مقالة منهجية

الإنتاجية العالية فحص الاختلافات الإستعصاء في Lignocellulosic الكتلة الحيوية: إجمالي اللجنين، اللجنين مونمرات، والأنزيمية السكر الإصدار

9.7K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/53163

⸱

سبتمبر 15, 2015

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1BioEnergy Science Center, National Renewable Energy Laboratory

في هذه المقالة

ملخص

يتم تقييم هيكل جدار الخلية النباتية وسمات الكيمياء لتحديد المواد الأولية المثالية للوقود الحيوي والمواد الحيوية. الطرق القياسية لها قيود عند تطبيقها على مجموعات البيانات الكبيرة. تقارن طرق المعالجة المسبقة عالية الإنتاجية ، وتكسير الإنزيم ، وقياس الطيف الكتلي للحزمة الجزيئية للانحلال الحراري أعدادا كبيرة من عينات الكتلة الحيوية مع انخفاض الوقت والتكلفة التجريبية.

الملخص

تم استكشاف تحويل الكتلة الحيوية اللجنوسليلوزية إلى وقود ومواد كيميائية وسلع أخرى كأحد المسارات الممكنة نحو التخفيضات في استخدام مصادر الطاقة غير المتجددة. من أجل تحديد النباتات ، من بين مجموعة متنوعة ، لديها السمات الكيميائية المرغوبة للتطبيقات النهائية ، يجب مقارنة السمات ، مثل محتوى السليلوز واللجنين ، أو إطلاق السكر الأحادي بعد التكسير الأنزيمي. يمكن أن تستغرق بروتوكولات تحليل البيانات التجريبية لطرق التحليل القياسية وقتا طويلا ، وبالتالي تحد من عدد العينات التي يمكن قياسها. تخفف طرق الإنتاجية العالية (HTP) من أوجه القصور في الطرق القياسية ، وتسمح بالفحص السريع للعينات المتاحة لعزل أولئك الذين يمتلكون السمات المرغوبة. توضح هذه الدراسة إطلاق سكر HTP وخطوط أنابيب قياس الطيف الكتلي للحزمة الحرارية والحزمة الجزيئية المستخدمة في المختبر الوطني للطاقة المتجددة. مكنت خطوط الأنابيب هذه من التقييم الفعال لآلاف المصانع مع تقليل الوقت والتكاليف التجريبية من خلال تخفيضات العمالة والمواد الاستهلاكية.

المقدمة

كما المعروض العالمي من الوقود غير المتجددة والتي تراجع المنتجات المرتبطة بها، وقد تحدى العلماء لخلق الوقود مماثلة والمواد الكيميائية من مصادر المشتقة من النباتات 1. أحد الجوانب الرئيسية لهذا العمل هي تحديد أي نوع من النباتات قد تكون مناسبة لإنتاج الوقود الحيوي والمواد الحيوية 2،3. عادة، يتم تقييم هذه المواد الأولية لاللجنين، السليلوز، والمحتوى هيميسيلولوز. فضلا عن قابليتها للالتفكيكية (عناد) من خلال المعالجة الحرارية والميكانيكية، و / أو كيميائية مع أو بدون لاحقة انزيم التسكير. تستخدم تحليلات أكثر تفصيلا لتحديد التشكيل المحدد لاللجنين وهيميسيلولوز الكسور وكذلك الأنشطة الإنزيمية المثلى اللازمة. وقد وفرت التعديلات المعدلة وراثيا من النباتات التي لا تملك في جوهرها الصفات المثالية لتحويل الكيمياء الحيوية أو حراري للسلع المطلوبة للباحثين مصدر توسعت بشكل كبير من وعاءالمواد الأولية ential 4. الطرق التحليلية القياسية لقياس الصفات الكيميائية للنبات، وإن كان مفيدا جدا لمجموعات عينة صغيرة، وغير مناسبة للفحص السريع لمئات أو آلاف من عينات 5-7. وقد تم تطوير أساليب بالمشاركه الموصوفة هنا بسرعة وكفاءة لتقييم أعداد كبيرة من المتغيرات الكتلة الحيوية للتغيرات في جدار الخلية عناد إلى تدهور حراري و / أو الأنزيمية.

فمن الأهمية بمكان أن نفهم أن فحوصات الكشف بالمشاركه ووصفت الوثيقة لم يتم تصميمها لتحقيق أقصى قدر من التحويل أو العائد. والهدف من ذلك هو تحديد الاختلافات النسبية في عناد لا يتجزأ من عينات الكتلة الحيوية ذات الصلة. ونتيجة لذلك، فإن العديد من الخطوات التحليل تختلف عن "نموذجية" المقايسات تحويل الكتلة الحيوية، حيث كان الهدف هو الحصول على الحد الأقصى لمعدل التحويل أو حد. على سبيل المثال، يتم استخدام أقل الشدة المعالجة وأقصر الأوقات إنزيم التحلل المائي لتعظيم تختلفبسبب الخلافات بين العينات. في معظم الحالات، يتم استخدام شحنات انزيم عالية نسبيا للحد من الخلافات نظرا لاختلاف التجريبي في نشاط انزيم، والتي يمكن أن تؤثر على النتائج بشكل ملحوظ.

