وغالبا ما تتضمن هندسة الأنسجة في التوسع في المختبر من أجل خلق طعم ذاتي لتجديد الأنسجة. في هذه الدراسة تم تطوير طريقة لتوسيع الأنسجة، وتجديد، وإعادة البناء في الجسم الحي من أجل تقليل تجهيز الخلايا والمواد البيولوجية خارج الجسم.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
الأنسجة المفروم في المضغوط الكولاجين: وBiotransplant التي تحتوي على خلية لإصلاح الترميمية نظموا وحيد
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
يمكن أن تتم التقنيات التقليدية لتوسيع الخلايا وزرع الخلايا الذاتية لأغراض هندسة الأنسجة في مرافق زراعة الخلايا البشرية المجهزة بشكل خاص. تشمل هذه الطرق عزل الخلايا في معلق خلية واحدة والعديد من الأحداث الشاقة والمستهلكة للوقت قبل إعادة الزرع إلى المريض. تشير الدراسات السابقة إلى أنه يمكن استخدام الجسم نفسه كمفاعل حيوي لتوسيع الخلايا وتجديد الأنسجة من أجل تقليل التلاعب خارج الجسم الحي بالأنسجة والخلايا قبل الزرع للمريض. كان الهدف من هذه الدراسة هو إظهار طريقة لحصاد الأنسجة ، وعزل الظهارة المستمرة ، وفرم الظهارة إلى قطع صغيرة ودمجها في مادة حيوية ثلاثية الطبقات. ثم عملت المادة الحيوية ثلاثية الطبقات كوسيلة توصيل ، للسماح بالمناولة الجراحية ، وتبادل التغذية عبر عملية الزرع ، والتدهور الخاضع للرسائر. تتكون المادة الحيوية من طبقتين خارجيتين من الكولاجين ونواة بوليمر مستقر ميكانيكيا وقابل للتحلل ببطء. تم دمج الظهارة المفرومة في إحدى طبقات الكولاجين قبل الزرع. عن طريق فرم الأنسجة الظهارية إلى قطع صغيرة ، يمكن أن تنتشر القطع وبالتالي يتم تحفيز انتشار الخلايا. بعد الأخذ الأولي لعمليات الزرع ، سيحدث توسيع الخلايا وإعادة تنظيمها وتنضج المصفوفة خارج الخلية للسماح بنمو الشعيرات الدموية والأعصاب ومزيد من نضوج المصفوفة خارج الخلية. تقلل هذه التقنية من التلاعب خارج الجسم الحي وتسمح بحصاد الخلايا وإعداد الطعم الذاتي والزرع للمريض كتدخل بسيط من مرحلة واحدة. في المستقبل ، يمكن البدء في توسيع الأنسجة حول قالب ثلاثي الأبعاد داخل الجسم نفسه ، وفقا للاحتياجات المحددة للمريض. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن إجراء هذه التقنية في بيئة جراحية عادية دون الحاجة إلى مرافق زراعة خلايا متطورة.
المقدمة
وتشمل معظم الدراسات هندسة الأنسجة على زرع على الجلد والجهاز البولي التناسلي المحاصيل خلية ذاتي من الأنسجة السليمة وتوسيع الخلية في مرافق زراعة الخلايا مجهزة خصيصا 1،2.
بعد توسيع الخلية، وعادة ما تكون مخزنة الخلايا لاستخدامها لاحقا عندما يتم تحضير المريض لتلقي الطعم الذاتي. المجمدات النيتروجين تسمح التخزين على المدى الطويل في درجات حرارة منخفضة من -150 درجة مئوية أو أقل. ويجب أن تكون عملية تجميد دقيق والتحكم حتى لا تفقد الخلايا. خطر واحد من موت الخلايا وتبلور الماء داخل الخلايا أثناء عملية ذوبان الجليد، والتي يمكن أن تؤدي إلى تمزق أغشية الخلايا. عادة ما يتم إجراء تجميد الخلية عن طريق بطيئة وتسيطر التبريد (-1 ° C لكل دقيقة)، وذلك باستخدام تركيز عال من الخلايا، مصل بقري جنيني، وسلفوكسيد ثنائي ميثيل. بعد ذوبان الجليد، تحتاج الخلايا التي سيتم تجهيزها مرة أخرى عن طريق إزالة المتوسطة تجميد وزرع على البلاستيك زراعة الخلايا أومادة بيولوجية قبل الزرع إلى المريض.
جميع الخطوات المذكورة أعلاه تستغرق وقتا طويلا، وشاقة، وتكلفة 3. وبالإضافة إلى ذلك، كل في المختبر تجهيز خلايا المعدة للزرع المريض درجة عالية من التنظيم ويتطلب موظفين مدربين تدريبا جيدا والمعتمدين ومختبرات 4. جميع في كل شيء، لشراء عملية التصنيع آمنة وموثوق بها، ويمكن وضع هذه التقنية إلا في عدد قليل جدا من المراكز المتقدمة تقنيا واستخدامها على نطاق أوسع في اضطرابات الجراحية المشتركة أمر مشكوك فيه.
من أجل التغلب على القيود المفروضة على زراعة الخلايا في بيئة المختبر، يتم تقديم مفهوم من زرع الأنسجة المفروم للتوسع خلية في الجسم الحي باستخدام الجسم نفسه بأنه مفاعل حيوي. لهذه الأغراض، فإن تفضيلي يتم زرعها على طعم ذاتي على العفن 3D وفقا للشكل أن هناك حاجة لإعادة إعمار النهائي للجهاز طnterest 5-7.
