عن طريق عزل الميتوكوندريا من كميات الحد الأدنى من الفأر العضلات الهيكلية لارتفاع صفيحة ميكروسكوبية الإنتاجية قياسات الجهاز التنفسي

ملخص

توفر الطرق المقدمة إرشادات خطوة بخطوة لأداء مجموعة من فحوصات قياس التنفس القائمة على الصفيحة الدقيقة باستخدام الميتوكوندريا المعزولة من كميات قليلة من عضلات الهيكل العظمي للفأر. هذه المقايسات قادرة على قياس التغيرات / التكيفات الميكانيكية في استهلاك الأكسجين في الميتوكوندريا في نموذج حيواني شائع الاستخدام.

الملخص

تلعب الميتوكوندريا العضلية الهيكلية دورا محددا في العديد من أمراض الأمراض. على هذا النحو ، أصبح قياس استهلاك الأكسجين كمؤشر لوظيفة الميتوكوندريا في هذا النسيج أكثر انتشارا. على الرغم من وجود العديد من التقنيات والمقايسات التي تقيس مسارات الجهاز التنفسي للميتوكوندريا في مجموعة متنوعة من الخلايا والأنسجة والأنواع ، إلا أن هناك حاليا فراغا في الأدبيات فيما يتعلق بتجميع هذه المقايسات باستخدام الميتوكوندريا المعزولة من عضلة الهيكل العظمي للفأر لاستخدامها في التقنيات القائمة على الصفيحة الدقيقة. الأهم من ذلك ، أن استخدام فحوصات قياس التنفس القائمة على الصفيحة الدقيقة يتزايد بين علماء الأحياء في الميتوكوندريا لأنه يسمح بقياسات إنتاجية عالية باستخدام كميات قليلة من الميتوكوندريا المعزولة. لذلك ، تم تطوير مجموعة من المقايسات التنفسية القائمة على الصفيحة الدقيقة القادرة على تقييم التغييرات / التكيفات الميكانيكية في استهلاك الأكسجين في نموذج حيواني شائع الاستخدام. توفر الطرق المعروضة هنا إرشادات خطوة بخطوة لإجراء هذه المقايسات بكمية مثالية من بروتين الميتوكوندريا والكواشف ، ودقة عالية كما يتضح من الحد الأدنى من التباين عبر النطاق الديناميكي لكل فحص.

المقدمة

دور الفسيولوجية الرئيسي الميتوكوندريا العضلات والهيكل العظمي هو إنتاج ATP من الفسفرة التأكسدية ^1. الأهم من ذلك، الميتوكوندريا العضلات والهيكل العظمي دورا محددا في القدرة على ممارسة الرياضة ^2، والشيخوخة ^3، الأمراض التنكسية ^{(4) والنوع} الثاني من مرض السكري ^5. كما مجتمع الشيخوخة، والسكري من النوع الثاني يكون السبب الرئيسي ^ال 7 للوفاة في الولايات المتحدة ^6، أصبحت الحاجة إلى أساليب التي تقيم وظيفة الميتوكوندريا على نحو متزايد أكثر انتشارا في البحوث الطبية الحيوية ^7،8. على وجه التحديد، وقياس استهلاك الأوكسجين له فائدة استثنائية في تقييم وظيفة الميتوكوندريا لأنها تمثل وظيفة منسقة بين جينوم الميتوكوندريا والنووية للتعبير عن المكونات الوظيفية لالفسفرة التأكسدية ^9.

العديد من التقنيات موجودة والتي تمكن من قياس استهلاك الأوكسجين في خلايا سليمة وعزلد الميتوكوندريا ^7-10. وبالإضافة إلى ذلك، تم تطوير فحوصات لأنواع خلايا متعددة والأنسجة، ومجموعة متنوعة من الأنواع التي تسمح لقياس مسارات الميتوكوندريا والتحكم في الجهاز التنفسي ^9،11،12. ومع ذلك، لا يوجد حاليا فراغا في الأدب في ما يخص تجميع كل هذه المقايسات باستخدام الميتوكوندريا المعزولة من الماوس العضلات والهيكل العظمي لاستخدامها في تقنيات استهلاك الأوكسجين صفيحة ميكروسكوبية القائمة. الأهم من ذلك، استخدام صفيحة ميكروسكوبية مقرها المقايسات respirometric ينمو بين علماء الأحياء الميتوكوندريا ويسمح لقياس إنتاجية عالية باستخدام كميات ضئيلة من الميتوكوندريا معزولة ^9. لذلك، وضعت مجموعة من صفيحة ميكروسكوبية مقرها المقايسات respirometric التي تسمح التحديد الدقيق من حيث تشوهات و / أو التعديلات قد تحدث في سلسلة نقل الإلكترون (ETC). وبالإضافة إلى ذلك، تم تطوير تحليلين respirometric صفيحة ميكروسكوبية إضافية على أساس أن تمكين تقييم التنسيق بين هذا وذاكن الثلاثي الكربوكسيل حمض (TCA) دورة وETC، وبين ß للأكسدة والخ. الأهم من ذلك أن الأساليب المقدمة توفر وسيلة واضحة وموجزة لقياس التغيرات الميكانيكية في وظيفة الميتوكوندريا في نموذج حيواني تستخدم عادة.

