توجد طرق مختلفة لإدخال العوامل السامة للأذن إلى قوقعة النماذج الحيوانية. يتم تقديم بروتوكول جراحي لتوصيل العوامل السامة للأذن إلى مكانة النافذة المستديرة. الإجراء موثوق به ، ويخلق آفات مستهدفة داخل القوقعة الصناعية ، ويتجنب الضرر الميكانيكي للبنية الدقيقة. يمكن فحص الإصلاح الذاتي / التجديد الذاتي للقوقعة الصناعية.
مقالة منهجية
النهج ماوس جولة نافذة للالسامة وكيل التسليم: A السريع وتقنيات موثوقة لإحداث قوقعة تحلل الخلية
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
استخدم المحققون مجموعة واسعة من النماذج الحيوانية وتقنيات التحقيق لدراسة الجهاز السمعي للثدييات. يستلزم الكثير من الأبحاث الأساسية التي تشمل القوقعة والمسارات العصبية المرتبطة بها تعريض القوقعة النموذجية لمجموعة متنوعة من العوامل السامة للأذن. يسمح ذلك للباحثين بدراسة آثار الأضرار المستهدفة لهياكل القوقعة الصناعية ، وفي بعض الحالات ، الإصلاح الذاتي أو التجديد الذاتي لتلك الهياكل. توجد تقنيات مختلفة لإيصال العوامل السامة للأذن إلى القوقعة. عند اختيار تقنية معينة ، يجب على الباحثين مراعاة عدد من العوامل ، بما في ذلك تحريض السمية الجهازية غير المقصودة ، ومقدار تلف القوقعة الناتج عن الإجراء الجراحي نفسه ، ونوع الآفة المطلوبة ، وبقاء ، وقابلية تكرار / موثوقية النتائج. تشمل التقنيات المعمول بها حاليا الحقن بالحقن ، والحقن داخل الصفاق ، والحقن عبر الطبلة ، وحقن الكيس اللمفاوي البطاني ، وفغر القوقعة مع التروية المحيطة اللمفاوية. تم استخدام كل من هذه الطرق بنجاح وتم وصفها جيدا في الأدبيات. ومع ذلك ، لكل منها أوجه قصور مختلفة. هنا ، نقدم تقنية للتطبيق الموضعي للعوامل السامة للأذن مباشرة على مكانة النافذة المستديرة. هذه التقنية غير جراحية لهياكل الأذن الداخلية ، وتنتج بداية سريعة للآفات المستهدفة بشكل موثوق ، وتتجنب السمية الجهازية ، وتسمح بالتحكم داخل (الأذن المقابلة للجانب). ساعدت النتائج النابعة من هذا النهج في فهم أعمق للفيزيولوجيا المرضية السمعية ، وتنكس خلايا القوقعة ، والقدرة التجديدية استجابة لإصابة حادة. قد تستخدم التحقيقات المستقبلية هذه الطريقة لإجراء دراسات تدخلية تتضمن العلاج الجيني وزرع الخلايا الجذعية لمكافحة فقدان السمع.
المقدمة
وقد استخدم الباحثون مجموعة واسعة من نماذج حيوانية لدراسة وظيفة طبيعية من النظام السمعي فضلا عن الفيزيولوجيا المرضية لفقدان السمع. هذه النماذج هي أيضا مفيدة للغاية لإجراء دراسات تدخل ضد العمليات المرضية المختلفة وتكون بمثابة الأساس لتطبيقات متعدية في البشر. بالنسبة لمعظم البحوث التي القوقعة السمعية والمسارات المرتبطة بها، يجب وضع حد للأضرار أو تعطل النظام. في كثير من الأحيان، ويهدف الضرر عمدا لخلق آفة معينة، مما يسمح للمحققين لدراسة تأثير تلك الآفة على وظيفة عادية، وكذلك القدرة قوقعة للتعافي من ذلك. عند اختيار نموذج معين الحيوان و / أو تقنية (الصورة) لإدخال الضرر، يجب النظر في عدد من العوامل لتحقيق أفضل النتائج الممكنة. نماذج حيوانية مختلفة قد تستجيب لمختلف التدخلات، في حين أن الآثار المباشرة وغير المباشرة لتقنية قد تكونضارة تماما إلى النتيجة المرجوة. في معظم الحالات، سوف الداخلي بروتوكول ضرر الأذن المثالي تجنب سمية جهازية، بسرعة وبشكل موثوق ينتج الضرر، وخلق الآفة دقيقة ومتناسقة، وتكون النجاة للسماح للمزيد من الدراسة للتغييرات وظيفية، الخلوية والجزيئية. من الناحية المثالية، فإن هذه الأساليب أيضا الحفاظ على المعمارية المصغرة والكهروكيميائية التدرجات الحساسة من القوقعة إلى أقصى حد ممكن.
حتى الآن، نجح الباحثون في إنشاء عدد من التقنيات للحث على إصابة الأذن الداخلية. معظم هذه تنطوي على فضح القوقعة إلى وكيل السامة إما بشكل منتظم أو عن طريق النهج الجراحية. وتشمل تقنيات الحقن الحقن، حقن داخل الصفاق، حقن العابر للطبلي، حقن الكيس اللمفي الباطن، وفغر القوقعة مع نضح اللمف المحيطي. وقد استخدمت هذه التقنيات لتقديم مجموعة متنوعة من العوامل السامة، مثل فوروسيميد، جنتاميسين، ابائين، وheptanol 1-5بينما نجحت في خلق الآفات قوقعة محددة، والتقنيات المذكورة أعلاه أيضا واعترف القيود. يمكن حقن النظامية تكون سامة للغاية للحيوان وقد يترافق مع الشتائم قوقعة غير المقصودة والنتائج غير متناسقة. كما تم المرتبطة العيب الأخير مع الحقن عبر الطبلي. تقنيات مثل فغر القوقعة ونضح اللمف المحيطي، في حين قادرة على إحداث تقرحات سريعة وموثوق بها للغاية، والغازية مباشرة إلى بنية الأذن الداخلية وظيفة. ترتبط العديد من الطرق الجراحية أيضا مع وجود درجة عالية من الصعوبة التقنية وقد تتطلب ترك أجسام غريبة في الحيوانات، مثل التحلل MICROPUMP. 2-4،6-8 لا تقنية واحدة خالية من العيوب، ويجب أن المحققين اختيار طرق بعناية لتناسب احتياجاتهم التجريبية. هنا، نحن تصف بالتفصيل، النافذة المستديرة المتخصصة (RWN) تقنية طلب تسليم موضعي وكلاء السامة في فئران بالغة.
فايوصف RST من قبل HUSMANN وآخرون في عام 1998 عندما كان يدرس تأثير الجنتاميسين على الحسي انحطاط خلية الشعر في نموذج الطيور، تم العثور على هذه التقنية لتكون قادرة على إنتاج الآفات بشكل ملحوظ أكثر موثوقية من تطبيق الجنتاميسين النظامية، مع تجنب السميات المصاحبة. 9 منذ ذلك الحين، وقد استخدمت عدد من المحققين الآخرين، بما في ذلك المختبر لدينا، هذه التقنية نجاحا كبيرا. في عام 2004، Heydt وآخرون. تكييفه مع نموذج الفأر وصفها تعزيز القدرة على التحكم في حجم الآفة عن طريق ملء RWN مع الإسفنج الجيلاتين امتصاص غارقة في تركيزات الجنتاميسين متفاوتة. 10 Palmgren آخرون، في عام 2010، ودرس الآثار السامة من بيتا بنغاروتوكسين، وهي قوية عنصر في السم من التايوانيين النطاقات قفص، من خلال تطبيق نموذج مائي منه إلى RWN الجرذان الكبار. 11 وبالإضافة إلى ذلك، فإن عددا من الدراسات السابقة من مختبرنا وقد استخدمت النهج نافذة مستديرة لدراسة الآثار السامة من furosemidه، وابائين، وheptanol. 5،6،12-15 نتائج هذه الدراسات أثبتت أهمية السوائل القوقعة والأيونات التوازن على السمع، اكتشفت خلية القدرة التكاثري في العقدة الحلزونية والجدار الجانبي قوقعة، وتعزز فهمنا لل المرتبطة بالعمر فقدان السمع.
ينطوي على النهج التالي في الوصول جراحيا في الأذن الوسطى عن طريق شق خلف صيوان الأذن وunroofing جزئية من طبلي الفقاعة العظمية. وهذا يسمح للتعرض الممتاز للRWN والغشاء الذي وكيل السامة ومن الممكن أن تطبق مباشرة. وكيل السائل ثم برك في الغور مثل كوب من RWN (أو ببطء تستنزف من امتصاص الناقل الإسفنج الجيلاتين المشبعة معبأة في RWN) وينتشر من خلال النافذة غشاء جولة في الفضاء اللمف المحيطي من الدهليز القوقعة. ولم يرصد أي فغر القوقعة مباشرة في هذا النهج. وتشمل مزايا هذا الأسلوب الحفاظ على الأذن الداخلية المعمارية المصغرة، وتجنبالسمية الجهازية، وبدل من عنصر تحكم الأذن داخل الحيوان، بداية العاجل من التأثير، انحطاط انتقائية في بعض أنواع الخلايا قوقعة (على سبيل المثال، النوع الأول دوامة الخلايا العصبية العقدية مع التعرض ابائين ونوع القوقعة II الخلايا الليفية الناجم عن علاج heptanol)، والنتائج استنساخه / موثوقة. هذه التقنية يمكن تطبيقها مع بعض التعديلات بين أنواع القوارض الأخرى، بما في ذلك الفئران والخنازير الغينية، والجربوع. وتشمل النواحي منحنى التعلم التقني حاد والحد النسبي من إهانة السامة التي مقيدة إلى نقطة واحدة في الوقت المناسب.
البروتوكول
أجريت جميع جوانب البحوث الحيوانية وفقا للمبادئ التوجيهية للجنة رعاية الحيوان المؤسسية واستخدام المناسبة. وقد وافق جميع الإجراءات التجريبية الحيوانات الفقارية وصفها هنا في إطار المبادئ التوجيهية من كلية الطب بجامعة جنة (MUSC) رعاية الحيوان المؤسسية واستخدام ولاية كارولينا الجنوبية (IACUC).
1. اختيار الموديل
- الحفاظ على نموذج حيواني في الحظيرة منخفضة الضوضاء مع caretaking الروتينية في بروتوكولات المؤسسية لتصبح جاهزة للاستخدام. في البحوث الحيوانية المرافق (ARFs)، والحفاظ على الاستقرار والاهتزاز والضوضاء التخميد، والإضاءة النهارية، الفضاء الإعدادية، والتشطيبات السطحية، وختم والسد، والتهوية التي تلبي معايير المعاهد الوطنية للصحة.
يجوز إعادة النظر في المعاهد الوطنية للصحة (NIH) مبادئ توجيهية لARFs وصيانة الحظيرة منخفضة الضوضاء على العنوان التالي: ملاحظة: http://www.orf.od.nih.gov/PoliciesAndGuidelines/BiomedicalandAnimalResearchFacilitiesDesignPoliciesandGuidelines/ - لجميع التجارب، استخدم الأذن اليمنى كما في الأذن التجريبية. تخدم الأذن اليسرى كعنصر تحكم داخل الحيوانية ولم يتم تغييرها جراحيا.
- تفقد الحيوان نموذج ما قبل الجراحة لعلامات التهاب الأذن الوسطى أو الخارجي. ويمكن أن تشمل علامات محتملة تصريف السائل أو صديد من الأذن والأنسجة الملتهبة الصيوان، و / أو الخمول للحيوان. هذا أمر غير مألوف، ولكن إذا لاحظت، وتجنب المزيد من جراحة وعلاج الحيوان بشكل مناسب.
2. إجراءات قبل الجراحة
- تخدير الحيوان دقيقة 30 قبل الجراحة وأي إجراءات المحيطة بالجراحة عن طريق داخل الصفاق (IP) حقن الكيتامين (100 ملغم / كغم IP) وزيلازين (20 ملغ / كغ IP). تكملة التخدير عند الضرورة، كما تقرره إيجابي منعكس إصبع القدم قرصة، مع جرعة أقل من الكيتامين (25 ملغم / كغم IP) وزيلازين (5 ملغ / كغ IP). تحديد الجرعات وفقا للبروتوكولات يسمح مؤسسيا للفئران مع التقدم في السن التعديلات المناسبة في الجرعة.
- التحقق من الصورة الكاملةedation للنموذج. تحقق من وجود طائرة المرحلة 3 من التخدير لمجمل بروتوكول صفها تميزت معدل التنفس العادي، نقص المنعكس التقويمي (في الفئران)، وعدم وجود دواسة وجفني (أخمص القدمين قرصة) ردود الفعل. الحفاظ على الحيوانات في هذا المستوى من التخدير. هذا أمر بالغ الأهمية للتقليل من الألم والحركة أثناء العملية، والنزيف، وتسرب السوائل الخلالية أثناء الجراحة.
- الحفاظ على درجة حرارة جسم الحيوان في 37.5 درجة مئوية مع وسادة التدفئة حلقة مغلقة.
- إدارة التسكين عن طريق الحقن تحت الجلد البوبرينورفين. تقديم البوبرينورفين (0.1 ملغ / كغ SQ مرة واحدة 30 دقيقة قبل الجراحة)، وتسكين للتقليل من أي إزعاج الجراحي. الجرعات الأساسية وبدائل مناسبة للنموذج المحدد على البروتوكولات المعتمدة مؤسسيا. استخدام المضادات الحيوية ليست ضرورية إذا مورست تقنية العقيم جيدة. الحيوانات تتلقى تسكين بعد العملية إذا كان هناك علامات الألم والضيق.
- أداء فتاهاختبارات ysiologic قبل الجراحة. أداء السمعي استجابة الدماغ (ABR) اختبار و / أو تشويه المنتج اختبار الانبعاثات بصري سمعي (DPOAE) على حد سواء قبل الجراحة وفقط قبل أن يضحي من الحيوان بمثابة القياس الموضوعي للتأثير من وكيل السامة الذي تم اختياره على السمع الفأر.
3. إعداد الجراحي وتحديد المواقع
- تعقيم جميع الأدوات ما قبل الجراحة فقا للمعايير المؤسسية. إعداد الأدوات الجراحية والميدان بطريقة متسقة ومعقمة، ومنظمة لتجنب الجهد لزوم لها والحركة أثناء العملية. أدوات نموذجية المطلوبة تشمل مقص تشريح حادة، عدة أزواج من ملقط معدني مع نصائح الجواهري، ومعول الأذني، وهو كوريت طب الأذن، ووحدة كهربي بين القطبين (الشكل 1).
- إعداد وتعقيم الفتائل الورق المصنوع من labwipes مقدما عن طريق قطع قطعة مثلثة صغيرة من مسح (~ 0.7 في العاشر 1.25 في × 1.75 في) والتواء بإحكام بين الإبهام والسبابة من جهة (~ 1.25 في). إنشاء الملتوية بإحكام، الفتيل رقيقة للغاية هو الهدف الأسمى لنجاح العملية. إعداد ما مجموعه 15-20 الفتائل قبل الجراحة (الشكل 2).
- استخدام حفر الأسنان لخرم بسرعة عظم الفقاعة الطبلية بشكل مضبوط. استخدام الحفر اليد الأسنان حزام يحركها مع طرف 1 أو 2 ملم مدبب هو الأفضل. المجهر الجراحي ضروري لاستكمال البروتوكول. (انظر الخطوة 4.7)
- قبل رسم 0.2 مل من محلول مائي يحتوي على وكيل السامة المحددة في حقنة 1 مل السلين مع 28 G، 1/2 "الإبرة. عادة 1 قطرة (~ 10 ميكرولتر) من وكيل يكفي لملء تماما RWN الماوس. A المعدنية، كليلة إبرة حقنة نصيحه تخفف تسليم وكيل في حين منع الأضرار التي لحقت الكامنة هياكل من طرف شطبة حاد. طرد أي الهواء داخل الحقنة كما فقاعات يمكن أن تملأ سهوا RWN و / أو منع السليمتطبيق عامل إلى إطار الجولة نفسها.
- إزالة الفراء من الجلد بعد الأذني باستخدام كليبرز الاستمالة الكهربائية. إزالة الفراء في منطقة تمتد من تجعد-الأذنية رأسي rostrally إلى caudally حزام الكتف. تمديد إزالة الشعر من ظهري، خط الوسط سهمي إلى زاوية الفك السفلي أفقيا. إزالة الفراء المناسبة أمر بالغ الأهمية للحفاظ على الجراحي الميداني نظيفة وواضحة. الفرشاة بلطف قصاصات من موقع الجراحية المقصود.
- تعقيم الجلد من منطقة المعدة في بروتوكولات المؤسسية. تطبيق betadine (البوفيدون / اليود) بالتناوب مع الإيثانول موضعيا بطريقة دائرية لمدة 2 دقيقة. يمكن أن تكون بديلا غيرها من العوامل في المبادئ التوجيهية المؤسسية.
- وضع الحيوان على سطح مستو للحفاظ على المواقع هيئة المستمر أثناء العملية. استخدام وسادة التدفئة صغيرة توضع تحت الجسم على منصة للتحكم في درجة حرارة الجسم أثناء إجراء للحفاظ على درجة حرارة جسم الحيوان في 36-38 درجة مئوية. لا اوفهrheat الحيوان لأن هذا قد يؤدي إلى خفيفة الى تلف الجلد الشديد و / أو القتل الرحيم في وقت مبكر.
- تأمين رأس الحيوان عن طريق جهاز حامل كتلة دغة / الرأس. الاستفادة من 0.5 سم في 2 سم كتلة دغة تشكيله من النحاس الأصفر مع 2-4 ثقوب مم حفر من خلال ذلك في 5 مم فترات على طول المحور الطويل. فتح فم الحيوان حول هذه المباراة وتناسب القواطع الوسطى العلوية في واحدة من الثقوب اعتمادا على حجم الحيوان. تشديد بلطف المشبك صغير فوق ظهر من خطم الحيوان ليثبت في مكانه (الشكل 3).
- تأكد من أن لدغة حامل كتلة / رئيس يرتبط بشكل صارم إلى وسط الذراع يعبرون عنه على شكل حرف U (الشكل 3). تأمين قضيب واسعة 1CM إلى الذراع الأيسر من "U" واستخدام قضيب باعتبارها الجانب الأيسر رئيس بقية (الجانب الأيمن هو دائما الجانب العملي).
- مرة واحدة تثبت بإحكام في صاحب الرأس، وتناوب على الماوس لوضع استلقاء الجانبي الأيسر. ضع يتنبه الجسمLLY على سطح مستو التشغيل للتأكد من أنه لن تكون مستقرة في جميع أنحاء الداخلي وتجنب الإجهاد التوائية لا مبرر له على الفقرات العنقية.
- وضع مجهر التشغيل قادرة على 4X، 10X، 20X التكبير وعلى مدى الجراحي الميداني. تأكد من أن المجهر يمكن الحفاظ على موقفها بطريقة حرة اليدين لأن هذا هو المثل الأعلى للبروتوكول الجراحية بكلتا اليدين مناقشتها أدناه.
- وضع وحدة الكي تمكين القطبين باليد قطعة مجوهرات يميل على ما يرام في موقف ما هو متاح على الفور للمساعدة في الكي السفن الصغيرة وتشريح الأنسجة. قد يكون هذا أيضا يجب أن يكون واجه نزيف أثقل اللازم.
4. نهج الجراحية
- تحت التكبير المجهري، استخدم مقص حاد أو شفرة المشرط لخلق شق خلف صيوان الأذن 1-1.5 سم، ما يقرب من 6-8 ملم الذيلية إلى تجعد auriculocephalic. في الماوس الكبار، شق من خط الوسط الظهريةأفقيا إلى نقطة بالقرب من زاوية الفك السفلي غير كافية. تجنب بعناية قطع عميق للحفاظ على البنى الوعائية الكامنة.
- إجراء تشريح حادة دقيق من خلال طبقة الدهون تحت الجلد والتي يمكن أن تكون ذات سمك متغير. الدهون يمكن إزالتها بأمان إذا دعت الحاجة لتحسين التعرض. أخذ الحيطة والحذر عند تشريح في اتجاه بطني-وسطي كما الوريد الوداجي الخارجي يخترق هذا المجال، والأضرار التي لحقت هذا الهيكل قد تسبب كميات كبيرة من فقدان الدم والفيضانات في مجال العمليات الجراحية. السيطرة على أي نزيف حاد مع الإسفنج الجيلاتين امتصاص و / أو كريات القطن. استخدام الكي ثنائي القطب لوقف نزيف أثقل.
- مرة واحدة يتم تقسيم طبقة الدهون بشكل صحيح، وتعريض عضلات عنق الرحم. ملاحظة هياكل هامة بما في ذلك مجموعة كبيرة من العضلات cleidomastoideus مركزيا في مجال الجراحة المكشوفة، حبل الوريد الخارجي من الناحية البطنية، والأنسجة النكفية المغطي rostrally زاوية الفك السفلي. معلما هاما هو الفروع الخارجية العصبية الصغيرةح (من العصب القحفي الحادي عشر) الذي يلتف حول الحافة الخلفية / الظهري للcleidomastoideus لتمديد rostrally نحو الصيوان (الشكل 4).
- بلطف سحب الجسم العضلات cleidomastoideus في اتجاه الخلفي / الظهرية (أرقام 4، 5). تقسيم بلطف لفافة شفافة يغلف الجسم العضلات. بطريقة مماثلة، سحب بلطف النكفية والوريد الوداجي الخارجي في المقابل (الأمامي / بطني) الاتجاه (الشكل 5).
- مع تراجع جيدة من الجسم العضلات cleidomastoideus، فإن قبة لامعة من الفقاعة السمحاق الطبلي حيز عرض (الشكل 6). في الجانب الذيلية من الفقاعة، والإدراج في عضلة عنق الرحم أكثر عمقا، وsternomastoideus، ستدخل حيز عرض (الشكل 6). المحافظة على العصب الوجهي، والتي تصبح مرئية في ظهري والجانب منقاري من الفقاعة القبة. وضع ضام الذاتي الاحتفاظ (التيتانيوم العقيمة shaft-- جزءا لا يتجزأ من السيليكون القابل للتصرفلصق) قبل الحفر.
- مع تقنية بكلتا اليدين، وتقسيم بلطف السمحاق الفقاعة مع الإنفاذ الحراري بين القطبين لفضح العظام الكامنة. باستخدام ملقط أو كوريت الأذني، رفع بلطف ودفع السمحاق في اتجاه الطرفية للكشف على نطاق واسع الفقاعة القبة.
ملاحظة: الخطوة 4.6 أمر بالغ الأهمية لتحقيق أقصى قدر من عرض العمليات الجراحية في الفضاء الأذن الوسطى. الاستفادة من التعامل مع الأنسجة اللينة دقيق ولطيف لتجنب النزيف و / أو تسرب السائل الخلالي في تجويف الفقاعة بعد الحفر. - بناء على الفقاعة قبة تتعرض بشكل صحيح، حفر 2 مم ثقب التجريبية من خلال العظام الفقاعة مع الحفر الجراحية الأسنان بين الهامش الذيلية من القبة والخط مبهمة واضح (تمثل الغشاء الطبلي) تمتد عبر الجانب منقاري من الفقاعة (الشكل 7). احرص على حفر إلا من خلال العظام للحفاظ على الهياكل الأساسية، مثل الشريان الركابي. حفر حفرة الرائد الثاني في مكان قريب لتسهيل الامم المتحدة تسقيف العظم الفقاعة (<قوي الشكل> 7).
- باستخدام زوج من ملقط غيض المجوهرات، إرفع قبعة العظم الفقاعة في ظهري والتوجيه الذيلية (الشكل 8). إزالة العظام بطريقة مجزأة تحت التكبير عالية. لا ثقب الشريان الركابي، التي تقع مباشرة تحت سقف الفقاعة، ونزيف من هذا الشريان قد تعرض للخطر الإجراء. تقليل كمية من العظام إزالتها لمنع دخول السوائل المفرط للأذن الوسطى في حين لا يزال يسمح التصور الممتاز والوصول إلى إطار الجولة المتخصصة (الشكل 8).
5. جولة طلب نافذة السامة وكيل
- إجراء تعديلات التناوب خفية إلى صاحب الرأس لجلب RWN تماما في الرأي. يقع RWN عادة في ظهري والجانب الذيلية من مساحة الأذن الوسطى ويظهر على شكل تثليم مثل كوب من الكبسولة العظام أذني. في معظم الحالات، الشريان الركابي يعمل 1-2 ملم بطني / منقاري إلى ذلك. وRWN يمكن أن يكون في بعض الأحيان TUCرطة محيطيا تحت التزوي حاد في الفقاعة القبة. في مثل هذه الحالات، وضع دقيق للرأس الحيوان هو الهدف الأسمى.
- باستخدام الفتائل رقة أعدت قبل الجراحة، وإزالة جميع السوائل وضوحا في الأذن الوسطى وRWN حتى يتم تصور العظام الجافة.
ملاحظة: هذه هي الخطوة الأكثر أهمية البروتوكول بأكمله، كما ~ 10 ميكرولتر (1 قطرة) من وكيل السامة تطبيقها على RWN يمكن بسهولة أن تضعف هذا السائل.
- باستخدام الفتائل رقة أعدت قبل الجراحة، وإزالة جميع السوائل وضوحا في الأذن الوسطى وRWN حتى يتم تصور العظام الجافة.
- تحت الحد الأقصى للتكبير، واستخدام إبرة عيار الجميلة على 1 مل حقنة السلين لتطبيق قطرة واحدة (~ 10 ميكرولتر) من وكيل السامة مباشرة إلى RWN، وملئه تماما. الحرص على عدم تعطيل الشريان الركابي ومراقبة عن كثب لاستبدال انعكاس ضوء صغير في قاعدة مكانة الجافة مع هلالة السوائل مملة وضبابية كمؤشر على أن مكانة تملأ بشكل صحيح.
- السماح للعامل للراحة داخل RWN لحوالي 10 دقيقة وقت التعرض. بعد ذلك، تماما ثإك من وكيل واستبدالها بتطبيق جديد لنفس الوكيل. تحديد تكرار التطبيق وفقا لمواصفات العميل. مجموع وقت التعرض في هذا الإجراء عادة ما يتراوح بين 30 إلى 60 دقيقة.
- في نهاية هذا الإجراء، الفتيل بعيدا تماما وكيل مرة واحدة نهائية وتطبيق وكيل جديد لRWN. ترك الفقاعة لم يسبق لهم اللعب واستخدام ملقط لإغلاق الأنسجة الرخوة على موقع الجراحية.
- اغلاق موقع الجراحية على مستوى الجلد مع 4-0، حيدة غير قابل للامتصاص خياطة. وضع الحيوان في انتعاش قفص / المحطة. رصد حالة سريرية الحيوان بعد العملية بانتظام. الحفاظ على الحيوانات في ظروف البيئة المناسبة، بما في ذلك السكن مع الفراش لينة والمكملات الغذائية مع لينة، للحد من التوتر. تحديد الإجراءات المستقبلية وظروف ما بعد الجراحة وفقا لبروتوكولات IACUC المؤسسية.
- استخدام المؤسسية بروتوكولات IACUC لتعقيم الأدواتالصورة قبل الاستخدام على الحيوان المقبل. السماح لوقت التبريد المناسب بين استخدام الصك.
6. إجراءات ما بعد الجراحة وقوقعة الأنسجة الحصاد
- كما هو موضح في الخطوة 2.5، نفذ اختبار فيزيولوجي السمع بعد العمل الجراحي عند نقاط المطلوبة وقبل أن يضحي. إجراء عمليات ما بعد الجراحة وفقا لأهداف تجريبية. التضحية الحيوانية في أي يوم بعد العملية الجراحية المطلوبة.
- على التخدير الكامل عن طريق الحقن IP، كما هو مطلوب في بروتوكولات IACUC المؤسسية، التضحية الحيوانية. باستخدام مقص حاد، قطع رأس الحيوان فقط الذيلية إلى قفا. بشكل حاد فتح قبو الجمجمة مع مقص على طول ظهري وبطني خط الوسط وانتشرت على نطاق واسع. حلج القطن بلطف من أنسجة المخ لفضح العظام الزمنية.
ملاحظة: هناك عدد من الإجراءات لتحقيق التغيرات تعرض بعد في القوقعة يمكن أن تتفرع من هذه النقطة، وستذكر في قسم المناقشة. تحديد أسلوب التحقيق أكثر relevanر لأهداف تجريبية. إذا تم التخطيط المجهر الإلكتروني بعد مقطوع القوقعة، استخدام القسطرة القلبية إلى ما قبل إصلاح الأنسجة. هذا هو خارج نطاق هذه المناقشة وتمت تغطية متعمقة في مكان آخر. 13 - قطع العظام الزمنية للخروج من قاعدة الجمجمة مع مقص ووضعها فورا في حل تثبيتي. تزج العظام مباشرة في بارافورمالدهيد 4٪ مقابل 1.5 ساعة عند RT. مراقبة الوقت التثبيت، وأطول مدة يمكن أن تحد من نتائج التحليل النسيجي في خطوات لاحقة. تشريح يزيل الكلس العظام لفترة من الزمن المتغير عن طريق الغمر في 1 حمض ملي Ethylenediaminetetraacetic (EDTA).
النتائج
في دراسة حديثة أجراها ستيفنز وآخرون باستخدام بروتوكول أعلاه، تعرضت الفئران CBA / CAJ الكبار من كلا الجنسين عن طريق مستديرة نافذة نشرها لheptanol 15 Heptanol فجوة تقاطع الامم المتحدة مقرنة المعروف أن تنتج المستهدفة، إصابة القابلة للخلايا الجدار الجانبي القوقعة. وكان الغرض من هذه الدراسة هو إنتاج نموذج موثوق عن الضرر القوقعة المستهدفة، مما يسمح للتحقيق في تجديد بعد الجراحة من أي عناصر التالفة. عتبات جلسة استماع قبل الجراحة وبعد الجراحة كانت بمثابة نقطة النهاية وظيفية. استخدمت المجهر وتقنيات تلطيخ المناعى لدراسة التغيرات الشكلية. وقد لوحظت زيادات كبيرة في عتبات ABR في الفئران المعالجة heptanol (الشكل 9). الحيوانات السيطرة تلقي جراحة صورية، مع تسليم المالحة بدلا من heptanol، لم تثبت عتبة تحولات كبيرة في أي التردد المختبرة.
المناعية ضد تصحيح باطنهقناة البوتاسيوم (قير) 4.1 بمثابة الطريقة غير المباشرة لتصور الضرر / استرداد الهياكل القوقعة. أظهرت هذه الاختلافات استنساخه للغاية بين العلاج والسيطرة الأذنين. وقد انخفضت كثافة تلطيخ الشاملة بشكل ملحوظ داخل عائي السطر (STV) وبين الخلايا الليفية في الرباط دوامة (SLF) بعد 1-3 أيام بعد التعرض heptanol، تدل على كميات كبيرة من الأضرار التي تستهدف هذه المناطق. كان هناك انخفاض معين في قير كثافة 4.1 تلطيخ في مجالات النوع الثاني والنوع الرابع SLFs (الشكل 10) وSTV (الشكل 11). واعتبر دليلا على سلامة النووية تعطلت والكروموسومات التكثيف / الفقاعات نموذجية من الخلايا الخلوية أيضا على counterstains النووية في هذه المناطق قوقعة (الشكل 10). مناطق فجوية قير 4.1 تلطيخ حل ملحوظ في 7 أيام، وكانت غائبة تماما في 14 يوما. عندما كان كميا قير 4.1 كثافة تلطيخ في مجالات STV، تظاهر آذان يعامل هذا initiآل الحوض يليه تحولا كبيرا (P <0.05) مرة أخرى نحو شدة السيطرة بعد 7 أيام التعرض heptanol (الشكل 12).
تعيين الرقم 1. صك تصل. تصوير من قبل الجراحة مجموعة المتابعة من الأجهزة. وينبغي أن يكون الوصول إليها بسهولة في مجال الجراحة المعقمة جميع المعدات. ويشمل الأجهزة نموذجي 2 مقص حاد تشريح، 2-3 على التوالي و / أو ملقط المنحنية الجواهري طرف مع كرتس الأذن، يختار طب الأذن رمح منحنية (في وقت لاحق استبداله مع روزين يختار - لا يظهر)، ووحدة الكهربائية الكي مع ملقط غرامة منحني الجواهري طرف ل خوذة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2. إمدادات جراحية. إمدادات إضافية للحفاظ على البيئة RWN. القواطع labwipe تعقيمها لتشكيل الفتيل ورقة (يسار)، ورقة شكلت بإحكام ويكس مصنوعة من مناديل معقمة المختبر (في الوسط)، و 4 الكريات مم القطن (يمين) وتستخدم لمسح السوائل الزائدة والفيضانات الدم في إطار الجولة المتخصصة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3. الحيوان صاحب الرأس. صورة تصور صاحب ورئيس كتلة دغة. الثقوب في كتلة تناسب وتأمين القواطع الوسطى العلوية. وشددت المشبك بلطف على خطم ظهري لتأمين الحيوان في المكان. استخدام صاحب الرأس أمر بالغ الأهمية لنجاح outc الجراحيةيا انا. من الناحية المثالية، ينبغي أن تكون قادرة على تدوير حول محور منقاري الذيلية للحيوان لتحسين وجهات النظر الجراحي للالفقاعة أثناء العملية. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 4. Cleidomastoideus م. البياني. تخطيطي تصور علم التشريح الأساسي للالقوارض عضلات عنق الرحم وارتباطه الوريد الوداجي الخارجي. عضلة cleidomastoideus هي العضلة الأكثر تحديدها بسهولة خلال النهج الجراحية. الإفراج عن لفافة يغلف تليها الخلفية / الظهرية تراجع من الجسم العضلات سيوجه تشريح جراحي نحو الفقاعة الطبلية (دائرة سوداء). الرجاء انقر هنا لمشاهدة النسخة arger من هذا الرقم.
الرقم 5. منطقة التعرض الجراحية. يصور تعرض بعد تشريح عبر طبقات الدهون الجلدية وتحت الجلد. وتشمل المعالم الهيكلية للمذكرة فرع من العصب القحفي الحادي عشر تغمر العضلات cleidomastoideus (A)، حبل الوريد الخارجي (B)، ويتعرض النسيج النكفية (C). وكثيرا ما يرتبط الجمجمة فرع العصب الحادي عشر مع سفينة صغيرة ويجب أن تقسم قبل المتابعة. اليمين إلى اليسار على الصورة يتوافق مع محور منقاري الذيلية الحيوان. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 6. فضح بوLLA. التعرض للالفقاعة الطبلية بعد تراجع من cleidomastoideus والهياكل المحيطة بها. وتشمل المعالم البارزة الجسم العضلات cleidomastoideus (A) يعكس الخلف / ظهريا، والعصب الوجهي (B)، وقبة لامعة من السمحاق الفقاعة الطبلي (C). أيضا، لاحظ الإدراج عضلة sternomastoideus في الجانب الأيسر من الذيلية الفقاعة الطبلية (النجمة). وجود العصب الوجهي في ظهري ومنقاري الجانب من الفقاعة معلما حاسما لتحديد الحقيقي للالفقاعة. اليمين إلى اليسار على الصورة يتوافق مع محور منقاري الذيلية الحيوان. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 7. تعريض الجولة نافذة المتخصصة I. صورة التي تصور tympaشركة الاستثمارات الوطنية الفقاعة يتعرض بشكل كامل بعد تشريح السمحاق المغطي. هو الأقدر ثقب التجريبية عند نقطة في منتصف الطريق بين الحافة الذيلية للالفقاعة القبة وخط مبهمة خفية تصور داخل الجانب منقاري الفقاعة (تمثل الغشاء الطبلي). والثاني، ثقب التجريبية المجاورة قد يسهل أسهل الامم المتحدة تسقيف العظم الفقاعة. ينبغي أن تؤخذ تجنب الحفر العميق حتى لا تجرح الشريان الركابي الأساسي. و، جسم معدني داكن في الجزء السفلي من الصورة هو ضام الأنسجة الرخوة التيتانيوم. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 8. تعريض نافذة مستديرة المتخصصة II. الفقاعة الطبلية لم يسبق لهم اللعب مع التعرض من النافذة مكانة المستديرة (السهم) والشريان الركابي (هيكل الأحمر1-2 ملم الوحشي لمحراب) كما ينظر تحت 20X التكبير. مكانة غالبا ما يضع في موقف مدسوس تحت زاوية حادة شكلتها الفقاعة قبة مع الكبسولة أذني في الجانب الذيلية القبة. ومن الضروري أن التصور الكامل للمكانة تتحقق قبل تطبيق كيل السامة أو فتل. وينبغي أيضا تجنب إزالة العظام المفرطة خلال uncapping كما تميل الخلالي السوائل / الدم لإغراق تجويف عندما تم إنشاؤها فتحات كبيرة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 9. ممثل النتائج - Heptanol الناجم عن فقدان السمع والانتعاش يعني استجابة الدماغ السمعية (ABR) عتبات (ديسيبل SPL) تآمر بوصفها وظيفة من لهجة نقطةتردد. يتم تجميع القياسات وفقا لمرحلة ما قبل التعرض (الأسود التحكم) واليوم بعد العمليات الجراحية (POD) 1 و 7 و 14 (الأحمر). أشرطة الخطأ تمثل SEM. وكان الرقم إعادة تآمر-من ستيفنز وآخرون. 2014. 15 الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 10. ممثل النتائج - استهداف الضرر القوقعة بعد التعرض heptanol الجزء الأول التغيرات في البوتاسيوم المعدل الداخلية (قير) قناة 4.1 تلطيخ داخل عائي السطر (STV) من آذان تعامل مع heptanol والسيطرة على الأذنين. (A) عادي قير 4.1 تلطيخ نموذجية من آذان السيطرة مع تقارب خلية strial القوي لقير 4.1 (الخضراء). (B) علاج الأذن على POD1. مناطق vacuolized كبيرة من decrوينظر خففت قير 4.1 تقارب في STV (النصال) جنبا إلى جنب مع انخفاض عام في STV قير 4.1 كثافة تلطيخ. وcounterstained نوى مع اليود propidium (أحمر) (B). = شريط نطاق 15 ميكرون. وكان الرقم إعادة تآمر-من ستيفنز وآخرون، 2014. 15 الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 11. ممثل النتائج - استهداف الضرر القوقعة بعد التعرض heptanol الجزء الثاني التغييرات في الرباط دوامة (SL) من heptanol الأذن المعالجة مقارنة للسيطرة على الأذن. (A) عادي قير 4.1 تلطيخ (الأخضر) داخل SL نموذجية من السيطرة الأذن مع نوع العادي الظهور II الخلايا الليفية الرباط لولبية (II). (B) Heptanol رالأذن reated مع انخفاض ملحوظ في قير كثافة 4.1 تلطيخ في مجال النوع الثاني الخلايا الليفية الرباط لولبية، واختلال النووي والكروموسومات التكثيف / الفقاعات تتفق مع موت الخلايا المبرمج (السهام). وcounterstained نوى مع اليود propidium (الحمراء). = شريط نطاق 15 ميكرون. وكان الرقم إعادة تآمر-من ستيفنز وآخرون، 2014. 15 الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 12. ممثل النتائج - استرداد قوقعة كثافة تلطيخ بعد التعرض heptanol يعني الإنارة النسبية قير تآمر 4.1 تلطيخ بوصفها وظيفة من يوم بعد التعرض. يتم احتساب الإنارة النسبية كما قير 4.1 كثافة العاكسة تحت المجهر متحد البؤر في heptanol علاجآذان إد اتخذت كنسبة مئوية من نفسه في آذان السيطرة. يتم تجميع البيانات ملاحظة POD14-28 باعتبارها نقطة واحدة على المنحنى. وتمثل الدوائر الصلبة القيم المتوسطة بينما تمثل قضبان الخطأ الخطأ المعياري للمتوسط. وقد أظهر انتعاشا كبيرا من الإنارة النسبية بين POD 7 وتواريخ لاحقة (ر ص اختبار الطالب <0،05، النجمة). وكان الرقم إعادة تآمر-من ستيفنز وآخرون، 2014. 15 الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
المناقشة
تم الحصول على نتائج البروتوكول والتمثيلية المذكورة أعلاه في نموذج الفأر CBA / CAJ بما في ذلك كلا الجنسين. تم تأسيس هذه السلالة الفطرية كذلك معيار "الاستماع الجيد" و "الشيخوخة الطبيعية" نموذج في البحث السمع. 16-23 وصف استخدام هذا البروتوكول في نماذج الثدييات الأخرى خارج نطاق هذا النص. القارئ ينبغي أن نلاحظ، مع ذلك، أن تقنية التطبيق RWN تقدم العديد من المزايا لدراسة الأذن الداخلية الثدييات. من هذه، وأبرزها هو أنه يتجنب انقطاع المباشر من التركيب التشريحي الدقيق والتدرجات الكيميائية الحيوية التي توجد داخل جدران الكبسولة أذني. إجراءات مثل فغر القوقعة وزرع مضخات حقن لديها الميل إلى تنتهك مباشرة الهياكل الأذن الداخلية مما يؤدي إلى تحولات عتبة الدائمة؛ وهذه حقيقة يجب أن تؤخذ بعين الاعتبار عند تحليل النتائج. اختلال الهياكل الجدار الجانبي القوقعة التي كتبها metho الغازيةقد DS أيضا الحد من استخدام وكلاء السامة مثل فوروسيميد أو heptanol، الذين محدد المنطقة من تأثير يقتصر على هذا الموقع. 15،24 النهج غير الغازية البديلة مثل الحقن عبر الطبلي والحقن الوريدية قد تعاني من نتائج لا يمكن الاعتماد عليها و / أو سمية جهازية إلى نموذج حيواني. وقد أثبتت هذه الطريقة تطبيق لتجنب كل من هذه العيوب، وتحقيق مستوى من الاتساق يقترب ذلك من أساليب أكثر الغازية التي نوقشت أعلاه.
وتشمل المزايا الأخرى لهذه التقنية يتم تطبيقها على نطاق واسع لعدد من النماذج الحيوانية وجدوى لتدرج في بنية تحتية المختبرات القائمة. بخصوص هذا الأخير، ليس هناك حاجة لالكواشف الكيميائية المتخصصة أو جانبا من اختيار السامة وكلاء، والتخدير، والمسكنات. وتستخدم وكلاء السامة عادة بتركيز ثابت ومختلطة في حجم كبير بما فيه الكفاية من حل (5 مل) إلى آخر فترات طويلة من الزمن النظرجي كل تطبيق يستخدم حوالي 10 ميكرولتر (في الفئران). وهكذا، وبعد الشراء الأولي من اللوازم والأدوات والمحققين أحرار نسبيا من مضيعة للوقت إعداد الحل أو الاستبدال المتكرر للمواد. كما يوفر هذا الأسلوب تخفيضات في الوقت المنطوق، والتي قد تكون كبيرة بالمقارنة مع الإجراءات التي تنطوي على زرع مضخات حقن المحيط باللمف أو cochleostomies. عند بلوغ مستوى من الكفاءة الفنية، وكان لدينا متوسط وقت الانتهاء من شق الأولي لإغلاق عادة 20 دقيقة إلى 1.5 ساعة اعتمادا على طول التعرض المطلوب للعامل السامة. قد بسهولة أن تكتمل ثلاث أو أربع عمليات جراحية في يوم واحد، مما يتيح لزيادة الكفاءة وزيادة إمكانية الحصول على نتائج ناجحة. كما هو موضح أعلاه، هذه التقنية يمكن أيضا تطبيقها بسهولة إلى مجموعة متنوعة من نماذج القوارض بما في ذلك الفئران والجرذان والخنازير الغينية والجربوع.
وتتركز القيود المفروضة على هذا الأسلوب علىمتوسطة منحنى التعلم حاد بحاجة إلى السيطرة عليه وانخفض النتائج المتوقعة حتى يتم التوصل إلى الكفاءة الفنية. كما ستتم مناقشته بمزيد من التفصيل أدناه، سوف الأخطاء الصغيرة خلال النهج الجراحية أو التصور الكافي للالجراحي الميداني تؤدي دائما تقريبا إلى نتائج سيئة. النتائج الدقيقة التي قد تفشل مبتدئ الاعتراف، مثل سميك فقاعة الهواء لمنعها من الوصول دون ملليمتر من وكيل إلى إطار غشاء مستديرة أو السائل الخلالي تمييع وكيل، يستغرق وقتا طويلا لنقدر وتطوير المهارات الحركية اللازمة لتصحيحها. ومع ذلك، مع الأداء المتكرر لإجراء هذه العقبات والتغلب عليه بسهولة، وتشكل تحديا تقنيا أقل ترويعا للمحققين من بعض الأساليب الغازية المذكورة آنفا. وأخيرا، ويرتبط هذا الأسلوب مع الحد النسبي الذي الإصابة قوقعة لا يمكن إلا أن يتسبب في نقطة واحدة في الوقت المناسب أثناء التعرض للعمليات الجراحية. هذا يمكن التغلب عليها لدرجة معينة، عن طريق ملء RWN مع الإسفنج الجيلاتين امتصاص غارقة في عامل كما وصفت من قبل Heydt وآخرون. 10 والجيلاتين الإسفنج امتصاص ممتص مع مرور الوقت، ولكن قد تسمح للفترة تعرض أطول مما هو تحقيقه من خلال تطبيق محلول مائي وحدها.
من أجل محقق لتحقيق المزايا الكاملة لهذا الأسلوب وتجنب أي عثرات، فمن الأهمية بمكان أن ندرك اثنين من العناصر الحاسمة لهذه التقنية: 1) الحفاظ على التصور للفضاء الأذن الوسطى وRWN باستمرار. و2) القدرة على الحفاظ على الجراحي الميداني خالية من السائل الخلالي و / أو الدم. في تحقيق سابق من هذه، وأهمية رأس صاحب السليم لا يمكن المبالغة في التأكيد عليها. تثبيت آمن للرأس الحيوان يضمن رأي مستقر تحت المجهر. أهمية التي تصبح واضحة بسهولة عندما أجهزة خفية يتغير بشكل جذري وضعية الهياكل تحت التكبير. A ح جيدةحامل EAD التي يمكن أن تدور حول محور منقاري-الذيلية الحيوان يسهل أيضا تغييرات ديناميكية مهمة في خط المحقق من الموقع. في كثير من الأحيان، يمكن أن بضعة ملليمترات الدوران حول هذا المحور يعني الفرق بين التصور من RWN والتصور فقط الكبسولة العظام أذني. القدرة على تغيير باستمرار نظرا أيضا قصوى لضمان السائل الخلالي وإزالتها بشكل صحيح من أعماق المتخصصة وأيضا أن وكيل السامة تتم إزالة تماما بين التطبيقات على النحو المبين في الجزء 5. في تجربتنا، والدم، والتكثيف، أو السائل الخلالي الذي يدخل حيز الأذن الوسطى لديه القدرة على التدخل مع التجربة برمتها. وهذا ليس مستغربا، حيث أن كمية ضئيلة من وكيل السامة تطبيقها على نافذة مستديرة (~ 10 ميكرولتر) يمكن بسهولة أن تضعف من قبل ملامسة حتى كميات صغيرة من السوائل دخيلة. لهذا السبب، تشريح جراحي دقيق، uncapping الجزئية من الفقاعة الطبلية وpreservat دقيقأيون الشريان الركابي هي بمثابة النتائج التجريبية الناجحة.
إذا لوحظ وما زالت لم تحقق النتائج المتوقعة الخطوات الحاسمة المذكورة أعلاه، يجب أن تبدأ استكشاف الأخطاء وإصلاحها. في تجربتنا، وغالبا ما يكون من المفيد أن تؤدي الاختلافات محاكمة اثنين من العناصر الإجرائية. الأول هو تعديل التردد الذي يتم تجديدها وكيل السامة في إطار الجولة. اعتمادا على وكيل المستخدمة، ومجموع وقت التعرض ما بين 30 دقيقة و 1 ساعة، مع فتل كامل واستبدال لاحق للعامل كل 10 دقيقة. إذا تعرض لفترات أقصر، وزيادة التعرض الإجمالي قد تسمح للعامل مزيد من الوقت لنزع فتيل عبر نافذة غشاء المستديرة. تعرض إضافي وتجديد قد يساعد أيضا على تجنب تخفيف غير المرغوب فيها من وكيل السامة عن طريق الدم، والتكثيف، أو فراغي على النحو المذكور أعلاه. ينبغي الحفاظ الحذر عند استخدام هذا النهج، ومع ذلك، لأنه يميل إلى زيادة خطر غير مقصودلاي اصابة الشريان الركابي و / أو إدخال السائل الخلالي إلى RWN.
هذه التقنية هي كبيرة في ما تقدم أن التحقيقات في علم وظائف الأعضاء القوقعة والفيزيولوجيا المرضية. تسمح هذه التقنية التنظيرية دراسة مفصلة عن العمليات الكيميائية الحيوية الحساسة، وكان بمثابة في تعزيز أبحاثنا التي تهدف إلى تقييم إمكانات التجدد القوقعة. 12،24 هذا النهج الجراحية والتعرض ويرد أيضا عبر مجموعة متنوعة من التقنيات فرع الأخرى، ونتائج ناجحة باستخدام هذه تم الإبلاغ عن طريقة في دراسات قوقعة زرع الخلايا الجذعية. ولا يزال 14 هناك قدر كبير معروف عن القوقعة، ولكن هذا الأسلوب، جنبا إلى جنب مع عتاد أوسع متاح للمحققين، سوف تساعد في تضييق هذه الفجوة المعرفية.
الإفصاحات
لا تنافس المصالح المالية. الكتاب ليس لديهم ما يكشف.
شكر وتقدير
تم دعم هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة (NIH) رقم المنحة: NIH P50DC00422 (HL); المعاهد الوطنية للصحة R01DC12058 (H.L.). استفاد هذا العمل أيضا من جائزة العلوم السريرية والتحويلية لمؤسسة ساوث كارولينا للبحوث السريرية والتحويلية (SCTR) (NIH / NCRR UL1RR029882). لم يكن للممولين دور في تصميم الدراسة و / أو جمع البيانات و / أو التحليل. يود المؤلفون أن يشكروا لوني إي براون جونيور على مساهماته الفنية والرسومية.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| 1-هيبتانول 98٪ | سيجما ألدريتش | H2805 ؛ | PubChem معرف المادة 24895536 |
| Ketaset عن طريق الحقن | باترسون البيطري | 07-803-6637 | تركيز 100 مجم / مل |
| (الكيتامين حمض الهيدروكلوريك) | 10 مل | الجدول CIII مادة | |
| Anased Insuable | Lloyd Laboratories | NADA # 139-236 | مركز 20 مجم / مل |
| Buprenex عن طريق الحقن ؛ | باترسون البيطرية | 07-850-2280 | مركز 0.3 مجم / مل |
| (بوبرينورفين حمض الهيدروكلورايدي) | 5 أمبولات في الصندوق | الجدول CIII مادة | |
| بيتادين للجلد الإعدادية | Medline | MDS093941 < / a> | 1 كوارت زجاجة علوية برغي |
| 0.9٪ محلول ملحي معقم | متغير | لخلط المحاليل والحقن | |
| تشغيل المجهر | كارل زايس | 32192 | |
| الصوتيات الخاضعة للرقابة البيئة كشك الصوت | شركة | ||
| حامل الرأس الجراحي حسب | الطلب & ndash ؛ | يرجى الاطلاع على الشكل 3 | |
| ضام الأنسجة الرخوة للرقبة بجامعة ساوث كارولينا | |||
| مضمن في معجون يمكن التخلص منه لتثبيته ديناميكيا على حامل | |||
| Emesco | خمر عنصر | ||
| مشرط مقبض مقاس 6 | Bard-Parker | MEDC-011990 | |
| مشرط جراحية من الفولاذ المقاوم للصدأ | بارد باركر | رمز المنتج: 097-7215 | 50 شفرة / صندوق |
| عبر ACE كود | |||
| الجراحي الملقط المجوهري ذو الطرف المستقيم | برنيل | MIL17304 | |
| مقص قزحية منحني | Medline | DYND04026 < / a> | |
| مقص القزحية مستقيم | Medline | DYND04025 < / a> | |
| Stevens Tenotomy مقص مستقيم | Medline | MDG3222111 < / a> | |
| Rosen إبرة الأذن عمود مستقيم ، طرف منحني قليلا | MytaMed | البند # 6.56.00 | الشكل 1 يوضح اختيارات العمود بزاوية. تم استبدال هذا لاحقا باختيارات روزين |
| إبرة الأذن الوردية عمود مستقيم ، طرف منحني بقوة | MytaMed | البند # 6.56.01 | |
| Kimwipes ممسحات المهام الحساسة | Kimtech Science | CODE 34155 | أبيض مقاس 4.4x8.4 بوصة. تقطع إلى مثلثات وتدحرج إلى فتائل ذات طرف رفيع. |
| الأذن Curette ، 6 "رمح ، زاوية الضوء | Medline | MDG0396486 ؛ < / a> | |
| جل فوم (إسفنجة جيلاتين قابلة للامتصاص) مقاس 100 | Medline | IIS34201 ؛ يمكن إجراء بدائل < / a> | |
| كريات قطنية # 3 4 مم | ريتشموند | كود الشركة المصنعة 100108 | |
| وحدة الجراحة الكهربائية 100 E M / M | Elmed | القائمة رقم 52-5770 | ثنائي القطب وأحادي القطب قادر |
| على 1cc U-100 حقنة الأنسولين 28 جرام ، إبرة بطول 0.5 بوصة | رقم | المنتج: 329410 | اختياري لتسليم عامل الأذن |
| السامة 23G ، طرف حاد ، 1 " طول إبرة | كيندال | رمز المنتج 8881202397 | للتسليم المتحكم فيه لعامل الأذن مع مخاطر أقل من إتلاف الشريان الثابت |
| قناع جراحي | U-line | S-10478 | |
| قفازات جراحية النتريل الصف | U-line | S-12549 < / a> | |
| ماكينة قص الشعر | Wahl | يمكن استبدال نماذج متعددة | |
| 5-0 خياطة أحادية الشعيرات السوداء من النايلون على PC-1 & nbsp ؛ يمكن إجراء بدائل إبرة دائرية مقاس 13 مم 3/8 | Ethilon | 1855G | . |
| كيس التعقيم الفوري | الختم فيشر | 01-812054 | |
| معقم جاف | ROBOZ | Germinator TM< / sup> 500 |
المراجع
- Kimura, R. S., Iverson, N. A., Southard, R. E. Selective lesions of the vestibular labyrinth. The Annals of otology, rhinology, and laryngology. 97, 577-584 (1988).
- Dodson, H. C. Loss and survival of spiral ganglion neurons in the guinea pig after intracochlear perfusion with aminoglycosides. Journal of neurocytology. 26, 541-556 (1997).
- Wanamaker, H. H., Gruenwald, L., Damm, K. J., Ogata, Y., Slepecky, N. Dose-related vestibular and cochlear effects of transtympanic gentamicin. The American journal of otology. 19, 170-179 (1998).
- Lee, K. S., Kimura, R. S. Effect of ototoxic drug administration to the endolymphatic sac. The Annals of otology, rhinology, and laryngology. 100, 355-360 (1991).
- Schmiedt, R. A., Okamura, H. O., Lang, H., Schulte, B. A. Ouabain application to the round window of the gerbil cochlea: a model of auditory neuropathy and apoptosis. Journal of the Association for Research in Otolaryngology : JARO. 3, 223-233 (2002).
- Schmiedt, R. A., Lang, H., Okamura, H. O., Schulte, B. A. Effects of furosemide applied chronically to the round window: a model of metabolic presbyacusis. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 22, 9643-9650 (2002).
- Suzuki, M., Kikuchi, T., Ikeda, K. Endocochlear potential and endolymphatic K+ changes induced by gap junction blockers. Acta oto-laryngologica. 124, 902-906 (2004).
- Chen, Z., Mikulec, A. A., McKenna, M. J., Sewell, W. F., Kujawa, S. G. A method for intracochlear drug delivery in the mouse. Journal of neuroscience methods. 150, 67-73 (2006).
- Husmann, K. R., Morgan, A. S., Girod, D. A., Durham, D. Round window administration of gentamicin: a new method for the study of ototoxicity of cochlear hair cells. Hearing research. 125, 109-119 (1998).
- Heydt, J. L., Cunningham, L. L., Rubel, E. W., Coltrera, M. D. Round window gentamicin application: an inner ear hair cell damage protocol for the mouse. Hearing research. 162, 65-74 (2004).
- Palmgren, B., Jin, Z., Ma, H., Jiao, Y., Olivius, P. beta-Bungarotoxin application to the round window: an in vivo deafferentation model of the inner ear. Hearing research. 265, 70-76 (2010).
- Lang, H., Schulte, B. A., Schmiedt, R. A. Effects of chronic furosemide treatment and age on cell division in the adult gerbil inner ear. Journal of the Association for Research in Otolaryngology : JARO. 4, 164-175 (2003).
- Lang, H., Schulte, B. A., Schmiedt, R. A. Ouabain induces apoptotic cell death in type I spiral ganglion neurons, but not type II neurons. Journal of the Association for Research in Otolaryngology : JARO. 6, 63-74 (2005).
- Lang, H., et al. Transplantation of mouse embryonic stem cells into the cochlea of an auditory-neuropathy animal model: effects of timing after injury. Journal of the Association for Research in Otolaryngology : JARO. 9, 225-240 (2008).
- Stevens, S. M., et al. Heptanol application to the mouse round window: a model for studying cochlear lateral wall regeneration. Otolaryngology--head and neck surgery : official journal of American Academy of Otolaryngology-Head and Neck Surgery. 150, 659-665 (2014).
- Zheng, Q. Y., Johnson, K. R., Erway, L. C. Assessment of hearing in 80 inbred strains of mice by ABR threshold analyses. Hearing research. 130, 94-107 (1999).
- Hequembourg, S., Liberman, M. C. Spiral ligament pathology: a major aspect of age-related cochlear degeneration in C57BL/6 mice. Journal of the Association for Research in Otolaryngology : JARO. 2, 118-129 (2001).
- Ohlemiller, K. K., Gagnon, P. M. Apical-to-basal gradients in age-related cochlear degeneration and their relationship to 'primary' loss of cochlear neurons. The Journal of comparative neurology. 479, 103-116 (2004).
- Tadros, S. F., D'Souza, M., Zhu, X., Frisina, R. D. Apoptosis-related genes change their expression with age and hearing loss in the mouse cochlea. Apoptosis : an international journal on programmed cell death. 13, 1303-1321 (2008).
- Souza, M., Zhu, X., Frisina, R. D. Novel approach to select genes from RMA normalized microarray data using functional hearing tests in aging mice. Journal of neuroscience. 171, 279-287 (2008).
- Tang, X., et al. Age-related hearing loss: GABA, nicotinic acetylcholine and NMDA receptor expression changes in spiral ganglion neurons of the mouse. Neuroscience. 259, 184-193 (2014).
- Borkholder, D. A., Zhu, X., Frisina, R. D. Round window membrane intracochlear drug delivery enhanced by induced advection. Journal of controlled release : official journal of the Controlled Release Society. 174, 171-176 (2014).
- Tadros, S. F., D'Souza, M., Zhu, X., Frisina, R. D. Gene expression changes for antioxidants pathways in the mouse cochlea: relations to age-related hearing deficits. PloS one. 9, e90279(2014).
- Lang, H., et al. Sox2 up-regulation and glial cell proliferation following degeneration of spiral ganglion neurons in the adult mouse inner ear. Journal of the Association for Research in Otolaryngology : JARO. 12, 151-171 (2011).
إعادة الطباعة والأذونات
طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه
طلب إذن