مقالة منهجية

إعداد الميتوكوندريا المخصب الكسور لتحليل التمثيل الغذائي في

8.9K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/53149

⸱

سبتمبر 30, 2015

 , 
1Biology Department, Adelphi University, 2Department of Ecology and Evolutionary Biology, Brown University

في هذه المقالة

ملخص

تلعب الميتوكوندريا أدوارا مركزية في تنظيم التمثيل الغذائي والتوازن. قد يكون من الصعب اكتشاف التغيرات الطفيفة في عملية التمثيل الغذائي للميتوكوندريا التي تؤثر على فسيولوجيا الكائن الحي في دراسات التمثيل الغذائي للكائن الحي بأكمله. نصف هنا طريقة عزل تعزز الكشف عن التحولات الأيضية الدقيقة في ذبابة الفاكهة السوداء.

الملخص

نظرا لأن الميتوكوندريا تلعب أدوارا في استقلاب الأحماض الأمينية واستقلاب الكربوهيدرات وأكسدة الأحماض الدهنية ، فإن العيوب في وظيفة الميتوكوندريا غالبا ما تضر بحياة أولئك الذين يعانون من هذه الأمراض المعقدة. يعد الكشف عن التغيرات الأيضية في الميتوكوندريا أمرا حيويا لفهم اضطرابات الميتوكوندريا واستجابات الميتوكوندريا للعوامل الدوائية. على الرغم من أن التمثيل الغذائي للميتوكوندريا هو جوهر تنظيم التمثيل الغذائي ، إلا أن اكتشاف التغيرات الطفيفة في عملية التمثيل الغذائي للميتوكوندريا قد يعوقه التمثيل المفرط للمستقلبات العصارية الخلوية الأخرى التي تم الحصول عليها باستخدام الكائن الحي الكامل أو استخراج الأنسجة الكاملة.

هنا نصف طريقة عزل اكتشفت التغيرات الأيضية الواضحة للميتوكوندريا في ذبابة الفاكهة التي كانت متميزة بين الذبابة الكاملة والمستحضرات المخصبة بالميتوكوندريا. لتوضيح حساسية هذه الطريقة ، استخدمنا مجموعة من ذبابة الفاكهة التي تؤوي الحمض النووي للميتوكوندريا المتنوعة وراثيا (mtDNA) وعرضناها لعقار الراباميسين. باستخدام هذه الطريقة ، أظهرنا أن الرابامايسين يعدل عملية التمثيل الغذائي للميتوكوندريا بطريقة تعتمد على النمط الجيني للميتوكوندريا. ومع ذلك ، فإن هذه التغييرات أكثر تميزا في دراسات التمثيل الغذائي عندما تم استخراج المستقلبات من الكسور المخصبة بالميتوكوندريا. في المقابل ، اكتشفت مستخلصات الأنسجة الكاملة فقط التغيرات الأيضية بوساطة عقار الرابامايسين بشكل مستقل عن mtDNAs.

المقدمة

الهدف من هذا الإجراء هو تطوير الكسور الميتوكوندريا المخصب التي تحقق ما يكفي من نواتج الأيض الميتوكوندريا لالايض الدراسات باستخدام ذبابة الفاكهة السوداء البطن. في تجربتنا، والايض التحليل باستخدام أساليب الاستخراج الخلوية كلها غير قادرة على اكتشاف التغيرات الطفيفة الأيض الميتوكوندريا في ذبابة الفاكهة. ومع ذلك، تجزئة الميتوكوندريا قبل التحليل الايض يزيد من حساسية لتحديد التحولات الأيض الميتوكوندريا.

