يبحث في المرونة اللزوجة للمواد. هنا ، يتم استخدام هذه التقنية لتحديد مرونة اللزوجة والامتثال للزحف وأدوار التشابك الفعالة لمكونات المصفوفة المختلفة للأغشية الحيوية البكتيرية. تتكون المصفوفة من مواد بوليمرية تفرزها البكتيريا وتحدد مكوناتها بنية الأغشية الحيوية والخصائص الميكانيكية.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
في الموقع خارطة الخواص الميكانيكية لالأغشية الحيوية التي تتبع الجسيمات Microrheology
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
الخلايا البكتيرية قادرة على تكوين مجتمعات غشاء حيوي متصلة بالسطح تعرف باسم الأغشية الحيوية عن طريق تغليف نفسها بمواد بوليمرية خارج الخلية (EPS). يعمل EPS كسقالة مادية وواقية تضم الخلايا البكتيرية وتتكون من مجموعة متنوعة من المواد التي تشمل البروتينات وعديد السكاريد الخارجي والحمض النووي. قد يتغير تكوين EPS ، مما يعيد تشكيل الخصائص الميكانيكية للأغشية الحيوية لتطوير أو دعم هياكل الأغشية الحيوية البديلة ، مثل اللافتات ، استجابة للإشارات البيئية. على الرغم من ذلك ، هناك القليل من الأوصاف الكمية حول كيفية مساهمة مكونات EPS في الخواص الميكانيكية ووظيفة الأغشية الحيوية. تعتبر الريولوجيا ، وهي دراسة تدفق المادة ، ذات أهمية خاصة للأغشية الحيوية حيث تنمو العديد من الأغشية الحيوية في ظروف التدفق وتتعرض باستمرار لإجهاد القص. كما يوفر القياس والنظرة ثاقبة حول انتشار الأغشية الحيوية على السطح. هنا ، يتم استخدام الميكروريولوجيا لتتبع الجسيمات لفحص مرونة اللزوجة وأدوار التشابك الفعالة لمكونات المصفوفة المختلفة في أجزاء مختلفة من الأغشية الحيوية أثناء التطور. يسمح هذا النهج للباحثين بقياس الخصائص الميكانيكية للأغشية الحيوية على النطاق الصغير ، مما قد يوفر معلومات مفيدة للتحكم في الأغشية الحيوية وهندستها.
المقدمة
معظم الخلايا البكتيرية هي قادرة على توظيف كل من العوالق (حرة المعيشة) و (لاطئة) وسائط المرفقة سطح النمو 1. في وضع المرفقة سطح نمو الخلايا البكتيرية تفرز ويغلف أنفسهم في كميات كبيرة من المواد البوليمرية خارج الخلية (EPS) لتشكيل الأغشية الحيوية. وEPS يتكون أساسا من البروتينات، exopolysaccharide، DNA خارج الخلية وضروري لتشكيل بيوفيلم 2. وهو بمثابة سقالة المادية التي البكتيريا يمكن استخدامها للتمييز مكانيا، ويحمي البكتيريا من الظروف البيئية الضارة والاستجابات المضيفة. مكونات مختلفة من EPS لها أدوار متميزة في تشكيل بيوفيلم 3 والتغيرات في التعبير عن مكونات EPS يمكن إعادة تشكيلها بشكل كبير هياكل بيوفيلم 4. يمكن مكونات EPS تعمل أيضا يشير إلى جزيئات 5، وأظهرت الدراسات التي أجريت مؤخرا بعض المكونات EPS التفاعل مع الخلايا الميكروبية لتوجيه الهجرة وبيوفيلم فرق بهمerentiation 6-8.