في الأصل، تم تقديم فكرة زرع ظهارة مفروم التي كتبها ميك عام 1958 عندما وصف كيف ينمو ظهارة من حواف الجرح. وقد أوضح أن قطعة صغيرة من الجلد من شأنه أن يزيد من هوامش أرباحها وبالتالي قدرته على توسيع الخلية بنسبة 100٪ عن طريق قطع قطعة مرتين في الاتجاهات المتعامدة (الشكل 1) 8. وقد تم دعم هذه النظرية عن طريق استخدام الطعوم سماكة الجلد جزئية مزجها لزرع الجلد 9 وفي الجلد التئام الجروح نماذج 10.
الشكل 1: نظرية وديع وفقا لنظرية ميك، وظهارة تنمو على حواف الجرح. من خلال زيادة مساحة كشفها بواسطة تكنولوجيا تنميق، الأنسجة المفروم epithelializes الجروح من العديد من المواقع.
وتعتمد الدراسة الحالية على فراش لا تسببأطروحة أن نفس المبدأ يمكن تطبيقها على الأنسجة تحت الجلد عن طريق وضع ظهارة مفروم حول القالب. إن الخلايا الظهارية حشد من زرع مفروم (تنظيم)، وتغطي مناطق الجرح (تهاجر) والقسمة (توسيع) من أجل تشكيل neoepithelium المستمر الذي يغطي منطقة الجرح ويفصل جسم غريب (القالب) من الجسم الداخلية ( الشكل 2).
الشكل 2: كارتون من قالب 3D مع ظهارة المفروم في الجسم الحي توسيع الأنسجة intracorporal وفقا لنظرية ميك باستخدام الأنسجة المفروم وضعت على قالب ثم زرعها في الأنسجة تحت الجلد، والفرضية هي أن الخلايا الظهارية تهاجر من حواف الأنسجة المفروم وإعادة تنظيم وتوسيع ذلك لتشكيل neoepithelium المستمر الذي يغطي منطقة الجرح ويفصل جسم غريب (القالب) من الجسم الداخلية.
على الرغم من أن الدراسات السابقة في الجسم الحي تظهر نتائج واعدة، ويمكن تحقيق مزيد من التحسينات من خلال تعزيز طعم ذاتي بحيث ظهارة مجدد يمكن أن تحمل الصدمات الميكانيكية أفضل 7. لهذه الأغراض، تم تحديد أهم الشروط الأساسية لمادة بيولوجية الناجحة، مثل: نشر السهل من المواد الغذائية والفضلات، إمكانية العفن بطريقة 3D وسهولة التعامل الجراحي. وقدمت النتائج أن هذه الاحتياجات يمكن تلبيتها عن طريق إضافة مادة بيولوجية المركبة إلى الأنسجة المفروم.
الدراسة الحالية تهدف إلى تطوير سقالة تتكون من الأنسجة المفروم في الكولاجين البلاستيك ضغط تحتوي على نواة يعزز من نسيج القابلة للتحلل. بهذه الوسائل، يمكن أن خلايا قابلة للحياة تهاجر من جزيئات الأنسجة المفروم وتتكاثر مع الميزات المورفولوجية سمة من ظهارة الأصلية (الجلد أو الظهارة البولية). باستخدام ضغط من البلاستيك، وكانت سقالة الحدتم المغطى د في حجمها من 1 سم إلى حوالي 420 ميكرون كما الجسيمات المفروم في الكولاجين الطبقة العليا. النسيج الأساسية يمكن أن يكون أي البوليمر ولكن يحتاج إلى تعديل مع سطح ماء من أجل الربط بين مع تغطي طبقات الكولاجين 11.
توفير طريقة لسلامة سقالة معززة من خلال دمج شبكة محبوك تتكون من بولي (ε-caprolactone) (PCL) في غضون سنتين من البلاستيك المضغوط والمواد الهلامية الكولاجين باستخدام بأنها سقالة لزراعة مفروم مخاطية المثانة أو الجلد مفروم من الخنازير. وقد حافظت على بناء في ظروف زراعة الخلايا لمدة تصل إلى 6 أسابيع في المختبر، مما يدل على تشكيل الناجح لالطبقية، الظهارة البولية متعدد الطبقات أو الحرشفية ظهارة الجلد على الجزء العلوي من بناء الهجين موحد بشكل جيد. كان بناء السهل التعامل معها ويمكن خياطة في مكان لأغراض المثانة زيادة أو تغطية عيوب البشرة. جميع أجزاء من سقالة الأنسجة وادارة الاغذية والعقاقير وافق وتقنيةيمكن استخدامها في إجراءات مرحلة واحدة من قبل الحصاد الأنسجة، تنميق، وضغط من البلاستيك، وزرع العودة إلى المريض كتدخل واحد على مراحل. يمكن إجراء العملية للتوسع الأنسجة وإعادة الإعمار تحت ظروف معقمة في أي وحدة الجراحة العامة.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
وقبل الموافقة على جميع البروتوكولات الحيوان من قبل لجنة مقاطعة ستوكهولم على الحيوانات ويتفق جميع الإجراءات لوائح للاستخدام الحيواني، وكذلك القوانين الاتحادية ذات الصلة.
1. إجراءات الحيوان
- إعداد الحيوان للجراحة
- إعداد طاولة الجراحة مع جميع المواد والأدوات اللازمة لتشغيل تحت ظروف معقمة. إجراء عملية جراحية على وجه الحصر تحت ظروف معقمة للحد من خطر العدوى وتحسين الأوضاع في جراحة بقاء.