البروتوكول

ملاحظة: يبدأ هذا البروتوكول بعد واحد قد عزل الميتوكوندريا من عضلات الهيكل العظمي الأحمر. تم عزل الميتوكوندريا كما هو موضح سابقا من ~ 75-100 ملغ من الهيكل العظمي والعضلات الحمراء ^(13). بين 5 - سيتحقق 10 ميكروغرام / ميكرولتر من البروتين الميتوكوندريا من هذا المبلغ من الأنسجة عن طريق إعادة التعليق على بيليه النهائي الميتوكوندريا في ≤50 ميكرولتر من العازلة عزل الميتوكوندريا (IBM) 2 (انظر Frisard وآخرون ^13).

1. إعداد

1. إعداد العمل حلول الأوراق المالية (الجدول 1) والحل فحص الميتوكوندريا (MAS) يمزج (الجدول 2) لفحوصات لاحقة.
   ملاحظة: يمكن أن يتم معظم التحضير للفحوصات مقدما لأن معظم الحلول الأسهم وMAS يمكن تخزينها.
2. هيدرات خرطوشة فحص respirometric في 1 مل من محلول المعايرة في الليلة التي سبقت التجربة في غير _CO-2 حاضنة عند 37 درجة مئوية.
3. في يوم من التجربة، رأك من الأسهم المجمدة (ركائز وجهري الميتوكوندريا، MAS المزيج، MAS ث / س BSA، الجدول 1)، وذوبان الجليد في 37 ° C حمام أو الحاضنة.
4. إعداد جميع الحلول الركيزة (الجدول 3) والحقن (الجدول 4-5) وضبط درجة الحموضة كما هو مطلوب (7.4 درجة الحموضة). بعد يتم ضبط درجة الحموضة، وتخزين على الجليد.
5. برنامج متعدد جيدا آلة قياس استهلاك الأوكسجين إلى المزيج الصحيح، الانتظار، والمعلمات قياس (انظر الجدول 6) والخلفية التسمية ومجموعة / حالة الآبار عن طريق إدخال أول برنامج التحليل، يليه وضع "ستاندرد".
   1. الدخول في منتدى "ضيف" وانقر على "معالج الفحص". مرة واحدة في "معالج الفحص"، انقر على "بروتوكول" لتغيير المزيج، الانتظار، وقياس المعلمات. تسمية الآبار الخلفية تحت عنوان "عودة. تصحيح "علامة التبويب وتأكد لتسليط الضوء على" هل تصحيح الخلفية ".
   2. التسمية كوندitions عن طريق النقر الأول على "المجموعات وتسميات" علامة التبويب، تليها "مجموعة معلومات" علامة التبويب. بعد أن يتم إدخال هذه المعلمات، انقر فوق "إنهاء"، تليها "حفظ القالب".

