بروتوكول لعزل خلايا الكبد الإنسان الابتدائية والموافق السكان الرئيسية للخلايا الكبد غير متني

ملخص

تم وصف تقنية لعزل خلايا الكبد البشرية وخلايا الكبد غير المتني من نفس المتبرع. تبني أنواع خلايا الكبد المختلفة الأساس لنماذج الكبد الوظيفية وهندسة الأنسجة. تهدف هذه الطريقة الجديدة إلى عزل خلايا الكبد بإنتاجية عالية وقابلية للحياة.

الملخص

بجانب خلايا الكبد متني، والكبد يتكون من خلايا غير متني (مجلس الشعب) وهي خلايا كوبفر (KC)، الكبد الخلايا البطانية (كرا) والخلايا النجمية الكبدية (شهادة الثانوية العامة). لا تزال تعتبر ثنائي الأبعاد (2D) ثقافة الكبدية الإنسان الأساسية (PHH) باسم "المعيار الذهبي" لفي التجارب المختبرية من استقلاب الدواء وتسمم الكبد. ومن المعروف جيدا أن الأحادية 2D من PHH يعاني من فقد التمايز وفقدان الوظيفة. في الآونة الأخيرة تبين أن الكبد مجلس الشعب لعب دورا مركزيا في الكبد (patho-) علم وظائف الأعضاء والحفاظ على وظائف PHH. وتركز أبحاث الحالي على إعادة البناء في الجسم الحي العمارة الأنسجة عن طريق 3D- وثقافة مشتركة نماذج للتغلب على القيود المفروضة على الزراعات الأحادية 2D. سبق أن نشرت طريقة لعزل خلايا الكبد البشرية والتحقيق في مدى ملاءمة هذه الخلايا لاستخدامها في مزارع الخلايا في البيولوجيا التجريبية والطب ^1. وبناء على اهتمام واسع في هذه الشركة المصرية للاتصالاتchnique الهدف من هذه المادة هو توفير بروتوكول أكثر تفصيلا لعملية عزل خلايا الكبد بما في ذلك الفيديو، والتي سوف تسمح للاستنساخ من السهل لهذه التقنية.

تم عزل خلايا الكبد البشرية من عينات أنسجة الكبد الإنسان من التدخلات الجراحية التي من خطوتين EGTA / كولاجيناز تقنية P الارواء. تم فصل PHH من مجلس الشعب قبل الطرد المركزي الأولي في 50 ز س. واستخدمت كثافة خطوات الطرد المركزي التدرج لإزالة الخلايا الميتة. تم عزل السكان خلية الكبد الفردية من الكسر مجلس الشعب المخصب باستخدام خصائص خلية معينة وإجراءات الفرز الخلية. إلى جانب العزلة PHH تمكنا من فصل KC، كرا وشهادة الثانوية العامة للحصول على مزيد زراعة.

مجتمعة، بما يسمح للبروتوكول المعروضة عزل PHH ومجلس الشعب في ذات جودة عالية وكمية من عينة الأنسجة المانحة واحد. الوصول إلى السكان خلية الكبد تنقية قد يسمح بإنشاء في الجسم الحي مثل لى البشرينماذج الاصدار.

المقدمة

أنسجة الكبد الإنسان هي معقدة للغاية، ويتألف من كيانين مختلفين الخلايا، والخلايا متني والخلايا غير متني (مجلس الشعب). وتشمل خلايا الكبد متني خلايا الكبد وcholangiocytes. وتمثل خلايا الكبد 60-70٪ من مجموع خلايا الكبد، وتمثل أكثر من وظائف الكبد الأيضية، على سبيل المثال، الحامض المراري وتكمل تصنيع العامل، أحيائي والطاقة والتمثيل الغذائي ^2،3.

