Method Article

تسمية خالية واحدة كشف الجزيئة عن طريق Microtoroid البصرية الرنين

DOI:

10.3791/53180

⸱

December 29th, 2015

1Division of Biology and Biological Engineering, California Institute of Technology

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لقد قمنا بتطوير نظام استشعار حيوي خال من الملصقات يعتمد على تقنية الرنان البصري المعروفة باسم مرنان الزائد البصري لقفل التردد (FLOWER) القادر على اكتشاف الجزيئات المفردة في المحلول. هنا يتم وصف وعرض الإجراءات الكامنة وراء هذا العمل.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكشف عن تركيزات صغيرة من الجزيئات وصولا الى حد جزيء واحد له تأثير على مجالات مثل الكشف المبكر عن المرض، والدراسات الأساسية على سلوك الجزيئات. تقنيات الكشف عن جزيء واحد تستخدم عادة تسميات مثل العلامات الفلورية أو النقاط الكمومية، ومع ذلك، والعلامات غير متوفرة دائما، وزيادة التكلفة والتعقيد، ويمكن التشويش على الأحداث التي تجري دراستها. ظهرت المرنانات البصرية كوسيلة واعدة للكشف عن جزيئات واحدة دون استخدام التسميات. حاليا أصغر الجسيمات الكشف عنها بواسطة المحسن plasmonically وعدم العارية نظام مرنان البصرية في حل هو 25 نانومتر البوليسترين المجال 1. قمنا بتطوير تقنية تعرف باسم التردد قفل البصرية يهمس زائل الرنان (زهرة) التي يمكن تجاوز هذا الحد وتحقيق الكشف عن جزيء واحد خالية من التسمية في محلول مائي 2. كما موازين قوة الإشارة مع حجم الجسيمات، يمثل عملنا ل> 100X تحسينهالإقليم الشمالي في إشارة إلى نسبة الضوضاء (SNR) على الدولة الراهنة للفن. هنا يتم عرض الإجراءات وراء FLOWER في محاولة لزيادة استخدامه في هذا المجال.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

واحدة من التجارب الكشف عن جزيء مفيدة لتقليل كمية الحليلة المستخدمة في أجهزة الاستشعار، للكشف المبكر عن المرض، ودراسة الخصائص الأساسية للجزيئات 3. وعادة ما يتم إجراء مثل هذه التجارب باستخدام تسميات، ولكن التسميات ليست دائما ممكنة للحصول على بروتين معين، وزيادة التكاليف، ويمكن التشويش على الأحداث التي تجري دراستها، ويمكن أن تكون مزعجة، خاصة في الوقت الحقيقي في الموقع تجارب أو نقطة من- التشخيص الرعاية.

المعيار الذهبي الحالي لتسمية خالية biosensing هو سطح مأكل بالرنين 4، ولكن النظم التجارية مأكل سطح الرنين وعادة ما يكون الحد الأدنى نموذجي للكشف على ترتيب نانومتر. في الآونة الأخيرة، ظهرت المرنانات البصرية وتكنولوجيا واعدة لتسمية خالية جزيء واحد biodetection 5. العمل مرنانات بصري على أساس طويل الأجل (م) الحبس الضوء 6،7. الضوء هو evanescentlyبالإضافة إلى هذه الأجهزة عادة عن طريق الألياف البصرية. عندما الطول الموجي للضوء يمر الألياف يطابق الطول الموجي صدى مرنان، وعلى ضوء كفاءة الأزواج إلى مرنان. على ضوء هذا بالإضافة يعكس داخليا تماما داخل تجويف مرنان لتوليد حقل زائل في المنطقة المجاورة للمحيط مرنان. كما جزيئات تدخل مجال زائل وربط للمرنان، والطول الموجي صدى التغييرات مرنان بما يتناسب مع حجم الجسيمات 8.

من حيث القدرة على الكشف، وقد استخدمت في وقت سابق المرنانات microsphere للكشف عن أنفلونزا A احد جزيئات الفيروس (100 نانومتر) 9،10. في الآونة الأخيرة، وقد استخدمت المرنانات البصرية المحسنة plasmonically-microsphere للكشف عن المصل البقري واحد الألبومين جزيئات 11 و [أليغنوكليوتيد 8 مير 12، ولكن هذا النهج يحد من مجال التقاط الجسيمات إلى 0.3 ميكرون 2 في دينائب. أكبر أجهزة الاستشعار التقاط منطقة مثالية لتحقيق أقصى قدر من فرصة للكشف عن الجسيمات. تم التكنولوجيات القائمة على حل الحالية خالية من التسمية biosensing مع (> 100 ميكرون 2) المناطق القبض كبيرة تقتصر على الكشف عن جزيئات البوليستيرين ≥ 25 نانومتر.

قمنا بتطوير نظام biosensing خالية من التسمية على أساس تكنولوجيا مرنان البصرية المعروفة باسم التردد قفل البصرية يهمس زائل الرنان (زهرة) 13 (الشكل 1) التي هي قادرة على الكشف عن وقت حل للجزيئات واحدة في الحل. يستخدم FLOWER عمر الفوتون طويل من المرنانات البصرية microtoroid جنبا إلى جنب مع تردد تأمين مراقبة ردود الفعل، والكشف عن متوازن، والتصفية الحسابية للكشف عن جزيئات صغيرة وصولا الى جزيئات البروتين واحدة. استخدام قفل تردد يسمح للنظام لتتبع دائما صدى التحول من microtoroid كما ربط جزيئات، من دون الحاجة إلى كنس أو مسح الليزر الطول الموجي أكثرنطاقات واسعة. مبادئ FLOWER يمكن أن تستخدم لتعزيز قدرات الكشف عن تقنيات أخرى بما في ذلك تعزيز plasmonic. في ما يلي، ووصف الإجراءات لأداء FLOWER.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. الإعداد التجريبي وإعداد نموذج

  1. افتعال microtoroids باستخدام الطباعة الحجرية والحفر، وإجراء ذوبان كما هو موضح سابقا 6. افتعال microtoroids على رأس رقاقة السيليكون (رقاقة) التي عادة ما يكون قطرها كبير من 80-100 ميكرون، وقطرها صغير من 2 ميكرون.
  2. استرخاء ما يقرب من متر من الألياف البصرية أحادية النمط (125 ميكرون الكسوة، 4.3 ميكرون وضع قطر الميدان) من بكرة الألياف لها.
  3. في منتصف الجزء المساس بها من الألياف البصرية، تجريد شريحة صغيرة (2.5 سم) من طلاء البوليمر حول الألياف الضوئية باستخدام تقشير الأسلاك. ملاحظة: هذا هو جزء من الألياف الضوئية التي سيتم استخدامها لevanescently ضوء زوجين في microtoroid.
  4. تنظيف الألياف جردت مع الكحول الأيزوبروبانول والوبر مجانا القضاء.
  5. عقد هذا الجزء من الألياف في مكانها باستخدام حامل الألياف المصنوعة من المشابك المغناطيسية.
  6. رقيقة الألياف جردت إلى ~ 500 نانومتر meltinز وسحب باستخدام شعلة الهيدروجين واثنين من المحركات السائر تتحرك في اتجاهين متعاكسين في 60 ميكرون / دقيقة. ضع الألياف البصرية داخل الجزء العلوي من اللهب، التي ينبغي أن تكون ~ 10 مم طويل القامة. وقف سحب الألياف عندما انتقال العدوى عن طريق الألياف يتوقف المتقلبة، والتي يمكن رصدها إما بصريا (من خلال مشاهدة الضوء الذي تنتشر أفقيا من وميض الألياف داخل وخارج) أو عن طريق توصيل الألياف إلى الثنائي الضوئي وهو يعلق على الذبذبات .
  7. يلتصق طرف واحد من الألياف الضوئية وأدخله محول الألياف العارية. ضع هذه الغاية من الألياف في مدخلات photoreceiver.
  8. زوجين من الألياف الطرف الآخر من بكرة الألياف ليزر باستخدام مقرنة الألياف البصرية.
  9. وضع رقاقة microtoroid على رأس صاحب العينة (الفولاذ المقاوم للصدأ، 37.8 مم × 6.4 مم × 3.2 مم) باستخدام الايبوكسي أو الشريط مزدوجة من جانب.
  10. جبل صاحب العينة على رأس مرحلة تحديد المواقع التي تضم من 3 محاور النانو لتحديد المواقع (نanocube) مرحلة (انظر قائمة المعدات) على رأس ميكرومتر 3 محاور. أداء جميع التجارب على طاولة البصرية معزولة بالهواء المضغوط لتقليل الاهتزازات.
  11. موقف خشن رقاقة عينة باستخدام ميكرومتر 3 محاور.
  12. محاذاة رقاقة بالتوازي التي تحتوي على microtoroid إلى الألياف الضوئية باستخدام النانو مناور. ملاحظة: محاذاة microtoroid على مسافة من طول موجي واحد من الضوء المدخلات (~ 633 نانومتر). لرؤية هذه العملية استخدام عمودين التصوير (أنبوب مع عدسة موضوعية وكاميرا، انظر قائمة المعدات) وضعه على رأس وعلى جانب من الشريحة.
  13. تحسين استقطاب ضوء الليزر الموجهة من خلال الألياف البصرية باستخدام وحدة تحكم الاستقطاب في خط (انظر قائمة المعدات) مع مقبض لضبط الاستقطاب. ملاحظة: يتم تحقيق الاستقطاب الأمثل عندما يظهر تراجع ملموس في انتقال الألياف البصرية أضيق. ملاحظة هذا الانخفاض على الذبذبات (راجع الخطوة 2.2 لمزيد من التفاصيل).
  14. بناءغرفة العينة epoxying ساترة الزجاج على مرحلة العينة باستخدام شريحة المجهر والزجاج كفاصل. ملاحظة: A الضميمة زجاجي يغطي كامل الإعداد قد تكون مفيدة للتقليل من التيارات الهوائية. يجب أن تترك فتحة صغيرة للسماح الحل ليتم ضخها في استخدام الأنابيب.
  15. تتوازن حراريا تعليق الجسيمات أو المحاليل المائية جزيء واحد ل≥ 1 ساعة في حمام مائي RT (~ 500 مل). ملاحظة: يتم تخفيفه عينات إلى التركيز المطلوب في أنابيب microcentrifuge باستخدام مخازن المرتبطة المحددة من الشركة المصنعة، على سبيل المثال، في برنامج تلفزيوني أو HEPES. إذا تم الكشف عن أية أحداث ملزمة، وزيادة تركيز الملح المخزن المؤقت.
  16. دوامة الجسيمات تحتوي على حلول (1 مل) لفترة وجيزة ل~ 2 ثانية.
  17. حقن الجسيمات تحتوي على حلول في حجرة العينة في 1 مل / دقيقة باستخدام 1 مل ضخ حقنة.
  18. بعد أن شغل حجرة العينة، إيقاف ضخ حقنة.
  19. انتظر 30 ثانية قبل تسجيل البيانات للحد منآثار الاهتزازات الميكانيكية الناجمة عن تدفق السوائل التي يمكن أن تؤثر على القياس.

2. تردد قفل

  1. إعادة الزوجين حلقي إلى الألياف البصرية عن طريق تحريك صاحب العينة مع nanopositioner، لأنه سيتم بالانزعاج اقتران نظرا لحقن السائل.
  2. تحديد الطول الموجي صدى من microtoroid عن طريق مسح الكمبيوتر التي تسيطر عليها إدخال الليزر من خلال مجموعة متنوعة من الأطوال الموجية. تنفيذ هذه الخطوة عن طريق إرسال إشارة الثلاثي الموجي الجهد لعنصر كهرضغطية داخل وحدة تحكم الليزر الذي ينظم الطول الموجي لليزر. إجراء تجارب باستخدام الضوء المرئي (635 نانومتر ± 2.5 نانومتر) كما أن هناك انخفاض امتصاص الضوء في الماء عند هذا الطول الموجي.
  3. قياس انتقال الضوء من خلال الألياف البصرية عن طريق توصيل إخراج الألياف البصرية إلى photoreceiver السيارات متوازنة. سد العجز الناتج من photoreceiver إلى الذبذبات باستخدام كابل BNC. مراقبة سن الذبذبات أنه في الطول الموجي صدى من microtoroid، انتقال العدوى عن طريق الألياف البصرية قطرات.
  4. إرفاق إخراج photoreceiver إلى المدخل الرئيسي للتردد قفل تحكم ردود الفعل (انظر قائمة المعدات) عن طريق كابل.
  5. تشغيل التردد قفل تحكم ردود الفعل في وضع القفل الآلي باستخدام أعلى من الذروة قفل مع تردد ارتجف من 2 كيلو هرتز واتساع موجة التذبذب من 19 وزير الخارجية. ضبط تجريبيا الإعدادات يتناسب-يتجزأ المشتقة في إطار البرنامج باستخدام زيغلر-نيكولز ضبط القواعد 14. ملاحظة: هذه القيم تحتاج إلا أن تكون مجموعة مرة واحدة في بداية كل التجارب.
  6. لصناعة السيارات في قفل الطول الموجي لليزر لطول الموجة صدى من microtoroid. تنفيذ هذه الخطوة بعد ملء حجرة العينة. ملاحظة: إذا كان التحول الطول الموجي هو كبير جدا، ثم وحدة تحكم ردود الفعل سوف تفقد القفل وستتحول تلقائيا إلى وضع المسح الضوئي من أجل تحديد موقع صدى الطول الموجي. هذا OCالأوغاد لطول موجة التحولات أكبر من ما يقرب من linewidth (لا يقل عن 600 وزير الخارجية لجميع أنظمة التحقيق هنا).
  7. تسجيل الإخراج من وحدة تحكم ردود الفعل في 20 كيلو هرتز باستخدام 24 بت بطاقة الحصول على البيانات. تصدير البيانات كملف نصي عبر برنامج الحصول على البيانات.

3. تجهيز وتحليل البيانات

  1. تحويل فورييه البيانات في MATLAB.
  2. المنخفضة تمرير البيانات باستخدام "الطوب الجدار" مرشح مع قطع في 1 كيلو هرتز لإزالة التردد ارتجف المفروضة من 2 كيلو هرتز (انظر الرمز التكميلي ملف شاشة 1).
  3. الشق حسابيا تصفية البيانات باستخدام حجم نافذة 16 هرتز. ملاحظة: يتم ذلك لإزالة المصادر المعروفة للضجيج، في هذه الحالة، 60 هرتز الضوضاء خط الالكترونية والتوافقيات، وكذلك 100 هرتز (قادمة من سائق ليزر) والتوافقيات (انظر الرمز التكميلي ملف شاشة 1).
  4. فورييه العكسي تحويل البيانات مرة أخرى إلى المجال الزمني.
  5. مرشح متوسط ​​البيانات باستخدام نافذةحجم 1001 عينات (انظر الرمز التكميلي ملف لقطة 2).
  6. تحديد التغييرات خطوة في الطول الموجي صدى باستخدام خوارزمية تقصي خطوة من Kerssemakers وآخرون. 15.
  7. توليد رسوم بيانية للسعة كل خطوة ملزمة.
  8. حساب حجم الجسيمات باستخدام المعادلة. (1) (انظر مناقشة).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الجسيمات الأحداث ملزم يتم رؤيتها بوضوح عن التغيرات خطوة تشبه في الطول الموجي صدى من microtoroid على مر الزمن (الشكل 2A). وتظهر مرتفعات الخطوات كما رسم بياني في الشكل 2B. أرقام 2-4 تظهر آثار تمثيلية من الربط من exosomes (nanovesicles)، وحبات السيليكا 5 نانومتر، وبشرية واحدة انترلوكين 2 الجزيئات، على التوالي. حقيقة أن الأحداث خطوة تشبه النطاق مع حجم الجسيمات يظهر أن قد تم تنفيذ هذه التقنية بشكل صحيح. هذا يمكن تحليله...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

كما يربط جسيم، والطول الموجي صدى (λ) للزيادات حلقي. إذا unbinds جسيم، والطول الموجي صدى النقصان تبعا ل(أ الحدث خطوة لأسفل). يمكن تحديد قطرها الجسيمات (د) عن طريق رسوم بيانية للسعة كل خطوة الطول الموجي. يختلف ارتفاع كل خطوة الطول الموجي نظرا لاختلاف حجم الجسيمات ملزمة ونظرا لموقعها على microtoroid حيث يربط الجسيم. يحدث أقصى تغير في الطول الموجي صدى (الارتفاع الخطوة) عندما ربط الجزيئات عند خط الاستواء من حيث microtoroid المجال الكهربائي (E 0، كحد ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعلن المؤلفون أنه ليس لديهم مصالح مالية متنافسة.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم هذا البحث جزئيا من خلال جائزة خدمة البحوث الوطنية (T32GM07616) من المعهد الوطني للعلوم الطبية العامة.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
ليزر قابل للضبطنيوبورتTLB-6300
وحدة تحكم ليزرنيوبورتTLB-6300-LN
وحدة تحكم التغذية المرتدة لقفل الترددToptica PhotonicsDigilock 110
جهاز استقبال ضوئي متوازنتلقائي نيوبورتموديل 2007
وحدة تحكم في الاستقطابفي الخط الضوئيات العامةPLC-003-S-90
بطاقة الحصول على البيانات 24 بتالأدوات الوطنيةNI-PCI-4461
المؤتلف البشري interleukin-2بيرس التكنولوجيا الحيويةR201520
20 نانومتر حبات البوليسترينالحرارية العلمية3020A
NanoCube XYZ Piezo StagePhysik InstrumenteP-611.3
الجدول البصرينيوبورتVH3660W-OPT
عدسة موضوعية لعمود التصويرNavitar Machine Vision1-60228
عمود التصوير (أنبوب المحول)Navitar Machine Vision1-60228
كاميرا CCD عالية الدقة لعمود التصويربصريات إدموند الصناعيةNT39244

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lu, T., et al. High sensitivity nanoparticle detection using optical microcavities. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108, 5976-5979 (2011).
  2. Su, J., Goldberg, A. F. G., Stoltz, B. Label-free detection of single nanoparticles and biological molecules using microtoroid optical resonators. Light: Science and Applications. , (2016).
  3. Knight, A. Single molecule biology. , Elsevier/Academic. (2009).
  4. Jonsson, U., et al. Real-time biospecific interaction analysis using surface plasmon resonance and a sensor chip technology. BioTechniques. 11, 620-627 (1991).
  5. Vollmer, F., Arnold, S. Whispering-gallery-mode biosensing: label-free detection down to single molecules. Nat. Methods. 5, 591-596 (2008).
  6. Armani, D. K., Kippenberg, T. J., Spillane, S. M., Vahala, K. J. Ultra-high-Q toroid microcavity on a chip. Nature. 421, 925-928 (2003).
  7. Vahala, K. J. Optical microcavities. Nature. 424, 839-846 (2003).
  8. Arnold, S., Khoshsima, M., Teraoka, I., Holler, S., Vollmer, F. Shift of whispering-gallery modes in microspheres by protein adsorption. Opt. Lett. 28, 272-274 (2003).
  9. Vollmer, F., Arnold, S., Keng, D. Single virus detection from the reactive shift of a whispering-gallery mode. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 105, 20701-20704 (2008).
  10. He, L., Ozdemir, S. K., Zhu, J., Kim, W., Yang, L. Detecting single viruses and nanoparticles using whispering gallery microlasers. Nat Nano. 6, 428-432 (2011).
  11. Dantham, V. R., et al. Label-free detection of single protein using a nanoplasmonic-photonic hybrid microcavity. Nano Lett. 13, 3347-3351 (2013).
  12. Baaske, M. D., Foreman, M. R., Vollmer, F. Single-molecule nucleic acid interactions monitored on a label-free microcavity biosensor platform. Nat Nanotechnol. 9, 933-939 (2014).
  13. Su, J. Label-Free Single Exosome Detection Using Frequency-Locked Microtoroid Optical Resonators. ACS Photonics. (9), 1241-1245 (2015).
  14. Åström, K. J., Murray, R. M. Feedback systems : an introduction for scientists and engineers. , Princeton University Press. (2008).
  15. Kerssemakers, J. W., et al. Assembly dynamics of microtubules at molecular resolution. Nature. 442, 709-712 (2006).
  16. Su, T. -T. J. Label-free detection of single biological molecules using microtoroid optical resonators. , California Institute of Technology. (2014).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Label free Single Molecule DetectionMicrotoroid Optical ResonatorsFrequency Locking Optical Whispering Evanescent ResonatorOptical Resonator TechnologySingle Molecule DetectionNanoparticle DetectionProtein Folding AnalysisBinding Kinetics StudyOptical Fiber CouplingResonance Wavelength Tracking

Related Articles