2. الفحص تشغيل

1. تحميل حلول الحقن في مقايسة خرطوشة تشغيل وبدء المعايرة عن طريق إدخال أول برنامج التحليل، يليه دخول وضع "عادي". الدخول في منتدى "ضيف". فتح القالب المحفوظة في الخطوة 1.5 تحت "XF" حملة تحت "قوالب" علامة التبويب. مرة واحدة مفتوحة، انقر على زر "ابدأ" لبدء المعايرة.
   ملاحظة: يجب إدخال خرطوشة المدى الفحص في الجهاز مع الزاوية حقق إلى أسفل اليسار. وهذا يستغرق حوالي 30 دقيقة. الحرص على حقن الحلول في المنافذ المناسبة. وترد الحقن في الجدول 4-5 في ترتيب التحميل.
2. بلطف، ولكن مزيج دقيق mitochondالأوراق المالية ريا عن طريق اثارة الحل مع ماصة 200 ميكرولتر، تليها الطحن بلطف الأسهم مع ماصة 200 ميكرولتر التي تمت زيارتها فتحتها اتسعت عن طريق خفض ~ 3 ملم من نهاية طرف مع مقص.
3. إجراء حمض bicinchoninic (BCA) فحص لتحديد تركيز البروتين في الأوراق المالية الميتوكوندريا.
4. باستخدام تركيز الأسهم المكتسبة من الخطوة 2.3، و resuspend 10 ميكروغرام من البروتين الميتوكوندريا / 200 ميكرولتر من مزيج الركيزة سوسينات / روتينون (الجدول 3). و resuspend 14 ميكروغرام من البروتين الميتوكوندريا / 200 ميكرولتر من تبقى يمزج الركيزة (يجب أن يتم هذا لكل مزيج الركيزة) (الجدول 3). وضع كل من البروتين الميتوكوندريا / الركيزة تختلط على الجليد.
   ملاحظة: تم تحديد المبلغ الأمثل للالميتوكوندريا البروتين لكل بئر لكل مقايسة كما هو موضح سابقا ^9. تقرر أن البيروفات / مالات، بالميتويل الكارنيتين / مالات، الغلوتامات / مالات لد المقايسات تدفق الإلكترونات تستخدم 3.5 ميكروغرام من البروتين الميتوكوندريا، في حين يستخدم الفحص سوسينات / روتينون 2.5 ميكروغرام من البروتين الميتوكوندريا لكل بئر. ولذلك، يحتاج الباحث ل resuspend ما يكفي من البروتين الميتوكوندريا لمدة 4 يعيد في هذه الخطوة منذ إما 2.5 ميكروغرام أو يتم تحميل 3.5 ميكروغرام في 50 ميكرولتر لكل بئر (انظر الخطوة 2.6).
5. مزيج الحلول الميتوكوندريا / الركيزة بلطف، ولكن بدقة عن طريق اثارة الحل مع ماصة 200 ميكرولتر، تليها الطحن بلطف الأسهم مع ماصة 200 ميكرولتر التي تمت زيارتها ~ 3 ملم من نهايته قطع.
6. وضع لوحة الثقافة الخلية على الجليد وفي ثلاث نسخ، تحميل 50 ميكرولتر / جيد لكل من يمزج الميتوكوندريا / الركيزة. المطورين من صفيحة ميكروسكوبية أساس مقايسة respirometric نوصي ترك ما لا يقل عن اثنين فارغة (لا الميتوكوندريا) بئرا، ويفضل على جانبي على لوحة ثقافة الخلية.
7. تدور لوحة الثقافة الخلية في 2000 ز لمدة 20 دقيقة على 4 درجات مئوية. في حين أن لوحة هي الصورةتعلق، الاحماء الحلول الركيزة في حمام مائي 37 ° C.
8. بعد زيادة ونقصان كاملة، تحميل بعناية 450 ميكرولتر من كل حل الركيزة على رأس الآبار الخاصة به (أي تحميل البيروفات / الركيزة مالات إلى الآبار التي تحتوي على الميتوكوندريا معلق في البداية في هذا الحل الركيزة). تأكد من تحميل لوحة في RT. ملاحظة: يجب أن يتم تحميل الآبار فارغة مع 500 ميكرولتر من الركيزة. آبار فارغة مخصصة لالإلكترون تدفق الفحص يجب أن يتم تحميل مع الركيزة تدفق الإلكترونات (البيروفات / مالات + FCCP)، في حين أن الفحص إلى جانب الآبار فارغة يمكن تحميلها مع أي الركيزة اقتران الفحص.
   ملاحظة: إذا كان أداء المقايسات تدفق المترابطة والإلكترون على نفس لوحة، ويجب على الباحث إعادة تعيين الآبار الخلفية لفحوصات منها بعد تشغيل فحص اكتمال باستخدام منصة "XF قارئ" عبر برنامج "الصك" علامة التبويب. مرة واحدة في الإعداد "الصك"، انقر على "الإدارة"علامة التبويب، تلاه سهم "تصحيح الخلفية". ضرب "إنهاء وضع الإعداد الصك" عند اكتماله. وذلك لأن الجمع بين أسكوربات / TMPD يمكن أن تستهلك _O 2، وبالتالي لا بد من تصحيح خلفية منفصلة لكل نوع الفحص.
9. بعد إضافة ميكرولتر 450 من الركيزة إلى كل بئر، عرض طبقة من الميتوكوندريا في البئر لضمان فرقت الميتوكوندريا بالتساوي في أحادي الطبقة واحدة (20X التكبير [انظر روجرز ^9، الشكل 4]). الآبار التي لا يبدو أن لها أحادي الطبقة موزعة بالتساوي يمكن إزالة اللاحق.
10. بعد التحقق من الالتزام الميتوكوندريا، إدراج صفيحة ميكروسكوبية إلى أداة فحص respirometric وبدء فحص تشغيل بالنقر على "OK".
    ملاحظة: يجب أن تكون معايرة من الخطوة 2.1 كاملة قبل سيبدأ التشغيل. وبمجرد أن ينقر الباحث "موافق"، فإن آلة إخراج لوحة الأداة التي كانت تستخدم لمعايرة.
    <لى> إزالة لوحة المرافق ووضع لوحة ثقافة الخلية التي تحتوي على الميتوكوندريا على الدرج. يجب وضع الشق الأزرق على لوحة زراعة الخلايا في أسفل الزاوية اليسرى من الدرج. انقر على "متابعة" لبدء تشغيل الفحص.
11. بعد تشغيل كاملة، إخراج لوحة خلية ثقافة وخرطوشة عن طريق الضغط على "إخراج" على الشاشة.
    1. مرة واحدة يتم إخراج لوحة، وإزالة والتخلص من لوحة خلية ثقافة وخرطوشة وانقر على "متابعة" على الشاشة. سيتم حفظها على المدى تلقائيا ملف .xls في ملف "بيانات".
12. فتح هذا الملف وتغيير العرض من "O2" إلى "OCR" عن طريق ضرب السهم نحو الانخفاض تحت "Y1:" علامة.
    1. التغيير القادم "الشرق بوينت" إلى "نقطة إلى نقطة الاسعار" تحت عنوان "معدل البيانات المعروض ك:" الخيار. انقر على زر "موافق" لتطبيق هذه التغييرات.
13. انقر على "وضع مجموعة حسنا" علامة على الجزء السفلي الأيسر من الشاشة لآبار مجموعة من الظروف المتشابهة معا. وأخيرا، انقر فوق "متوسط ​​العينة / معيار الخطأ" علامة التبويب نحو منتصف الشاشة، إلى اليسار. بدلا من ذلك، يمكن لهذه الأوامر يكون الإعداد قبل أن يبدأ الفحص في الإعداد "معالج الفحص".
    ملاحظة: كل حالة سيكون له يعني ± الانحراف المعياري عرض لكل معدل وكل حالة. هناك قياسات معدل اتخاذها في حالة (حالة 2 [اقتران] / State3u [الكترون تدفق] التنفس تليها أربع حقن). استخدام متوسط ​​معدل الدولة 2 من القياس الثاني، تحديد الدولة 4O في الدنيا نقطة بعد أوليغوميسين الحقن، واستخدام أقصى نقطة للدولة 3 و3U الدولة بعد ADP وحقن FCCP، على التوالي، واستخدام الحد الأدنى من نقطة لAntimycin A التنفس التي يسببها للفحوصات اقتران. استخدام نقطة القصوى لالبيروفات / مالات يسببها الدولة 3U التنفس، واستخدام الحد الأدنىنقطة لروتينون الناجم عن التنفس، واستخدام أقصى نقطة لسوسينات يسببها 3U الدولة التنفس، واستخدام نقطة الحد الأدنى لAntimycin A التنفس التي يسببها للمقايسة الكترون التدفق. أجريت جميع التجارب 3 مرات والبيانات الواردة هي نتائج البحث عن المفقودين تمثيلي.