تقنيات سريعة لتحديد تكوين خلايا النبات الجدران والسكريات أحادى المحررة يلي التسكير الأنزيمية تشمل الروبوتات، حسب الطلب، متوافقة thermochemically لوحات 96-جيدا، وإدخال تعديلات على أساليب المختبر القياسية 8-11 والبروتوكولات مفيدة، مثل التحليل الطيفي الذبذبات (الأشعة تحت الحمراء (IR)، القريب من الأشعة تحت الحمراء (الجرد)، أو رامان) والرنين المغناطيسي النووي (NMR) 12-17. هذه المنهجيات هي المفتاح لعزل المواد الأولية مع السليلوز عالية أو محتويات اللجنين منخفضة، أو تلك المتوقع أن يحقق أعلى الجلوكوز، الفركتوز، والإيثانول، الخ وقد مكنت هذه الأساليب التحليلات يضيق نطاق التي تستخدم كميات أقل من الكتلة الحيوية والمواد الاستهلاكية، مما يؤدي إلى تخفيضات في التجريبية حساب 18 . ميزة أخرى لهذا النهج المنهجي هي أن ظروف تجريبية مختلفة يمكن أن يكون سريعا، وفي بعض الحالات في وقت واحد، تقييمها. على سبيل المثال، مجموعة متنوعة من مختلف استراتيجيات المعالجة أو الكوكتيلات الانزيم يمكن اختبار، والسماح للمعلمات التجريبية المثلى لتحديدها بسرعة وموظفات. المواد الأولية شعبية، مثل حطب الذرة 9، الحور 8،10، تفل قصب السكر 8، والتبن 8 تم تقييم بنجاح باستخدام هذه الأساليب بالمشاركه.

مجموع اللجنين وتكوين أحادى اللجنين كما كميا عادة الصفات الكتلة الحيوية. وقد ثبت تخفيضات في محتوى اللجنين لزيادة هضم الأنزيمية من السكريات 19،20. الدور الذي لنسبة أحادى اللجنين (في كثير من الأحيان كما ذكرت syringyl / guaiacyl (S / G) المحتوى) يلعب في تفكيك جدار الخلية النباتية لا يزال قيد التحقيق. وقد أشارت بعض التقارير أن التخفيضات في S / Gأدت نسبة لزيادة الغلة الجلوكوز بعد التحلل 21، في حين أن دراسات أخرى كشف الاتجاه المعاكس 19،22. أساليب إنتاجية عالية لتقييم اللجنين وأحادية لها تشمل التحليل الطيفي الذبذبات (IR نير، ورامان 23-26) إلى جانب التحليل متعدد المتغيرات، والانحلال الحراري شعاع الجزيئي الطيفي (pyMBMS) 27،28.

عند وضع أساليب بالمشاركه لفحص الكتلة الحيوية، وتحتاج عدة اعتبارات أساسية ينبغي أن يوضع في الاعتبار. واحد الجوانب الرئيسية هو تعقيد الأسلوب. ما هو مستوى المهارة المطلوب للتقنية؟ تحليلات Chemometric، على سبيل المثال، تتطلب مهارات محددة للبناء، وتقييم، والحفاظ على النماذج التنبؤية. الطرق المعيارية يحمل غير مرغوب فيها خطوات تحليل تحضيرية أو البيانات أو توظف الكواشف السامة. تطوير نماذج عملية مستمرة حيث يتم إدخال بيانات جديدة في النموذج مع مرور الوقت لزيادة متانة النموذج. consid أخرىeration هو وفورات في التكاليف وانخفاض الأوقات تحليل التجريبية من الأساليب الإنتاجية العالية المقترحة. إذا كان الأسلوب هو سريع جدا، ولكن مكلفة جدا، قد لا تكون تقنية مجدية للعديد من المختبرات لاعتماده. الأساليب هو موضح في هذه المخطوطة هي أنواع من تقنيات موحدة أو تعديل لتضخيم القدرات الإنتاجية. هذه البروتوكولات قياس كميا الصفات الكتلة الحيوية التي تهم دون يستلزم تطوير نماذج تنبؤية. هذا هو السمة الرئيسية لهذه التقنيات، منذ أساليب التنبؤ، في حين أنه يظهر الارتباطات القوية مع معيار التحليلات المستخدمة في تطوير النماذج، ليست دقيقة مثل قياس فعلا كمية من الفائدة للعينات. في حين أن الطرق المستخدمة يتم تحجيم أساسا بانخفاض إصدارات الأساليب التحليلية مقاعد البدلاء النطاق القياسية، يتم تداول الدقة والإحكام للسرعة والإنتاجية. في الغالب، هي نتيجة لأخطاء العليا في pipetting لحجم صغير ووزن هذه النتيجة؛ فضلا عن زيادة الصورةوانخفض التجانس وافرة مثل حجم العينة. بينما مجموعات عينة كبيرة يمكن فحص ومقارنة، يجب توخي الحذر الشديد عند إجراء مقارنات بين حملات منفصلة ونتائج مقاعد البدلاء النطاق.

