش	T133
كيتامين		كليبر 2010012
محلول الملح المتوازن هانكس   ؛	جيبكو	14025092