النتائج

يمثل الرقم 1 معدلات استهلاك الأوكسجين (OCR) لالبيروفات / مالات، سوسينات / روتينون، بالميتويل الكارنيتين / مالات، والغلوتامات / المقايسات مالات (اقتران فحوصات). يتم عرض هذه اقتفاء أثر الفحص كما الأوكسجين معدل استهلاك، أو OCR، مقابل الوقت، والخلفية correceted، ويتم عرضها كما من نقطة إلى نقطة أسعار الفائدة. وتمثل كل لوحة استهلاك الأوكسجين في الدول الميتوكوندريا مختلفة كما وصفها فرصة ويليامز ^14. تمثل الفريق الأول استهلاك الأوكسجين القاعدية، أو دولة 2. لوحة الثانية، بعد حقن ADP، تمثل القصوى إلى جانب التنفس، أو دولة 3. لوحة ثالثة، بعد حقن أوليغوميسين A (مثبط لمجمع V)، تمثل التنفس المناسب تسرب بروتون، أو دولة 4O. لوحة الرابعة، بعد حقن FCCP، يمثل القصوى التنفس وفكت أو 3U الدولة. وأخيرا، لوحة الخامسة، بعد حقن Antimycin A، يمثل تثبيط الأكسدة التنفس. والجدير بالذكر أن آلل الدول الميتوكوندريا لديها الحد الأدنى من الانحراف المعياري. ويرجع ذلك إلى خلط دقيق للسهم الميتوكوندريا ويمزج الميتوكوندريا / الركيزة، وتحقيق أحادي الطبقة واحدة من الميتوكوندريا بعد زيادة ونقصان الالتزام (الخطوة 2.6) هذا. من ناحية أخرى، وتحميل الميتوكوندريا غير متكافئة في كل بئر وليس تحقيق أحادي الطبقة واحدة من الميتوكوندريا في البئر للصفيحة ميكروسكوبية يؤدي إلى زيادة الانحراف المعياري في كل ولاية كما هو معروض في الشكل 2.

اقتفاء أثر في الشكل 1 عرض الهضاب لكل دولة الميتوكوندريا ولكل الركيزة. الهضبة يبلغوا بعد دورتين قياس جودة تشير الميتوكوندريا جيدة وأن الميتوكوندريا لا تزال تتمسك جيدا طوال فترة الفحص. وبالإضافة إلى ذلك، فإن تحقيق استقرت معدلات القصوى قد تكون أكثر من المرغوب فيه لأن هذا يسمح للباحث أن يأخذ متوسط ​​OCR في هذه الدول الميتوكوندريا، مما يقلل من التحيز التي قد تحدثعن طريق اختيار تعسفي نقطة.

تم تحديد مبلغ الميتوكوندريا لكل بئر من قبل محاكمات الأمثل. مبلغ الأمثل للالميتوكوندريا لكل بئر ينبغي أن يؤدي إلى حالة 2 معدلات بين 100-200 بمول / دقيقة / جيد والدولة 3 معدلات <1500 بمول / دقيقة / جيد، لأن هذه القيم هي ضمن نطاق الاستشعار الأوكسجين الحيوي من الأكسجين متعددة جيدا استهلاك آلة القياس. تحميل الكثير من البروتين الميتوكوندريا لكل بئر قد يؤدي إلى OCRs خارج النطاق الديناميكي للأداة (الشكل 3A). الشكل 3 يصور تحميل 3.5 ميكروغرام من الميتوكوندريا البروتين لكل بئر (تتبع الأزرق) مقارنة مع التحميل 2.5 ميكروغرام من البروتين الميتوكوندريا لكل بئر (الأحمر البحث عن المفقودين) لفحص سوسينات / روتينون. يمكن تحميل الكثير من البروتين الميتوكوندريا لكل بئر يؤدي أيضا إلى استنفاد الأكسجين داخل microchamber من البئر، وبالتالي منع القياس الدقيق للOCR لكل قياس التوالي ⁹ (الشكل 3B </ قوي>). نقطة إلى نقطة OCR هو سعر الفوري للتغيير OCR. إذا شقة، وOCR هو ثابت / مستقر، ولكن إذا تناقص، ثم قد تكون هناك مشكلة بيولوجية أو التقنية. ويتسبب الانخفاض الحاد في التعرف الضوئي على الحروف في الدولة 3 والتنفس 3U الدولة (الشكل 3A) من الميتوكوندريا استنفاد امدادات الاوكسجين قبل نهاية القياس (الشكل 3B).

ويمثل الرقم 4 OCR مقابل الوقت لفحص تدفق الإلكترونات. يتم تصحيح تتبع وعرضها كما هو موضح الشكل 1. والفريق الأول في هذا الاختبار تمثل التنفس 3U الدولة على البيروفات / مالات عبر I. مجمع على الفريق الثاني، بعد حقن روتينون، يمثل تثبيط مجمع I التنفس بوساطة. لوحة ثالثة، بعد حقن سوسينات، يمثل الركيزة حفز 3U الدولة مع الالكترونات تدخل ETC في مجمع II (مجمع II التنفس بوساطة). لوحة الرابعة، بعد حقن Antimycin A، يمثل تثبيط مجمع III وبالتالي مجموع التنفس. وأخيرا، لوحة الخامسة، بعد حقن أسكوربات / TMPD، يمثل مجمع IV بوساطة التنفس. وعلى غرار اقتفاء أثر في الشكل 1، جميع الدول الميتوكوندريا لديها الحد الأدنى من الانحراف المعياري، ولكل معدل له أو ما يقرب حققت هضبة.