يشكل جزءا مجلس الشعب أصغر 30-40٪ من مجموع خلايا الكبد. تشمل مجلس الشعب السكان مختلفة من الخلايا، وهي خلايا كوبفر (KC)، وخلايا الكبد البطانية (كرا) والخلايا النجمية الكبدية (شهادة الثانوية العامة). هذا جزء الخلية غيروي المنشأ يلعب دورا رئيسيا في العمليات الفسيولوجية للكبد. بالإضافة إلى ذلك، مجلس الشعب المشاركة في التوسط تلف الكبد الحاد، على سبيل المثال، إصابة المخدرات التي يسببها الكبد (ديلي)، فضلا عن وقوع إصابات الكبد المزمنة، مثل تليف الكبد ^4.

في السنوات الأخيرة، حأصبحت خلايا الكبد أومان المزيد والمزيد من الضروري في البحث والتطوير لاختبار المخدرات، تطوير العقاقير وتحديد المسارات البيوكيميائية جديدة في أمراض الكبد. لفي التجارب المختبرية لا تزال تعتبر الزراعات الأحادية PHH باسم "المعيار الذهبي" ^5. القيد الرئيسي من نماذج الكبد مثلي النمط الحالي هو فقد التمايز وفقدان وظيفة خلايا الكبد في غضون بضعة أيام ^4. وقد أظهرت إنشاء تقنيات 3 الأبعاد (3D) الثقافة أن هذه القيود يمكن تعويض ^4،6. ومع ذلك، وحتى تقنيات زراعة 3D الحديثة ليست قادرة على عرض جميع وسائط كبدية من الإجراءات ^7. وتناقش في عداد المفقودين السكان مجلس الشعب في المختبر في النماذج القائمة كسبب محتمل لهذا التفاوت إلى الوضع في الجسم الحي. فقد تبين أن البلاغ خلية خلية بين مختلف مجموعات خلايا الكبد يلعب دورا محوريا في التوازن الفسيولوجي ولكن أيضا في pathophysiologic العمليات ^8. وبالتالي فإن الاهتمام العلمي يركز أكثر فأكثر على مجلس الشعب والتفاعلات خلية خلية بهم. استعمالها هادفة في ثقافة مشتركة وأنظمة الأنسجة المهندسة ويمكن أن يكون حلا لارتفاع الطلب في المختبر نماذج الكبد ^8،9 والتي هي أقرب إلى الوضع في الجسم الحي وقت ممكن.

حاليا التحدي الرئيسي هو تطوير نموذج الكبد شارك في ثقافة الإنسان موحد، والذي يحتوي على أجزاء محددة بوضوح من PHH ومجلس الشعب. ونتيجة لذلك، هناك حاجة إلى تقنيات العزل للخلايا الكبد غيروي المنشأ جدا وأولئك يجب أن يكون الأمثل للحصول على السكان الخلية نقية. في حين بروتوكولات موحدة لPHH العزلة وجود ^10، وعزل موحدة للمجلس الوطنى البشري لا يزال قيد التطوير. وتستند معظم نشرت البروتوكولات العزلة مجلس الشعب على التجارب مع الخلايا غير البشرية ^11،12. تصف سوى عدد قليل من المنشورات عملية عزل مجلس الشعب البشري والأكثر تغطية فقططرق لعزل خلية واحدة نوع ^11-16. خصائص الخلية الأكثر أهمية التي تم تسخيرها لفصل الخلايا هي الحجم والكثافة، والسلوك المرفق، والتعبير عن البروتينات السطحية. على أساس هذه الخصائص قمنا بتطوير بروتوكول مبسط لعزل PHH، KC، كرا وشهادة الثانوية العامة، والتي نشرت سابقا في البيولوجيا التجريبية والطب ^1. ونظرا لاهتمام واسع في هذه التقنية، وكان الهدف من هذه المقالة لتوفير بروتوكول أكثر تفصيلا لعملية عزل خلايا الكبد بما في ذلك الفيديو، والتي سوف تسمح للاستنساخ هذه التقنية بشكل أكثر سهولة. ويشمل البروتوكول أيضا أساليب مراقبة الجودة لتقييم العائد والجدوى فضلا عن تحديد ونقاء تقييم استخدام immunostainings محددة.