وتشمل معظم الخطوات تستغرق وقتا طويلا التلاعب المادي من الكتلة الحيوية. عينات طحن قد يستغرق عدة دقائق لكل عينة، بما في ذلك تنظيف مطحنة بين العينات. تحميل يدويا والتفريغ، والنطاط تنظيف وتعبئة وتفريغ أكياس الشاي وأكياس عينة هي أيضا عمل مكثفة جدا. في حين أن كل خطوة قد يستغرق دقيقة واحدة أو أكثر، والآلاف فعل عينات قد يستغرق عدة ساعات أو حتى أيام. يمكن الروبوتات تحميل لوحة مفاعل نموذجية مع الكتلة الحيوية في حوالي 3-4 ساعة أو 6-8 لوحات اليوم -1 الروبوت -1. هذا الوضع يعتمد على معايير الدقة المستخدمة وكذلك نوع وكمية الكتلة الحيوية لفحصها. ملء وحات مفاعل بالماء، وتمييع حامض، أو يتم الإنزيم بسرعة باستخدام الروبوت معالجة السائل. Pإعادة معالجة من كومة وحة (1-20 وحات مفاعل) ما يستغرق ما بين 1 و 3 ساعة عندما التجمع، ويبرد، وتضمنت التفكيك. التحلل انزيم تستغرق 3 أيام ويتطلب تحليل السكر حوالي 1 ساعة من الوقت الإعدادية بالإضافة إلى 10 دقيقة لكل لوحة مفاعل لاستكمال فحص وقراءة النتائج. جدول الأسبوعي لمجموعة المعالجة والتحليل أيام يستوعب جدول أعمال معقول، والتقليل من الفردية ساعة وعطلة نهاية الأسبوع الجهود لعنصر البشري في الفحص ويسمح للتجهيز ~ 800 إلى 1000 عينة في الأسبوع على أساس مستمر. الحد الأقصى للسرعة تعتمد على عدة عوامل، أهمها كيف هم الكثير من الأجهزة (الروبوتات، المفاعلات لوحات، الخ)، وكيف الكثير من "البرمجيات" (أي الموظفين) المتاحة للقيام بهذا العمل اليدوي. الحد الأعلى العملي هو 2500 إلى 3000 عينات / أسبوع؛ مع ذلك، أن الناتج يتطلب عملية 7 أيام في الأسبوع والطلاب المتدربين متعددة والفنيين. وبالمقارنة، فإن 3000 العينات بواسطة HPLC تتطلب ما يقرب من 125 يوما من سامتحليل التنوير القائل بالإضافة إلى العمل الإضافي وزنها يدويا العينات في المفاعلات وعينات الترشيح قبل التحليل.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1. عالية الإنتاجية تحديد الجلوكوز وإكسيلوسي العائد فيما يلي الأنزيمية التسكير 9،29