الشكل 1. اقتران فحوصات. (A) 10 ملي البيروفات / 5 ملي مالات، (B) 10 ملي سوسينات / 2 ميكرومتر روتينون، (C) 40 ميكرومتر بالميتويل الكارنيتين / 1 ملم مالات، و (D) 10 مم الغلوتامات / 10 ملم مالات جانب الميتوكوندريا اقتفاء أثر التنفس فحص النحو الذي يحدده قياس متعددة جيدا من استهلاك الأوكسجين. يتم التعبير عن القيم كما يعني ± SD. كان الميتوكوندريا البروتين تحميل لكل بئر 3.5 ميكروغرام لكل المقايسات إلا سوسينات / تعفنenone، الذي يستخدم 2.5 ميكروغرام من البروتين الميتوكوندريا لكل بئر. تمثل البيانات ن = 3 مكررات البيولوجية المقترنة. OCR = معدل استهلاك الأوكسجين. ADP = ثنائي فسفات الأدينوزين. بنسبة ضئيلة = أوليغوميسين A؛ FCCP = الكربونيل cyanide- 4 - (trifluoromethoxy) فينيل هيدرازون. مكافحة A = Antimycin A؛ PYR = البيروفات؛ SUCC = سكسينات؛ ROT = روتنون. PAL-C = بالميتويل الكارنيتين. تخمة = الغلوتامات. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2. متغير بدرجة كبيرة البيروفات / مالات الفحص. متغير بدرجة كبيرة 10 ملي البيروفات / 5 ملي فحص مالات الناجمة عن الاختلاط غير كامل الميتوكوندريا من المخزون الميتوكوندريا في الركيزة / MAS المزيج، مما يؤدي إلى الموالية الميتوكوندريا متغيرالبروتين تحميل في كل بئر. كان الميتوكوندريا البروتين تحميل لكل بئر 3.5 ميكروغرام. تمثل البيانات ن = 3 مكررات البيولوجية المقترنة. OCR = معدل استهلاك الأوكسجين. ADP = ثنائي فسفات الأدينوزين. بنسبة ضئيلة = أوليغوميسين A؛ FCCP = الكربونيل cyanide- 4 - (trifluoromethoxy) فينيل هيدرازون. مكافحة A = Antimycin A؛ PYR = البيروفات. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 3. الزائد الميتوكوندريا البروتين لسكسينات / روتنون الفحص. (A) معدلات استهلاك الأوكسجين خارج النطاق الديناميكي للمتعددة أيضا آلة قياس استهلاك الأوكسجين الناجم عن تحميل 3.5 ميكروغرام من الميتوكوندريا البروتين لكل بئر (تتبع الأزرق) مقارنة مع التحميل 2.5 ميكروغرام من الميتوكوندريا البروتين لكل بئر (تتبع الأحمر). (B ) الثورygen التوتر تقترب من الصفر التالية ADP وحقن FCCP الناجمة عن تحميل البروتين الميتوكوندريا المفرط (3.5 ميكروغرام) لكل بئر (تتبع الأزرق) مقارنة مع تحميل مبلغ الأمثل (2.5 ميكروغرام) من البروتين الميتوكوندريا لكل بئر (تتبع الأحمر). تمثل البيانات ن = 3 مكررات البيولوجية يقترن في الميتوكوندريا كمية البروتين. OCR = معدل استهلاك الأوكسجين. ADP = ثنائي فسفات الأدينوزين. بنسبة ضئيلة = أوليغوميسين A؛ FCCP = الكربونيل cyanide- 4 - (trifluoromethoxy) فينيل هيدرازون. مكافحة A = Antimycin A؛ SUCC = سكسينات؛ ROT = روتنون. _O 2 = الأوكسجين. ملم زئبق = ملليمتر من الزئبق. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 4. الكترون تدفق الفحص. 5 ملي البيروفات / 1 ملم مالات + 4 ميكرومتر FCCP، والإلكترون وانخفاض الميتوكوندريا تتبع التنفس فحص النحو الذي يحدده قياس متعددة جيدا من استهلاك الأوكسجين. يتم التعبير عن القيم كما يعني ± SD. كان الميتوكوندريا البروتين تحميل لكل بئر 3.5 ميكروغرام. تمثل البيانات ن = 3 مكررات البيولوجية المقترنة. OCR = معدل استهلاك الأوكسجين. مكافحة A = Antimycin A؛ تصاعدي = أسكوربات. TMPD = N، N، N، N '-tetramethyl- ص -phenylenediamine. الرجاء النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

كاشف	الأسهم تركيز	MW	الحجم النهائي	واضاف كتلة	تعليقات / الوصف
	(م)	(ز / مول)	(مل)	(ز أو مل)
EGTA، ودرجة الحموضة 7.2	0.1	380.35	100 مل من 1M تريس قاعدة	3،801 ز	تخزينها في 4 ° C
HEPES	1	238.3	250 مل من DiH 2 O	59. 57 ز	تخزينها في 4 ° C
MgCl 2، هيكساهيدرات	1	203.31	250 مل من DiH 2 O	50.82 ز	تخزينها في 4 ° C
البيروفات درجة الحموضة 7.4	0.1	88،06 (14،11 يأتي كما M الحل)	40 مل من DiH 2 O	0.283 مل من حمض البيروفيك	جعل 1 مل قسامات وتخزينها في -20 ° C، وجعل جديدة كل أسبوعين
سوسينات درجة الحموضة 7.4	0.5	118.09	100 مل من DiH 2 O	9.4 غرام من سوحمض ccinic	جعل 1 مل قسامات وتخزينها في -20 درجة مئوية
مالات، ودرجة الحموضة 7.4	0.5	134.09	100 مل من الايثانول 95٪	6.7 غرام من حمض الماليك	جعل 200 مكل وتخزينها في -20 درجة مئوية
TMPD	0.01	164.25	10 مل	0.0164 ز	جعل 300 مكل وتخزينها في -20 ° C؛ خلط مع مبلغ متساوي المولية من أسكوربات للحفاظ على انخفاض TMPD
بالميتويل كلوريد L-كارنيتين	0.01	436.07	1.14 مل من الايثانول 95٪	0.005 غرام	جعل 40 مكل وتخزينها في -20 درجة مئوية
أوليغوميسين A	0،006	791.06	0.987 مل من الايثانول 95٪	0.005 غرام	جعل 20 مكل وتخزينها في -20 درجة مئوية
FCCP	0.01	254.17	3.9 مل من الايثانول 95٪	0.01 ز	جعل 40 مكل وتخزينها في -20 درجة مئوية
روتنون	0،001	394.4	10 مل من الايثانول 95٪	0.0039 ز	مخزن في -20 درجة مئوية
Antimycin A	0.005	548.63	9.12 مل من الايثانول 95٪	0.025 غرام	مخزن في -20 درجة مئوية
K + ADP	0.5	501.32	3.9 مل من DiH 2 O	1.0 ز	مخزن في -20 درجة مئوية
حمض الماليك، ودرجة الحموضة 7.4	0.5	134.09	40 مل	2.68 ز	جعل 200 مكل وتخزينها في -20 درجة مئوية