البروتوكول

ملاحظة: تم عزل جميع الخلايا من مقطوعة غير ورمي أنسجة الكبد الإنسان، التي بقيت بعد استئصال الكبد الجزئي مع أورام الكبد الأولية أو الثانوية. تم الحصول على الموافقة المسبقة من المرضى وفقا للمبادئ التوجيهية الأخلاقية للشاريتيه - Universitätsmedizin برلين.

1. إعداد مواد وحلول

1. تعقيم جميع الأدوات والمواد في وقت مبكر لتفادي التلوث البكتيري أثناء عملية العزل.
2. إعداد الحلول اللازمة لنضح من عينة أنسجة الكبد، عملية عزل خلايا الكبد وخلايا الكبد غير متني وزراعة خلايا الكبد البشرية الأساسية وفقا لالجدولين 1 و 2، مع استثناء من الهضم، الحل الذي الطازجة قبل استخدامها. ويمكن تخزين كل الحلول عند 4 درجات مئوية، وينصح لاستخدامها في غضون 4 أسابيع بعد الإعداد.
3. عقمجميع الحلول باستخدام فلتر كبار 0،22 ميكرون زجاجة.

2. إعداد المعدات الإرواء

1. إعداد المعدات اللازمة لنضح والهضم من عينة أنسجة الكبد كما هو مبين في الشكل 1A.
2. ضبط درجة حرارة حمام الماء إلى 39 درجة مئوية لضمان النشاط P كولاجيناز المثلى خلال نضح والهضم.

3. الإرواء والهضم من عينة الكبد الأنسجة (1.5 ساعة)

1. اختيار عينة الأنسجة مع كبسولة وغليسون سليمة من أنسجة الكبد مقطوعة. عندما قطع عينات الأنسجة، في محاولة للحصول على سطح قطع صغيرة مع السفن مرئية جيدة. تجنب الأوقات نقص التروية الدافئة من خلال نقل والتعامل مع عينة أنسجة الكبد على الجليد حتى نضح.
2. تأخذ وزن الأنسجة تحت ظروف معقمة ووضع عينة أنسجة الكبد في طبق بتري في تدفق الهواء الصفحي. تنظيف سطح عينة الأنسجة مع ضغط العقيمة من إعادةاملتبقي الدم وطرد مجموعة قنية باستخدام 1X الإرواء، الحل الأول للتأكد من أن كل قنية كانت قابلة للاختراق.
3. استخدام الغراء الأنسجة لإصلاح الزيتون للقنية في بعض الأوعية الدموية الكبيرة. اعتمادا على حجم العينة أنسجة الكبد وعدد من السفن على السطح، واستخدام قنية مع مجموعة 3-8 قنية. اختبار نضح والتحقق من وجود تسرب. إغلاق جميع الأوعية الدموية، مما تسرب واضح 1X الإرواء، الحل الأول، مع الغراء الأنسجة.
4. ضع عينة أنسجة الكبد مقنى في قمع بوشنر عن دورتها مرشح القرص مثقب (الشكل 1A).
5. ضبط معدل تدفق المضخة تحوي بين 7.5 مل / دقيقة و 14.6 مل / دقيقة اعتمادا على عدد من قنية المستخدمة وعلى المقاومة من أنسجة الكبد. ضبط معدل تدفق في كل مرة لضمان عدم وجود نضح الحالي ولكن ببطء. يروي الأنسجة حتى يتم مسح الدم الكامل بها ولكن لا يقل عن 20 دقيقة. مراقبة الأنسجة تصبح أكثر إشراقا في المناطق التي perfusi جيدعلى.
   ملاحظة: في بعض الحالات، قد يكون من الضروري اتخاذ اجراءات واحدة من قنية مع المشابك البلاستيكية أو لزيادة الضغط الداخلي للمنطقة عن طريق دفع بهدوء مع ملعقة ضد كبسولة الكبد، لتحسين التروية. تغيير لون الكامل إلى أصفر الضوء على اللون البني الفاتح يشير إلى وجود نضح جيد.
6. تغيير السائل نضح على الهضم، الحل تحتوي على كولاجيناز P (الجدول 1).
7. إعادة ترتيب الإعداد (الشكل 1A) للخطوة عملية الهضم. وبالتالي تؤدي إلى تدفق دائري الهضم-الحل وفقا ل1B الشكل لمدة تصل إلى 15 دقيقة.
   ملاحظة: من المهم جدا لوقف نضح على الفور عندما يتم هضمها عينة أنسجة الكبد بما فيه الكفاية. والهضم الجيد ويمكن ملاحظة، عندما تظهر الأنسجة أي علامة على مرونة وفقا لتقييم صيانة التشوهات كبسولة، عندما يتم الضغط عليه مع ملعقة.

4. عزل خلايا الكبد (1 ساعة)

1. تجرة مضخة تحوي قبالة ووضع عينة أنسجة الكبد في وعاء زجاجي. شطف خارج عينة الأنسجة مع الجليد الباردة توقف الحل (الجدول 1). إزالة قنية من عينة أنسجة الكبد. استخدام مشرط لفتح عينة أنسجة الكبد، عن طريق عمل قطع في منتصف المنطقة التي كانت تعلق قنية. حافظ على الرعاية التي الكبسولة Glisson's تبقى سليمة.
2. شطف داخل عينات الأنسجة ومن ثم تغطية عينة النسيج كله مع الجليد الباردة توقف الحل. هزة الأنسجة بلطف للافراج عن الخلايا من الأنسجة.
3. جمع تعليق خلية وتصفية عليه من خلال نظرة القمع (قمع البلاستيك واصطف مع ضغط الشاش) إلى 50 مل أنابيب البلاستيك. إضافة المزيد من توقف حل لعينة أنسجة الكبد حتى يتم استهلاك الحجم النهائي من 500 مل.
4. الطرد المركزي تعليق خلية في 50 x ج، 5 دقائق، 4 درجات مئوية. جمع طاف لاحقة عزل الخلايا غير متني. غسل بيليه الخلية مع برنامج تلفزيوني (الشكل 2A).
5. الطرد المركزي تعليق الخلية مرة أخرى في 50 x ج، 5 دقائق، 4 درجات مئوية. جمع طاف وإعادة تعليق بيليه في الكبدية الحضانة المتوسطة (الجدول 2، الشكل 2B).
6. تحديد عدد الخلايا وقدرتها على البقاء في تعليق الخلية الناتجة باستخدام تلطيخ التريبان الأزرق. عدد الأحياء والخلايا الميتة في عد غرفة نويباور. حساب عدد الخلايا، والسلامة والعائد من PHH باستخدام الصيغ أدناه.
   
   العائد (خلايا تحصى) = خلايا عدها س عامل تخفيف حجم العاشر من تعليق خلية (مل) × 10000
   
   العائد (خلايا الكبد / (ز الكبد عينة الأنسجة)) = (الغلة (خلايا الكبد / (وسائل الإعلام مل)) X الحجم من تعليق خلية (مل)) / (وزن عينة أنسجة الكبد (ز))
   
   الجدوى (٪) = 100٪ × (عدد الخلايا الحية) / (إجمالي عدد الخلايا)

5. تنقية خلايا الكبد (1 ساعة)

ملاحظة: هذه الخطوة مستحسن تنقية، إذا الجدوىأقل من 70٪.

1. تنفيذ جميع الخطوات على الجليد. إعداد 25٪ التدرج الكثافة عن طريق خلط 5 مل من محلول كثافة التدرج و 15 مل برنامج تلفزيوني لمدة الطرد المركزي التدرج الكثافة.
2. وضع حد أقصى قدره 50 خلية ميو في مجموعه من الكبدية تعليق خلية غنية بعناية وببطء على أعلى من 25٪ طبقة التدرج الكثافة لضمان فصل واضح من كل الطبقات ويتحقق (الشكل 2C). وضع أنابيب بعناية في أجهزة الطرد المركزي وأجهزة الطرد المركزي في 1250 x ج، 20 دقيقة، 4 درجات مئوية دون فرامل (الشكل 2D).
3. نضح تعليق خلية المتبقية والخلايا الميتة في الطور البيني. تبعا للنوع المحتوى من الدهون ويمكن أيضا نضح كثافة التدرج حل.
   ملاحظة: PHH مع محتوى الدهون منخفضة تشكيل بيليه كثيفة والتدرج الكثافة يمكن أن يستنشق تماما. PHH مع محتوى الدهون عالية تشكيل بيليه أكثر انتشارا والكثير من خلايا قابلة للحياة قد تبقى في حل التدرج الكثافة فوق بيليه.
4. اعادة تعليق الكريات الكبدية مع برنامج تلفزيوني وأجهزة الطرد المركزي مرة أخرى في 50 x ج، 5 دقائق، 4 درجات مئوية. تجمع الكريات، ويغسل مرة أخرى مع برنامج تلفزيوني واعادة تعليق النقي PHH في الكبدية الحضانة المتوسطة. أداء عد الخلايا كما هو موضح في الخطوة 4.6.

6. زراعة خلايا الكبد

1. إعداد أطباق زراعة الخلايا لزرع البذور من PHH من طلائها مع المصفوفة خارج الخلية، على سبيل المثال ذيل فأر الكولاجين (نوع الكولاجين الأول). إعداد الكولاجين ذيل فأر وفقا للبروتوكول المعمول به من قبل راجان وآخرون. ¹⁷
2. تمييع ذيل فأر حل الأسهم الكولاجين 1: 200 في برنامج تلفزيوني. نقل 100 ميكرولتر / سم ² الفئران حل الذيل الكولاجين في أطباق الثقافة، مع الحرص على أن يتم تغطية السطح كله. احتضان البلاستيك زراعة الخلايا لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. نضح في ذيل فأر حل الكولاجين المتبقية.
3. البذور 15 × 10 ⁴ خلايا الكبد / سم ² في الكبدية الحضانة المتوسطة على dishe الثقافةق المغلفة مع الكولاجين ذيل فأر. زراعة الخلايا في حاضنة ترطيب عند 37 درجة مئوية، و 5٪ CO ₂ لمدة 4 على الأقل ساعة. بعد 4 ساعات انضمت خلايا الكبد ويمكن تغيير المتوسطة.
4. أداء التحقيقات اعتمادا على الإعداد التجريبية. ينصح الوقت ثقافة 48 ساعة للسماح للخلايا للتعافي من عملية العزلة.

7. عزل خلايا الكبد غير متني (1.5-2 ساعة)

1. الطرد المركزي طاف جمعها (الخطوة 4.5 و 4.6) في 72 x ج، 5 دقائق، 4 درجات مئوية للقضاء على خلايا الدم الحمراء وخلايا الكبد المتبقية. تجميع supernatants وأجهزة الطرد المركزي لهم مرتين للحصول على اثنين من الكريات الخلايا: 300 x ج، 5 دقائق، 4 درجة مئوية لمدة الترسيب من شهادة الثانوية العامة، كرا وجزئيا KC و 650 x ج، 7 دقائق، 4 درجة مئوية لمدة الترسيب ما تبقى من KC.
2. تجمع كل من الكريات وإعادة تعليق عليها في HBSS. إعداد 25٪ والتدرجات 50٪ الكثافة عن طريق خلط حل التدرج الكثافة وبرنامج تلفزيوني لمدة centrif كثافة التدرجugation (25٪ محلول كثافة التدرج: 5 مل كثافة حل التدرج و 15 مل في برنامج تلفزيوني، 50٪ محلول التدرج الكثافة: 10 مل كثافة حل التدرج و 10 مل في برنامج تلفزيوني، انظر الشكل 2). وضع 25٪ من محلول كثافة التدرج بعناية على أعلى من 50٪ كثافة التدرج طبقة فحل.
3. ضع تعليق مجلس الشعب بعناية وببطء على أعلى من 25٪ كثافة التدرج طبقة فحل في الطريقة التي يتم بها تحقيق فصل واضح من كل الطبقات.
4. الطرد المركزي تعليق خلية في التدرج الكثافة في 1800 x ج، 20 دقيقة، 4 درجات مئوية دون فرامل (الشكل 2.2).
5. نضح الخلايا الميتة وبقايا الخلايا من الطبقة العليا. وتقع على مجلس الشعب في الطور البيني بين 25٪ و 50٪ التدرج الكثافة طبقة (الشكل 2). جمع مجلس الشعب، وغسلها مع HBSS وأجهزة الطرد المركزي تعليق خلية تطبيق وصف خطوة الطرد المركزي المزدوجة أعلاه (الخطوة 7.2).

8. فصل خلايا كوبفر (الالتزامالخطوة الانفصال) (1 ساعة)

1. إجراء تعداد خلايا لKC في جزء مجلس الشعب كما هو موضح في الخطوة 4.6. (للحصول على مظهر KC في تعليق انظر الشكل 3B). الطرد المركزي الكسر مجلس الشعب مع مزدوجة الطرد المركزي خطوة المذكورة أعلاه (الخطوة 7.2) وإعادة تعليق مجلس الشعب في كوبفر خلية البذر المتوسطة (الجدول 2).
2. البذور وKC تحتوي على جزء على السفن زراعة الخلايا البلاستيكية في مناطق ذات كثافة 5 × 10 ⁵ KC / سم ^2. احتضان الثقافات KC لمدة 20 دقيقة في حاضنة ترطيب عند 37 درجة مئوية، و 5٪ CO _2. KC الأساسي الالتزام على البلاستيك زراعة الخلايا في غضون فترة قصيرة من الزمن (الشكل 2.3).
3. جمع طاف تحتوي لم تلتزم مجلس الشعب، التي تتألف أساسا من كرا وشهادة الثانوية العامة. تجميع supernatants لفصل لاحق من LEC (انظر القسم 9)، وشهادة الثانوية العامة (انظر المادة 10). غسل KC ملتصقة مع HBSS وزراعتها في كوبفر خلية ثقافة المتوسط ​​(الجدول 2) عند 37 درجة مئوية، و 5٪ CO₂ في حاضنة مرطب.

9. فصل الخلايا البطانية (1.5 ساعة)

1. الطرد المركزي طاف جمعها (الخطوة 8.5) في 300 x ج، 5 دقائق، 4 درجات مئوية. غسل بيليه مع برنامج تلفزيوني. بعد الطرد المركزي في 300 x ج، 5 دقائق، 4 ° C اعادة تعليق الخلايا النجمية في خلية / البطانية المتوسطة الفصل الخلية وإجراء تعداد خلايا لجميع الخلايا المتبقية كما هو موضح في الخطوة 4.6.
2. اعادة تعليق 1 × 10 ⁷ خلايا ميو في 1 مل النجمية خلية / البطانية المتوسطة الفصل الخليوي، إضافة 20 ميكرولتر عرقلة الحل من أجهزة ماكينتوش-KIT و 20 ميكرولتر من الخرز CD31 مايكرو لimmunolabeling واحتضان تعليق مما أدى لمدة 15 دقيقة على 4 درجة مئوية درجة الحرارة (الشكل 2.4).
3. كرا منفصل عن شهادة الثانوية العامة كما هو موضح في بروتوكول manufacturer's للخلية الفرز نظام تنشيط مغناطيسيا أجهزة ماكينتوش (الشكل 2.5). أزل احتفظ مغناطيسيا كرا-CD31 إيجابي وتعليق عليها في النجمية Cالذراع / البطانية مستنبت الخليوي (الجدول 2).
4. أداء الخلية عد لكرا كما هو موضح في الخطوة 4.6. كرا البذور في كثافة 1.25 × 10 ⁵ خلية / سم ² في الأوعية زراعة الخلايا المغلفة مع الكولاجين ذيل فأر (راجع الخطوة 6.1). زراعة الخلايا عند 37 درجة مئوية، و 5٪ CO ₂ في حاضنة مرطب.

10. فصل الخلايا النجمية (0.5 ساعة)

1. غير المسماة شهادة الثانوية العامة اجتياز عمود الفصل أثناء إجراء بالاعمال. جمع جزء شهادة الثانوية العامة (راجع الخطوة 9.5، الشكل 2.5). أداء عد الخلايا كما هو موضح في الخطوة 4.6.
2. شهادة الثانوية العامة البذور مع كثافة 5 × 10 ⁴ خلية / سم ² في الأوعية زراعة الخلايا المغلفة مع الكولاجين ذيل فأر (راجع الخطوة 6.1) في النجمية خلية / البطانية مستنبت الخليوي (الجدول 2) وزراعة لهم عند 37 درجة مئوية، و 5٪ CO ₂ في حاضنة مرطب.

الجدول 1: الإرواء وحل العزلة.

الجدول 2: الثقافة والعزلة وسائل الإعلام.

النتائج

فصل في متني وغير متني جزء، وذلك باستخدام الكثافة الطرد المركزي التدرج كإجراء تنظيف جنبا إلى جنب مع استخدام خصائص الالتزام وأجهزة ماكينتوش يؤدي إلى نجاح PHH ومجلس الشعب العزلة. PHH ومجلس الشعب يمكن أن تكون معزولة في ذات جودة عالية وكمية ويبين الشكل 1 الإعداد تمثيلية من المعدات اللازمة لنضح الكبد والهضم. تم إضافة 10٪ FCS إلى كولاجيناز P تحتوي على الإرواء - الحل الثاني للحد من نشاط بروتين البروتياز والعمل على استقرار النشاط P كولاجينا...

المناقشة

يصف بروتوكول نشر تقنية لعزل النقي PHH ومجلس الشعب، وهي KC، شهادة الثانوية العامة وكرا، في وقت واحد في ذات جودة عالية ونقاء من نفس عينة من أنسجة الكبد الإنسان. غالبية المنشورات التعامل مع العزلة خلية الكبد وتغطي واحد من هؤلاء السكان الخلية ^18-20 وإجراءات العزل يؤديها مع الأنسجة البشرية فقط نادرة (التي استعرضتها دام وآخرون.) ^21. التكيف من أساليب أنشئت مع الأنسجة الحيوانية (على سبيل المثال، كبد الفئران) لكبد الإنسان وكشف العديد من الاختلافات في...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
<قوية> معدات عامة< / قوية>
PIPETBOY	ماصات إيبندورف
	مجهر إيبندورف
	مجهر كارل زايس
	أوليمبوس
CO2< / حاضنة فرعية >	الموثق
لامين اير	هيريوس
الطرد المركزي فاريفوج 3.0R	هيريوس
دورق بول	سارستيدت	2041101
حقنة بيرفيوسور 50 مل	B.Braun	12F0482022
فلتر علوي للزجاجة	نالجين	1058787
فالكون 50 مل أنبوب مخروطي بولي بروبيلين	BD Biosciences	352070
فالكون 15 مل أنبوب مخروطي بولي بروبيلين	BD Biosciences	352096
لوحة زراعة الأنسجة	BD Biosciences	533047	24
ماصة مصلية بئر BD	Biosciences	357525 ، 357551 ، 357543	25 مل ، 10 مل ، 5 مل
أطراف ماصة	SARSTEDT	0220 / 2278014 ، 0005 / 2242011 ، 0817 / 2222011	100 & micro ؛ لتر ، 200 وميكرو ؛ لتر ، 1,000 وميكرو ؛
ل<قوي>الاسم	<قوي>الشركة	رقم الكتالوج	تعليقات
عزل المعدات
حمام مائي	Lauda
مضخة تمعجية	كارل روث
ترموستات	Lauda
مقياس الأس الهيدروجيني	Schott
مقاييس دقيقة	Sartorius
حامل
Bü قنية قنية
مع أطراف
ملقط
صحن
مشرط	ريشة	12068760
	المخاض
	كوستار
الستارة الجراحية	Charit & eacute ؛ Universitä tsmedizin Berlin	A2013027
ضغط	Fuhrmann	40013331
قفازات جراحية معقمة	Gammex PF	1203441104
غراء الأنسجة	B. زجاجة زجاجية 1050052
	VWR
Collagenase P	Roche	13349524
Percoll حل فصل	Biochrom	L6145	الكثافة 1.124 جم / مل
هانك s BSS	PAA	H00911-3938
Dulbecco ' s PBS	PAA	H15 - 002	بدون ملغ / كالسيوم
أمبووا	بلاستيبور   ؛	13CKP151
الألبومين	سيجما ألدريتش	A7906
كلوريد الصوديوم	ميرك	1,064,041,000
كيلو كلوريد	ميرك	49,361,000
هيبس البفيران	Roth	133196836
EDTA	Sigma	E-5134
Name	Company	Catalog Number	Comments
Media Equipment  < / قوي>
DMEM	PAA	E15-005	منخفض الجلوكوز (1 جم / لتر) (بدون L-Glutamine) محلول
عازلة HEPES 1   ؛ إم	جيبكو	1135546
ل-جلوتامين	جيبكو	25030-024	200 ملي
NEA	GIBCO	11140-035
البنسلين / الستربتومايسين	جيبكو	15140-122
RPMI 1640	PAA	E15 - 039	بدون L-Glutamine
Sodium Pyruvate	GIBCO	1137663	100 ملي
تريبان أزرق الحل	سيجما ألدريتش	T8154	0.4٪
ويليام s E	GIBCO	32551-020
مع GlutaMAX & trade ؛
EGTA	سيجما ألدريتش	03780-50 جم
فورتيكورتين	ميرك	49367	8 مجم / 2 مل
الأنسولين البشري	ليلي	HI0210	100 IE / مل
N-Acetyl سيستين	سيجما ألدريتش	A9165-5G
مصل عجل الجنين (FCS) PAA		A15-101
Name< / strong>	Company	Catalog Number	Comments
Equipment for Immunostainings
CD 68	R& D Systems ، الولايات المتحدة الأمريكية		أحادية النسيلة
CK 19	سانتا كروز	D2309	متعددة النسيلة
CK18	سانتا كروز	K2105	أحادية
Vimentin	سانتا كروز		أحادية النسيلة
GFAP	Sigma Aldrich		أحادية النسيلة
Triton X-100	Sigma Aldrich	23.472-9
الماعز المضادة للفأر IgG1-PE	سانتا كروز	C0712
الماعز المضاد للأرانب IgG-FITC	سانتا كروز	L0412
ميثانول	جي تي بيكر	1104509006
الفورمالديهايد 4٪	هيربيتا أرزنيميتيل	200-001-8
ألبومين مصل الأبقار (BSA)	سيجما ألدريتش	A7906-100G