البحث عن EPS وكثيرا المتقدمة بناء على التحليلات المورفولوجية الأغشية الحيوية التي تنتجها المسوخ المعيبة في مكون محدد من EPS 9،10. وبالإضافة إلى ذلك، وعادة ما تميزت به EPS على المستوى الكلي (توصيف بالجملة) 11. الصرفية يحلل ومع ذلك، يمكن تفتقر إلى التفاصيل الكمي وتوصيف بالجملة، والتي ترجع متوسط القيم، يفقد التفاصيل الموجودة داخل تجانس بيوفيلم. الآن هناك اتجاه متزايد للتقدم إلى توصيف الوقت الحقيقي من الخصائص الميكانيكية للEPS على النطاق الصغير. يوضح هذا البروتوكول كيف microrheology الجسيمات تتبع غير قادرة على تحديد الآثار الزمانية المكانية من مكونات المصفوفة عرض بيل وexopolysaccharides البولندي على زوجة مطاطية وفعال يشابك الزائفة الزنجارية الأغشية الحيوية 4.
microrheology السلبي هو الم بسيط وغير مكلفطريقة eology التي توفر أعلى سرعة نقل العينات microrheological المكانية للمادة حتى الآن 12،13. في microrheology السلبي، وتوضع دوائر التحقيق في العينة ويتبع حركتها البراونية، مدفوعا الطاقات الحرارية (ك B T) بواسطة المجهر الفيديو. يمكن تتبع عدة جزيئات في وقت واحد، والإحداثيات التي تعتمد على الوقت من الجسيمات يتبع المشي العشوائي التقليدية. لذلك، في المتوسط، تبقى جسيمات في نفس الموقف. ومع ذلك، فإن الانحراف المعياري للنزوح أو متوسط تربيع النزوح (MSD) من الجسيمات، ليس صفرا. منذ تدفق سوائل لزجة، والجسيمات MSD في السائل اللزج ينمو خطيا مع مرور الوقت. في المقابل، يشابك البوليمر وجدت في اللزجة أو المواد المرنة تساعدهم على مقاومة التدفق، وتصبح جزيئات محدود في نزوحهم، مما أدى إلى الهضاب في منحنى MSD (الشكل 1A). هذه الملاحظة تتبع العلاقة MSDαt α، حيث α هو الأس ناشر الذي نسبة المساهمات المرنة وزجة من مادة ذات الصلة. للجسيمات تتحرك في السوائل اللزجة α = 1، في المواد اللزجة 0 <α <1، والمواد المرنة α = 0. ويمكن أيضا أن MSD استخدامها لحساب الامتثال زحف، وهو الميل للمواد التي تشوه دائم على الوقت ويقدر مدى سهولة وينتشر المادية.
حجم وكثافة وسطح الكيمياء من الجسيمات حاسمة لتطبيق الصحيح للتجربة microrheological ويتم اختيار فيما يتعلق بنظام درس (في هذه الحالة البوليمرات المصفوفة بيوفيلم، انظر الشكل 1B). أولا، الجسيمات يقيس الريولوجيا للمادة مع الهياكل التي هي أصغر بكثير من الجسيمات نفسها. إذا هياكل مادة هي على نطاق مماثل لالجسيمات، وحركة المساواةومن دواعي جسيما من جانب الشكل والتوجه للهياكل الفردية. ومع ذلك، إذا الهياكل المحيطة الجسيمات هي أصغر من ذلك بكثير، وهذا التأثير هو صغير ومتوسط من، تقديم بيئة متجانسة إلى الجسيمات (الشكل 1B). ثانيا، يجب أن تكون كثافة الجسيمات مماثلة إلى متوسطة (1.05 ز مل -1 لوسائل الإعلام تعتمد على الماء) بحيث يتم تجنب الترسيب وقوات بالقصور الذاتي تكاد لا تذكر. معظم الجسيمات مع الشبكات البوليسترين تفي بالمعايير أعلاه. من الناحية المثالية، والجسيمات لا تتفاعل مع البوليمرات المصفوفة بيوفيلم كما تفسير الانسيابية من الجسيمات MSD صالحا إلا إذا كان الاقتراح هو عشوائي، مدفوعا الطاقة الحرارية والتصادم مع الهياكل الجوهر. هذا يمكن ملاحظتها عن طريق فحص ما إذا كانت الجسيمات التحقيق يميل إلى ربط أو ترتد على سطح بيوفيلم قبل نمت. ومع ذلك، على الرغم من عدم وجود جاذبية للبيوفيلم، يجب أن تكون قادرا على أن تدرج في مصفوفة الجسيمات.بالإضافة إلى ذلك، عدم تجانس الفيزيائية للبيوفيلم قد يؤدي إلى جزيئات مختلفة كونها أكثر ملاءمة كما تحقيقات في مناطق مختلفة من بيوفيلم. وهكذا، والجسيمات ذات الأحجام المختلفة والكيمياء السطحية يجب أن تطبق على بيوفيلم.