حلول المالية

كاشف	الأسهم تركيز	واضاف كتلة	المولية النهائي / في المئة
	(م)	(ز أو مل)
سكر القصب	-	11.98 ز	70 ملي
مانيتول	-	20.04 ز	220 ملي
البوتاسيوم أحادي القاعدة فوسفات	-	0.34 ز	5 مم
MgCl 2، هيكساهيدرات	1	2.5 مل	5 مم
HEPES	1	1.0 مل	2 مم
EGTA	0.1	5.0 مل	1 ملم
أساسا الأحماض الدهنية احلرية BSA	-	1.0 ز	0.20٪

الجدول 2. MAS ميكس درجة الحموضة 7.4، 500 مل: قسامة 25 مل وتخزينها في -20 درجة مئوية * ملاحظة: استبعاد BSA لمزيج MAS تستخدم لحقن الفحص.

الركيزة المتوسطة	تركيز النهائي	كمية من الأوراق المالية (ميكرولتر)	كمية MAS * (مل)
البيروفات / مالات	10 ملي / 5 ملي	البيروفات: 1000	9
		مالات: 100
Succicinate / روتنون	10 ملم / 2 ميكرومتر	سوسينات: 200	10
		روتنون 20
* البيروفات / مالات + FCCP	5 مم / 1 ملم / 4 ميكرومتر	البيروفات: 500	10
		FCCP: 4
		مالات: 20
بالميتويل L-كارنيتين / مالات	40 ميكرومتر / 1 ملم	Palmitoylcarnitine: 40 مالات: 20	10
الغلوتامات / مالات	10 ملم / 10 ملم	الغلوتامات: 400	10
		مالات: 200

الجدول 3. حلول الركيزة 7.4 درجة الحموضة: جعل الطازجة في يوم من التجربة. * الكترون حل فحص التدفق.

حقن المتوسطة	تركيز	كمية من الأوراق المالية (ميكرولتر)	قيمة MAS (مل)	كمية حقن خرطوشة	تركيز النهائي
					(بعد حقنه في لوحة)
ADP	50 ملي	300 ميكرولتر	3	50 ميكرولتر	5.0 ملم
أوليغوميسين A	20 ميكرومتر	10 ميكرولتر	3	55 ميكرولتر	2.0 ميكرومتر
FCCP	40 ميكرومتر	12 ميكرولتر	3	60 ميكرولتر	4.0 ميكرومتر
Antimycin A	40 ميكرومتر	24 ميكرولتر	3	65 ميكرولتر	4.0 ميكرومتر

تتمكنت 4. حقن لفحوصات إلى جانب 7.4 درجة الحموضة: جعل الطازجة في يوم من التجربة. * وتشمل فحوصات اقتران (ولكن لا تقتصر على) البيروفات / مالات، سوسينات / روتينون، بالميتويل الكارنيتين / مالات، والغلوتامات / مالات.

حقن المتوسطة	تركيز	كمية من الأوراق المالية (ز أو UL)	كمية MAS (مل)	كمية حقن خرطوشة	تركيز النهائي (بعد حقنه في لوحة)
روتنون	20 ميكرومتر	60 ميكرولتر	3	50 ميكرولتر	2.0 ميكرومتر
سوسينات	50 ملي	300 ميكرولتر	3	55 ميكرولتر	5.0 ملم
Antimycin A	40 ميكرومتر	24 μ؛ ل	3	60 ميكرولتر	4.0 ميكرومتر
TMPD / Ascorabte	1 ملم، 100 ملم	TMPD: 300 ميكرولتر	3	65 ميكرولتر	100 ميكرومتر، 10MM
		أسكوربات: 0.059 ز

الجدول 5. حقن للالكترون تدفق الفحص 7.4 درجة الحموضة: إصنع العذبة في يوم من التجربة

أمر	الوقت (دقيقة)	# الدورات
عاير
انتظر	10 دقيقة (للسماح لوحة لتدفئة من الخطوة التزام)
مزيج	1 دقيقة	2
أنااسوري	2 دقيقة
حقن A
مزيج	1 دقيقة	2
قياس	2 دقيقة
حقن B
مزيج	1 دقيقة	2
قياس	2 دقيقة
حقن C
مزيج	1 دقيقة	2
قياس	2 دقيقة
حقن D
مزيج	1 دقيقة	2
قياس	2 دقيقة

الجدول 6. بروتوكول تشغيل الآلات.