- صيام الحيوان لمدة 12 ساعة قبل الجراحة وقياس وزنه. إدارة الحقن العضلي من azaperone (2 ملغ / كغ) للتخدير. تخدير الحيوانات مع حقن في العضل من hypochloride تلييتامين (2.5 ملغ / كلغ)، hypochloride zolazepam (2.5 ملغ / كلغ)، medetomidine (25 ميكروغرام / كغ) والأتروبين (25 ميكروغرام / كغ).
- حقن phenobarbiturate (15 ملغ / كلغ) قبل endotracheآل التنبيب ويستمر التخدير العام مع 0.8٪ -2٪ الأيزوفلورين. ادخال قسطرة الوريد الطرفية في أذن واحدة ويبث الجلوكوز (25 ملغ / مل) عن طريق الوريد أثناء إجراء للحفاظ على رفاهية الحيوان.
- وضع الأجهزة على الأذن أو الذيل رصد لفحص درجة حرارة وضغط الدم والتشبع، والنبض المحيطي. التخدير السيطرة عن طريق تحفيز آلام الأذنين أو الحوافر. تطبيق مرهم للعين لمنع جفاف بينما تحت التخدير.
- استئصال المثانة خزعة عينة
- يقثطر المثانة باستخدام القسطرة سيليكون 10-الفرنسية عن طريق إدخال منظار لعرض مجرى البول وادخال القسطرة عن طريق مجرى البول وإلى المثانة البولية لإفراغ البول تحت ظروف شبه معقمة. ملء المثانة مع محلول ملحي معقم لضغط من 20-25 سم H 2 O، حوالي 100-300 مل، ومن ثم فارغة إلى 20 سم H 2 O (حوالي 8 مل / كجم من وزن الجسم).
- مع الالبريد الخنازير تحولت بعناية لموقف الجانب، إجراء التعقيم قبل الجراحة الأساسية من الجلد مع تطبيق غلوكونات الكلورهيكسيدين. تطبيق لوحة الإنفاذ الحراري في الكتف بعد إزالة نتف الشعر مع مقص الحلاقة.
- تحويل خنزير بعناية في موقف ضعيف وإزالة نتف الشعر في البطن باستخدام مقص الحلاقة والقيام التعقيم قبل الجراحة الأساسية للجلد البطن مع تطبيق غلوكونات الكلورهيكسيدين.
- تضمين الأطراف مع الثياب الناعمة للحد من خطر تلف تمدد مفرط في المفاصل في الأطراف. تعقيم الجلد في منطقة البطن للحيوان مع تطبيقات المتعاقبة من غلوكونات الكلورهيكسيدين ووضع اللف العقيمة حول الجراحي الميداني.
- قبل شق الجلد، وتطبيق مسكن في الوريد يتكون من البوبرينورفين (45 ميكروغرام / كغ)، كاربروفين (3 ملغ / كغ)، والحقن المحلي ليدوكائين في خط الوسط تحت السرة. تحقق من وجود رد فعل الألم عن طريق استيعاب كورونافي بالملقط. جعل انخفاض شق خط الوسط من خلال لفافة والغشاء البريتوني باستخدام الإنفاذ الحراري للسيطرة على النزيف. توطين المثانة لديها موقف داخل الصفاق تماما في خنزير ويمكن أن يتعرض بحرية من خلال تعبئة من خلال الجروح.
- اتخاذ اجراء من المثانة مع ملقط وقياسه مع شريط قياس تعقيمها وعلامة على عينة الخزعة على شكل بيضاوي الشكل تقريبا 2 سم طوليا و 1 سم عرضيا، أو أصغر، وذلك باستخدام قلم تعقيمها (الخنزير تتسامح انخفاض ربع حجم المثانة ممتاز). استئصال منطقة ملحوظة، وذلك باستخدام مشرط، ووضع عينة المثانة خزعة في DMEM تحت ظروف معقمة.
- أداء الزرع الذاتي مع biotransplant أو إغلاق المثانة عن طريق خياطة مع 5-0 Vicryl في طبقتين. إغلاق رباط البطن بعناية مع 2-0 أو 3-0 تشغيل Vicryl. إغلاق تحت الجلد مع 3-0 Vicryl والجلد مع 3-0 Ethilon. وضع ضمادة على الجرح وبعناية فيتميل للحيوان حتى تعافى بشكل كاف من التخدير ولا يعبر عن الألم.
- نقل الحيوانات إلى مرفق رعاية الحيوانات لتأمين الظروف الملائمة لرعاية ما بعد الجراحة. وضع الحيوان في قفص واحد مع مصباح التدفئة وحضور للحيوان حتى الشفاء التام من التخدير ومن ثم السماح أن المتوقفة الحيوانات في أزواج.
- توفير الانتعاش هادئ حول الألم ورفاه وإدارة البوبرينورفين (45 ميكروغرام / كغ) عضليا لتسكين الألم بعد العملية الجراحية وtrimetoprim (4 ملغ / كلغ) والسلفوناميد (20 ملغ / كلغ) مرتين يوميا لمدة ثلاثة أيام ومرة واحدة يوميا لمدة خمسة أيام للحد من خطر العدوى بعد الجراحة.
- استئصال خزعة الجلد عينة
- إعداد طاولة الجراحة مع جميع المواد اللازمة. تخدير الحيوانات كما هو موضح سابقا في 1.1. إزالة نتف الشعر باستخدام الشمع، وغسل وتعقيم المنطقة شق مع betadine والكحول 70٪ وبعد ذلك وضعت اللف العقيمة أروند منطقة شق.
- استخدام جلدي لحصاد 0.3 مم سمك جزئي خزعة الجلد. ضع عينة الجلد في DMEM قبل تنميق، كما هو موضح في 2.2. تغطية منطقة الجرح مع مرهم الدهنية وخلع الملابس.
2. مفروم الأنسجة التحضير
- المثانة الغشاء المخاطي
- غسل خزعة المثانة مرتين في DMEM. ضع العينة المثانة خزعة على طبق من ذهب تشريح تعقيمها مع الغشاء المخاطي التي تواجه صعودا وإصلاح واحد من الجانبين لوحة باستخدام دبابيس تشريح.
- فصل الأنسجة المخاطية من عضلة النافصة باستخدام مقص الجميلة وملقط (الشكل 3) والحفاظ على الأغشية المخاطية رطبة بسبب يقطر المالحة أو DMEM أكثر من ذلك.
- استخدام جهاز تنميق عن طريق وضعها على الغشاء المخاطي ومن ثم تمرير الجهاز من نهاية واحدة إلى أخرى عموديا وأفقيا، وتطبيق الضغط اليدوي للحصول على قطعة من نسيج مفروم 0.8 مم × 0.8 مم (0.8 ملم هي المسافة بين rotatinز مناشير).
- بشرة
- إذا كان biopsis الجلد سميكة: وضع الجلد على طبق من ذهب تشريح معقمة واستخدام مقص جراحي لفصل البشرة من الدهون تحت الجلد والأدمة. البشرة رقيقة وشفافة (حوالي 0.3 مم) عندما يكون جاهزا لتنميق.
- استخدام جهاز تنميق عن طريق وضعه على البشرة. مع الضغط، وتمرير الجهاز من نهاية واحدة إلى أخرى عموديا وأفقيا للحصول على قطعة من نسيج مفروم 0.8 مم × 0.8 مم.
3. إعداد البلاستيك المضغوط PCL / الكولاجين طعم ذاتي
- ضع كل المكونات على الجليد للحفاظ على برودة. الأواني اللازمة: أنبوب الصقر، 10X DMEM، 1X DMEM، 1 N هيدروكسيد الصوديوم وذيل فأر نوع الكولاجين 1.
- مزيج 2 مل من 10X DMEM (بعناية لتجنب الفقاعات) مع 12 مل من نوع الكولاجين 1. إضافة 1 N هيدروكسيد الصوديوم، قطرة قطرة، لتحقيق درجة الحموضة تصل إلى 7،4-8 (اللون في المتوسط يجب أن تشير إلى درجة الحموضة عن طريق تغيير من شدة الأصفر إلى دبوسك). وبالإضافة إلى ذلك، استخدم شريط الأس الهيدروجيني.
- بعناية إضافة 2 مل من 1X DMEM ومزيج الحل. لوحة ما يقرب من 2 مل من الكولاجين في كل بئر من العفن مستطيل الصلب (20x30x10 مم)، واحتضان في 37 ° مئوية في 5٪ CO 2 لمدة 10 دقيقة.
ملاحظة: يجب أن يكون تركيز الكولاجين 2.06 ملغ / مل في حمض الخليك 0.6٪ وكمية الكولاجين 1 مل / سم 2. - مرة واحدة يحدد الكولاجين في القالب، ضع مادة بيولوجية (PCL) على أعلى من هلام الكولاجين (20 ملم × 30 ملم) وتصب الكولاجين المتبقية (حوالي 6 مل) على أعلى من ذلك. احتضان عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2 لمدة 20 دقيقة.
- وضع الأنسجة المفروم (لمدة 1: 6 التوسع) في الجزء العلوي من هلام الكولاجين. اضغط على المياه من بناء بالقوة الميكانيكية باستخدام ضغط البلاستيك على النحو التالي (الأرقام 3 و 4).
- وضع طبقة سميكة من قطع من الشاش على سطح العقيمة. مكان واحد مش الفولاذ المقاوم للصدأ (400 ميكرون سميكة) على رأس gauzمنصات ه ثم ورقة من شبكة من النايلون (110 ميكرون سميكة). نقل بعناية الجل الكولاجين / الأنسجة المفروم على شبكة من النايلون وإزالة بعناية القالب الصلب مستطيلة.
- وضع طبقة جديدة من شبكة من النايلون على رأس هلام الكولاجين / الأنسجة المفروم. وضع شبكة من الصلب الثانية على رأس شبكة من النايلون. وضع في موقف لوحة الضغط أو تحميل وزنها لا يقل عن 120 غرام (أي لوحة من الزجاج) لمدة 5 دقائق.
- إزالة تنسجم الوزن، والنايلون، والصلب. وطعم ذاتي هي الآن جاهزة للخياطة إلى المثانة خنزير في الجروح الجلدية كامل سماكة أو مثقف في المختبر.
- لفي المختبر زراعة، وقطع بناء رقيقة إلى قطع صغيرة تركيب لوحات 12-جيدا. إضافة 1 مل من المتوسط القرنية. وضع لوحات في الحاضنة عند 37 درجة مئوية، و 5٪ CO 2 والثقافة تصل إلى 6 أسابيع وتغيير المتوسطة 3 مرات في الأسبوع.
4. خياطة لطعم ذاتي
- خياطة من الطعم الذاتي مع مفروم مخاطية المثانة إلى المثانة خنزير
- الحفاظ على الطعم الذاتي رطبة في DMEM خلال فترة الانتظار. خياطة الطعم الذاتي مع غرامة خيوط تشغيل حيدة. استخدام غير قابل للامتصاص 5-0 Ethilon لأغراض البحث.
- معرفة ما اذا كان للماء عن طريق ملء المثانة مع المياه المالحة عن طريق القسطرة البولية مسستقر. إذا كان ذلك ممكنا، وتغطية الطعم الذاتي مع طبقة من الثرب الكبير. إغلاق جدار البطن، الأنسجة تحت الجلد، والجلد كما هو موضح في 1.2.6. تطبيق تضميد الجراح.