  1. إعداد نموذج (طحن، دي اتنشى، استخراج، المعالجة)
    1. طحن لا يقل عن 300 ملغ من كل عينة الكتلة الحيوية باستخدام طاحونة وايلي، بحيث جزيئات تمر عبر شبكة 20 (850 ميكرون) الشاشة. نقل لمكافحة ساكنة الرمز البريدي أعلى أكياس (عادة شريط ترميز) والمعلومات عينة التسجيلة الى قاعدة بيانات الباركود.
    2. إضافة حوالي 250 ملغ أو أكثر من الكتلة الحيوية الأرض من مكافحة ساكنة كيس لمرقمة (مع قلم رصاص، لا تستخدم الحبر أو علامة) كيس شاي، بعناية نشمر عن أكياس الشاي، ويجري التأكد من اضعاف ينتهي على الكتلة الحيوية لمنع خسارة خلال دي اتنشى والاستخراج.
    3. التفاف تيباج مغلقة باستخدام المغلفة القصدير الأسلاك النحاسية. تسجيل عدد تيباج لكل عينة barcoded.
    4. إعداد التنشية اجتثاث حل الانزيم من الإنزيمات التجارية (عادة، 0.25٪ (ت / ت) غلوكوأميلاز (~ 1600 جامعة الخليج العربي / L) و1.5٪ (ت / ت) ألفا الأميليز (~ 2900 KNU-S / L) في 0.1 M خلات الصوديوم (الرقم الهيدروجيني 5.0)). إعداد 16 مل غرام من الكتلة الحيوية الأكبر في أو 500 مل لكل 120 عينة تيباج. ملاحظة: عمليات تحميل قادرة على إزالة النشا من الكتلة الحيوية الأرض ينبغي أن تحدد تجريبيا عن طريق اختبار النشا بعد الهضم مع مجموعة من شحنات انزيم والنسب.
    5. في وعاء من البلاستيك، إضافة 16 مل من حل التنشية دي الانزيم لكل 1 غرام من الكتلة الحيوية الأرض السائبة. لدفعة بروتوكول دي اتنشى، إضافة 120 أكياس إلى 500 مل من محلول العازلة الانزيم.
    6. احتضان في شاكر في 55 درجة مئوية لمدة 24 (± 4) ساعة، في 120 دورة في الدقيقة لإزالة من الممكن النشا.
    7. بعد حضانة لمدة التنشية دي، وشطف وينقع الكتلة الحيوية في عدة لترات من الماء منزوع الأيونات لمدة 30 دقيقة. كرر هذه العملية مرتين إضافية لإزالة الأملاح العازلة التي يمكن أن تسبب الاهتزاز (تشكيل فقاعات الغاز في الحل الذي يمكن أن يؤدي إلى ارتفاع مفاجئ وعنيف في مستوى من الحل، مما تسبب في الإيثانول السائل الساخن إلى شلالمن رد فعل السفينة) خلال الاستخراج.
    8. بعد الشطف شاملة من الكتلة الحيوية منشى دي، ووضع أكياس الشاي في العمود سوكسليت لاستخراج. لا يلزم كشتبان لهذه الخطوة.
    9. إعداد الجزر سوكسليت، وذلك باستخدام 95٪ من الإيثانول واستخراج العينات لمدة 24 ساعة.
    10. إزالة أكياس من المفاعل سوكسليت وانتشرت في طبقة واحدة في صينية مسطحة.
    11. السماح للعينات لتجف بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة في غطاء الدخان.
    12. انبسط أكياس والعودة الكتلة الحيوية المجففة لالأصلية barcoded أكياس مكافحة ساكنة.
      ملاحظة: أكياس مكافحة ساكنة هي فعالة في الحد من الكهرباء الساكنة في الكتلة الحيوية، وتحسين التعامل مع خصائص. في حالة استخدام خيارات التخزين الأخرى، قد تكون هناك حاجة إلى الكتلة الحيوية إضافية بسبب التشبث الكتلة الحيوية إلى جانب حاوية التخزين.
    13. نقل ما لا يقل عن 50 ملغ من الكتلة الحيوية الجافة إلى قادوس barcoded (استخدام المزيد من المواد هو أفضل للصرف دقيقة). Sيمكن الباركود من أكياس مكافحة ساكنة واثب تلقي لضمان دقة تتبع عينة.
    14. النطاط تحميل على المواد الصلبة وزنها الروبوت، مع إيلاء اهتمام وثيق للترتيب العينات في الرفوف. تحميل لوحات مفاعل كافية لاحتواء جميع العينات وتحديد بروتوكول صرفها بناء على عدد من لوحات المستخدمة.
    15. تزن آليا 5 ملغ من العينات المجففة (± 0.3 ملغ) في الفولاذ المقاوم للصدأ لوحات 96-جيدا أحمضة. تزن من 3 مكررات لكل عينة موزعة في جميع أنحاء لوحة للحد من أي اختلافات محلية.
    16. تشمل 8 عينات الكتلة الحيوية السيطرة على الكتلة الحيوية المادية مستوى جيدا اتسم ذلك من أجل متابعة أداء الاختبار. لوحات متعددة، فإن استخدام متعددة النطاط الكتلة الحيوية القياسية تقليل الانجراف حجم الجسيمات الناجمة عن النخل في النطاط عبر دورات الاستغناء المتكررة.
      ملاحظة: في كل لوحة، وينبغي أن يكون هناك 24 عينة مع 3 مكررات، 4 الفراغات التي تتكون من الماء منزوع الأيونات وانزيم، و 8 كنترولليرة سورية، وذلك باستخدام الكتلة الحيوية القياسية تتميز سابقا. محجوزة 3 آبار الزاوية لكل من زوايا 4 من لوحة للمعايير السكر.
    17. تحقق الآبار مستوى فارغة والسكر للجسيمات الكتلة الحيوية المخطئين وإزالة حالة وجودها.
    18. إضافة 250 ميكرولتر من الماء منزوع الأيونات إلى كل بئر، وختم لوحات مع تترافلوروإيثيلين المدعومة من لاصق سيليكون (PTFE) الشريط.
    19. باستخدام 1/8 "طرف حام الحديد، اختراق الشريط PTFE في كل منفذ البخار (117 الكل) لكل لوحة. استخدام لوحة فارغة مكدسة على مختومة لوحة مفاعل كدليل وتقييد حركة PTFE الفيلم.
    20. المشبك لوحات بإحكام مع 0.031 "حشيات سميكة الزجاج المقوى PTFE (لكمات مسبقا مع فتحات للموانئ البخارية) بين لوحات ولوحات فارغة على أعلى وأسفل المكدس. يمهد للمعالجة العينات باستخدام مفاعل البخار لتعيين 180 درجة مئوية لمدة 17.5 دقيقة، أو تركيبات درجة الحرارة / الوقت الأخرى على أساس شدة المطلوب.
    21. لوحات مفاعل باردة إلى 50 درجة؛ C من الفيضانات مع الماء منزوع الأيونات.
  2. الأنزيمية التسكير
    1. يعد حل التسكير الأنزيمية التي تتكون من 8٪ (V / V) حل الانزيم في 1.0 M سيترات الصوديوم، ودرجة الحموضة 5.0. إعداد 5 مل لكل لوحة المفاعل. ملاحظة: التخفيف ينبغي أن تحدد على أساس النشاط والبروتين المحتوى من حل معين انزيم الأسهم المطلوبة.
    2. عندما لوحات هي باردة، الطرد المركزي لهم في الدلو المتأرجح الدوار في 1500 x ج لمدة 20 دقيقة. إزالة ختم الفيلم. ملاحظة: هذه اللوحات هي ثقيلة ويجب فحص مواصفات أجهزة الطرد المركزي من أجل التوافق.
    3. إضافة 40 ميكرولتر من 8٪ محلول المخزون انزيم إلى كل بئر (70 ملغ الإنزيم في غرام الكتلة الحيوية).
    4. ختم الشريط مع PTFE الجديد. وضع لوحة مختومة في المغناطيسي لوحة المشبك.
    5. المزيج بلطف على العينات عن طريق انقلاب (15 مرات على الأقل)، واحتضان عند 50 درجة مئوية لمدة 70 ساعة.
    6. عندما قد اختتم التسكير، مزيج من قبل قلب وأجهزة الطرد المركزي لوحات في 1500 سز لمدة 20 دقيقة.
  3. الفحص السكر
    1. إعداد مجموعة من 6 الجلوكوز والفركتوز جنبا إلى جنب معايير المعايرة في 0.014 عازلة M سترات (درجة الحموضة 5.0) تتراوح 0-،750 ملغ / مل (0، 0.2، 0.3، 0.45، 0.65، و 0.75 ملغم / أوصى مل)، و0-،600 ملغ / مل (0، 0.1، 0.2، 0.35، 0.45، و 0.6 ملغ / مل الموصى بها) لالجلوكوز والفركتوز، على التوالي.
    2. إعداد أوكسيديز الجلوكوز / الغلوثانيون (GOPOD) والفركتوز نازعة (XDH) الكواشف وفقا لتعليمات في المجموعة.
    3. باستخدام ماصة، وإزالة 200 ميكرولتر من السائل من الآبار الزاوية 4 و حافة الآبار المجاورة لآبار ركنية (12 مجموع الآبار) من لوحة المفاعل.
    4. باستخدام ماصة، الاستغناء عن 180 ميكرولتر منزوع الأيونات الماء إلى كل بئر من شقة القاع لوحة تخفيف البوليسترين 96-جيدا. لا يضاف الماء إلى مستوى وزاوية الآبار 12 السكر (إزالة تلك النصائح في حالة استخدام رأس 96 قناة).
    5. باستخدام ماصة، الاستغناء عن 180 ميكرولتر GOPOD الكاشف إلى كل بئر من فحص السكر في ررأكل.
    6. باستخدام ماصة، الاستغناء عن 180 ميكرولتر XDH كاشف لكل بئر من لوحة زيلوز الفحص.
    7. باستخدام ماصة، ونقل 20 ميكرولتر قسامات حلامة من لوحة مفاعل 96-جيدا لوحة التخفيف. الماصة من الجزء العلوي من الآبار لتجنب المواد الصلبة الكتلة الحيوية والسائل المتبقي في آبار الزاوية. مزيج من قبل سحن لا يقل عن 10 دورات.
    8. باستخدام ماصة، ونقل 110 ميكرولتر من المعايير السكر، في نسختين، إلى الآبار ركن من لوحة التخفيف.
    9. باستخدام ماصة، ونقل 20 مكل من لوحة التخفيف إلى الجلوكوز والفركتوز لوحات الفحص. مزيج من قبل سحن.
    10. احتضان الجلوكوز والفركتوز فحص لوحات في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. كسر بعناية أي فقاعات السطح قبل القراءة. ألف بندقية الحرارة مرت فترة وجيزة على سطح اللوحة يعمل بشكل جيد.
    11. باستخدام 96-جيدا قارئ لوحة فوق البنفسجية / مرئية، تعيين الطول الموجي قياس إلى 510 نانومتر، وتسجيل الامتصاصية ضد كاشف فارغة.هذا القياس يراقب تشكيل quinonimine، الذي يتناسب مع تركيز الجلوكوز. يتم حساب تركيز الجلوكوز من منحنى المعايرة استنادا إلى معايير المعايرة التي أعدت في 1.3.1.
    12. باستخدام 96-جيدا قارئ لوحة فوق البنفسجية / مرئية، تعيين الطول الموجي قياس إلى 340 نانومتر، وتسجيل الامتصاصية. هذا القياس يراقب الحد من NAD + إلى NADH، الذي يتناسب مع تركيز الفركتوز. يتم حساب تركيز الفركتوز من منحنى المعايرة استنادا إلى معايير المعايرة التي أعدت في 1.3.1.

2. ارتفاع الإنتاجية تحديد إجمالي اللجنين واللجنين أحادى المحتوى عن طريق pyMBMS 28

  1. إعداد عينة
    1. طحن واستخراج الكتلة الحيوية باستخدام الأساليب المذكورة في الخطوات 1.1.1، و1.1.6-1.1.8. وهذا يشمل طحن واستخلاص مجموعة من المعايير لاستخدام عناصر التحكم التجريبية كما.
      ملاحظة: قياس آثافة pyMBMSبيانات أدلى ليست جسيمات بحجم يتوقف، حتى ولو باستخدام بروتوكول pyMBMS، ينبغي أن يتم إعداد الكتلة الحيوية إلى السماح للعينة لتتناسب مع صاحب العينة، <4 مم.
    2. باستخدام ملعقة صغيرة الاستغناء عن حوالي 4 ملغ (3-5 ملغ فضل) من الكتلة الحيوية مستعدة إلى الفولاذ المقاوم للصدأ كوب 80 ميكرولتر المصممة لصناعة السيارات في العينات.
    3. ضمان أن لا يقل عن 10٪ من العينات التي تم تحليلها هي معايير مراقبة مثل تلك المتوفرة من المعهد الوطني للمعايير والتكنولوجيا (تفل قصب السكر-8491؛ الحور-8492؛ الصنوبر 8493، أو القمح من القش 8494). المعيار يمكن أيضا أن تكون أي نوع مشابهة لعينات لتحليلها التي سبق أن تتميز باستخدام أساليب القياسية.
    4. عشوائيا تحميل العينات في أكواب السيارات العينات باستخدام الملقط لتجنب التحيز بسبب احتمال الانجراف مطياف مع مرور الوقت. ملاحظة: ومن شأن التوزيع العشوائي نموذجي من العينات تشمل قياس جميع العينات مرة واحدة، تليها إعادة التوزيع العشوائي-من أجل من العينات لقياس مكررة. برامج التوزيع العشوائي على شبكة الإنترنت.
    5. استخدام معيار حفرة لكمة، تنتج يدويا أقراص تصفية الزجاج من نوع أوراق A / D الألياف الزجاجية، مع عدم وجود الموثق. عقد الزجاج جولة تصفية الألياف مع ملاقط، مركز على مدى كأس العينة، ودفع في العينة باستخدام 3.5 ملم ألين وجع لحصر المواد في كل كوب أثناء التجربة.
  2. بروتوكول فعال
    1. معايرة مطياف الكتلة باستخدام معيار معروف أن لديها كثافة الذروة خلال مجموعة كاملة من المركبات التي قد تكون موجودة في العينات التجريبية. للحصول على عينات نموذجية الكتلة الحيوية، استخدم perfluorotributylamine (PFTBA).
    2. ضبط معدل تدفق الغاز الناقل الهيليوم إلى 0.9 لتر / دقيقة باستخدام متر تدفق الغاز.
    3. تعيين فرن لصناعة السيارات في العينات إلى درجة حرارة الانحلال الحراري من 500 درجة مئوية، ودرجة الحرارة واجهة إلى 350 ° C باستخدام برنامج لصناعة السيارات في العينات. ملاحظة: 1/8 "الفولاذ المقاوم للصدأ ساخنةيتم التحكم في خط نقل ملفوفة في الشريط الحرارة التي تربط لصناعة السيارات في العينات إلى مطياف الكتلة باستخدام وحدة تحكم في الحرارة 250 درجة مئوية.
    4. بدء الحصول على البيانات على مطياف الكتلة والانتظار على الأقل 60 ثانية للحصول على بيانات كافية لجمع أطياف الخلفية.
    5. بدء طريقة لصناعة السيارات في العينات الآلي للمواصفات من 2.2.2. ملاحظة: يسقط-العينات السيارات كل عينة على حدة في فرن لصناعة السيارات في العينات. إجمالي الوقت الحصول على البيانات ما يقرب من 1.5 دقيقة. ومع ذلك، من الانحلال الحراري نموذجية 4 عينة ملغ كاملة بعد 30 ثانية.
    6. سجل إجمالي محتوى أيون (TIC) من كل عينة باستخدام برنامج مطياف الكتلة في معدل المسح 0.5 ثانية. شدة سجل بين م / ض 30-450.
      ملاحظة: المركبات الكتلة الحيوية النموذجية تستخدم التأين لينة في 17 فولت. ويمكن للأداة تسجيل فترات أكبر من م / ض 1 إلى 1000. ومع ذلك، معدل المسح سوف تكون محدودة بسبب قوة جهاز الكمبيوتر CPU.
    7. إزالة خلفية من أطياف باستخدام أماهnual تعزيز ميزة في البرنامج. ويستخدم جزء 60 فحص خط الأساس في بداية جمع البيانات لحساب قيمة خلفية متوسط: مذكرة. تتم إزالة هذا متوسط ​​أطياف الخلفية من العينة الأطياف التجريبية تلقائيا في البرنامج مطياف الكتلة.
    8. استيراد ملف نصي عمود واحد تم إنشاؤها بواسطة برنامج مطياف الكتلة التي تحتوي على البيانات الطيفية لكل عينة، في برنامج قاعدة البيانات والجمع بين جميع العينات في قاعدة بيانات واحدة. إضافة أية بيانات تعريف ينطبق على جدول البيانات. استيراد البيانات المنسقة (جدول / ملف CSV) إلى مجموعة من البرامج الإحصائية ويعني تطبيع الأطياف لحساب التباين في الجماهير عينة pyrolyzed.
    9. استخدام حزمة البرامج الإحصائية لإجراء تحليل المكون الرئيسي (PCA) باستخدام البيانات الطيفية لتحليل تجميع العينات القياسية تكرارها المستخدمة في القياسات، وكذلك لتقييم القمم التي هي جزء لا يتجزأ من تصنيف المواد الكيميائيةالمركبات في شحنات مؤامرة 28.
      ملاحظة: مجموعة PCA العينات على أساس تشابه أطيافها، ويسمح الاختيار من المعايير لقياس الخطأ التجريبي بسبب الانجراف الصك خلال الفترة السابقة.
    10. لحساب syringyl اللجنين (S) / guaiacyl (G) النسبة، خلاصة القول مجالات القمم S (م / ض = 154، 167، 168، 182، 194، 208، و 210) والقسمة مجموع القمم G في 124، 137، 138، 150، 164، و 178.
    11. لحساب مجموع محتوى اللجنين، خلاصة القول القمم اللجنين مع م / ض = 120، 124، 137، 138، 150، 152، 154، 164، 167، 178، 180، 182، 194، و 210.
    12. حساب معامل تصحيح لتوسيع نطاق قياس pyMBMS إلى الطريقة القياسية لتقدير مجموع اللجنين، مثل Klason اللجنين. تقسيم قيمة اللجنين Klason من مستوى فردي من قبل محتوى اللجنين مجموع قياس لتلك العينة القياسية باستخدام pyMBMS.
    13. تطبيق هذا معامل التصحيح لجميع الأنواع الشبيهة في مجموعة البيانات. كرر لكل نوع من أنواع الكتلة الحيوية تحليلها. Nالمؤسسة التجارية العمانية: إن معامل التصحيح يمكن أن تختلف استنادا إلى حد كبير على S / G من الكتلة الحيوية تحليلها.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

يتم قياس التأثير المشترك للالمعالجة الحرارية واللاحق انزيم التسكير بوصفها وظيفة من كتلة الجلوكوز والفركتوز صدر في نهاية الفحص. يتم الإبلاغ عن النتائج من حيث ملليغرام من الجلوكوز والفركتوز صدر في كل غرام من الكتلة الحيوية. هذا هو في تناقض صارخ مع البيانات الواردة من المقايسات مقاعد البدلاء النطاق، التي عادة ما تكون كما ذكرت العائد النظري في المئة على أساس التحليل التركيبي للمواد البداية. كما أنه ليس من العملي لتنفيذ التحليل التركيبي على آلاف العينات في الأسبوع حتى الآن، هو أفضل أبل...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

خطوات تحضير العينة الرئيسية للحصول على بيانات دقيقة وقابلة للتكرار عند إجراء الإنتاجية العالية التجارب العرض كالتالي:

السكر الإصدار الفحص:

بشكل عام، يتم إعداد العينات في الكثير تتراوح بين بضع عشرات إلى عدة آلاف في وقت واحد. وعادة ما تتم كل خطوة كبرى بالنسبة لجميع العينات قبل المضي قدما من أجل تقليل الاختلافات في إعداد بين العينات. وكان دي اتنشى ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

يود المؤلفون أن يشكروا المتدربة إيفلين فون نيدا التي قدمت رؤى قصوى فيما يتعلق بإعداد عينات الكتلة الحيوية لكل من خطوط الأنابيب عالية الإنتاجية التي تمت مناقشتها في هذه المخطوطة. تم تقديم الدعم لتطوير هذا العمل والمخطوطة من قبل مركز علوم الطاقة الحيوية. مركز علوم الطاقة الحيوية هو مركز أبحاث الطاقة الحيوية التابع لوزارة الطاقة الأمريكية بدعم من مكتب البحوث البيولوجية والبيئية في مكتب العلوم التابع لوزارة الطاقة. المختبر الوطني للطاقة المتجددة (NREL) هو مختبر وطني تابع لمكتب كفاءة الطاقة والطاقة المتجددة التابع لوزارة الطاقة الأمريكية ، يتم تشغيله لصالح وزارة الطاقة من قبل التحالف من أجل الطاقة المستدامة ، LLC. تم دعم هذا العمل من قبل وزارة الطاقة الأمريكية بموجب العقد رقم. DE-AC36-08-GO28308 مع المختبر الوطني للطاقة المتجددة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
محطة العمل الآلية Biomek FXBeckman CoulterBiomek FXAutomated Liquid Handler
Wiley MillThomas Scientific3375E15 (موديل 4) ، أو 3383L20 (مطحنة صغيرة)
أكياس مضادة للكهرباء الساكنةMinigrip *MGST4P025032.5x3 "، العديد من الموردين المتاحين
الأسلاك النحاسية المطلية بالقصديرMcMaster-Carr8871K840.016 "القطر ، أكياس شاي سلكية ثني وتبقى أكياس
HerbcoPress n 'brewأكياس شاي 3.5x5 بوصة
جلوكو أميليزNovozymesSpirizyme Fuel  
ألفا أميليزنوفوزيمزليكوزيم SC DS
أسيتات الصوديوم ثلاثي الهيدراتأي موردكاشف الصف
حمض الأسيتيكأي موردكاشف الصف
190 دليل (95٪) الإيثانولأي موردكاشف الصف
قواديسFreeslate
96- حسنا C-276 لوحات Hastelloy AspenMachining (لافاييت ، كولورادو)N / A (مخصص البني)
1/8 "طرف
تفلون مدعوم بالسيليكوناللاصق 3M51803 "عريض (لفات 36 ياردة)
محلول إنزيمNovozymesCellic CTec2
حامض الستريك أحادي الهيدراتأي مورد
الصوديوم سترات ثنائي هيدراتأي مورد
يمكن التخلص منه ، ألواح البوليسترين 96 جيداGreiner Bio-One655101أو ما يعادلها ؛ العديد من الموردين المتاحة
لوكوز أوكسيديز / بيروكسيداز   ؛MegazymeK-GlucMegazyme D-glucose مجموعة فحص الجلوكوز
زيلوز نازعة هيدروجين زيلوزميجازيمK-Xyloseمجموعة فحص D-xylose
الحل القياسي للجلوكوزMegazymeK-GlucMegazyme D-glucose مجموعة فحص الجلوكوز
القياسي xyloseMegazymeK-XyloseMegazyme D-xylose مجموعة
أكواب عينة من الفولاذ المقاوممختبرات فرونتيرPY1-EC80F
صفائح Pall662278x10 بوصة ؛ دوائر مثقوبة بكمة ثقب قياسية
قصب السكر تفل قصب السكر مواد أولية الكتلة الحيوية الكاملةNIST8491
خشب القطن الشرقي (الحور) المواد الأولية للكتلة الحيويةبالكامل NIST8492
مونتيري الصنوبر الكتلة الحيوية الكاملة المواد الأوليةNIST8493
القمح قش كامل الكتلة الحيوية المواد الأوليةNIST8494
شاي كيميائي كيميائي كيميائي حديد لحام شريط كيميائي ثلاثي كيميائي الحل فحص للصدأ صفائح الألياف الزجاجية

المراجع

  1. U.S. Billion-Ton Update: Biomass Supply for a Bioenergy and Bioproducts Industry. Perlack, R. D., Stokes, B. J. , Oak Ridge National Laboratory. Oak Ridge, TN. (2011).
  2. Henry, R. Ch. 5. Plant Resources for Food, Fuel and Conservation. , Earthscan. 53-80 (2009).
  3. Henry, R. J. Evaluation of plant biomass resources available for replacement of fossil oil. Plant Biotechnol. J. 8 (3), 288-293 (2010).
  4. Furtado, A., et al. Modifying plants for biofuel and biomaterial production. Plant Biotechnol. J. 12 (9), 1246-1258 (2014).
  5. Sluiter, J. B., Ruiz, R. O., Scarlata, C. J., Sluiter, A. D., Templeton, D. W. Compositional analysis of lignocellulosic feedstocks. 1. Review and description of methods. J. Agric. Food Chem. 58 (16), 9043-9053 (2010).
  6. Lupoi, J. S., Singh, S., Simmons, B. A., Henry, R. J. Assessment of Lignocellulosic Biomass Using Analytical Spectroscopy: an Evolution to High-Throughput Techniques. Bioenerg. Res. 7 (1), 1-23 (2014).
  7. Lapierre, C., Monties, B., Rolando, C. Thioacidolysis of lignin: comparison with acidolysis. J. Wood Chem. Technol. 5 (2), 277-292 (1985).
  8. DeMartini, J. D., Studer, M. H., Wyman, C. E. Small-scale and automatable high-throughput compositional analysis of biomass. Biotechnol. Bioeng. 108 (2), 306-312 (2010).
  9. Selig, M. J., et al. High throughput determination of glucan and xylan fractions in lignocelluloses. Biotechnol. Lett. 33 (5), 961-967 (2011).
  10. Selig, M. J., et al. Lignocellulose recalcitrance screening by integrated high-throughput hydrothermal pretreatment and enzymatic saccharification. Ind. Biotechnol. 6 (2), 104-111 (2010).
  11. Studer, M. H., De Martini, J. D., Brethauer, S., McKenzie, H. L., Wyman, C. E. Engineering of a high-throughput screening system to identify cellulosic biomass, pretreatments, and enzyme formulations that enhance sugar release. Biotechnol. Bioeng. 105 (2), 231-238 (2009).
  12. Gjersing, E., Happs, R. M., Sykes, R. W., Doeppke, C., Davis, M. F. Rapid determination of sugar content in biomass hydrolysates using nuclear magnetic resonance spectroscopy. Biotechnol. Bioeng. 110 (3), 721-728 (2013).
  13. Templeton, D. W., Sluiter, A. D., Hayward, T. K., Hames, B. R., Thomas, S. R. Assessing corn stover composition and sources of variability via NIRS. Cellulose (Dordrecht, Netherlands). 16 (4), 621-639 (2009).
  14. Tucker, M. P., et al. Fourier transform infrared quantification of sugars in pretreated biomass liquors. Appl. Biochem. Biotechnol. 84-86, 39-50 (2000).
  15. Wolfrum, E. J., Sluiter, A. D. Improved multivariate calibration models for corn stover feedstock and dilute-acid pretreated corn stover. Cellulose (Dordrecht, Netherlands). 16 (4), 567-576 (2009).
  16. Ona, T., et al. Non-destructive determination of wood constituents by Fourier-transform Raman spectroscopy. J. Wood Chem. Technol. 17 (4), 399-417 (1997).
  17. Ona, T., Sonoda, T., Ohshima, J., Yokota, S., Yoshizawa, N. A rapid quantitative method to assess eucalyptus wood properties for kraft pulp production by FT-Raman spectroscopy. J. Pulp Pap. Sci. 29 (1), 6-10 (2003).
  18. Hames, B. R., Thomas, S. R., Sluiter, A. D., Roth, C. J., Templeton, D. W. Rapid biomass analysis. New tools for compositional analysis of corn stover feedstocks and process intermediates from ethanol production. Appl. Biochem. Biotechnol. 105-108, 5-16 (2003).
  19. Studer, M. H., et al. Lignin content in natural Populus variants affects sugar release. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108 (15), 6300-6305 (2011).
  20. Chen, M., Zhao, J., Xia, L. Comparison of four different chemical pretreatments of corn stover for enhancing enzymatic digestibility. Biomass Bioenergy. 33 (10), 1381-1385 (2009).
  21. Davison, B. H., Drescher, S. R., Tuskan, G. A., Davis, M. F., Nghiem, N. P. Variation of S/G ratio and lignin content in a Populus. family influences the release of xylose by dilute acid hydrolysis. Appl. Biochem. Biotechnol. 129-132, 427-435 (2006).
  22. Li, X., et al. Lignin monomer composition affects Arabidopsis cell-wall degradability after liquid hot water pretreatment. Biotechnol. Biofuels. 3, 27-33 (2010).
  23. Lupoi, J. S., et al. High-throughput prediction of eucalypt lignin syringyl/guaiacyl content using multivariate analysis: a comparison between mid-infrared, near-infrared, and Raman spectroscopies for model development. Biotechnol. Biofuels. 7, 93(2014).
  24. Lupoi, J. S., Smith, E. A. Characterization of woody and herbaceous biomasses lignin composition with 1064 nm dispersive multichannel Raman spectroscopy. Appl. Spectro. 66 (8), 903-910 (2012).
  25. Sun, L., et al. Rapid determination of syringyl:guaiacyl ratios using FT-Raman spectroscopy. Biotechnol. Bioeng. 109 (3), 647-656 (2012).
  26. Lupoi, J. S., et al. High-throughput prediction of Acacia and eucalypt lignin syringyl/guaiacyl content using FT-Raman spectroscopy and partial least squares modeling. Bioenerg. Res. in press, (2015).
  27. Sykes, R., Kodrzycki, B., Tuskan, G., Foutz, K., Davis, M. Within tree variability of lignin composition in Populus. Wood Sci. Technol. 42 (8), 649-661 (2008).
  28. Sykes, R., et al. Ch. 12. High-Throughput Screening of Plant Cell-Wall Composition Using Pyrolysis Molecular Beam Mass Spectroscopy. Biofuels: Methods and Protocols. Mielenz, J. R. 581, 169-183 (2009).
  29. Decker, S., et al. Ch. 17. Reducing the effect of variable starch levels in biomass recalcitrance screening). Biomass Conversion. Himmel, M. E. 908, Humana Press. 181-195 (2012).
  30. Evans, R. J., Milne, T. A. Molecular characterization of the pyrolysis of biomass. Energy Fuels. 1 (2), 123-137 (1987).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة