يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

التفريق بين الخط خلية SH-SY5Y العصبية الإنسان

79.2K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/53193

⸱

فبراير 17, 2016

 ,  , 
1Department of Biochemistry and Molecular Biology, The Huck Institutes of the Life Sciences, The Pennsylvania State University

في هذه المقالة

ملخص

من الأهمية بمكان في علم الأعصاب وعلم الفيروسات العصبية أن يكون لديك نظام موثوق به وقابل للتكرار في المختبر يعمل كنموذج انتقالي لما يحدث في الجسم الحي في الخلايا العصبية البشرية. يصف هذا البروتوكول كيفية استزراع وتفريق خلايا الورم الأرومي العصبي البشري SH-SY5Y إلى خلايا عصبية قابلة للحياة لاستخدامها في التطبيقات المختبرية.

الملخص

يعد وجود أنظمة مناسبة في الجسم الحي وفي المختبر توفر نماذج انتقالية للأمراض البشرية جانبا لا يتجزأ من البحث في علم الأعصاب وعلوم الأعصاب. تشمل النماذج التجريبية التقليدية في المختبر المستخدمة في علم الأعصاب الثقافات العصبية الأولية من الفئران والفئران ، وخطوط خلايا الورم الأرومي العصبي بما في ذلك الفئران B35 وخلايا الفئران العصبية -2A ، وخلايا الفئران PC12 ، ومزارع الشرائح قصيرة المدى. بينما يعتمد العديد من الباحثين على هذه النماذج ، إلا أنهم يفتقرون إلى مكون بشري ويمكن أن تكون التأثيرات التجريبية الملحوظة حصرية للأنواع المعنية وقد لا تحدث بشكل مماثل في البشر. بالإضافة إلى ذلك ، على الرغم من أن هذه الخلايا عبارة عن خلايا عصبية ، إلا أنها قد تحتوي على أنماط ناعمة غير مستقرة ، مما يجعل استخدامها مشكلة في دراسات التعبير الجيني والدراسات القابلة للتكرار لإشارات الخلية. لذلك من المهم تطوير نماذج أكثر اتساقا للأمراض العصبية البشرية.

يصف الإجراء التالي طريقة سهلة المتابعة وقابلة للتكرار للحصول على ثقافات عصبية بشرية متجانسة وقابلة للحياة ، عن طريق التفريق بين خط خلايا الورم الأرومي العصبي البشري المستقر كروموسومات ، SH-SY5Y. تدمج هذه الطريقة العديد من الطرق الموصوفة سابقا1-4 وتعتمد على الإزالة المتسلسلة للمصل من الوسط. يتضمن الجدول الزمني تجويعا تدريجيا للمصل ، مع إدخال بروتينات المصفوفة خارج الخلية وعوامل التغذية العصبية. هذا يسمح للخلايا العصبية بالتمايز ، بينما يتم اختيار الخلايا الظهارية ضدها ، مما يؤدي إلى ثقافة عصبية متجانسة. توضح النتائج التمثيلية التمايز الناجح لخلايا الورم الأرومي العصبي SH-SY5Y من نمط ظاهري أولي للخلايا الشبيهة بالظهارة إلى نمط ظاهري عصبي أكثر اتساعا وتشععا. يوفر هذا البروتوكول طريقة موثوقة لتوليد مجموعات متجانسة من الثقافات العصبية التي يمكن استخدامها في التحليلات الكيميائية الحيوية والجزيئية اللاحقة ، مما يوفر للباحثين نموذجا انتقاليا أكثر دقة للعدوى البشرية والأمراض.

المقدمة

القدرة على استخدام نظم نموذج المختبر عزز كثيرا من مجالات علم الأعصاب وعلم الأعصاب. الخلايا في الثقافة بمثابة منصة فعالة لتوصيف وظيفة البروتين والآليات الجزيئية الظواهر المحددة الأساسية، لفهم علم الأمراض من الأمراض والعدوى، وإجراء عمليات تقييم اختبار المخدرات الأولية. في علم الأعصاب، وأنواع رئيسية من نماذج ثقافة الخلية تشمل الثقافات العصبية الأولية المستمدة من الجرذان والفئران، وخطوط الخلايا العصبية مثل خلايا الفئران B35 5، العصبية-2A خلايا فأر 6، وخلايا الفئران PC12 7. على الرغم من أن استخدام خطوط الخلايا مثل هذه تقدمت مجال كبير، وهناك عدة عوامل خارجية مرتبطة التعامل مع الخلايا غير والأنسجة البشرية. وتشمل هذه الأنواع المحددة فهم الاختلافات في عمليات التمثيل الغذائي، الظواهر من مظاهر المرض، والتسبب بالمقارنة مع البشر. ومن المهم أيضا أن نلاحظ أنإعادة اختلافات كبيرة بين الماوس والتعبير الجيني البشري وعامل النسخ الإشارات، وتسليط الضوء على القيود المفروضة على نماذج القوارض وأهمية التفاهم التي تم حفظها الممرات بين القوارض والبشر 8-11. ويعمل آخرون على استخدام خطوط الخلايا العصبية البشرية بما في ذلك N-تيرا-2 (NT2) خط البشري خلية سرطانة مسخية والخلايا الجذعية المحفزة محرض (iPSCs). هذه خطوط الخلايا توفر نماذج جيدة لفي المختبر النظم البشرية. ومع ذلك، تمايز الخلايا NT2 مع حمض الريتينويك (RA) النتائج في توليد يسكنها خليط من الخلايا العصبية، الخلايا النجمية، والخلايا الدبقية شعاعي 12، مما استلزم خطوة تنقية إضافية للحصول على مجموعات نقية من الخلايا العصبية. بالإضافة إلى ذلك، فإن الخلايا NT2 يبرهن على وجود النمط النووي متغير بدرجة كبيرة 13، مع أكثر من 60 الكروموسومات في 72٪ من الخلايا. iPSCs تظهر التباين في التفريق بين خطوط مختلفة من الخلايا وتتفاوت في كفاءة التمايز 14، وبالتالي من المستحسن أن يكون نموذجا الخلايا العصبية البشرية متسقة وقابلة للتكرار لتكمل هذه البدائل.

SH-SY5Y خلايا تشبه أرومة عصبية هي subclone من الوالدين خط الخلية العصبية SK-N-SH. تم إنشاء خط الخلية الوالدية في عام 1970 من خزعة نخاع العظم الذي يحتوي على خلايا تشبه الخلايا الظهارية 15 على حد سواء مثل أرومة عصبية و. الخلايا SH-SY5Y لديها النمط النووي مستقرة تتكون من 47 كروموسوم، ويمكن أن تكون متباينة من دولة مثل أرومة عصبية إلى الخلايا العصبية البشرية الناضجة من خلال مجموعة متنوعة من الآليات المختلفة بما في ذلك استخدام RA، استرات phorbol، وneurotrophins محددة مثل المستمدة الدماغ عامل التغذية العصبية (BDNF). وتشير الأدلة السابقة أن استخدام أساليب مختلفة يمكن اختيار لفرعية الخلايا العصبية محددة مثل الأدرينالية، الكوليني، والخلايا العصبية الدوبامين 16،17. هذا الجانب الأخير يجعل الخلايا SH-SY5Y مفيدة للعديد من التجارب علم الأعصاب.

ontent "> وقد لاحظ العديد من الدراسات اختلافات هامة بين الخلايا SH-SY5Y في ولاياتهم غير متمايزة ومتباينة، وعندما الخلايا SH-SY5Y هي غير متمايزة، فإنها تتكاثر بسرعة، ويبدو أن غير مستقطب، مع عدد قليل جدا من العمليات، قصيرة. وغالبا ما تنمو في كتل والتعبير عن علامات تدل على الخلايا العصبية غير ناضجة 18،19. وعندما متباينة، وهذه الخلايا تمتد طويلا، تشعبت العمليات، وانخفاض في انتشار، وفي بعض الحالات استقطاب 2،18. تم الخلايا SH-SY5Y متباينة تماما أثبتت سابقا للتعبير عن مجموعة متنوعة من علامات مختلفة من الخلايا العصبية الناضجة بما في ذلك البروتين المرتبط النمو (GAP-43)، نوى الخلايا العصبية (NeuN)، synaptophysin (SYN)، متشابك بروتين حويصلة الثاني (SV2)، الخلايا العصبية إينولاز معين (NSE) وأنيبيب المرتبطة بروتين (MAP) 2،16،17،20، وتفتقر إلى التعبير عن علامات الدبقية مثل ييفي الدبقية البروتين الحمضية (GFAP) (4). وفي مزيد من الدعم الذي يميز الخلايا SH-SY5Y represeالإقليم الشمالي يبلغ عدد سكانها العصبية متجانسة، وإزالة عامل التغذية العصبية نتائج في الخلايا الخلوية (4). هذا يشير إلى أن بقاء الخلايا SH-SY5Y متباينة تعتمد على العوامل الغذائية، مماثلة إلى أن تنضج الخلايا العصبية.

وقد ازداد استخدام الخلايا SH-SY5Y منذ تأسيس subclone في عام 1978 3. وتشمل بعض الأمثلة على استخدامها يحقق مرض باركنسون 17 ومرض الزهايمر 21، والتسبب في العدوى الفيروسية بما في ذلك فيروس شلل الأطفال 22، الفيروس المعوي 71 (EV71) 23،24 وفيروس الحماق النطاقي (جدري الماء) 1، والفيروس المضخم للخلايا الإنسان 25، وفيروس الهربس البسيط (HSV) 2،26. من المهم أن نلاحظ أن العديد من الدراسات باستخدام الخلايا SH-SY5Y وقد استخدمت هذه الخلايا في شكلها غير متمايز، وخاصة في مجال neurovirology 27-36. الاختلاف في النمط الظاهري الملحوظ من غير متمايزة مقابل الخلايا SH-SY5Y متباينة يثير مسألة عرجذر التقدم لوحظ من العدوى ستكون مختلفة في الخلايا العصبية متباينة ناضجة. على سبيل المثال، متباينة الخلايا SH-SY5Y لها كفاءة أعلى من HSV-1 امتصاص مقابل غير متمايزة، تكاثر الخلايا SH-SY5Y، والذي قد يكون نتيجة لعدم وجود مستقبلات سطح التي تربط HSV وتعدل الدخول على غير متمايزة خلايا SH-SY5Y 2. ولذلك فمن الأهمية بمكان أن عند تصميم تجربة تركز على اختبار الخلايا العصبية في المختبر، ينبغي التمييز بين الخلايا SH-SY5Y من أجل الحصول على أدق النتائج للترجمة وبالمقارنة مع النماذج في الجسم الحي.

تطوير طريقة يمكن الاعتماد عليها لتوليد الثقافات العصبية الإنسان أمر حتمي السماح للباحثين لإجراء تجارب متعدية هذا النموذج بدقة الجهاز العصبي البشري. بروتوكول المقدمة هنا هو الإجراء الذي يحدد أفضل الممارسات المستمدة من الطرق السابقة 1-4 لإثراء لالخلايا العصبية البشرية التي متباينةاستخدام حمض الريتينويك.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1. اعتبارات عامة

  1. انظر جدول المواد / المعدات للحصول على قائمة من الكواشف اللازمة. تنفيذ جميع الخطوات تحت ظروف معقمة صارمة.
  2. استخدام الحرارة المعطل مصل بقري جنيني (hiFBS) لجميع الاستعدادات وسائل الاعلام التي تشمل FBS. لتسخين-تعطيل، تدفئة قسامة 50 مل من FBS عند 56 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة، عكس كل 10 دقيقة (انظر أيضا الجدول 1).
    ملاحظة: عند استخدام FBS دون الحرارة تعطيل، النمط الظاهري مثل الظهارية يتقدم بسرعة أكثر في جميع أنحاء الثقافات الخلايا SH-SY5Y.
  3. قبل الاستخدام، والسماح لوسائل الإعلام لتدفئة وتتوازن في حاضنة لإقامة توازن الرقم الهيدروجيني المناسب قبل كل خطوة. على سبيل المثال، 50 مل من وسائل الاعلام تأخذ تقريبا ساعة واحدة لكي تتوازن تماما (الرقم الهيدروجيني 7، 37 درجة مئوية، و 5٪ CO 2).
    ملاحظة: يستخدم هذا البروتوكول على إجراء تقسيم من خطوتين يتطلب خلايا SH-SY5Y متباينة جزئيا إلى أن trypsinized وإعادة مطلي. هذا هو المجهدةعملية لهذه الخلايا هشة للغاية. وبالتالي، فمن المهم أن احتضان الخلايا في التربسين عن الحد الأدنى من الوقت. وهذا سوف يسمح لالتفضيلي انطلاقه من الخلايا العصبية، وترك الخلايا الظهارية مثل ما زالت تعلق على طبق.
  4. أداء سحن من الخلايا المتمايزة ببطء مع الماصة البلاستيك 10 مل مع طرف ضد الجزء السفلي من أنبوب مخروطي يحتوي على الخلايا. أداء سحن بسرعة بطيئة، صعودا وهبوطا لا يزيد عن خمس مرات.

2. مرور الثقافات صيانة SH-SY5Y

  1. الثقافات صيانة تقسيم عندما وصلت إلى خلايا 70-80٪ confluency، ولا تتجاوز 10 إلى 15 الممرات. تحتاج الثقافات عادة ما تكون passaged كل 3-5 أيام (لا تضعف الثقافات افتراض أكثر من 5 أضعاف خلال تقسيم).
  2. إلى خلايا مرور من قارورة T-75، ونضح من وسائل الإعلام، ثم شطف مع ما يقرب من 10 مل برنامج تلفزيوني 1X.
    ملاحظة: نحن لا ننصح تقسيم SH-SY5Y الثقافات صيانة فوrther من 1: 5 أثناء الركض لأن هذا يمكن أن يسبب الخلايا للموت بسبب confluency منخفضة.
  3. نضح في برنامج تلفزيوني، ثم قم بإضافة 2.5 مل 0.05٪ التربسين-EDTA (1X).
  4. احتضان في حاضنة 2-3 دقيقة وتقلب بلطف للافراج عن الخلايا من سطح القارورة.
  5. إضافة 10 مل نمو وسائل الإعلام الأساسية (انظر الجدول 2) ويسحن 1-2 مرات.
  6. تدور باستمرار لمدة 2 دقيقة في 1000 x ج، ووسائل الإعلام نضح، ثم بيليه resuspend في 5 مل وسائل الاعلام النمو الأساسية.
  7. تمييع الخلايا من 1: 3-1: 5 في إجمالي حجم 20 مل لمدة الطلاء العادي في T-75 قارورة، أو العد ولوحة للتمايز (القسم 5).

3. تجميد الخلايا SH-SY5Y

  1. تجميد المقاطع الأولى من الخلايا العصبية SH-SY5Y في وسائل الاعلام النمو الأساسية تستكمل مع 5٪ (ت / ت) DMSO.
  2. في البداية، وتجميد aliquots في -80 درجة مئوية لمدة 24 ساعة، ثم نقل إلى النيتروجين السائل لتخزين على المدى الطويل.
    ملاحظة: للإشارة، متموجة (75-85٪) T-75 قارورة سيؤدي إلى خمسة1 مل aliquots من الخلايا SH-SY5Y لتجميد. كل من هذه قسامات يجب أن يحتوي أي مكان 2-5 مليون خلية الإجمالية.

4. خلايا الذوبان والثقافة مشوه SH-SY5Y العصبية

  1. إعداد وسائط النمو الأساسية.
  2. بسرعة ذوبان الجليد الخلايا المجمدة في حمام مئوية الماء 37 درجة (حوالي 2 دقيقة).
  3. Resuspend الخلايا في 9 مل وسائل الاعلام النمو الأساسية في 15 مل أنبوب مخروطي الشكل، ثم الطرد المركزي لمدة 2 دقيقة في 1000 ز س.
  4. نضح في وطاف مع الحرص على عدم تعكير صفو خلايا مكعبات، وResuspend الخلايا برفق في 10 مل وسائل الاعلام النمو الأساسية.
  5. لوحة الخلايا على قارورة T-25 أو 60 ملم 2 طبق.
  6. في اليوم التالي، تحل محل وسائل الإعلام لإزالة الخلايا الميتة.

5. يوم 0: تصفيح خلايا للتمايز

  1. انظر الشكل 1 للجدول الزمني التمايز.
  2. شطف خلايا غير متمايزة مع برنامج تلفزيوني 1X، نضح، ومن ثم يعرض للتريبسين باستخدام 1-2 مل تحسنت1X 0.05٪ التربسين-EDTA.
  3. عندما تكون الخلايا في التربسين، واحتضان لحوالي 3 دقائق في حاضنة.
  4. إخماد التربسين بإضافة 10 مل وسائط النمو الأساسية، وشطف جانبي قارورة أو صحن، ويسحن بلطف 1-3 مرات. نقل المحتويات إلى أنبوب مخروطي 15 مل.
  5. أجهزة الطرد المركزي لمدة 2 دقيقة في 1000 x ج، ونضح وسائل الإعلام مع الحرص على عدم تعكير صفو بيليه.
  6. بيليه resuspend في 5 مل وسائل الاعلام النمو الأساسي ويسحن 1-3 مرات.
  7. عد الخلايا باستخدام عدادة الكريات، ثم تمييع باستخدام وسائط النمو الأساسية إلى 50000 خلية / مل.
  8. لوحة 2 مل من الخلايا لكل 35 ملم 2 طبق لما مجموعه 100،000 خلايا في طبق والمكان مرة أخرى في الحاضنة.

6. يوم 1: تغيير وسائل الإعلام (التفاضل وسائل الإعلام رقم 1)

  1. قسامة 50 مل من التمايز وسائل الإعلام # 1 (انظر الجدول 2)، واحتضان في 37 درجة مئوية حمام الماء.
  2. عند درجة حرارة سائل الإعلام، والسماح لها لكي تتوازن في حاضنة (37درجة مئوية، 5٪ CO 2) لساعة واحدة على الأقل لإقامة توازن الرقم الهيدروجيني المناسب قبل استخدامها.
  3. إضافة حمض الريتينويك (RA) (انظر الجدول 1) إلى درجة حرارة وسائل الإعلام معايرتها على الفور قبل أن يضيف وسائل الإعلام إلى الأطباق.
    ملاحظة: حمض الريتينويك خفيف حساسة ويجب أن يتم تخزين في زجاجات داكنة في 4 درجات مئوية
  4. نضح بلطف وسائل الإعلام القديمة والتخلص منها.
  5. إضافة 2 مل التمايز وسائل الإعلام # 1 مع التهاب المفاصل الروماتويدي في 35 ملم 2 طبق والعودة إلى الحاضنة.

7. يوم 3: تغيير وسائل الإعلام (التفاضل وسائل الإعلام رقم 1)

  1. كرر القسم 6 (الخطوات 1-5)

8. يوم 5: تغيير وسائل الإعلام (التفاضل وسائل الإعلام رقم 1)

  1. كرر القسم 6 (الخطوات 1-5)

9. يوم 7: تقسيم الخلايا 1: 1

  1. إضافة RA إلى حرارة ومعايرتها التمايز وسائل الإعلام رقم 1 على الفور قبل أن يضيف وسائل الإعلام إلى الأطباق.
  2. نضح بلطف وسائل الإعلام القديمة والتخلص منها.
  3. إضافة 200 ميكرولترتحسنت بنسبة 0.05٪ 1X التربسين EDTA لكل 35 ملم 2 طبق ودافئة في حاضنة حوالي 2-3 دقائق أو حتى خلايا ترفع بشكل واضح من لوحة كما لوحظ تحت المجهر.
  4. إخماد التربسين بإضافة 2 مل التمايز وسائل الإعلام # 1 مع التهاب المفاصل الروماتويدي في 35 ملم 2 طبق واستخدام وسائل الإعلام لشطف الخلايا العصبية المتبقية من لوحة. ثم نقل المحتويات إلى أنبوب مخروطي 50 مل.
    ملاحظة: أثناء trypsinization الخطوات، لا يعرض للتريبسين الكثير من الأطباق في آن واحد. وهذا يساعد على ضمان عدم حضنت الثقافات العصبية في التربسين لفترة طويلة جدا، والتي يمكن أن تكون سامة للخلايا.
  5. الجمع بين محتويات من ما يصل الى 10 أطباق في 50 مل أنبوب مخروطي الشكل ويسحن بلطف ببطء صعودا ونزولا لا يزيد عن خمس مرات مع 10 مل الماصة البلاستيكية.
  6. قسامة 2 مل تعليق خلية في جديدة 35 مم 2 أطباق والعودة إلى الحاضنة.

10. يوم 8: تغيير وسائل الإعلام (التفاضل وسائل الإعلام رقم 2)

  1. إضافة RA (انظر <قوي> الجدول 1) إلى درجة حرارة والمتوازنة سائل الاعلام على الفور قبل أن يضيف وسائل الإعلام إلى الأطباق.
  2. نضح بلطف وسائل الإعلام القديمة والتخلص منها.
  3. ببطء إضافة 2 مل التمايز وسائل الإعلام # 2 (انظر الجدول 2) مع التهاب المفاصل الروماتويدي في 35 ملم 2 طبق والعودة إلى الحاضنة. لا تسمح الخلايا العصبية إلى أن يتعرض للهواء لفترة طويلة من الزمن لأنها يمكن أن تجف بسرعة.

11. يوم 9: إعداد مصفوفة خارج الخلية (ECM) أطباق المغلفة

  1. ذوبان الجليد قارورة واحدة من حل ECM على الجليد وتمييع 1: 100 في DMEM البارد.
  2. الاستغناء 2 مل من الخليط في كل طبق 35 مم 2 وضمان تغطية قاعدة كاملة من الطبق.
  3. مكان في حاضنة (37 درجة مئوية، و 5٪ CO 2) لمدة 1 ساعة أو بين عشية وضحاها.
  4. خليط نضح والسماح للهواء الجاف لحوالي 1 ساعة في غطاء محرك السيارة. تخزين في درجة حرارة الغرفة لمدة تصل إلى 2 أشهر.

12. يوم 10: نقل الخلايا علىECM لوحات المغلفة 1: 1

  1. إضافة RA (انظر الجدول 1) إلى درجة حرارة وسائل الإعلام معايرتها على الفور قبل أن يضيف وسائل الإعلام إلى الأطباق.
  2. نضح بلطف وسائل الإعلام وتجاهل.
  3. إضافة 200 ميكرولتر حرارة التربسين إلى كل طبق 35 مم 2، والسماح لاحتضان في درجة حرارة الغرفة لحوالي 1-2 دقائق أو حتى يتم رفع الخلايا العصبية بشكل واضح من الطبق كما لوحظ تحت المجهر.
    ملاحظة: تنفيذ هذه الخطوة trypsinization في درجة حرارة الغرفة حتى لا تفرط في احتضان الخلايا العصبية مع التربسين وتسبب ضررا. الافراج عن الخلايا العصبية من لوحات أسرع بكثير من الخلايا مثل الخلايا الظهارية في هذه المرحلة.
  4. إخماد التربسين بإضافة 2 مل التمايز وسائل الإعلام # 2 في 35 ملم 2 طبق واستخدام وسائل الإعلام لشطف الخلايا العصبية المتبقية من لوحة. ثم نقل المحتويات إلى أنبوب مخروطي 50 مل.
  5. الجمع بين محتويات من ما يصل الى 10 أطباق في 50 مل أنبوب مخروطي الشكل ويسحن بلطف ببطء صعودا ونزولا لا يزيد عن خمس مرات مع10 مل الماصة البلاستيكية.
  6. الاستغناء 2 مل تعليق خلية إلى 35 مم 2 أطباق المغلفة ECM والعودة إلى الحاضنة.

13. يوم 11: تغيير وسائل الإعلام (التفاضل وسائل الإعلام رقم 3)

  1. إضافة RA (انظر الجدول 1) إلى درجة حرارة وسائل الإعلام معايرتها على الفور قبل أن يضيف وسائل الإعلام إلى الأطباق.
  2. نضح بلطف وسائل الإعلام القديمة والتخلص منها.
  3. ببطء إضافة 2 مل التمايز وسائل الإعلام # 3 (انظر الجدول 2) مع التهاب المفاصل الروماتويدي في 35 ملم 2 طبق والعودة إلى الحاضنة. لا تسمح الخلايا العصبية إلى أن يتعرض للهواء لفترة طويلة من الزمن.

14. يوم 14: تغيير وسائل الإعلام (التفاضل وسائل الإعلام رقم 3)

  1. كرر القسم 13 (الخطوات 1-3)

15. يوم 17: نشاط تغيير وسائل الإعلام (التفاضل وسائل الإعلام رقم 3)

  1. كرر القسم 13 (الخطوات 1-3)

16. يوم 18: الثقافات العصبية جاهزة للاستخدام

  1. تغيير وسائل الإعلام إلى الفرق العذبةerentiation وسائل الإعلام رقم 3 مع RA كل 3 أيام للحفاظ على صحة الخلايا العصبية.
    ملاحظة: يجب التفريق بين الخلايا إلى الخلايا العصبية ويحمل النمط الظاهري العصبية. الثقافات مستقرة عادة لمدة تصل إلى 14 يوما التالية التمايز المحطة، ولكن مدة بقاء الخلايا العصبية تعتمد على عدد مرور خلايا غير متمايزة في بداية التمايز. أرقام مرور ارتفاع العائد الخلايا العصبية متباينة مع عمر المفيد أقصر.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

في الوقت الحاضر، هناك العديد من الحالات في مجال علم الأعصاب وneurovirology حيث يتم استخدام الخلايا SH-SY5Y غير متمايزة كنموذج عملي لالخلايا العصبية البشرية 27-36، والأهم من ذلك، خلايا غير متمايزة قد تفتقر الظواهر مثل الأمثل امتصاص الفيروسي 2 التي هي ضرورة التفسير الدقيق. ومن الأهمية بمكان أن عند استخدام الخلايا SH-SY5Y أو أي دولة أخرى في المختبر نظام الخلايا العصبية، والتفريق بين الخلايا بشكل مناسب في الخلايا العصبية، من أجل الحصول على البيانات التي ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

وينص البروتوكول أعلاه طريقة واضحة وقابلة للتكرار لتوليد الخلايا العصبية الثقافات البشرية متجانسة وقابلة للحياة. هذا البروتوكول يستخدم التقنيات والممارسات التي تدمج العديد من الطرق التي نشرت سابقا 1-4 والأهداف لتحديد أفضل الممارسات من كل. تمايز الخلايا SH-SY5Y يعتمد على الحرمان المصل بشكل تدريجي، إضافة حمض الريتينويك، عوامل عصبية والبروتينات المصفوفة خارج الخلية. وتقسيم التسلسلي لتحديد لالخلايا العصبية ملتصقة ناضجة متباينة. يبدأ هذا الخط الخلية على أنها السكان غير متجانس...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

نحن ممتنون لمساهمات يولاندا تافوري في تحسين ظروف تمايز SH-SY5Y ، ولدعم الدكتورة لين إنكويست ، التي بدأ هذا العمل في مختبرها. ساهم Y. Tafuri في الصور الموضحة في الشكل 3. تم دعم هذا العمل من قبل مركز موارد المعلوماتية الحيوية لموارد مسببات الأمراض بالفيروسات NIH-NIAID (ViPR) (MLS و L. Enquist) و K22 AI095384 (MLS).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
B-27ThermoFisher Scientific17504-044انظر <قوي>الجدول 1< / قوي> لتحضير
عامل التغذية العصبية المشتق من الدماغ (BDNF)سيجماSRP3014 (10 & mu; ز) / B3795 (5 & mu ؛ ز)انظر <قوي>الجدول 1 لتحضير
ديبوتيريل AMP الدوري (ديسيبل-cAMP)SigmaD0627انظر <قوي>الجدول 1 لتحضير
DMSOATCC4-X-Minimum
Essential Essential Medium Eagle (EMEM)SigmaM5650-Fetal
Bovine Serum (FBS) HycloneSH30071.03انظر <قوي>الجدول 1< / قوي> للتحضير
GlutamaxILife Technologies35050-061-Glutamine
HycloneSH30034.01-Potassium
Chloride (KCl)FisherScientificBP366-1انظر <قوي>الجدول 1< قوي> لتحضير
محلول MaxGel Extracell Matrix (ECM)SigmaE0282انظر الخطوة 11 من بروتوكول
NeurobasalLifeTechnologies 21103-049-Penicillin
/ Streptomycin (Pen / Strep)LifeTechnologies15140-122-Retinoic
acid (RA)SigmaR2625يجب تخزينها في الظلام عند 4 درجات ؛ C لأن هذا الكاشف حساس للضوء
SH-SY5Y CellsATCCCRL-2266-0.5
٪ Trypsin + EDTALife Technologies15400-054-Falcon
35 مم أطباق TCFalcon (ماركة Corning)353001-

المراجع

  1. Christensen, J., Steain, M., Slobedman, B., Abendroth, A. Differentiated Neuroblastoma Cells Provide a Highly Efficient Model for Studies of Productive Varicella-Zoster Virus Infection of Neuronal Cells. Journal of Virology. 85 (16), 8436-8442 (2011).
  2. Gimenez-Cassina, A., Lim, F., Diaz-Nido, J. Differentiation of a human neuroblastoma into neuron-like cells increases their susceptibility to transduction by herpesviral vectors. Journal of Neuroscience Research. 84 (4), 755-767 (2006).
  3. Biedler, J. L., Roffler-Tarlov, S., Schachner, M., Freedman, L. S. Multiple Neurotransmitter Synthesis by Human Neuroblastoma Cell Lines and Clones. Cancer Research. 38 (11 Pt 1), 3751-3757 (1978).
  4. Encinas, M., Iglesias, M., et al. Sequential Treatment of SH-SY5Y Cells with Retinoic Acid and Brain-Derived Neurotrophic Factor Gives Rise to Fully Differentiated, Neurotrophic Factor-Dependent, Human Neuron-Like Cells. Journal of Neurochemistry. 75 (3), 991-1003 (2000).
  5. Otey, C. A., Boukhelifa, M., Maness, P. B35 neuroblastoma cells: an easily transfected, cultured cell model of central nervous system neurons. Methods in Cell Biology. 71, 287-304 (2003).
  6. LePage, K. T., Dickey, R. W., Gerwick, W. H., Jester, E. L., Murray, T. F. On the use of neuro-2a neuroblastoma cells versus intact neurons in primary culture for neurotoxicity studies. Critical Reviews in Neurobiology. 17 (1), 27-50 (2005).
  7. Shafer, T. J., Atchison, W. D. Transmitter, ion channel and receptor properties of pheochromocytoma (PC12) cells: a model for neurotoxicological studies. Neurotoxicology. 12 (3), 473-492 (1991).
  8. Yue, F., Cheng, Y., et al. A comparative encyclopedia of DNA elements in the mouse genome. Nature. 515 (7527), 355-364 (2014).
  9. Cheng, Y., Ma, Z., et al. Principles of regulatory information conservation between mouse and conservation between mouse and human. Nature. 515 (7527), 371-375 (2014).
  10. Stergachis, A. B., Neph, S., et al. Conservation of trans-acting circuitry during mammalian regulatory evolution. Nature. 515 (7527), 365-370 (2014).
  11. Lin, S., Lin, Y., et al. Comparison of the transcriptional landscapes between human and mouse tissues. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (48), 17224-17229 (2014).
  12. Coyle, D. E., Li, J., Baccei, M. Regional Differentiation of Retinoic Acid-Induced Human Pluripotent Embryonic Carcinoma Stem Cell Neurons. PLoS ONE. 6 (1), e16174(2011).
  13. Mostert, M. M., van de Pol, M., et al. Fluorescence in situ hybridization-based approaches for detection of 12p overrepresentation, in particular i(12p), in cell lines of human testicular germ cell tumors of adults. Cancer Genetics and Cytogenetics. 87 (2), 95-102 (1996).
  14. Hu, B. -Y., Weick, J. P., et al. Neural differentiation of human induced pluripotent stem cells follows developmental principles but with variable potency. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (9), 4335-4340 (2010).
  15. Biedler, J. L., Helson, L., Spengler, B. A. Morphology and growth, tumorigenicity, and cytogenetics of human neuroblastoma cells in continuous culture. Cancer Research. 33 (11), 2643-2652 (1973).
  16. Påhlman, S., Ruusala, A. I., Abrahamsson, L., Mattsson, M. E., Esscher, T. Retinoic acid-induced differentiation of cultured human neuroblastoma cells: a comparison with phorbolester-induced differentiation. Cell Differentiation. 14 (2), 135-144 (1984).
  17. Xie, H., Hu, L., Li, G. SH-SY5Y human neuroblastoma cell line: in vitro cell model of dopaminergic neurons in Parkinson’s disease. Chinese Medical Journal. 123 (8), 1086-1092 (2010).
  18. Kovalevich, J., Langford, D. Considerations for the use of SH-SY5Y neuroblastoma cells in neurobiology. Methods in Molecular Biology. 1078, Clifton, N.J. 9-21 (2013).
  19. Påhlman, S., Hoehner, J. C., et al. Differentiation and survival influences of growth factors in human neuroblastoma. European Journal of Cancer. 31 (4), 453-458 (1995).
  20. Cheung, Y. -T., Lau, W. K. -W., et al. Effects of all-trans-retinoic acid on human SH-SY5Y neuroblastoma as in vitro model in neurotoxicity research. Neurotoxicology. 30 (1), 127-135 (2009).
  21. Agholme, L., Lindström, T., Kågedal, K., Marcusson, J., Hallbeck, M. An in vitro model for neuroscience: differentiation of SH-SY5Y cells into cells with morphological and biochemical characteristics of mature neurons. Journal of Alzheimer's disease: JAD. 20 (4), 1069-1082 (2010).
  22. La Monica, N., Racaniello, V. R. Differences in replication of attenuated and neurovirulent polioviruses in human neuroblastoma cell line SH-SY5Y. Journal of Virology. 63 (5), 2357-2360 (1989).
  23. Cordey, S., Petty, T. J., et al. Identification of Site-Specific Adaptations Conferring Increased Neural Cell Tropism during Human Enterovirus 71 Infection. PLoS Pathog. 8 (7), e1002826(2012).
  24. Xu, L. -J., Jiang, T., et al. Global Transcriptomic Analysis of Human Neuroblastoma Cells in Response to Enterovirus Type 71 Infection. PLoS ONE. 8 (7), e65948(2013).
  25. Luo, M. H., Fortunato, E. A. Long-term infection and shedding of human cytomegalovirus in T98G glioblastoma cells. Journal of Virology. 81 (19), 10424-10436 (2007).
  26. Sun, Z., Yang, H., Shi, Y., Wei, M., Xian, J., Hu, W. Establishment of a cell model system of herpes simplex virus type II latent infection and reactivation in SH-SY5Y cells. Wei Sheng Wu Xue Bao = Acta Microbiologica Sinica. 50 (1), 98-106 (2010).
  27. Yun, S. -I., Song, B. -H., et al. A molecularly cloned, live-attenuated japanese encephalitis vaccine SA14-14-2 virus: a conserved single amino acid in the ij Hairpin of the Viral E glycoprotein determines neurovirulence in mice. PLoS pathogens. 10 (7), e1004290(2014).
  28. Garrity-Moses, M. E., Teng, Q., Liu, J., Tanase, D., Boulis, N. M. Neuroprotective adeno-associated virus Bcl-xL gene transfer in models of motor neuron disease. Muscle & Nerve. 32 (6), 734-744 (2005).
  29. Kalia, M., Khasa, R., Sharma, M., Nain, M., Vrati, S. Japanese Encephalitis Virus Infects Neuronal Cells through a Clathrin-Independent Endocytic Mechanism. Journal of Virology. 87 (1), 148-162 (2013).
  30. Haedicke, J., Brown, C., Naghavi, M. H. The brain-specific factor FEZ1 is a determinant of neuronal susceptibility to HIV-1 infection. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (33), 14040-14045 (2009).
  31. Xu, K., Liu, X. -N., et al. Replication-defective HSV-1 effectively targets trigeminal ganglion and inhibits viral pathopoiesis by mediating interferon gamma expression in SH-SY5Y cells. Journal of molecular neuroscience: MN. 53 (1), 78-86 (2014).
  32. Oh, J., Fraser, N. W. Temporal association of the herpes simplex virus genome with histone proteins during a lytic infection. Journal of Virology. 82 (7), 3530-3537 (2008).
  33. Stiles, K. M., Milne, R. S. B., Cohen, G. H., Eisenberg, R. J., Krummenacher, C. The herpes simplex virus receptor nectin-1 is down-regulated after trans-interaction with glycoprotein D. Virology. 373 (1), 98-111 (2008).
  34. Thomas, D. L., Lock, M., Zabolotny, J. M., Mohan, B. R., Fraser, N. W. The 2-kilobase intron of the herpes simplex virus type 1 latency-associated transcript has a half-life of approximately 24 hours in SY5Y and COS-1 cells. Journal of Virology. 76 (2), 532-540 (2002).
  35. Handler, C. G., Cohen, G. H., Eisenberg, R. J. Cross-linking of glycoprotein oligomers during herpes simplex virus type 1 entry. Journal of Virology. 70 (9), 6076-6082 (1996).
  36. Nicola, A. V., Hou, J., Major, E. O., Straus, S. E. Herpes Simplex Virus Type 1 Enters Human Epidermal Keratinocytes, but Not Neurons, via a pH-Dependent Endocytic Pathway. Journal of Virology. 79 (12), 7609-7616 (2005).
  37. Korecka, J. A., van Kesteren, R. E., et al. Phenotypic characterization of retinoic acid differentiated SH-SY5Y cells by transcriptional profiling. PloS One. 8 (5), e63862(2013).
  38. Presgraves, S. P., Ahmed, T., Borwege, S., Joyce, J. N. Terminally differentiated SH-SY5Y cells provide a model system for studying neuroprotective effects of dopamine agonists. Neurotoxicity Research. 5 (8), 579-598 (2004).
  39. Qiao, J., Paul, P., et al. PI3K/AKT and ERK regulate retinoic acid-induced neuroblastoma cellular differentiation. Biochemical and Biophysical Research Communications. 424 (3), 421-426 (2012).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

استكشف المزيد من المقالات

تمايز SH-SY5Yزراعة عصبونات بشريةتجويع من المصلبروتينات المصفوفة خارج الخلويةعوامل التغذية العصبيةتريبسين EDTAأوساط التمايزأطباق مغلفة بالمصفوفة خارج الخلويةالتمايز النهائي
التفريق بين الخط خلية SH-SY5Y العصبية الإنسان
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.