Method Article

تحديد أزواج كيناز الركيزة عن طريق فحص إنتاجية عالية

DOI:

10.3791/53152

⸱

August 29th, 2015

 , 
1Children's Hospital of Eastern Ontario Research Institute, 2Sunnybrook Research Institute, University of Toronto, 3Department of Biochemistry, University of Toronto

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

فسفرة البروتين هي سمة مركزية لكيفية تفسير الخلايا للمعلومات والاستجابة لها في بيئتها خارج الخلية. هنا ، نقدم بروتوكول فحص عالي الإنتاجية باستخدام الكينازات المنقاة من خلايا الثدييات لتحديد الكينازات التي تعمل على الفسفرة في ركيزة (ركيزة) ذات أهمية.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

قمنا بتطوير منصة الفحص لتحديد مخصصة تحركات البروتينات البشرية للركائز فسفرته والتي يمكن استخدامها لتوضيح رواية مسارات نقل الإشارة. نهجنا ميزات استخدام مكتبة تنقية الموسومة GST تحركات البروتينات البشرية وركيزة البروتين المؤتلف من الاهتمام. وقد استخدمنا هذه التكنولوجيا لتحديد MAP / أنيبيب التنظيم تقارب كيناز 2 (MARK2) كما كيناز لموقع التنظيم الجلوكوز على الخاضعة للرقابة CREB الترانسكربتي Coactivator 2 (CRTC2)، وهو بروتين اللازم لتكاثر الخلايا بيتا، وكذلك الأسرة AXL التيروزين كيناز كما المنظمين من ورم خبيث الخلية عن طريق الفسفرة من البروتين محول ELMO. وصفنا هذه التكنولوجيا ومناقشة كيف يمكن أن يساعد على وضع خريطة شاملة لكيفية استجابة الخلايا للمؤثرات البيئية.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

البروتين التعديلات بعد متعدية (PTMs) ضرورية للتواصل بين الخلايا. ولعل أفضل درس لجميع PTMs هو الفسفرة، يحفزه تحركات البروتينات، التي تنظم عدد لا يحصى من وظائف البروتين، بما في ذلك نشاطهم الكيمياء الحيوية، وتوطين التحت خلوية، التشكل، والاستقرار. تحديد المواقع الفسفرة على البروتينات الهدف يمكن تحقيقه عن طريق التعيين phosphopeptide زيتية أو عن طريق تقنيات البروتين الآن القياسية باستخدام عينات المخصب لالببتيدات فسفرته 1،2. في حين من المتوقع أن يتم فسفرته 3 ثلاثة أرباع بروتيوم أعرب وحددت 200،000 مواقع الفسفرة 5، مع تقديرات تصل إلى 1000000 6، وك....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. إعداد الكواشف، لوحات، والخلايا

  1. جعل 500 مل العازلة تحلل: 25 ملي تريس درجة الحموضة 7.5، 150 مم كلوريد الصوديوم، و 50 ملي ناف، 0.5 ملي EDTA الرقم الهيدروجيني 8.0، 0.5٪ TritonX-100، 5 ملي بيتا سكرولي، 5٪ الجلسرين. تخزينها في 4 ° C. مباشرة قبل الاستخدام، إضافة 1 ملي dithiothreitol (DTT)، 1 ملم phenylmethyl السلفونيل الفلورايد (PMSF)، و 1 ملي فانادات الصوديوم. بعد هذه الخطوة، غير مطلوب PMSF في أي العازلة الشطف.
  2. جعل 20 مل من 10X كيناز العازلة: 200 ملي تريس درجة الحموضة 7.5، 50 ملي بيتا سكرولي ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وتظهر نتائج ممثلة من شاشة في الشكل 2. تم فحص 180 تحركات باستخدام الببتيد الركيزة GST الموسومة الموافق أأ 268-283 من CRTC2 وكذلك البروتين الأساسي الكلاسيكي كيناز فحص الركيزة المايلين (ب ب). اثنين فقط من تحركات، MARK2 وMARK3 كيناز ذات الصلة للغاية مفسفر الببتيد CRTC2. يتم تضمين MBP باعتبارها الرقابة الداخلية في جميع المقايسات، كما أنه يحتوي على العديد من بقايا phosphorylatable ويمتد على 18 كيلو دالتون، نحو الجزء السفلي من هلام. هذا يسمح لتفسير خصوصية: فإن بعض كيناز .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

منذ المنشورات الأصلية واصفا نهج 14،15، تم توسيع المكتبة الأصلي من 180 GST-تحركات إلى 420 عضوا، أو ~ 80٪ من kinome البروتين البشري. مع مكتبة الموسعة، البروتوكول كما هو موضح يستغرق 4-5 أيام ثم 1-4 أيام لتطوير الأفلام (بحسب ما تقتضيه الضرورة)، والتي يمكن اختصارها عن طريق استخدام phosphorimaging وتعزيز الإشارات الرقمية. هناك العديد من الخطوات الرئيسية التي يجب توخي الحذر (انظر الشكل 1 لمحة عامة عن بروتوكول). أولا، هو صحة المخزون من الخلايا .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وأيد هذا العمل عن طريق منح NSERC 386634. ونود أن نشكر أعضاء مختبر Screaton لإجراء مناقشات مفيدة.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
المخزن المؤقت للتحللصنع في المنزلانظر البروتوكول الخطوة 1.1
10x المخزن المؤقت كينازصنع في المنزلانظر خطوة البروتوكول 1.2
10x M-ATPصنع في المنزلانظر خطوة البروتوكول 1.3
بلازميدات كيناز الإنسانOrfeome ، Invitrogen ، OrigeneGST الموسومة في المنزل
96 لوحة بئرFisher ScientificCS003595
293T الخلاياATCCCRL-11268
DMEMفيشر SH3002201 العلميةمع 100   ؛ U / مل البنسلين ، 100   ؛ μ جم / مل من الستربتومايسين ، مصل ربلة الساق الجنينية 10٪.
حاضنة CO2< / sub>SanyoMCO-17AIC
أطباق زراعة الخلايا 15 سمفيشر ساينتفيك877224
متوسط مصل مخفضInvitrogen22600-050
كاشف التعداء القائم على الدهونInvitrogen11668-019
موزع السوائل الآليThermo Scientific5840300
مرفق كاسيت صغيرThermo Scientific24073295
مرفق كاسيت قياسيThermo Scientific14072670
4 mM pervanadateصنع في المنزلانظر خطوة البروتوكول 3.1
0.25 M CaCl2ماصة متعددة القنوات مصنوعة في المنزل
(20-200 &# 956; ل)Labnetp4812-200
ماصة متعددة القنوات (1-10 &# 956 ؛ ل)Thermo Scientific4661040
V-bottom 6-well ألواحEvergreen Scientific290-8116-01V
الجلوتاثيون المطلية بألواح 96 بئرفيشر ScientificPI-15240
فرن تهجين Biostad350355
GST موسومة الركيزةصنع في المنزل
بروتين المايلين الأساسي (MBP)ماصة مكرر سيجماM1891
(1 مل)Eppendorf22266209
32P gamma-ATPPerkin ElmerBLU502Z500UC
2x SDS Lysis Buffer (100 & nbsp; مل)صنع في المنزلانظر خطوة البروتوكول 1.4
26 بئر المواد الهلامية TGX مسبقة الصبBioRad567-1045النسبة المئوية للهلام المطلوبة تعتمد على الوزن الجزيئي للركيزة ذات الأهمية
Coomassieصنع في المنزل0.1٪ Coomassie R250 ، 10٪ حمض الأسيتيك ، 40٪ ميثانول
Coomassie destainصنع في المنزل10٪ حمض الأسيتيك ، 20٪ ميثانول
حاويات هلام مصنفةمصنوعة في المنزلأغطية بلاستيكية مستعملة من صناديق ذات أطراف فارغة ، كبيرة بما يكفي لاحتواء ورق ترشيح واحد هلام
واتمانصفائح السيلوفان فيشر Scientific57144
(2)BioRad165-0963
جل مجففLabconco4330150
فيلم التصوير الشعاعي الذاتي المستحلب المزدوجVWRIB1651454
كاسيت فيلمفيشر ScientificFBAC-1417
مكثفةفيشر ScientificFBIS-1417
لوحة ختم الأسطوانة المطاطيةSigmaR1275
صبغة شاشة

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Meisenhelder, J., Hunter, T., van der Geer, P. Phosphopeptide mapping and identification of phosphorylation sites. Curr Protoc Mol Biol. 18, Unit 18 19(2001).
  2. Doll, S., Burlingame, A. L. Mass spectrometry-based detection and assignment of protein posttrans....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Kinase Substrate IdentificationHigh Throughput ScreeningGST Kinase PulldownProtein Kinase LibrarySubstrate Phosphorylation AnalysisGel ElectrophoresisAutoradiography DetectionKinase Specificity ValidationSignal Transduction MappingCell Based Validation

Related Articles