الميتوكوندريا هي العضيات الخلوية مسؤولة عن توفير 90٪ من الطاقة التي الخلايا بحاجة لوظيفة عادية 1. في السنوات الأخيرة تم الاعتراف بأن الميتوكوندريا تلعب دورا أكثر نشاطا في وظيفة الخلوية والعضوي من مجرد إنتاج أدينوسين ثلاثي الفوسفات (ATP)، ويتم الاعتراف الآن كمراكز لتنظيم التمثيل الغذائي التوازن 2،3. الميتوكوندريا هي نتيجة لعملية endosymbiotic التي ديساندمجت الأنساب الميكروبية صبغة ~ 1.5 مليار سنة مضت 4. كما الميتوكوندريا تطورت إلى العضيات الحقيقية، وأدرجت الجينات من معايش جواني في الجينوم النووي الناشئة. في الحيوانات اليوم، ما يقرب من 1500 بروتينات الميتوكوندريا هي المشفرة النووية، بينما لا تزال 37 الجينات في الحمض النووي المتقدري، 13 منها ترميز البروتينات الميتوكوندريا التي هي مفارز من المجمعات انزيم الفسفرة التأكسدية 5. هناك حاجة إلى التنسيق بين الميتوكوندريا ومقصورات النووية للحفاظ على وظيفة الميتوكوندريا سليمة.

باستخدام الأساليب المذكورة هنا كنا قادرين على اكتشاف التغيرات الأيضية الميتوكوندريا في ذبابة الفاكهة التي تنتج عن التلاعب في التنسيق بين جينوم الميتوكوندريا والنووية. كنا سلالة من ذبابة الفاكهة التي و mtDNA من الأنواع الشقيقة D. وضعت simulans على D. واحد البطن خلفية النووية 6. هذا mitonuclear 'عطلت'ومقارنة التركيب الوراثي إلى التركيب الوراثي mitonuclear "الأصلي"، أو تطورت المشارك لD. البطن تحمل نفس الجينوم النووي مع D. شعبه الأصيل البطن و mtDNA. وD. البطن وD. simulans mtDNAs تختلف باختلاف ~ 100 الأحماض الأمينية و> 500 بدائل مرادفة التي تؤثر mitonuclear 7،8 الاتصالات. ولدت لنا مقتطفات ذبابة كاملة ومقتطفات المخصب الميتوكوندريا لدراسة التحولات الأيض ردا على الإجهاد الدوائي. نحن هنا تظهر أنه عند استخدام الميتوكوندريا المخصب الكسور نكتشف التحولات وضوحا في الأيض الميتوكوندريا بين الأصلي،-تطورت شارك الوراثي تحمل D. mtDNAs البطن وراثى تعطلت تحمل D. simulans و mtDNA. في المقابل، فإن التغييرات الأيض بين هذه الأنماط الجينية هما خفية باستخدام أساليب العادية التي تستخدم كله استخراج الطاير. ولذلك، قدمت هذه الطريقة مسار لفهم كيفية mtDNAs توسط التغييرات في الميتوكوندريااستجابة إلى أدوية مختلفة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1. الكواشف وحلول

  1. إعداد الطعام ذبابة وسائل الإعلام
    1. حرارة المكونات الذبابة 11٪ سكر، 2٪ الخميرة autolyzed، 5.2٪ دقيق الذرة، أجار 0.79٪ ث / ت في الماء في موقد وضعت في 90 ° C. اثارة بانتظام حتى يتم الحصول على خليط متجانس كثيف قليلا. إعداد الحجم النهائي من 550 مل من ذبابة الغذائية لما مجموعه 100 قارورة مع 5 مل يطير الطعام في كل منهما.
    2. إزالة من مصدر التدفئة، وإثارة أحيانا حتى الطعام يبرد إلى 80 درجة مئوية وإضافة 0.2٪ tegosept ميثيل 4-hydroxybenzoate الذائبة في الايثانول 95٪.
    3. تقسيم الطعام في مجلدين على قدم المساواة. إضافة 1.1 مل من 50 ملي rapamycin يذوب في الإيثانول إلى مجلد واحد و 1.1 مل من الايثانول لحجم الآخر. تحريك rapamycin والحلول الإيثانول إلى الطعام. مما لا شك فيه أن درجة الحرارة تنخفض إلى 50 درجة مئوية قبل إضافة المخدرات.
  2. العزلة العازلة
    1. إعداد 500 مل من العزلة العازلة [225 ملي المانيتول، 75 ملي السكروز، 10 مم 3- (N </ م> -morpholino) حمض propanesulfonic (اجتماعات الأطراف) و1 ملم ثنائي أمين الإيثيلين رباعي حمض الخل (EDTA)، و 2.5 ملغ / مل ألبومين المصل البقري (BSA)] في الماء.
    2. ضبط درجة الحموضة إلى 7.2 باستخدام هيدروكسيد الصوديوم. إن الأس الهيدروجيني الأولية يكون الحمضية.
    3. استخدام معقم زجاجات تخزين التصفية مع حجم المسام 0.22 ميكرون لتعقيم الحل وتخزينها في 4 درجات مئوية.
  3. غسل العازلة
    1. إعداد 500 مل من غسل العازلة [225 ملي المانيتول، 75 ملي السكروز، 10 ملي بوكل، 10 ملي تريس حمض الهيدروكلوريك و 5 ملي KH 2 PO 4] في الماء.
    2. ضبط درجة الحموضة إلى 7.2 باستخدام هيدروكسيد الصوديوم. إن الأس الهيدروجيني الأولية يكون الحمضية.
    3. استخدام معقم زجاجات تخزين التصفية مع حجم المسام 0.22 ميكرون لتعقيم الحل وتخزينها في 4 درجات مئوية.

2. تربية من سلالات ذبابة الفاكهة

  1. للسيطرة على كثافة اليرقات خلال التنمية، وضع 25 زوجا من الآباء والأمهات في لزجاجة الثقافة والسماح لهم لوضع البيض لمدة 48 ساعة.
    2. <لى> إزالة أولياء الأمور بعد 48 ساعة لتنظيم كثافة البيض.
  2. كرر الخطوات من 2.1 و 2.2 باستخدام ذرية F1 الناشئة، حتى يتم تحقيق جيلين من هذه السيطرة الكثافة.
  3. لجمع الكبار، تخدير الذباب باستخدام ثاني أكسيد الكربون (CO 2) ومنفصلة حسب الجنس.
    1. استخدام مرحلة منظم واحد لتسليم CO النقي 2 من خزان ضغوط عالية في تدفق مستمر من 5 رطل. لتجنب الكهرباء الساكنة، واستخدام أنابيب بلاستيكية لتحفيز CO 2 إلى 500 مل تصفية قارورة بالماء.
    2. استخدام سدادة مطاطية مع فتحة واحدة لاغلاق القارورة. استخدام أنابيب بلاستيكية لتوصيل الفتحة الجانبية للقارورة لوحة CO 2.
    3. وضع الذباب في لوحة لمدة لا تتجاوز 10-15 دقيقة. السماح للتعافي من التخدير لمدة 24 ساعة قبل وضعها في ظروف تجريبية.
  4. لتوليد ما يكفي من نواتج الأيض لكسور المخصب الميتوكوندريا، استخدم 300 الذباب في العينة. هنا، استخدام الإناث، ولكن gendeص قد تختلف في تجارب أخرى. نقل 150 الذباب إلى محلية الصنع 1 L الديموغرافيا القفص. السماح بالوصول إلى 5 مل من ذبابة الطعام في قارورة.
  5. نقل 150 الذباب المتبقية إلى 1 L قفص آخر. لا overpopulate أقفاص مع أكثر من 150 الذباب.
  6. استخدام ست عينات تكرار في حالة تجريبية. منذ مقتطفات الحيوانية كلها تسفر عن مزيد من نواتج الأيض، لتوليد العزلات 1 عينة من الحيوان كله، ونقل 50 أنثى الذباب في قفص واحد. أما بالنسبة للعزلة الميتوكوندريا، استخدم ست عينات تكرار في حالة تجريبية.
  7. مكان أقفاص عند 25 درجة مئوية مع دورة 12 ساعة ضوء و 12 ساعة الظلام.
  8. توفير المواد الغذائية الطازجة كل 2 أو 3 أيام في قارورة مع 5 مل من المواد الغذائية للمحافظة على جودة الطعام.
  9. الحفاظ على الذباب على الطعام لمدة 10 يوما. هناك حاجة إلى هذه الخطوة لعلاج rapamycin 7. والعلاج أو غيره من الظروف تختلف.

3. عزل الميتوكوندريا الكسور

  1. تفريغ الذباب من قفص واحد (150 الذباب) إلىالزجاج تفلون dounce الخالط مليئة 1 مل من العازلة عزل المبردة.
  2. التجانس من خلال نقل ما يصل مدقة وهبوطا لمدة 15 السكتات الدماغية. إبقاء هاون على الجليد للحفاظ على الميتوكوندريا سليمة.
  3. نقل جناسة لأنبوب 1.5 مل وأجهزة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية.
  4. اتخاذ طاف والطرد المركزي في 6000 x ج لمدة 10 دقيقة على 4 درجات مئوية إلى إثراء للالميتوكوندريا.
  5. كما يحتوي على طاف الكسر عصاري خلوي، تجاهل طاف أو استخدامه لاجراء تجارب بديلة. Resuspend وبيليه في 300 ميكرولتر من غسل العازلة.
  6. كرر الخطوات من 3،1-3،5 لالقفص الثاني. الجمع بين الكريات معلق على حد سواء أقفاص في أنبوب microcentrifuge المبردة.
  7. الطرد المركزي في 6000 x ج لمدة 10 دقيقة على 4 درجات مئوية.
  8. تجاهل طاف وفلاش تجميد بيليه في النيتروجين السائل.
  9. تخزين الكسور المخصب الميتوكوندريا في -80 ° C أو انخفاض درجة الحرارة.
    1. بدلا من ذلك، لمرحلة ما قبل الحيوان كلهparation، ضع البالغين في أنبوب microcentrifuge المبردة. فلاش تجميد القارورة في النيتروجين السائل ومخزن البالغين في -80 ° C أو انخفاض درجة الحرارة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

عن طريق شرح بروتوكول أعلاه، أجرينا تحليل metabolomic على الكسور المخصب الميتوكوندريا ومقتطفات الحيوانية كلها لاختبار تأثير المخدرات rapamycin على mtDNAs المتباينة 7. لقد نجينا 200 ميكرومتر من rapamycin عن طريق إذابة الدواء في الغذاء الطاير. تعرضت الذباب إلى rapamycin لمدة 10 يوما. وقد تم الحصول على نواتج من مقتطفات ذبابة كاملة ومقتطفات من الميتوكوندريا باستخدام اللوني للغاز مطياف الكتلة (GC / MS) والسائل اللوني، جنبا إلى جنب قياس ال...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

الخطوات الأكثر أهمية في هذا البروتوكول هي: 1) تربية كافية الذباب في الفضاء وفيرة. من المهم جدا أن لا overpopulate الأقفاص الديموغرافيا مع أكثر من 150 الذباب لكل منهما؛ 2) تغيير الغذائي للأقفاص في كثير من الأحيان لتجنب المنافسة المواد الغذائية والنقص الغذائي. و3) الحفاظ على جميع العينات عند 4 درجة مئوية لضمان سلامة خلال عزل جزء الميتوكوندريا. ويوصى أيضا أن يبرد عازلة العزلة، وغسل العازلة، والزجاج تفلون dounce الخالط قبل الاستخدام. للحد من التلوث عصاري خلوي من الفصائل الميتوكوندريا ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

شكر وتقدير

تم دعم هذا العمل من خلال منحة تطوير أعضاء هيئة التدريس بجامعة Adelphi ومنحة R15GM113156 من NIGMS الممنوحة إلى EVC ، ومنح R01GM067862 من NIGMS ومنح R01AG027849 من NIA الممنوحة إلى DMR.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
0.2٪ تيجوسيبت-ميثيل 4-هيدروكسي بنزواتVWRAAA14289
الإيثانولسيجما ألدريتش792799
مانيتولسيجما ألدريتشM4125
السكروزسيجما ألدريتشS9378
3- (N< / em>-morpholino) حمض البروبان سلفونيك (MOPS)سيجما ألدريتشM1254 & nbsp ؛
حمض الإيثيلين ديامين تترا أسيتيك (EDTA)سيجما ألدريتش38057   ؛
ألبومين مصل الأبقار (BSA)سيجما ألدريتش5470
KClسيجما ألدريتشP9333
تريس هيدروكلوريكسيل سيجما ألدريتشRES3098T-B7
KH2< / sub>PO4< / sub>Sigma-Aldrich1551139
CO2< / sub> منصات لتخدير الذبابTritech ResearchMINJ-DROS-FP
1 لتر قفصمتجر مطعم ويب999RD32
1 لتر غطاء قفصمطعمويب 999LRD
الخالط الزجاجي التفلون  NC9661231العلمي
هيدروكسيد الصوديومسيجما-ألدريتشS8045
رابامايسين  مختبرات LC R-5000
المضاد للبورينMitoSciencesMSA03
مضاد لألفا توبولينالدراسات التنموية بنك الورم الهجين12G10
بيرس BCA فحص البروتين كيت  ثرمو علمية 23225
CO2< / sub> padTritech Research، Incقارورة مرشح MINJ-DROS-FP
ENASCOSB08184M
سدادة مطاطيةEnascoS08512M
متجر فيشر

المراجع

  1. Scheffler, I. E. Mitochondria (Scheffler, Mitochondria). , Wiley-Liss. 484(2007).
  2. Guarente, L. Mitochondria--a nexus for aging, calorie restriction, and sirtuins. Cell. 132 (2), 171-176 (2008).
  3. Raimundo, N. Mitochondrial pathology: stress signals from the energy factory. Trends in molecular medicine. 20 (5), 282-292 (2014).
  4. Embley, T. M., Martin, W. Eukaryotic evolution, changes and challenges. Nature. 440 (7084), 623-630 (2006).
  5. Lane, N., , Power, Sex, Suicide: Mitochondria and the Meaning of Life. 368, Oxford University Press. USA. (2006).
  6. Montooth, K. L., Meiklejohn, C. D., Abt, D. N., Rand, D. M. Mitochondrial-nuclear epistasis affects fitness within species but does not contribute to fixed incompatibilities between species of Drosophila. Evolution; international journal of organic evolution. 64 (12), 3364-3379 (2010).
  7. Villa-Cuesta, E., Holmbeck, M. A., Rand, D. M. Rapamycin increases mitochondrial efficiency by mtDNA-dependent reprogramming of mitochondrial metabolism in Drosophila. Journal of cell science. 127 (Pt 10), 2282-2290 (2014).
  8. Zhu, C. -T., Ingelmo, P., Rand, D. M. G×G×E for Lifespan in Drosophila: Mitochondrial, Nuclear, and Dietary Interactions that Modify Longevity. PLoS genetics. 10 (5), e1004354(2014).
  9. Madala, N. E., Piater, L. A., Steenkamp, P. A., Dubery, I. A. Multivariate statistical models of metabolomic data reveals different metabolite distribution patterns in isonitrosoacetophenone-elicited Nicotiana tabacum and Sorghum bicolor cells. SpringerPlus. 3, 254(2014).
  10. Hogeboom, G. H., Schneider, W. C., Pallade, G. E. Cytochemical Studies Of Mammalian Tissues I . Isolation Of Intact Mitochondria From Rat Liver Some Biochemical Properties Of Mitochondria And Submicroscopic Particulate Material. Journal of Biological Chemistry. 172, 619-635 (1948).
  11. Frezza, C., Cipolat, S., Scorrano, L. Organelle isolation: functional mitochondria from mouse liver, muscle and cultured fibroblasts. Nature protocols. 2 (2), 287-295 (2007).
  12. Corcelli, A., Saponetti, M. S., et al. Mitochondria isolated in nearly isotonic KCl buffer: focus on cardiolipin and organelle morphology. Biochimica et biophysica acta. 1798 (3), 681-687 (2010).
  13. Roede, J. R., Park, Y., Li, S., Strobel, F. H., Jones, D. P. Detailed mitochondrial phenotyping by high resolution metabolomics. PloS one. 7 (3), e33020(2012).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة