يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

نظام عضوي إنتاجية عالية لتوصيف الدواء حساسية خلايا المايلوما المتعددة الابتدائية

8.3K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/53070

⸱

يوليو 15, 2015

 ,  ,  ,  , 
1Department of Cancer Imaging and Metabolism, H. Lee Moffitt Cancer Center and Research Institute

في هذه المقالة

ملخص

نصف مقايسة حساسية الدواء عالية الإنتاجية لخلايا الورم النقوي المتعدد الأولية. وهو يتألف من إعادة بناء البيئة المكروية لنخاع العظم (بما في ذلك المصفوفة خارج الخلية والسدى) في ألواح متعددة الآبار ، وطريقة غير جراحية للقياس الكمي الطولي لصلاحية الخلية.

الملخص

في هذا العمل وصفنا نهج الرواية التي تجمع بين خارج الجسم الحي المقايسات حساسية العقاقير وتحليل الصور الرقمية لتقدير chemosensitivity وتجانس المايلوما المتعددة (MM) الخلايا المشتقة من المريض. هذا النهج يتمثل في بذر خلايا MM الأولية المستخرجة حديثا من شفاطات نخاع العظم في غرف ميكروفلويديك تنفيذها في لوحات متعددة جيدا، يتألف كل منها من إعادة بناء المكروية نخاع العظم، بما في ذلك المصفوفة خارج الخلية (الكولاجين أو الغشاء القاعدي المصفوفة) وسدى (patient- الخلايا المشتقة الجذعية الوسيطة) أو الخلايا البطانية المستمدة البشرية (HUVECs). يتم تخديره غرف مع وكلاء وتركيزات مختلفة، ويتم تصوير متتالي لمدة 96 ساعة من خلال مشرق المجهري الميدان، في المجهر الآلية مزودة بكاميرا رقمية. الرقمي صورة برامج التحليل بالكشف عن الخلايا الحية والميتة من وجود أو عدم وجود حركة الغشاء، ويولد منحنيات التغير في جدوى بوصفها وظيفة سو تركيز الدواء ومدة التعرض. نستخدم النموذج الحسابي لتحديد معالم chemosensitivity من السكان الورم إلى كل دواء، فضلا عن عدد من السكان الفرعي الحالي كمقياس للورم عدم التجانس. ويمكن بعد هذه النماذج مصممة خصيصا المريض استخدامها لمحاكاة الأنظمة العلاجية وتقدير الاستجابة السريرية.

المقدمة

والهدف من هذه الطريقة هو أن تميز حساسية العقاقير من المايلوما المتعددة (MM) الخلايا الأولية إلى لجنة من وكلاء خارج الحي، في أقرب وقت ممكن إلى الظروف الفسيولوجية، وبدقة كافية أن هذه النتائج يمكن استخدامها لتحديد chemoresistant الفرعية السكان داخل عبء الورم و، في نهاية المطاف، إلى بالحدود نماذج حسابية تهدف إلى تقدير استجابة سريرية.

النماذج الحسابية هي أدوات قوية لتحليل النظم المعقدة، مثل التفاعلات السرطان في استضافة العلاج. ومع ذلك، ليست سوى نماذج جيدة مثل البيانات المستخدمة لبالحدود لهم. لسوء الحظ، فإن معظم البيانات المتاحة في الأدب لا يمكن استخدامها في شكلها الحالي لبالحدود مثل هذه النماذج، لأنها غالبا ما يتم الحصول عليها في ظروف تجريبية يستبعد بعضها بعضا. وهكذا، غالبا ما يطلب من التجارب الجديدة وذلك بهدف الحصول على مجموعة من المعلمات التجريبية الحاجة. معظم فحوصات جدوى، ومع ذلك، هي مدمرة واللنا تقتصر على عدد قليل من النقاط الزمنية، في كثير من الأحيان واحدة فقط. هذا يعيق كثيرا من استخدام المقايسات chemosensitivity إلى بالحدود النماذج الحسابية، لأن مثل هذه التجارب تفشل في توفير معلومات عن ديناميات الزمنية للنظام. هذا ينطبق بشكل خاص مع الخلايا السرطانية الأولية، والتي غالبا ما تقتصر على بضعة ملايين في العينة، ولها عمر قصير بعد الخزعة، مما يحد من عدد من الظروف التجريبية المتاحة هذا. وبالإضافة إلى ذلك، فإن معظم فحوصات الجدوى تتطلب فصل من السرطان من غير السرطانية (سدى) الخلايا في وقت الكمي، وهو ما يضيف العمل الإضافي للبروتوكول، مما يشوش على الخلايا، ويحد من عدد من التجارب التي يمكن القيام بها .

قبل 40 عاما، سمك السلمون والمتعاونين 1 اقترح الشهيرة في المختبر تشكيل مستعمرة الفحص لتقييم chemosensitivity الخلايا السرطانية. للأسف وجدت هذا الاختبار متفاوتة من النجاح نظرا لقلة عدد MYE متعددةLOMA (MM) عينات المريض التي كانت قادرة على تشكيل مستعمرات تحت ظروف التحكم: وتشير التقديرات إلى أنه ليس هناك سوى مجموعة فرعية صغيرة من 0.001٪ إلى 0.1٪ من خلايا MM كانت قادرة على تكرارها، ويجري توصف بأنها خلايا الجذعية المايلوما المتعددة 2. هذه محدودة إلى حد كبير من نسبة نجاح الفحص وعدد من الأدوية التي يمكن اختبارها في وقت واحد، حتى في أكثر النماذج الأخيرة 3. هذه المسألة هي أكثر أهمية بكثير الآن عندما كلاء MM (معيار أو تجريبي) هم أكثر عددا مما كانت عليه قبل أربعة عقود.

وجود قيود كبير من هذه المقايسات المبكرة انتاجهم إنقسم: إما المريض "حساسة" أو "مقاومة" لدواء معين. يتم توفير أي معلومات بشأن درجة من الحساسية وعدم تجانس السكان الورم. وبالتالي، سيتم تصنيف المرضى الذين يعانون من جماعات فرعية صغيرة من الخلايا المقاومة سريعة النمو بأنها "حساسة" للعلاج، ولكن الانتكاس قريبا، وبالتالي لا بنefit من العلاج. ونظرا لأهمية مدة الاستجابة في البقاء على قيد الحياة (OS) من مرضى السرطان 4،5، فمن الواضح كيف كانت هذه المقايسات غير قادرة على تقدير OS صحيح على الدوام.

من أجل الالتفاف على هذه القيود، وتكون قادرة على توليد نماذج حسابية المريض محددة من شأنها أن تقدير استجابة سريرية شخصية إلى لجنة المخدرات، قمنا بتطوير طريقة لحساسية غير المدمر اختبار المخدرات من المايلوما المتعددة (MM) خطوط الخلايا والخلايا MM الأولية في إعادة الإعمار خارج الحي من نخاع العظام المكروية، بما في ذلك المصفوفة خارج الخلية وسدى 6. هذا الاختبار، ومع ذلك، كان الحد من الاعتماد على شريحة معينة ميكروفلويديك التجارية، أبعادها وتكلفة تقييد عدد من التجارب أو الأدوية التي يمكن أن يؤديها في وقت واحد في قطعة معينة من المعدات.

النظام هنا وصف يمتد هذا الاختبار الأصلي إلى أعلى-throughput عضوي النمط منصة الاستجابة للجرعة، لفي المختبر فحص المخدرات، استنادا إلى خوارزمية تحليل الصور الرقمية لغير المدمر تحديد بقاء الخلية. كل بئر في 384 أو 1536-جيدا لوحات هي إعادة الإعمار 3D من نخاع العظام المكروية، بما في ذلك الخلايا الأولية MM، المصفوفة خارج الخلية، وسدى ونمو العوامل المستمدة من المريض. يتم استخدام المجهر الحية وتحليل الصور الرقمية للكشف عن أحداث موت الخلايا في تركيزات المخدرات المختلفة، والتي تستخدم لتوليد السطوح الاستجابة للجرعة. من البيانات في المختبر، ويحدد نموذج رياضي حجم وchemosensitivity السكان فرعية ضمن عبء ورم المريض، ويمكن استخدامها لمحاكاة كيفية الورم سوف يستجيب للدواء (ق) في الظروف الفسيولوجية في نظام السريري 6 ( الشكل 1).

الابتكارات الرئيسية من هذه المنصة هي: (أ) عدد قليل من الخلايا السرطانية المطلوبة (1،000-10،000 في تناسق المخدراتالتموينية)؛ (ب) تقييم نجاعة الأدوية في الظروف الفسيولوجية (المصفوفة خارج الخلية، سدى، وعوامل النمو المشتق المريض)؛ يستخدم (ج) لا سمية من علامات الجدوى 7 منذ التصوير حقل مشرق فقط، وبالتالي لا حاجة ل transfect الخلايا مع مضان 8 أو 9 تلألؤ بيولوجي. (د) على التصوير المستمر تأثير المخدرات بوصفها وظيفة من التركيز ومدة التعرض (الدوائية)؛ و (ه) التكامل بين في المختبر ونماذج تطورية الحسابية، لتقدير نتائج سريرية 6 (سيلفا وآخرون، قيد الإعداد).

العامل الرئيسي الذي يسمح للخوارزمية تحليل الصور الرقمية لتبين السرطان من الخلايا اللحمية هو تقارب مختلف بهم إلى قاع البئر: خلايا MM لا تلتزم، ويبقى معلق في المصفوفة، في حين أن الخلايا اللحمية تلتزم الجزء السفلي من جيدا ثم تمتد.

يحدث هذا الفصل على الرغم من MM وسدى لإعادة المصنف في نفس الوقت، ويحدث أثناء O / N عملية الحضانة. يسرع البذر الغزل عليها في أجهزة الطرد المركزي التالي من لوحة مزيد من هذه العملية. ونتيجة لذلك، تظهر خلايا MM في الصورة كأقراص مشرق مستديرة تحيط بها حلقة مظلمة، في حين يحتفظ سدى عن الانظار وأغمق (الشكل 2). وهكذا، فإن فحص في شكله الحالي هو الانسب لخلايا السرطان غير ملتصقة، على الرغم من التعديلات في الخوارزمية يمكن القيام به لسرطان منفصل وسدى على أساس الخصائص الشكلية الأخرى، مثل الحجم والشكل. في هذا البروتوكول وصفنا نوعين من المصفوفة خارج الخلية (الكولاجين والطابق السفلي مصفوفة الغشاء)، فضلا عن نوعين من المشترك الثقافات، مع (نخاع المستمدة الخلايا الجذعية الوسيطة العظام) BMSC وHUVECS، التي تمثل منافذ فراغي وحول الأوعية من نخاع العظام ، على التوالي.

باستخدام لوحة 384 جيدا، 5 تركيزات في المخدرات واثنين من مكررات، كنا قادرين على قسم التدريب والامتحاناتتي تصل إلى 31 الأدوية المختلفة مع عينة من مريض واحد. في لوحات 1536 جيدا هذا الرقم 127. الشكل 3 يصور تخطيط المستخدمة حاليا اليدوي للزرع الخلايا، في حين يمثل التكميلي الشكل 1 التوزيع الأمثل باستخدام pipettor الروبوتية. في التصميم من الشكل 3، يمكن لكل لوحة 384 جيدا تحمل 3 عينات المريض مع 7 الأدوية المختلفة، أو عينة واحدة المرضى اختبار مع 21 المخدرات. يتم تمثيل كل دواء بنسبة 5 تركيزات، والمصنف كل شرط في التكرارات. والمصنف 4 آبار المراقبة (مضاف المخدرات) لكل مجموعة من 7 المخدرات (على سبيل المثال، الآبار 36-39، 126-129 و200-203). لضمان فاعلية من الأدوية المستخدمة، خط خلية الورم النخاعي الإنسان (على سبيل المثال، H929 أو MM1.S) هو أيضا المصنف، وتخديره في التكرارات على أعلى تركيز كل من العقاقير المستخدمة (الآبار 76-89). مراقبة خط الخلية إيجابية يضمن أن العقاقير المستخدمة لديها قوة كافية، منذ منحنيات الاستجابة للجرعة هي المتردد مقارنةتجارب روس. هي المصنفة بئرين مع خط خلية الورم النقوي عن السيطرة للظروف البيئية، وبعبارة أخرى، للكشف عن المشاكل المحتملة في مقاعد البدلاء كبار حاضنة أثناء التصوير (الآبار 75 و 90). تعداد الآبار يتبع نمطا متعرج من أجل تقليل المسافة التي مرحلة الآلية المجهر، مما يقلل من اكتساب الوقت ويقلل من التآكل من المعدات المشمولة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

استخدام الخلايا البشرية المستمدة من الخزعات كما هو موضح أدناه والتي وافق عليها مجلس موفيت في المراجعة المؤسسية والتي أجريت تحت التجربة السريرية MCC # 14745 أجريت في مركز السرطان لي موفيت H. ومعهد بحوث.

1. فرز الخلايا MM من نخاع العظم شفاطات

  1. جمع شفاطات نخاع العظم (20 مل) من المرضى في هيبارين الصوديوم حقنة.
  2. عزل الخلايا وحيدات النوى بواسطة الطرد المركزي نخاع المخفف (1: 1 مع برنامج تلفزيوني العقيمة) على العقيمة مائي المتوسطة الطرد المركزي التدرج في 400 x ج لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  3. جمع واجهة، الذي يحتوي على الخلايا وحيدة النواة. غسل الخلايا مع PBS الباردة والعد باستخدام عدادة الكريات أو خلية مكافحة الآلي، وذلك باستخدام التريبان الأزرق لتحديد جدوى.
  4. إعداد طبقة رقيقة إعداد الخلية الشريحة 10 وصمة عار مع رايت بالغيمزا صمة عار لتقييم نسبة خلية بلازما 11.
  5. حسابكمية من الخرز CD138 لاستخدامها على أساس عدد الخلايا ونسبة الخلايا البلازما. إذا بدءا العينة أقل من 20٪ خلايا البلازما، ثم إعادة تعليق الخلايا باستخدام 90 ميكرولتر من العازلة الفصل و 10 ميكرولتر من الخرز CD138 في 5 × 10 6 خلايا. إذا بدءا عينة أكثر من 20٪ خلايا البلازما، معلق باستخدام 80 ميكرولتر من العازلة الفصل و 20 ميكرولتر من الخرز CD138 في 1 × 10 7 الخلايا.
  6. احتضان الخلايا مع حبات عند 4 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
  7. تمر الخلايا من خلال مصفاة 35 ميكرومتر وأضافت الفصل المبللة مسبقا ل(LS) أعمدة وضعها في فاصل المجال المغناطيسي (انظر قائمة المواد).
  8. إزالة عمود من المغناطيس. جمع الخلايا المختارة CD138 عن طريق غسل العمود 3 مرات مع 1 مل من العازلة الفصل.
  9. تقييم تخصيب CD138 مع إعداد خلية رقيقة طبقة أخرى الملون الشريحة 10.
  10. فلتر البلازما الحصول عليها من خزعة نخاع العظم من كل مريض مع فلتر حقنة 0.22 ميكرون. استخدام البلازما الطازجةمن نفس المريض كما الخلايا CD138 +.
  11. إعداد وسائل الاعلام عن التجربة من خلال استكمال RPMI-1640 مع 10٪ الحرارة المعطل مصل بقري جنيني، بلازما المريض 10٪ و 1٪ البنسلين، الستربتومايسين.
  12. جمع التدفق من خلال التحديد (CD138-) واتبع طريقة التصاق الكلاسيكي 12 لتحديد لخلايا نخاع العظام الوسيطة (BMSCs). وبما أن هذه العملية تتطلب أسابيع قبل BMSCs مستعدون لاستخدامها، فمن الضروري أن يكون BMSCs جاهزة من المرضى السابق أو المتبرعين الأصحاء.

2. خلايا البذر في لوحات (عن طريق يدوي متعدد القنوات Pipettor)

  1. استخدام لوحة متعددة جيدا (384 أو 1536) مع الجدران السوداء ومسطحة القاع الشفاف، تفضيلي واحد الأمثل للتطبيقات البصرية وثقافة الخلية.
  2. شارك في ثقافة BMSCs مع الخلايا MM في أي الكولاجين النوع الأول أو مصفوفة الغشاء القاعدي، ومع ذلك، HUVECs تتطلب مصفوفة الغشاء القاعدي.
  3. الحفاظ على الكثافة النهائية من كل نوع من الخلايا فيالنطاق التالي: 3 × 10 5 خلية / مل للخطوط الخلايا MM، 2 × 10 5 خلية / مل لHUVECs أو BMSCs، و2 × 10 6 خلية / مل للخلايا MM المستمدة من المريض.
    ملاحظة: هذه الكثافة هي نتيجة التحسين التجريبية للسماح لأعلى مستوى من الجودة صورة ممكنة وقتا أطول التصوير ممكن مع الحفاظ أهمية بيولوجية في المقايسات. هي المصنفة خطوط الخلايا MM بكثافة أقل من خلايا MM الأولية بسبب أسرع معدل تكرارها وحجم أكبر.
  4. ثقافة مشتركة من الخلايا MM الأولية مع BMSCs:
    1. إعداد 100 مكل من وسائل الإعلام قبل مختلطة تتكون من 20 ميكرولتر من 10X MEM، 20 ميكرولتر من H 2 O منزوع الأيونات، 10 ميكرولتر من 7.5٪ محلول بيكربونات الصوديوم، و 50 ميكرولتر من 1X RPMI 1640 وتخزينها في 4 ° C.
    2. في وقت البذر لوحات مع الخلايا MM، مزيج قسامات وسائل الإعلام قبل مختلطة مع 150 ميكرولتر من 3.1 ملغ / مل البقري نوع الكولاجين أنا إلى الحجم النهائي من 250 ميكرولتر.
    3. إعادة المعلإنهاء 50 ميكرولتر من الخلايا في RPMI 1640 في ستة أضعاف الكثافة النهائية المرجوة.
    4. مزج لتعليق الخلية مع مزيج الكولاجين لإنشاء وحدة تخزين النهائي من 300 ميكرولتر باستخدام ماصة P200.
    5. باستخدام ماصة اليدوية أو مكرر، إيداع انخفاض 8 ميكرولتر من خلية النهائية / مزيج مصفوفة في وسط كل بئر في لوحات 384 جيدا، أو 2 ميكرولتر في كل بئر من 1536 لوحات جيدة (راجع الخطوة 2.6 للحصول على مثال الترتيب المكاني من الآبار).
    6. لوحة أجهزة الطرد المركزي لمدة 2 دقيقة في 500 x ج لتركيز كل الخلايا إلى نفس المستوى البؤري أثناء التصوير.
    7. ترك لوحة في حاضنة (5٪ CO 2، 37 ° C) لمدة 1 ساعة، لجل البلمرة.
    8. إضافة 80 ميكرولتر من وسائط النمو تستكمل (RPMI-1640، و 10٪ FBS مرحبا، 10٪ المستمدة من المريض البلازما، 1٪ P / S) إلى كل بئر في 384 جيدا لوحات، أو 8 ميكرولتر في لوحات 1536 جيدا.
    9. ترك لوحة O / N في الحاضنة (5٪ CO 2، 37 ° C) للالتصاق سدى في الجزء السفلي من لوحة.
  5. شارك مكعبlture الخلايا MM الأولية مع HUVECs:
    1. نقل مصفوفة الغشاء القاعدي من -80 ° C إلى دلو مع الجليد لذوبان الجليد.
    2. العد وإعادة تعليق الخلايا الأولية وHUVECs في وسائل الإعلام RPMI-1640 في 4 أضعاف الكثافة النهائية، كل في أنبوب منفصل.
    3. مزج خلايا المريض وأحجام HUVECs في 1: نسبة 1.
    4. مرة واحدة يتم إذابة مصفوفة الغشاء القاعدي، ولكن لا يزال لا بلمرة، خلط 1: 1 مع خليط الخلية من الخطوة السابقة.
    5. قطرات البذور مع حجم كاف من مزيج خلايا المصفوفة في وسط كل جانب (8 ميكرولتر لوحات 384 جيدا و2 ميكرولتر لوحات 1536 جيدا، راجع الخطوة 2.6 للحصول على مثال الترتيب المكاني للآبار).
    6. لوحة أجهزة الطرد المركزي في 500 x ج لمدة 10 دقيقة.
    7. مكان لوحة في الحاضنة (5٪ CO 2، 37 درجة مئوية) لمدة 1 ساعة لمصفوفة البلمرة.
    8. إضافة وسائط النمو (RPMI-1640 تستكمل مع 10٪ FBS، البلازما المريض 10٪ و 1٪ P / S) إلى كل بئر (80 ميكرولتر لوحات 384 جيدا، 8 ميكرولتر عن 1،5لوحات 36-جيدا).
    9. ترك لوحة O / N في الحاضنة (5٪ CO 2، 37 ° C) للالتصاق HUVECs إلى الجزء السفلي من لوحة.
  6. البذور لوحة 384 جيدا الشكل 3 يصور التوزيع المكاني نموذجية من البذر.
    1. ابتداء من B2 جيد، البذور العديد من الأعمدة كعقاقير لفحصها. في المثال في الشكل 3، استخدم سبعة المخدرات.
    2. كرر بذر عدة مرات كما تركيزات لاستخدامها. في المثال في الشكل 3، استخدم خمسة تركيزات.
    3. البذور أربعة آبار أكثر لظروف السيطرة.
    4. كرر الخطوات من 2.6.1 و2.6.2 لتكرار الثاني.
    5. كرر الخطوات من 2.6.1 إلى 2.6.4 لكل عينة المريض لفحصها في اللوحة.
    6. البذور خط الخلية MM في سطرين من الآبار، ولكل منها العديد من الآبار مثل الأدوية لفحصها (في نسختين). سيتم التعامل مع كل من هذه الآبار وفقا لأعلى تركيز من كل دواء للتأكد من أن الأوراق المالية المستخدمة زيارتها الهياج كافيةقبرصي (انظر الشكل 3 على سبيل المثال).
    7. البذور بئرين مع خط خلية MM لتكون بمثابة السيطرة على الظروف التجريبية، مثل حسن سير العمل في أعلى حاضنة مقاعد البدلاء، وسائط النمو، وما إلى ذلك.

3. بذر خلايا في لوحات (باستخدام الروبوتية Pipettor)

ملاحظة: هذه السلسلة من بذور خطوات لوحة 384 جيدا باستخدام pipettor الروبوتية. وصفت تصميم لوحة في التكميلي الشكل 1، حيث يتم اختبار الخلايا MM الابتدائية ضد فريق من 31 أدوية مختلفة في خمس تراكيز مختلفة في اثنين من مكررات، بالإضافة إلى مراقبة سلبية. والمصنفة A خط الخلية أيضا السيطرة الإيجابية لتقييم نجاعة الأدوية واختبارها ضد جميع الأدوية 31 على أعلى تركيز، في اثنين من مكررات. الملفات المقدمة هي لعلامة تجارية ونموذج معين (انظر الجدول المواد) لكن الخوارزمية يمكن أن تتكيف مع أي pipettors الروبوتية.

  1. شارك في ثقافة من الخلايا MM الأوليةالصورة مع BMSCs:
    1. إعداد أنبوب 15 مل يتكون من 240 ميكرولتر من 10X MEM، 240 ميكرولتر من H 2 O منزوع الأيونات، 120 ميكرولتر من 7.5٪ محلول بيكربونات الصوديوم، 600 ميكرولتر من 1X RPMI 1640 و 1.8 مل من 3.1 ملغ / مل البقري نوع الكولاجين I. تسمية أنبوب ب "ما قبل المزيج لCD138 +". وضع على الجليد حتى الاستخدام.
    2. إعداد أنبوب 1.5 مل يتألف من 50 ميكرولتر من 10X MEM، 50 ميكرولتر من H 2 O منزوع الأيونات، 25 ميكرولتر من 7.5٪ محلول بيكربونات الصوديوم، 125 ميكرولتر من 1X RPMI 1640 و 375 ميكرولتر من 3.1 ملغ / مل البقري نوع الكولاجين I. تسمية أنبوب ب "ما قبل المزيج لخط الخلية". وضع على الجليد حتى الاستخدام.
    3. إعادة تعليق 300 ميكرولتر من CD138 + الخلايا في RPMI 1640 في ستة أضعاف الكثافة النهائية المرجوة. إعادة تعليق 300 ميكرولتر من الخلايا BMSC في RPMI 1640 في ستة أضعاف الكثافة النهائية المرجوة. خلط كلا المجلدين معا في أنبوب 1.5 مل وتسمية "CD138 +". وضع في الحاضنة حتى الاستخدام.
    4. إعادة تعليق 60 ميكرولتر منخط خلية في RPMI 1640 في ستة أضعاف الكثافة النهائية المرجوة. إعادة تعليق 60 ميكرولتر من الخلايا BMSC في RPMI 1640 في ستة أضعاف الكثافة النهائية المرجوة. خلط كلا المجلدين معا في أنبوب 1.5 مل وتسمية "خط الخلية". وضع في الحاضنة حتى الاستخدام.
    5. باستخدام البرامج المقدمة مع pipettor الروبوتية، تحميل ملف البرنامج النصي الأول، "cell_seedingPt47.PGM". وضع 200 ميكرولتر مربع ماصة، لوحة microtiter، ومعقمة 384 لوحة جيدا في محطات A، B و E، على التوالي، للروبوت.
    6. خلط محتويات الأنابيب "قبل المزيج لCD138 +" و "CD138 +". نقل 1.5 مل من محتوياته إلى البئر رقم 1 من لوحة microtiter. وضع أنبوب مع حجم المتبقية على الجليد. بدء تشغيل البرنامج. الروبوت سوف البذور الآبار 176 الأولى (11 اليسار معظم الأعمدة) من 384 لوحة جيدا ثم وقفة. نقل ما تبقى من الأنبوب على الجليد لبئر رقم 2 من وحة microtiter. استئناف البرنامج. السوف الروبوت البذور 144 الآبار المتبقية من 384 لوحة جيدا وقفة.
    7. خلط محتويات الأنابيب "قبل المزيج لخط الخلية" و "خط خلية" ونقل المحتويات إلى جانب رقم 3 من بين وحة microtiter. استئناف البرنامج. الروبوت سوف البذور على 64 بئرا المتبقية من 384 لوحة جيدا.
    8. وضع لوحة 384 جيدا في أجهزة الطرد المركزي لمدة 10 دقيقة في 500 x ج و 4 ° C. لوحة نقل إلى حاضنة (5٪ CO 2، 37 ° C) لمدة 1 ساعة لالكولاجين بلمرة.
    9. تحميل الملف النصي الثاني، "media_layer.PGM". وضع 120 ميكرولتر مربع ماصة، وخزان كاشف مع 31 مل من RPMI-1640 تستكمل مع 10٪ FBS، بلازما المريض 10٪ و 1٪ P / S، واللوحة 384 جيدا مع الخلايا في محطات A، B و E، على التوالي. تشغيل البرنامج. الروبوت سوف نقل 81 ميكرولتر من وسائل الإعلام إلى كل بئر. الانتهاء مرة واحدة، ونقل 384 لوحة جيدا إلى الحاضنة والسماح سدى التمسك الركيزة O / N.

4. إعداد المخدرات والتخدير من لوحات (عن طريق يدوي متعدد القنوات Pipettor)

  1. إعداد قالب مشابهة للشكل 3 وذلك لتسهيل عملية إضافة المخدرات إلى الآبار وتقليل فرصة من الارتباك.
  2. يعد، لوحة 96-جيدا، والتخفيف المتسلسل لكل من المخدرات لفحصها في لوحة، وعلى سبيل المثال، لمدة خمس تركيزات باستخدام التخفيف 3 أضعاف:
    1. إضافة 120 ميكرولتر من المخدرات في 10X التركيز المطلوب في أعلى تركيز جيدا. على سبيل المثال، استخدم 500 ميكرومتر ملفلان إذا كان أعلى تركيز سوف يتعرض الخلايا في لوحة ستكون 50 ميكرومتر.
    2. إضافة 80 ميكرولتر من وسائط النمو (RPMI تستكمل مع 10٪ FBS، 10٪ المستمدة من المريض البلازما و 1٪ البنسلين / الستربتومايسين (P / S)) إلى الآبار الأربع اللاحقة.
    3. نقل 40 ميكرولتر من أول بئر للثاني وتخلط، إلى وحدة تخزين ما مجموعه 120 ميكرولتر في 1/3 من تركيز الدواء أول البئر، أو 167 ميكرومتر.
    4. كرر الخطوة 4.2.3 إلى الآبار المتبقية (على سبيل المثال، نقل 40 ميكرولتر من المركز الثاني إلى المركز الثالث، مزيج، ثم نقل 40 ميكرولتر من المركز الثالث الى المركز الرابع، وما إلى ذلك).
  3. نقل 8 ميكرولتر من كل دواء يحتوي كذلك على المقابلة بشكل جيد في لوحة الخلية. كل دواء يحتوي أيضا يجب أن يكون حجم كاف لمدة 10 بئرا في لوحة الخلية. في المثال في الشكل 3، يضاف كل تركيز الدواء إلى 6 آبار مختلفة، باستثناء أعلى تركيز، والذي يضاف إلى 8 آبار.
  4. إضافة 8 ميكرولتر من وسائط النمو (RPMI تستكمل مع 10٪ FBS، 10٪ المستمدة من المريض البلازما و 1٪ P / S) إلى آبار المراقبة.
  5. خلايا مكان في المجهر في أقرب وقت جاهزة وتشغيل حضانة أعلى مقاعد البدلاء.

5. إعداد المخدرات والتخدير من لوحات (باستخدام الروبوتية Pipettor)

  1. تحميل ملفات البرامج النصية لpipettor الروبوتية من http://www.i-genics.com/Jove2014Silva/Precision XS فايles.zip
  2. تحميل البرنامج النصي "media_layer_DRUGPLATE.PGM" في واجهة المستخدم pipettor الروبوتية. وضع 120 ميكرولتر مربع ماصة، خزان مع 21 مل من RPMI-1640 تستكمل مع 10٪ FBS، بلازما المريض 10٪ و 1٪ P / S وفارغة لوحة 384 جيدا في محطات A، B و E، على التوالي. تشغيل البرنامج، سوف pipettor الروبوتية إضافة 30 ميكرولتر من وسائل الإعلام لجميع الآبار في لوحة 384 جيدا.
  3. بعد قالب من التكميلي الشكل 2 إضافة 200 ميكرولتر من المخدرات في 20x والتركيز الأقصى إلى كل بئر من وحة microtiter. هذا الإعداد يستوعب ما يصل إلى 31 المخدرات. لرقابة جيدا (CTRL)، إضافة RPMI-1640 تستكمل مع 10٪ FBS، البلازما المريض 10٪ و 1٪ P / S.
  4. وضع 120 ميكرولتر مربع ماصة، وحة microtiter مع المخدرات في 20X تركيز، و 384 بشكل جيد مع وسائل الإعلام (من الخطوة 5.1) في محطات A، B و C، على التوالي. تحميل برنامج "drug_plate.PGM". سوف pipettor الروبوتية إنشاء التخفيف المتسلسل1: 3، وبعد التوزيع المكاني في التكميلية الشكل 1.
  5. وضع 120 ميكرولتر مربع ماصة، لوحة 384 جيدا مع تخفيف المخدرات (من الخطوة 5.3) ولوحة 384 جيدا مع الخلايا (من الخطوة 3.1.9) إلى محطات A، B و C، على التوالي. تحميل وتشغيل البرنامج "drug_add.PGM". سوف pipettor الروبوتية نقل 8 ميكرولتر من المخدرات من كل بئر في لوحة المخدرات إلى نظيرتها في لوحة الخلية. وبمجرد الانتهاء، نقل لوحة الخلية إلى حاضنة للالمجهر الرقمي في أقرب وقت ممكن.

6. التصوير من الخلايا في لوحة

ملاحظة: يتم تطبيق الإجراء أدناه لالمجهر Evos السيارات FL، ولكن يمكن أن تتكيف بسهولة مع غيرها من المجاهر مرحلة الآلية مع أعلى مقاعد البدلاء الحضانة أو المجاهر جزءا لا يتجزأ من الحاضنة.

  1. تنظيف المناطق الداخلية من أكبر حاضنة مقاعد البدلاء مع الإيثانول الرطب مسح وإزالة بعناية غطاء لوحة في حين وضع غطاء من المؤتمر الوطني العراقيubator.
  2. اتبع الخطوات البرامج لإضافة منارات. هذا هو مصطلح يستخدم للإشارة إلى المعالم للمناطق ذات الأهمية، ليمكن تصوير تباعا خلال التجربة (انظر دليل مستخدم البرنامج للحصول على التفاصيل).
  3. استخدام الهدف التكبير 5X أو 10X. تأكد من أن التركيز يشبه الشكل 2: خلايا MM تظهر الأقراص كما مشرق تحيط بها حلقة مظلمة وBMSCs أو HUVECs هي بالكاد مرئية. بعض الخلايا MM الأساسية هي صغيرة جدا، وبالتالي قد تكون هناك حاجة إلى صقل للعثور على التركيز الأمثل.
  4. ضبط الفاصل الزمني الاستحواذ بين 10-30 دقيقة ومدة لا يقل عن 96 ساعة. في حين فترات أطول بين عمليات الاستحواذ مقبولة، قد فترات من 45 دقيقة أو أكثر يقلل بشكل كبير من دقة قياس قدرتها على البقاء.
  5. تكوين البرنامج بحيث يتم تخزين الصور من كل بئر في ملفات منفصلة اسمه منارة-1، منارة-2، وما إذا تم استخدام pipettor الروبوتية، تعيين منارات في الترتيب المبين فيالشكل التكميلي 3.
  6. تأكد من أن هناك ما يكفي من المياه في المرطب الحاضنة والغاز، وذلك أن الخلايا ستكون في أفضل الظروف.
  7. عند الانتهاء من التجربة، نسخ المجلدات التي تحتوي على الصور إلى الكمبيوتر الذي سيتم تشغيل التحليل.

7. الكمي من المخدرات الحساسية

ملاحظة: الإرشادات التالية ترشد استخدام تحليل الصور باستخدام مجموعة الكمبيوتر، لأن تحليل لوحة متعددة جيدا في جهاز كمبيوتر شخصي هو قتا طويلا جدا.

  1. تحميل برنامج يماغيج من موقع المعاهد الوطنية للصحة: ​​http://imagej.nih.gov/ij/
  2. تحميل برنامج نصي والإضافات في http://www.i-genics.com/Jove2014Silva/
  3. اتبع الإرشادات الموجودة في http://www.i-genics.com/Jove2014Silva/UserGuide.pdf لتشغيل البرمجيات الرقمية تحليل الصور. يجب أن تكون النتيجة جدول اسمه Results.csv تحتوي على قياسات حيوية على فترات منتظمة لمجموعة شرق افريقياح بشكل جيد في لوحة لمدة التجربة (أي 96 ساعة).
  4. في حالة استخدام يدوي متعدد القنوات pipettor، قم بالخطوات التالية.
    1. تحميل الملف http://www.i-genics.com/Jove2014Silva/ExperimentalDesign.txt وتعديله لتتناسب مع تخطيط لوحة المعرفة في الخطوة 3.1 (على سبيل المثال، الشكل 3).
    2. تحميل البرنامج http://www.i-genics.com/Jove2014Silva/Evos384.jar وتشغيله باستخدام الملفات التي تم إنشاؤها في الخطوات 5.3 و 5.4 كمعلمة الإدخال. ستكون النتيجة تقرير اسم المجلد الذي يحتوي على جداول متعددة، ولكل مجموعة نتائج لدواء معين.
    3. نسخ ولصق المحتويات في قالب جدول http://www.i-genics.com/Jove2014Silva/GraphPadAnalysisPT.pzfx
      ملاحظة: يجب أن تكون النتيجة الرسوم البيانية مثل واحد هو مبين في الشكل (4)، وهو ما يمثل chemosensitivity من العينة إلى الأدوية المختلفة بوصفها وظيفة من تركيز الدواء ومدة التعرض.
    4. إذا باستخدام pipettor الروبوتية، قم بالخطوات التالية.
      1. تحميل ملفات قالب من تحميل ملفات البرامج النصية لpipettor الروبوتية من http://www.i-genics.com/Jove2014Silva/Robotic قالب Files.zip واستخراج الملفات في الدليل.
      2. تعديل الملف DrugList.csv وفقا لقائمة من الأدوية وأعلى تركيز الدواء في لوحة مع الخلايا. اتبع تخطيط التكميلي الشكل 2.
      3. تشغيل البرنامج BuildExperimentalDesign.java تمرير كمعلمة المجلد الذي يحتوي على الملفات التي تم استخراجها في الخطوة 7.5.1 والملفات Results.csv من الخطوة 7.3. وينبغي أن تكون نتائج مجلدين أسم MM1_S وPtSample. أول تتضمن وصفا للآبار (المخدرات وتركيزات) لمراقبة إيجابية خط الخلية. والثاني يحتوي على نفس المعلومات، ولكن فيما يتعلق جزء من لوحة المصنف مع خلايا المريض.
      4. نسخ ملف Results.csv في كل من الدلائل التي تم إنشاؤها في الخطوة 7.5.3. تحميلبرنامج http://www.i-genics.com/Jove2014Silva/Evos384.jar وتشغيله باستخدام الملفات التي تم إنشاؤها في الخطوات 7.5.3 لكل من المجلدات. ستكون النتيجة تقرير اسم المجلد في كل من المجلدات التي تم إنشاؤها في 7.5.3. المجلد تقرير يحتوي على جداول متعددة، ولكل مجموعة نتائج لدواء معين.
      5. تشغيل البرنامج BuildGraphPadFile.java وتمرير كمعلمة المجلد الذي يحتوي على الملفات التي تم استخراجها في الخطوة 7.5.1 والملفات Results.csv من الخطوة 7.3. ستكون النتيجة ملف graphpad تحتوي على منحنيات الاستجابة للجرعة لكل من 31 المخدرات، وتطبيع بواسطة عنصر التحكم. وسيتضمن كل مخطط 5 تركيزات الدواء للخلايا MM الابتدائية وتركيز واحد لمراقبة خط الخلية إيجابية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

يوصف تدفق التجربة لفترة وجيزة في الشكل 1 إذا تم الانتهاء من جميع الخطوات بنجاح، يجب أن الصور التي حصلت عليها المجهر معادلا إلى الشكل 2: يعيش خلايا MM ينبغي النظر بوضوح الأقراص كما مشرق وBMSCs أو HUVECs ينبغي أن يكون بالكاد مرئية وتوزع بشكل جيد في الخلفية. كما رأينا في الشكل 2A، خلايا MM تتراوح في حجمها من مريض إلى آخر، ولكن بشكل عام هم أصغر من خطوط الخلايا. لأنها عمليا لا تكرار السابقين فيفو خلال فترة التجربة (96 ساعة) ال...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

باختصار، هذا هو وسيلة قوية وعالية الإنتاجية لتحديد chemosensitivity الخلايا MM الابتدائية وخارج الحي الدوائية للأدوية في إعادة بناء نخاع العظم. الخطوات الحاسمة في هذا البروتوكول هي بذر السليم للآبار وتركز كافية (انظر الشكل 2 للنتائج المتوقعة): تأكد من أن الخلايا MM وانسجة تتوزع بشكل موحد، أن الخلايا اللحمية هي ملتصقة إلى قاع البئر، أن جميع MM الخلايا في نفس المستوى البؤري، وأن الخلايا MM لديها جانب من جوانب القرص مشرق تحيط بها حلقة مظلمة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ليس لدى المؤلفين تضارب في المصالح للإفصاح عنه.

شكر وتقدير

وقد تم تمويل هذا البحث من قبل دولة بانكهد-كولي الفريق العلمي منحة ولاية فلوريدا (2BT03)، والمعاهد الوطنية لل/ المعهد الوطني للسرطان الصحة (1R21CA164322-01) ومركز موفيت للسرطان علوم فريق غرانت. وقد تم دعم هذا العمل في جزء من مرفق بالحركة البحوث الأساسية في لي موفيت للسرطان ومعهد بحوث H.، وهو مركز السرطان الشامل NCI المعينة (P30-CA076292). تم الحصول على الخلايا الأولية ممكن من خلال بروتوكول رعاية مرضى السرطان إجمالي في مركز موفيت للسرطان.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
مجهر رقمي EVOS FL AUTOAMG+ AMC1000مزود بحاضنة مسرح آلية ومقاعد البدلاء.
384-بئر لوحة CellBindCORNINGCLS3683 SIGMACorning CellBIND 384 ألواح بئر
384 لوحة بئر ، بوليسترين ، سطح CellBIND ، معقم ، قاع مسطح شفاف ، أسود ، مع غطاء
1،536 لوحة بئر CellBindCORNINGCLS3832 ALDRICHCorning 1،536 ألواح بئر ، قاعدة منخفضة ، معالجة سطحية CellBIND ، معقمة
Ficoll-Paque Plus   ؛GE HealthcareGE17-1440-02 SIGMAل in vitro< / em> عزل الخلايا الليمفاوية عن الدم المحيطي للإنسان.
CD138 الخرز المغناطيسيMiltenyi 130-051-301حبات مغناطيسية مترافقة بالأجسام المضادة لاختيار خلايا CD138 +.
أعمدة LSMiltenyi   130-042-401عمود لفصل الخلايا.
فاصل MidiMACSMiltenyi 130-042-302مغناطيس لعمود الفصل.
MatrigelSigma-AldrichE6909 SIGMAECM Gel من Engelbreth-Holm-Swarm ساركوما الفئران
GetrexLife TechnologiesA1413201مصفوفة غشاء أساسي خالية من LDEV
HUVECLife TechnologiesC-003-25P-Bالخلايا البطانية للوريد السري البشري (HUVEC
RPMI-1640 mediaGIBCO11875-093RPMI 1640 متوسطة + L-Glutamine + Phenol Red
FBSGIBCO10082-147مصل الأبقار الجنيني المعطل بالحرارة ، معتمد ، معطل بالحرارة ، أمريكي
الأصل 3.1 مجم / مل كولاجين بقري من النوع الأولAdvanced Biomatrix5005-Bالكولاجين البقري ، النوع الأول ، 3 مجم / مل ، 100 مل
الماصات الروبوتيPrecision XSBIOTEKPRC3841
AMAFD1000 ) محلول نظام

المراجع

  1. Salmon, S. E., et al. Quantitation of differential sensitivity of human-tumor stem cells to anticancer drugs. N Engl J Med. 298, 1321-1327 (1978).
  2. Suggitt, M., Bibby, M. C. 50 years of preclinical anticancer drug screening: empirical to target-driven approaches. Clin Cancer Res. 11, 971-981 (2005).
  3. Kirshner, J., et al. A unique three-dimensional model for evaluating the impact of therapy on multiple myeloma. Blood. 112, 2935-2945 (2008).
  4. Durie, B. G., Jacobson, J., Barlogie, B., Crowley, J. Magnitude of response with myeloma frontline therapy does not predict outcome: importance of time to progression in southwest oncology group chemotherapy trials. J Clin Oncol. 22, 1857-1863 (2004).
  5. Harousseau, J. L., Attal, M., Avet-Loiseau, H. The role of complete response in multiple myeloma. Blood. 114, 3139-3146 (2009).
  6. Khin, Z. P., et al. A preclinical assay for chemosensitivity in multiple myeloma. Cancer Res. 74, 56-67 (2014).
  7. Misund, K., et al. A method for measurement of drug sensitivity of myeloma cells co-cultured with bone marrow stromal cells. J Biomol Screen. 18, 637-646 (2013).
  8. Ramasamy, K., et al. Fluorescence-based experimental model to evaluate the concomitant effect of drugs on the tumour microenvironment and cancer cells. Br J Haematol. 157, 564-579 (2012).
  9. McMillin, D. W., et al. Tumor cell-specific bioluminescence platform to identify stroma-induced changes to anticancer drug activity. Nat Med. 16, 483-489 (2010).
  10. Koh, C. M. Preparation of cells for microscopy using cytospin. Methods Enzymol. 533, 235-240 (2013).
  11. Al-Quran, S. Z., Yang, L., Magill, J. M., Braylan, R. C., Douglas-Nikitin, V. K. Assessment of bone marrow plasma cell infiltrates in multiple myeloma: the added value of CD138 immunohistochemistry. Hum Pathol. 38, 1779-1787 (2007).
  12. Najar, M., et al. Mesenchymal stromal cells promote or suppress the proliferation of T lymphocytes from cord blood and peripheral blood: the importance of low cell ratio and role of interleukin-6. Cytotherapy. 11, 570-583 (2009).
  13. Scott, J. Phase i trialist. Lancet Oncol. 13, 236(2012).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

نظام عضوي إنتاجية عالية لتوصيف الدواء حساسية خلايا المايلوما المتعددة الابتدائية
اتصل بنا
أوصِ بها للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

2026 © حقوق الطبع والنشر MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.