على هذا النحو، والجسيمات MSD غير قادرة على تقديم معلومات مفيدة عن كيفية مختلفة تساهم المكونات إلى الريولوجيا وانتشار بيوفيلم. وعلاوة على ذلك، فإن استخدام مجسات مختلفة يسمح احد لاستخلاص المعلومات عن التجانس الفيزيائية المكاني للبيوفيلم. هذه الطريقة يمكن استخدامها لاختبار تأثير العلاج المضادة للميكروبات على الخواص الميكانيكية للبيوفيلم، أو تطبيقها على الأغشية الحيوية الأنواع المختلطة لمعرفة كيف يتم تغيير الخواص الميكانيكية للبيوفيلم من إدخال أنواع أخرى. قد تكون الجسيمات العضلية الهيكلية مفيدة أيضا لوصف بيوفيلم تشتت. ومن شأن هذه الدراسات أن تكون مفيدة في فهمنا للالأغشية الحيوية، ويحتمل أن تحسين العلاجات بيوفيلم لالهندسة الثانية من الأغشية الحيوية للأنشطة مفيدة.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1. بيوفيلم زراعة
- إعداد السلالات البكتيرية
- 1 يوم قبل زراعة بيوفيلم، وإعداد الثقافات البكتيرية العوالق، فحقن 2 مل من متوسط النمو المناسب من ثقافة البكتيرية المجمدة. استخدام لوريا، مرق المتوسطة (10 ز L -1 كلوريد الصوديوم، و 10 غرام L -1 خلاصة الخميرة، و 10 ز L -1 تريبتون) لمخاطي P. الزنجارية وااا Δ Δ والبولندي المسوخ التي المعيبة. احتضان ليلا 37 درجة مئوية و 200 دورة في الدقيقة يهز ظروف. تمييع الثقافات بين عشية وضحاها إلى OD 600 0.40 باستخدام مقياس الطيف الضوئي.
- تجميع الإعداد خلية تدفق، التي وصفت في وقت سابق 14، ويفضل على محطة المحمول أو العربة التي يمكن جلبها إلى غرفة المجهر لتصوير الخلية تدفق دون التفكيك.
- إعداد معقم متوسط النمو في 2 L أو 5 زجاجات L لكل خلية التدفق. استخدام الحد الأدنى من المتوسط M9 (48 ملي نا 2 هبو 4 و 22 مليKH 2 PO 4، 19 ملي NH 4 الكلورين، 9 ملي كلوريد الصوديوم، 2 ملي MgSO 4، و 0.1 ملي CaCl 2) تستكمل مع 0.04٪ الجلوكوز (وزن / المجلد) و 0.2٪ (وزن / المجلد) casamino الأحماض) لP. الزنجارية تدفق الأغشية الحيوية الخلية.
- المجهرية قسامة الفلورسنت في أنابيب microcentrifuge وتدور باستمرار في H 2 O معقمة لمدة 5 دقائق في أجهزة الطرد المركزي في 9،391.2 ز. إزالة وطاف resuspend في 1 مل نمو متوسط إلى إزالة أزيد الصوديوم (مطهر) قبل إضافة إلى نمو متوسط 2 L أو 5 زجاجات L المتوسطة.
ملاحظة: أحجام مختلفة من المجهرية تأتي في تركيزات مختلفة ويجب تخفيفه وفقا للتعليمات. على سبيل المثال، تفريق 120 ميكرولتر من 1.0 ميكرون المجهرية قطر، 15 ميكرولتر من 0.5 ميكرون المجهرية قطر و0.96 ميكرولتر من 0.2 ميكرون المجهرية قطر إلى 2 L من متوسط النمو لإعطاء 2.18 × 10 6 المجهرية مل -1 لكل حجم الجسيمات. - نعلق زجاجة متوسطة إلى upstماعون من خلية تدفق والسماح النمو المتوسطة في التدفق من خلال الإعداد بأكمله. وقف تدفق وضخ الثقافات بين عشية وضحاها المخفف إلى غرف الخلية التدفق. تسمح للبكتيريا ان نعلق على قوام ساترة لمدة 1 ساعة قبل مواصلة تدفق وسط النمو بمعدل تدفق ما يقرب من 5.5 × 10 -3 م ثانية -1، أو 8 دورة في الدقيقة مع مضخة تحوي.
وعادة ما نمت الأغشية الحيوية في درجة حرارة الغرفة (25 درجة مئوية) لمدة 3-7 أيام: ملاحظة. - بدلا من ذلك، على سبيل ثابت الإعداد الثقافة، وتمييع الثقافات بين عشية وضحاها 100 أضعاف في أنابيب microcentrifuge بإضافة 10 ميكرولتر من الثقافة بين عشية وضحاها إلى 1 مل النمو المتوسطة مع جزيئات. زيادة تركيز الجسيمات في وسط النمو للثقافة ثابتة قبل ما يقرب من 500 أضعاف مقارنة مع تلك المستخدمة في الأغشية الحيوية تدفق (مثل غسل و resuspend 600 ميكرولتر من 1.0 ميكرون المجالات قطر في 10 مل من متوسط النمو) كما الأغشية الحيوية خلية تدفق تتجدد باستمرار مع الجسيمات ولكن الثقافات ثابتة ليست كذلك.
- إضافة 2001؛ لتر من الثقافة بين عشية وضحاها المخفف مع جزيئات لغرف 8 الشرائح جيدا. احتضان عند 37 درجة مئوية تحت ظروف ثابتة. وعادة ما نمت الأغشية الحيوية لمدة 1 يوم. استبدال قضى المتوسطة النمو يوميا مع متوسط نمو جديدة مع الجسيمات إذا نمت بيوفيلم لأكثر من 1 في اليوم.
2. المجهر
- في يوم 3 و 5، وإيقاف تدفق من مضخة تحوي وجلب تدفق إعداد الخلية إلى غرفة الفحص المجهري. المشبك أنابيب بالقرب من مدخل ومخرج للغرف خلية تدفق لمنع الانجراف (سبب الخطأ المنهجي بالتغيرات التي تطرأ على البيئة) من التدفق. وضع خلية تدفق على خشبة المسرح مجهر المجهر تستقيم.
ملاحظة: استخدام مجهر مقلوب لتصوير microwells. - استخدام المجهر الفلورسنت مع 40X الهدف النفط لاتخاذ أشرطة الفيديو من microsphere الحركة جزءا لا يتجزأ من بيوفيلم في مواقع مختلفة (microcolonies وطبقات متمايزة مسطحة) وفي أيام مختلفة (يوم 3 و 5) لالتحقيقات الزمانية والمكانية. اتخاذ أشرطة الفيديو أقصر مع ارتفاع معدل الإطار للتحقيق في الأحداث التي وقعت ضمن جداول زمنية قصيرة (على سبيل المثال 1.5-3 أشرطة الفيديو دقيقة في معدل الإطار من 25-50 لقطة في الثانية لديناميكية سريعة)، وأشرطة الفيديو أطول مع انخفاض معدل الإطار للتحقيق في الأحداث على مر الزمن الطويل جداول (مثل أشرطة الفيديو 15-30 دقيقة في معدل الإطار من 2.5-5 لقطة / ثانية لديناميات أبطأ).
ملاحظة: يحتوي الفيديو عادة 5-10 الجسيمات، وعادة ما يكون من 1،0-2،5 GB في حجم الملف. microcolonies أكبر قد عقد المزيد من الجسيمات. تأخذ 5-10 أشرطة الفيديو لكل فئة (على سبيل المثال 5-10 أشرطة الفيديو من microcolonies مختلفة ومواقع مختلفة في طبقات متمايزة مسطحة). بيوفيلم لديه بنية متجانسة التي قد تتكون من microcolonies، قنوات، الفراغات وطبقات متمايزة مسطحة. - حفظ ملفات الفيديو في الشكل المناسب الذي يمكن قراءتها من قبل فيجي / يماغيج (على سبيل المثال czi، TIF).
- تحقق من أشرطة الفيديو لالانجراف عن طريق التمرير من خلال فيد النهائيEO وأشار إلى أن الجزيئات لا تتحرك في نفس الاتجاه في وقت واحد. يمكن أن يكون سبب الانحراف تلو مرحلة Z الحركة، والتيارات في الخلية التدفق، والخلل في جدول مضادة للاهتزاز، وضغط الهواء أو التغيرات في درجات الحرارة. قاصر الصحيح الانجراف باستخدام تقنيات ما بعد المعالجة التي تقدم عادة مع برنامج المجهر. تجاهل أي أشرطة الفيديو حيث لا يمكن تصحيح الانحراف. تسجيل المعلمات التالية، وهي مطلوبة من خلال تحليل الجسيمات تتبع: القرار (بكسل / أم)، عدد من إطارات، المدة.
- إزالة خلية تدفق من مرحلة المجهر وإعادة تشغيل مضخة تحوي على مواصلة زراعة بيوفيلم.
3. الجسيمات تحليل تتبع
- الحصول على مسارات الجسيمات باستخدام المكونات في TrackMate في مجال البرمجيات مفتوحة المصدر (يماغيج). تحميل فيجي في http://fiji.sc/Fiji. فتح الفيديو مع فيجي وضمن القائمة الإضافات، حدد تتبع وTrackMate.
- تحقق أو ضبط الإعدادات في الالبريد يوحي إعدادات المعايرة الأولية لتتناسب مع المعلمات الفيديو كما هو مسجل في الخطوة 2.4 النافذة.
- كشف الجسيمات في TrackMate باستخدام يماغيج.
- اختر 'للكشف عن سجل "، ومدخلات قطر الجسيمات وقيمة العتبة (على سبيل المثال 1000). التمرير عبر الفيديو في حين النقر على الزر "معاينة" للتأكد من أن الدوائر الأرجواني تتبع الجسيمات في جميع أنحاء الفيديو. ضبط القطر والعتبة القيم عند الضرورة: زيادة قيمة العتبة في حالة ظهور الدوائر الأرجواني في المساحة الفارغة. تخفيض قيمة عتبة إذا تم الكشف عن الجسيمات ليست كافية. انقر على زر المقبل لاستكمال الكشف عن الجسيمات.
- انقر على زر التالي عندما قدم مع خيار لإضافة أو إزالة الجزيئات المكتشفة في "العتبة الأولية '،' حدد طريقة عرض" و "اختر مرشح 'ويندوز لمواصلة دون تعديل إذا كان الكشف عن الجسيمات الأولية مرضية.
- اختر 'LAP تعقب بسيط "في غروبعلى شريط "حدد طريقة تعقب 'نافذة كما الجسيمات نادرا ما ينتقل من التركيز في بيوفيلم ويتم تعقبها بسهولة. استخدام المقترح أو منخفضة الربط والفجوة بين اقفال قيم أقصى مسافة، وانقر فوق التالي.
- تأكد من أن تتبع الجسيمات غير مرضية عن طريق التمرير من خلال الفيديو لمعرفة أن الجسيمات يتتبعون التي رسمها TrackMate، وأنه لا توجد مسارات غير المرغوب فيها أو في عداد المفقودين. تخطي مختلف خطوات الترشيح. انتقل إلى نافذة النهائي "حدد الإجراء". اختر 'مسارات تصدير إلى ملف xml' من القائمة المنسدلة وانقر فوق "تنفيذ". اختيار مجلد لحفظ المسارات.
ملاحظة: هناك العديد من البرامج المتاحة في المجال العام لتحليل مسارات الجسيمات واستخدام microrheology. msdanalyzer وTrackArt أمثلة من الجسيمات تتبع برامج التحليل التي تعمل في بيئة ماتلاب.
- إعداد مطلب لاستيراد مسارات الجسيمات في ملفات XML عن طريق اختيار في قائمةملف ماتلاب> تعيين مسار ... وإضافة مجلد البرامج النصية المتاحة مع حزمة فيجي.
- لتحليل مسارات الجسيمات مع msdanalyzer، تحميل رابط لملف مضغوط أو tar.gz الملف at http://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/40692-mean-square-displacement-analysis-of-particles-trajectories .
- استخراج المجلدmsdanalyzer 15 وأسقطه في المجلد الذي ينتمي إلى مسار ماتلاب (على سبيل المثال C: الوثائق وإعدادات <اسم المستخدم> المستندات ماتلاب). بدء مطلب وبدء محلل بكتابة:
أماه = msdanalyzer (2، 'أم'، 'ثانية')
حيث أم والثانية هي وحدة المكان والزمان المادية في الفيديو.- استيراد مسارات الجسيمات عن طريق الكتابة:
[المسارات، MD] = importTrackMateTracks ('FileName.xml'، 'clipZ ".، 'scaleT')
أماه = ma.addAll (مسارات)؛
حيث 'clipZ "يزيل البعد Z للحصول على فيديو 2D، و" scaleT. - رسم المسارات على الرسم البياني باستخدام:
ma.plotTracks.
ma.labelPlotTracks. - حساب العضلية الهيكلية من الجسيمات باستخدام:
أماه = ma.computeMSD.
ma.msd - رسم العضلية الهيكلية كل الجسيمات:
الشكل
ma.plotMSD - الجمع بين مسارات الجسيمات من أشرطة الفيديو وغيرها من نفس categery (على سبيل المثال الجزيئات جزءا لا يتجزأ من النوع البري microcolonies في يوم 3) بتكرار 3.5.1.1 ل3.5.1.4).
- رسم يعني الفرقة أو متوسط على كل المنحنيات:
ma.plotMeanMSD
تغيير Y- ومحور س من الخطية إلى مقياس لوغاريتمي. في بعض الأحيان فارق زمني طويل، منحنيات MSD تصبح صاخبة بسبب إحصاءات كافية في فترات زمنية أطول. قد ترتفع منحنيات MSD أيضا بشكل حاد بسبب خطأ الديناميكي. ويمكن إزالة هذه المناطق من منحنى باستخدام أداة الفرشاةلتحديد نهاية منحنى واختيار 'تنظيف'> 'إزالة Unbrushed "في القائمة أدوات.
- استيراد مسارات الجسيمات عن طريق الكتابة:
- تحميل Ezyfit في http://www.fast.u-psud.fr/ezyfit/ وإضافة Ezyfit إلى مجلد تنتمي إلى المسار ماتلاب (على سبيل المثال C: الوثائق وإعدادات <اسم المستخدم> المستندات ماتلاب). تثبيت القائمة Ezyfit عن طريق كتابة في Matlab مساحة العمل efmenu تثبيت. إعادة تشغيل MATLAB مع القائمة Ezyfit في إطار الشكل. تناسب منحنيات MSD للقانون الطاقة عن طريق اختيار في القائمة Ezyfit 'عرض صالح'> 'الطاقة'> 'ل* س ^ ن' كانت n هو الأس α ناشر المقدرة.
ملاحظة: msdanalyzer يتطلب المنحنى تركيب أدوات في Matlab لتركيب منحنيات MSD. Ezyfit هو بديل والبرمجيات الحرة التي يمكن أن تؤدي منحنى المناسب. - واضحة مسارات الجسيمات الحالية والمشاكل العضلية الهيكلية لحساب العضلية الهيكلية جسيمات جديدة في مواقع أو زمنية أخرى:
صافي - بعد احتساب مختلف منحنيات متوسط MSD الجسيمات في المتوسطة (السيطرة)، وmicrocolonies والمناطق غير متمايزة من مختلف السلالات، ونسخ ولصق المنحنيات في رسم بياني واحد للمقارنة. صلابة عينة ويشابك الزيادة مع القيم MSD أقل. المنحنيات المستوية لها α الدنيا والعينة هي أكثر مرونة من منحنيات حاد مع ارتفاع α.
- تحديد منحنى وانتقل إلى "أدوات" لإلقاء نظرة على البيانات الإحصائية، مثل الوسيط والمدى. وMSD للحبة يتناسب مع الامتثال زحف، J (ر) من المادة التي تم تضمين حبة وفقا للعلاقة،
حيث J = الامتثال الزحف، د = الجسيمات قطر، ك B = بولتزمان ثابتة، T = درجة الحرارة ور = الوقت.
- استخراج المجلدmsdanalyzer 15 وأسقطه في المجلد الذي ينتمي إلى مسار ماتلاب (على سبيل المثال C: الوثائق وإعدادات <اسم المستخدم> المستندات ماتلاب). بدء مطلب وبدء محلل بكتابة:
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
وقد تم التحقيق خصائص اللزجة المحلية للبيوفيلم في مناطق مختلفة من بيوفيلم، والتي تضمنت الفراغات (متوسطة فوق بيوفيلم) والسهول (طبقة مسطحة غير متمايزة من الخلايا) وmicrocolonies (انظر التسميات في الشكل 2A). 3-5 حددت أيضا التغيرات الزمانية في الخصائص اللزجة من بيوفيلم خلال النضج من الأيام. تم استخدام MSD للجسيمات في الفراغات كوسيلة لمراقبة وقابلة للمقارنة إلى MSD الجسيمات في وسط النقي. في المقابل، الجسيمات المحاصرين في بيوفيلم صدي في مواقع ثابتة وتراوحت قيم MSD من تلك...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
Microrheology هو أداة مفيدة لقياس الريولوجية المحلية في الأنظمة غير المتجانسة، مثل الأغشية الحيوية الميكروبية. وهو أسلوب غير مدمرة، مما يتيح رصد في الوقت الحقيقي من التغييرات الانسيابية داخل نفس العينة البيولوجية على نقاط زمنية متعددة. في هذا البروتوكول، تم تطبيق تتبع الجسيمات microrheology لعرض بيل والمسوخ exopolysaccharide البولندي من أجل التحقيق في الكيفية التي تؤثر على مرونة ويشابك الفعال لمصفوفة بيوفيلم. البولندي يفضل تطوير الأغشية الحيوية المرنة مع يشابك فعالية عالية، في حين...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.
شكر وتقدير
ويدعم هذا البحث من قبل مؤسسة البحوث الوطنية ووزارة التربية والتعليم سنغافورة تحت مركز البحوث في برنامج التميز، والبدء المنح (M4330002.C70) من جامعة نانيانغ التكنولوجية، وAcRF المستوى (2 MOE2014-T2-2-172) من وزارة التربية والتعليم، سنغافورة. الكتاب أشكر جوي يام كيوك Hoong للمشاركة في مظاهرة من هذا البروتوكول.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| الفلورفيرات | Invitrogen | F-8821 | 1.0 &# 956; م الفلورسنت الأحمر (580/605) الكريات المجهرية مع تعديل الكربوكسيل |
| Zeiss Axio Imager M1 | Carl Zeiss | مجهر epifluorescent | |
| Masterflex L / S محرك رقمي 07523-80 | Cole-Parmer | EW-07523-80 | المضخة التمعجية |
| غرف خلايا التدفق | بالجامعة التقنية في الدنمارك | ||
| فخ الفقاعات | الجامعة التقنية في الدنمارك | ||
| أنابيب سيليكون | داو كورنينج | 3 مم القطر الخارجي ، 1 & nbsp ؛ مم القطر | |
| الداخلي موصلات بلاستيكية من مادة البولي بروبلين الشفافة ؛ | كول بارمر | 06365-83 | 1/16 بوصة. (1.588 ملم) |
| مقاطع | لتثبيت | ||
| الأنابيب Coverslips | Thermo Scientific & Trade ؛ Nunc™ | حقنة 50 × 24 مم | |
| 3 مل | Terumo | ||
| 27 ز إبرة | Terumo | ||
| 2 L التخزين / زجاجات الوسائط | VWR & reg ؛ | ||
| عربة | لعقد إعداد الفيلم الحيوي |
المراجع
- Costerton, J. W., Lewandowski, Z., Caldwell, D. E., Korber, D. R., Lappin-Scott, H. M. Microbial biofilms. Annu Rev Microbiol. 49, 711-745 (1995).
- Flemming, H. C., Wingender, J. The biofilm matrix. Nat Rev Microbiol. 8, 623-633 (2010).
- Yang, L., et al. Distinct roles of extracellular polymeric substances in Pseudomonas aeruginosa biofilm development. Environ Microbiol. 13, 1705-1717 (2011).
- Chew, S. C., et al. Dynamic Remodeling of Microbial Biofilms by Functionally Distinct Exopolysaccharides. mBio. 5 (4), (2014).
- Irie, Y., et al. Self-produced exopolysaccharide is a signal that stimulates biofilm formation in Pseudomonas aeruginosa. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 20632-20636 (2012).
- Zhao, K., et al. Psl trails guide exploration and microcolony formation in Pseudomonas aeruginosa biofilms. Nature. 497, 388-391 (2013).
- Yang, L., Nilsson, M., Gjermansen, M., Givskov, M., Tolker-Nielsen, T. Pyoverdine and PQS mediated subpopulation interactions involved in Pseudomonas aeruginosa biofilm formation. Mol Microbiol. 74, 1380-1392 (2009).
- Yang, L., et al. Pattern differentiation in co-culture biofilms formed by Staphylococcus aureus and Pseudomonas aeruginosa. FEMS Immunol Med Microbiol. 62, 339-347 (2011).
- Friedman, L., Kolter, R. Genes involved in matrix formation in Pseudomonas aeruginosa PA14 biofilms. Mol Microbiol. 51, 675-690 (2004).
- Bokranz, W., Wang, X., Tschäpe, H., Römling, U. Expression of cellulose and curli fimbriae by Escherichia coli isolated from the gastrointestinal tract. J Med Microbiol. 54, 1171-1182 (2005).
- Denkhaus, E., Meisen, S., Telgheder, U., Wingender, J. Chemical and physical methods for characterisation of biofilms. Microchim Acta. 158, 1-27 (2007).
- Waigh, T. A. Microrheology of complex fluids. Rep Prog Phys. 68, 685-742 (2005).
- Wirtz, D. Particle-Tracking Microrheology of Living Cells: Principles and Applications. Annu Rev Biophys. 38, 301-326 (2009).
- Weiss Nielsen, M., Sternberg, C., Molin, S., Regenberg, B. Pseudomonas aeruginosa. and Saccharomyces cerevisiae. Biofilm in Flow Cells. J Vis Exp. , e2383(2011).
- Tarantino, N., et al. TNF and IL-1 exhibit distinct ubiquitin requirements for inducing NEMO-IKK supramolecular structures. Journal of Cell Biology. 204, 231-245 (2014).
- Yang, L., et al. Polysaccharides serve as scaffold of biofilms formed by mucoid Pseudomonas aeruginosa. FEMS Immunol Med Microbiol. 65, 366-376 (2012).
- Gjermansen, M., Nilsson, M., Yang, L., Tolker-Nielsen, T. Characterization of starvation-induced dispersion in Pseudomonas putida biofilms: genetic elements and molecular mechanisms. Mol Microbiol. 75, 815-826 (2010).
- Qin, Z., et al. Role of autolysin-mediated DNA release in biofilm formation of Staphylococcus epidermidis. Microbiology. 153, 2083-2092 (2007).
- Stoodley, P., et al. The influence of fluid shear and AlCl3 on the material properties of Pseudomonas aeruginosa. PAO1 and Desulfovibrio sp. EX265 biofilms. Water Science & Technology. 43, 113-120 (2001).
- Jäger-Zürn, I., Grubert, M. Podostemaceae depend on sticky biofilms with respect to attachment to rocks in waterfalls. International Journal of Plant Sciences. 161, 599-607 (2000).
- Matysik, A., Kraut, R. TrackArt: the user friendly interface for single molecule tracking data analysis and simulation applied to complex diffusion in mica supported lipid bilayers. BMC Research Notes. 7 (1), 274-283 (2014).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
الوسوم