- خياطة من بأسلوب الطعم الذاتي مع البشرة الجلد مفروم إلى الجرح كامل سماكة
- الحفاظ على الطعم الذاتي رطبة في DMEM خلال فترة الانتظار.
- خياطة الطعم الذاتي في الجزء السفلي من الجلد كامل سماكة الجرح بواسطة الغرز انقطاع في الزوايا وفي منتصف الطعم الذاتي للحفاظ على الطعم الذاتي متمسكة السطح السفلي.
- تغطية الجرح بضمادة البلاستيكية التي تحافظ على رطوبة الجرح.
الحمار = "jove_title"> 5. نهاية
- رزين الحيوان مع الحقن العضلي من hypochloride zolazepam (2.5 ملغ / كلغ) وmedetomidine (25 ميكروغرام / كغ) قبل إنهاء وتطبيق أجهزة الرصد إلى الأذن أو الذيل للتحقق من النبض وضغط الدم.
- الموت ببطء الحيوان بإعطاء جرعة قاتلة من الصوديوم بنتوباربيتال (60-140 ملغ / كلغ) عن طريق الوريد. تحقق النبض وضغط الدم إلى حين وقوع الوفاة.
6. في المختبر الثقافة
ملاحظة: تقييم تشريحيا تطور النسيج المفروم في بنيات PCL / الكولاجين في المختبر، والكولاجين / PCL / بقع مفروم يتم تربيتها في لوحات 12-جيدا باستخدام المتوسطة القرنية.
- إعداد المتوسطة القرنية:
- تعقيم زجاجة 500 مل.
- مزيج 400 مل من DMEM مع 100 مل من F12 هام (4: 1 خليط). تكملة مع 10٪ مصل بقري جنيني، والانسولين 5 ميكروغرام / مل،0.4 ميكروغرام / مل الهيدروكورتيزون، 21 ميكروغرام / مل الأدنين، 10 -10 مول / لتر الكوليرا السم، 2 × 10 -9 مول / لتر ثلاثي يودوثيرونين، 5 ميكروغرام / مل ترانسفيرين، 10 نانوغرام / مل عامل نمو البشرة، 50 U / مل البنسلين و 50 ميكروغرام / مل الستربتومايسين.
- تعقيم بواسطة الترشيح من خلال مرشح 0.2 ميكرومتر وجمع الرشاحة في زجاجة 500 مل العقيمة.
7. المناعية
ملاحظة: يتم تقسيم بروتوكول المناعية عموما إلى الخطوات التالية: (1) تثبيت والبارافين التضمين، (2) الصغيرة باجتزاء إلى 5 ميكرون شرائح والتنسيب على الشرائح، deparaffination، والإماهة، (3) المستضد إماطة اللثام، تلطيخ وتتصاعد . قبل البدء في الخطوات الأخيرة في إجراء المناعية، وإعداد مخازن الغسيل والحل فضح مستضد (انظر التفاصيل المادية منفصلة). إعداد الحل ABC معقدة لا يقل عن 30 دقيقة قبل الاستخدام.
- تثبيت
لاالشركة المصرية للاتصالات: في نهاية الثقافة في المختبر، وتحديد بقع على النحو التالي:- إعداد أنابيب إيبندورف مع 1 مل من 4٪ الفورمالديهايد مخزنة (PFA) (تحذير: الفورمالديهايد السامة يرجى قراءة ورقة بيانات السلامة المادية قبل العمل مع هذه المادة الكيميائية ارتداء القفازات والنظارات الواقية وإعداد الحل داخل غطاء الدخان).
- نقل كل من بقع الكولاجين لأنبوب إيبندورف تحتوي على 4٪ PFA. إصلاح أكثر من ليلة في درجة حرارة الغرفة.
- عينات مكان في الايثانول 70٪ للتخزين طويل الأجل عند 4 درجات مئوية. عينات جاهزة الآن للجفاف وتضمينها في كتل البارافين قبل باجتزاء.
- الإماهة
- ضع الشرائح في جرة تلطيخ مع يذاب X-هيئة تنظيم الاتصالات لمدة 15 دقيقة. كرر باستخدام جرة تلطيخ جديدة مع يذاب X-هيئة تنظيم الاتصالات. ضع الشرائح في جرة تلطيخ مع الايثانول المطلق لمدة 10 دقيقة. كرر باستخدام جرة تلطيخ جديدة مع الايثانول المطلق. ضع الشرائح في جرة تلطيخ مع 95٪ من الإيثانول لمدة 10 دقيقة وبعد ذلكفي وعاء تلطيخ مع 70٪ من الإيثانول لمدة 10 دقيقة. أخيرا غسل الشرائح مرتين لمدة 5 دقائق مع الماء المقطر.
- مستضد نزع القناع
- وضع الشرائح في جرة Coplin مع TE-حل ووضع الجرة في حمام الماء ليغلي لمدة 20 دقيقة. خذ جرة من حمام الماء بعناية. تبريد الشرائح إلى درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة ويغسل مرتين لمدة 5 دقائق في المخزن تريس. ضع الشرائح في جرة تلطيخ مع 3٪ بيروكسيد الهيدروجين لمدة 10 دقيقة. تغسل الشرائح مرتين لمدة 5 دقائق في المخزن تريس. رسم دائرة حول العينات باستخدام طارد المياه بمناسبة القلم.
- منع انوعي ملزمة من الأجسام المضادة باستخدام 100-300 ميكرولتر من عرقلة الحل. إزالة عرقلة الحل وإضافة 100-300 ميكرولتر من الأجسام المضادة الأولية حل في التركيز الموصى به في عازلة تريس. احتضان بين عشية وضحاها. إزالة حل الأجسام المضادة وغسل أقسام العازلة في تريس مرتين لمدة 5 دقائق.
- احتضان مع الأجسام المضادة الثانوية لمدة 1 ساعة في غرفة temperatلدى عودتهم. يغسل مرتين لمدة 5 دقائق في المخزن تريس. احتضان 30 دقيقة باستخدام أدوات ABC النخبة (اتبع إرشادات الشركة المصنعة). يغسل مرتين في المخزن تريس.
- تطوير رد فعل الأجسام المضادة باستخدام VIP عدة ناقلات، باتباع إرشادات الشركة المصنعة (تنتج 1-7 دقيقة الحضانة عادة كثافة اللون البنفسجي واضحة). وضع الشرائح في الماء المقطر. مباين مع الهيماتوكسيلين ماير لمدة 30 ثانية.
- يغسل في الماء الجاري لمدة 5 دقائق. ضع الشرائح في جرة تلطيخ مع 70٪ من الإيثانول لمدة 1 دقيقة. كرر باستخدام جرة تلطيخ جديدة مع 70٪ من الإيثانول. ضع الشرائح في جرة تلطيخ مع 95٪ من الإيثانول لمدة 1 دقيقة. كرر باستخدام جرة تلطيخ جديدة مع 95٪ من الإيثانول.
- ضع الشرائح في جرة تلطيخ مع يذاب X-هيئة تنظيم الاتصالات لمدة 5 دقائق. إزالة، في وقت واحد للحفاظ على رطوبة. ضع قطرة من تصاعد المتوسطة على رأس كل شريحة ووضع غطاء زجاجي على رأس (تفعل ذلك بعناية لتجنب فقاعات الهواء). السماح للشرائح الجافة بين عشية وضحاها وعرض الشرائح تحت الجزئينطاق.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
تقدم هذه الدراسة طريقة يوضح كيفية إنتاج مادة بيولوجية للزرع باستخدام ضغط البلاستيك الكولاجين والأنسجة المفروم.
مخاطية المثانة والجلد ويمكن أن تحصد ثم مفروم ميكانيكيا الى جزيئات صغيرة (الشكل 3). بواسطة ضغط من البلاستيك، وتدرج الجسيمات المفروم داخل سقالة مركبة تتألف من البوليمر قابلة للتحلل وضعها مركزيا الذي هو قوي ميكانيكيا في الطبقات الخارجية من هلام الكولاجين (الشكل 4). جزيئات ا...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
تقدم هذه الدراسة مقاربة الاستخدام السهل أن تنتج بقع جدار المثانة مع الأنسجة ذاتي للزرع على طاولة العمليات الجراحية. تتشكل بقع من قبل مجموعة من الحياكة بوليمر قابلة للتحلل في الوسط والكولاجين مع وبدون الأنسجة المفروم في الأسطح الخارجية في تركيبة مع ضغط من البلاستيك. ضغط البلاستيك هو الطريقة الموصوفة سابقا من قبل مؤلفين آخرين، ويمكن تعريفها بأنها الطرد السريع من السوائل من المواد الهلامية الكولاجين 12،13. والمصنف الأنسجة المفروم من الغشاء المخاطي المثانة أو الجلد في هذه ا...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.
شكر وتقدير
يشكر المؤلفون الجمعية السويدية للبحوث الطبية ، ومؤسسة بروموبيليا ، ومؤسسة ولي العهد الأميرة لوفيزا ، ومؤسسة الماسونية لرعاية الأطفال ، والجمعية السويدية للطب ، ومؤسسة سولستيكان ، ومعهد كارولينسكا ، ومجلس مدينة ستوكهولم على الدعم المالي.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| قسطرة سيليكون 10-فرنسي | تحضير للجراحة ، القسم 1 | ||
| DMEM 10x | Gibco | 31885-023 | قسم ضغط البلاستيك 4 |
| 24 ألواح البئر Falcon | 08-772-1 | قسم ضغط البلاستيك 4 | |
| 3 '، 3 '، 5-Triiodothyronine | Sigma-Aldrich | IRMM469 | In vitro < / em > ثقافة ؛ القسم 5 |
| 4٪ PFA | Labmed Solutions | 200-001-8 | الكيمياء المناعية. القسم 6 |
| 70٪ الإيثانول | Histolab | الكيمياء المناعية ؛ القسم 6 | |
| مجموعة ABC Elite: مجموعة الكشف عن البيوتين والستربتافيدين | Vector | PK6102 | Immunocytocytochemistry ؛ القسم 6 |
| الإيثانول المطلق | Histolab | 1399.01 | الكيمياء المناعية. القسم 6 |
| Adenine | Sigma-Aldrich | A8626 | in vitro< / em> ثقافة. القسم 5 |
| الأتروبين 25 & جم / كجم | Temgesic ، RB Pharmaceuticals ، بريطانيا | العظمى إعداد للجراحة ، القسم 1 | |
| Azaperone 2 & thinsp ؛ ملغ / كجم | Stresnil, Janssen-Cilag, Pharma, النمسا | تحضير للجراحة, القسم 1 | |
| السلامة الحيوية المستوى 2 غطاء محرك السيارة | ضغط البلاستيك القسم 4 | ||
| الحظر: تم إنشاء مصل طبيعي من نفس النوع مثل الجسم المضاد الثانوي الثانوي. | ناقلات | يعتمد حل الحجب على أصل الجسم المضاد الأول | للكيمياء المناعية. القسم 6 |
| بوبرينورفين 45 & mu; جم / كجم | أتروبين ، شركة ميلان ، كانونسبورغ ، بنسلفانيا | تحضير للجراحة ، القسم 1 | |
| كاربروفين 3 & thinsp ؛ ملغ / كجم | Rimadyl ، Orion Pharma ، السويد | تحضير للجراحة ، القسم 1 | |
| غلوكونات الكلورهيكسيدين ؛ | كركديه 40 & thinsp ؛ ملغ / مل ، ريجنت الطبية ، إنجلترا | إعداد للجراحة ، القسم 1 | |
| الكوليرا | سيجما ألدريتش | C8052 | في المختبر < / م > ثقافة. القسم 5 |
| جرة كوبلين: جرة تلطيخ لغلي | Histolab | 6150 | الكيمياء المناعية. القسم 6 |
| غير قابل للصدأ (33 مم × 22 مم × 10 مم) | ؛ القسم 4 | ||
| DMEM | Gibco | 3188-5023 | البلاستيك القسم 4. ابق على الجليد عند استخدامه في ضغط البلاستيك |
| عامل نمو البشرة | سيجما ألدريتش | E9644 | في المختبر < / م > ثقافة; القسم 5 |
| Ethilon (الشعيرات الأحادية غير القابلة للامتصاص لخيوط الجلد)جراحة | الإيثيكون | ، القسم 1 | |
| مصل الأبقار الجنينية (FBS) | Gibco | 10437-036 | البلاستيك القسم 4 |
| ملقط (أديسون مع الأسنان) تحضير | للجراحة ، القسم 1 | ||
| شاش (Gazin Mullkompresse) | تحضير للجراحة ، القسم 1 | ||
| Ham's F12 | Gibco | 31765-027 | قسم ضغط البلاستيك 4 |
| Hematoxylin | Histolab | 1820 | Immunocytochemistry ؛ القسم 6 |
| غرفة الرطوبة | DALAB | الكيمياء المناعية. القسم 6 | |
| هيدروكورتيزون | سيجما ألدريتش | H0888 | في المختبر < / م > ثقافة; القسم 5 |
| محلول بيروكسيد الهيدروجين 30٪ | سيجما ألدريتش | H1009 | الكيمياء المناعية ؛ القسم 6 |
| الأنسولين | سيجما ألدريتش | I3536 | في المختبر< / em> ثقافة; القسم 5 |
| Isoflurane | Isoflurane ، باكستر ، ديرفيلد ، إلينوي | تحضير للجراحة ، القسم 1 | |
| ليدوكائين 5 مجم / مل | زيلوكايين ، أسترازينيكا ، السويد | تحضير للجراحة ، القسم 1 | |
| Lucose 25 & thinsp ؛ ملغ / مل | باكستر ، ديرفيلد ، إلينوي | تحضير للجراحة ، القسم 1 | |
| قلم | قلم Sigma-Aldrich | Z377821-1EA | Immunocytochemistry ؛ القسم 6 |
| Medetomidine 25 & mu; جم / كجم | Domitor ، Orion Pharma ، السويد | تحضير للجراحة ، القسم 1 | |
| جهاز الفرم | Applied Tissue Technologies LLC | تحضير الأنسجة المفرومة ، القسم 2 | |
| Monocryl (الشعيرات الأحادية القابلة للامتصاص) | جراحة الإيثيكون | ، القسم 1 | |
| كلوريد الصوديوم | سيجما-ألدريتش | S7653 | الكيمياء المناعية ؛ القسم 6 |
| هيدروكسيد الصوديوم 1 N | Merck Millipore | 106462 | قسم ضغط البلاستيك 4 وشبكة نايلون ثقافة |
| الخلية ، 110 & mu ؛ M حجم المسام السميكة 0.04 ضغط البلاستيك sqmm | . القسم 4 | ||
| Oculentum simplex APL: مرهم لحماية العين | جراحة 336164 APL | Vnr | ، القسم 1 |
| PBS | Gibco | 14190-094 | قسم ضغط البلاستيك 4 |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | قسم ضغط البلاستيك 4 |
| Phenobarbiturate 15 & nbsp ؛ ملغ / كجم | Pentobarbital ، APL ، السويد | تحضير للجراحة ، القسم 1 | |
| PCL محبوك النسيج | ضغط البلاستيك ؛ القسم 4 | ||
| ذيل الفئران الكولاجين | First LINK، Ltd ، المملكة المتحدة | 60-30-810 | قسم ضغط البلاستيك 4 ، حافظ على شفرة مشرط الثلج |
| - 15 | تحضير للجراحة ، القسم 1 | ||
| مقصات | تحضير للجراحة ، القسم 1 | ||
| شبكة الفولاذ المقاوم للصدأ ، 400 & nbsp ؛ مو M حجم | السميكة ضغط البلاستيك. القسم 4 | ||
| قفازات | تحضير للجراحة ، القسم 1 | ||
| العباءات | تحضير للجراحة ، القسم 1 | ||
| الستائر | |||
| Sterilium | Bode Chemie HAMBURG | تحضير للجراحة ، القسم 1 | |
| خياطة خيط Ethilon | تحضير للجراحة الجراحة ، القسم 1 | ||
| محلول TE (محلول كشف القناع بالمستضد) يتكون من 10 ملي تريس و 1 ملي EDTA ، درجة الحموضة 9.0 | 10 ملي تريس / 1 ملي مولار EDTA ، ؛ ضبط درجة الحموضة على 9.0 | ||
| تيليتامين هيبوكلوريد 2.5 ملغ / كغ | إعداد للجراحة ، القسم 1 | ||
| Transferrin | Sigma-Aldrich | T8158< | em>in vitro < / em > ثقافة ؛ القسم 5 |
| قاعدة تريزما ، H2NC | سيجما ألدريتش | T6066 | الكيمياء المناعية. القسم 6 |
| مجموعة ناقلات VIP: إنزيم مجموعة ركيزة بيروكسيداز | Vector | SK4600 | Immunocytochemistry ؛ القسم 6 |
| فيكريل (مخطط قابل للامتصاص) | جراحة الإيثيكون | ، القسم 1 | |
| تريس عازلة درجة الحموضة 7.6 (محلول الغسيل) | محلول TE: اصنع 10x (0.5 م تريس ، 1.5 م كلوريد الصوديوم) عن طريق الخلط: 60.6 جم تريس (قاعدة تريزما ، H2< / sub>NC (CH2< / sub>OH) 3< / sub> ، م = 121.14 جم / مول) ، أضف 800 مل من الماء المقطر ، واضبط الرقم الهيدروجيني حتى 7.6 ، أضف 87.7 جم كلوريد الصوديوم واملأه حتى 1,000 مل بالماء المقطر. خفف إلى 1x بالماء المقطر. | ||
| X-tra solv (مذيب) DALAB | 41-5213-810 | الكيمياء المناعية ؛ القسم 6. استخدم تحت غطاء الدخان | |
| زولازيبام هيبوكلوريد | زوليتيل ، فيرباك ، فرنسا | تحضير للجراحة ، القسم 1 | |
| شرائط الشمع لإزالة الشعر | Veet | تحضير للجراحة ، القسم 1 | |
| الصوديوم Pentobarbital | Lundbeck | ، القسم 3 |
المراجع
- Rheinwald, J. G., Green, H. Serial cultivation of strains of human epidermal keratinocytes: the formation of keratinizing colonies from single cells. Cell. 6, 331-343 (1975).
- Fossum, M., Nordenskjold, A., Kratz, G. Engineering of multilayered urinary tissue in vitro. Tissue Engineering. 10, 175-180 (2004).
- Salmikangas, P., et al. Manufacturing, characterization and control of cell-based medicinal products: challenging paradigms toward commercial use. Regen Med. 10, 65-78 (2015).
- Guidelines of 7 March 2013 on Good Distribution Practice of medicinal products for human use (OJ C 343/1, 23.11.2013). 7, Retrieved from: http://ec.europa.eu/health/human-use/good_distribution_practice/index_en.htm (2013).
- Fossum, M., et al. Minced skin for tissue engineering of epithelialized subcutaneous tunnels. Tissue Engineering. Part A. 15, 2085-2092 (2009).
- Fossum, M., et al. Minced urothelium to create epithelialized subcutaneous conduits. The Journal of Urology. 184, 757-761 (2010).
- Reinfeldt Engberg, G., Lundberg, J., Chamorro, C. L., Nordenskjold, A., Fossum, M. Transplantation of autologous minced bladder mucosa for a one-step reconstruction of a tissue engineered bladder conduit. BioMed Research International. 2013, 212734(2013).
- Meek, C. P. Successful microdermagrafting using the Meek-Wall microdermatome. Am J Surg. 96, 557-558 (1958).
- Tanner, J. C., Vandeput, J., Olley, J. F. The Mesh skin graft. Plastic and Reconstructive Surgery. 34, 287-292 (1964).
- Svensjo, T., et al. Autologous skin transplantation: comparison of minced skin to other techniques. The Journal of Surgical Research. 103, 19-29 (2002).
- Ajalloueian, F., Zeiai, S., Rojas, R., Fossum, M., Hilborn, J. One-stage tissue engineering of bladder wall patches for an easy-to-use approach at the surgical table. Tissue Engineering. Part C, Methods. 19, 688-696 (2013).
- Engelhardt, E. M., et al. A collagen-poly(lactic acid-co-varepsilon-caprolactone) hybrid scaffold for bladder tissue regeneration. Biomaterials. 32, 3969-3976 (2011).
- Brown, R. A., Wiseman, M., Chuo, C. B., Cheema, U., Nazhat, S. N. Ultrarapid engineering of biomimetic materials and tissues: fabrication of nano- and microstructures by plastic compression. Adv Funct Mater. 15, 1762-1770 (2005).
- Fumagalli Romario, U., Puccetti, F., Elmore, U., Massaron, S., Rosati, R. Self-gripping mesh versus staple fixation in laparoscopic inguinal hernia repair: a prospective comparison. Surg Endosc. 27, 1798-1802 (2013).
- Muangman, P., et al. Complex Wound Management Utilizing an Artificial Dermal Matrix. Annals of Plastic Surgery. 57, 199-202 (2006).
- Ajalloueian, F., Zeiai, S., Fossum, M., Hilborn, J. G. Constructs of electrospun PLGA, compressed collagen and minced urothelium for minimally manipulated autologous bladder tissue expansion. Biomaterials. 35, 5741-5748 (2014).
- Orabi, H., AbouShwareb, T., Zhang, Y., Yoo, J. J., Atala, A. Cell-seeded tubularized scaffolds for reconstruction of long urethral defects: a preclinical study. Eur Urol. 63, 531-538 (2013).
- Blais, M., Parenteau-Bareil, R., Cadau, S., Berthod, F. Concise review: tissue-engineered skin and nerve regeneration in burn treatment. Stem Cells Transl Med. 2, 545-551 (2013).
- Serpooshan, V., Muja, N., Marelli, B., Nazhat, S. N. Fibroblast contractility and growth in plastic compressed collagen gel scaffolds with microstructures correlated with hydraulic permeability. J Biomed Mater Res A. 96, 609-620 (2011).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