المناقشة

الطرق الواردة في هذه المادة توفر خطوة بخطوة تعليمات لأداء مجموعة من صفيحة ميكروسكوبية مقرها المقايسات respirometric باستخدام الميتوكوندريا المعزولة 75-100 ملغ من الماوس العضلات والهيكل العظمي. ويمكن تنفيذ هذه المقايسات مع دقة عالية كما يتضح من الانحراف المعياري ضيق بين الآبار ثلاث نسخ. الأهم من ذلك، هذه المقايسات respirometric تسمح التحديد الدقيق من حيث تشوهات و / أو التعديلات قد تحدث في ETC، دورة TCA، مسار β للأكسدة، النقل الركيزة، وما إلى ذلك في نموذج حيواني تستخدم عادة.

من المهم تسليط الضوء على الأساس المنطقي لاستخدام مختلف أنواع الوقود ومثبطات المستخدمة في هذا البروتوكول. البيروفات / مالات والغلوتامات / المقايسات respirometric مالات يسمح لتقييم مجمع I التنفس بوساطة، فضلا عن تقييم شركات النقل الخاصة بها، وذلك في حالة من الغلوتامات، ونازعة أمين ^15. بدلا من ذلك، فإن الجمع بينسوسينات / روتينون يسمح تقييم تدفق الجهاز التنفسي الميتوكوندريا من خلال مجمع الثاني من ETC منذ روتينون يمنع مجمع الأول ويتيح سوسينات الإلكترونات إلى مجمع II عن طريق الحد من فلافين الأدينين ثنائي النوكليوتيد (القوات المسلحة الهايتية ₂₎ ^15. توفر هذه المقايسات معلومات محددة الركيزة لكفاءة اقتران والتنفس القصوى. فحص تدفق الإلكترونات هي فريدة من نوعها في أن الجمع بين ركائز ومثبطات يسمح لتقييم المجمعات متعددة خلال تدفق الجهاز التنفسي الميتوكوندريا ^9. مزيج الركيزة الأولي من البيروفات / مالات + FCCP يسمح لتقييم التنفس القصوى يقودها مجمع I، في حين أن حقن روتينون تليها سوسينات يسمح للتنفس القصوى تقييم يقودها مجمع II. حقن Antimycin A، مثبط لمجمع III، تليها حقن أسكوربات / TMPD السماح لللتقييم التنفس يقودها مجمع IV منذ أسكوربات / TMPD هوالإلكترون المانحة لالسيتوكروم C / مجمع IV. في حين يتم الحصول على أي معلومات عن كفاءة اقتران، فإن هذه الطريقة مثالية لأحجام عينة صغيرة جدا التي تحول دون تشغيل ركائز متعددة بشكل مستقل. وأخيرا، واستخدام بالميتويل الكارنيتين / مالات يسمح لتقييم التنسيق بين β للأكسدة وETC منذ ما يعادل خفض إنتاجها من أكسدة الأحماض البالمتيك (β-الأكسدة) تغذي ETC من خلال الإلكترون نقل بروتين فلافيني ^15. وتجدر الإشارة إلى أن فحوصات تدفق اقتران والكترون ويمكن أيضا أن تستخدم جنبا إلى جنب لتحديد التغيرات في وظيفة الميتوكوندريا بسبب بعض التدخل (العلاج من تعاطي المخدرات، والتلاعب الجيني).

ومن المقرر في المقام الأول إلى خلط دقيق من الميتوكوندريا عالية الدقة بلغ عن هذه المقايسات، سواء كان ذلك قبل تقرير البروتين، أو مع حلول الركيزة. على طول هذه الخطوط، وبمجرد أن الميتوكوندريا وresuspendend في solutio الركيزةنانوثانية، فمن الأهمية بمكان لخلط هذا الحل مسبق بدقة لتحميل لوحة زراعة الخلايا كما هو موضح في الخطوة 2.2 مع اتساع فتحة طرف ماصة. عدم خلط الميتوكوندريا بدقة سوف يؤدي إلى تفاوت كبير في الفحص. وبالإضافة إلى ذلك، وذلك باستخدام فتحة ضيقة ماصة سيخلق قوى القص في حين خلط الميتوكوندريا ويزيد من القدرة على تلف الأغشية الميتوكوندريا والإفراج عن السيتوكروم C. الخطوة التزام (2.7) هي أيضا خطوة حاسمة في هذا البروتوكول. وعدم تدور تحميل لوحة الثقافة خلية طويلة / بسرعة كافية يؤدي إلى الالتزام غير الكامل للالميتوكوندريا إلى البئر، مما أدى إلى زيادة التباين بين الآبار والقياسات.

وقد تم تحسين بروتوكول صفها لتشمل: تحميل مبلغ الأمثل للبروتين الميتوكوندريا لكل بئر، وذلك باستخدام تركيزات / أساليب إعداد الصحيحة لجعل الأسهم والركيزة الحلول، وتغيير على المدى فحص للتأكد من جيش التحرير الشعبى الصينى دولة الميتوكوندرياteaus، وخلط المناسب للسهم والميتوكوندريا / الركيزة الميتوكوندريا يمزج. قبل هذه الجهود الأمثل، واجهت عثرات الكتاب في المدى الفحص. يناقش يلي طرق استكشاف الأخطاء وإصلاحها / التعديلات التي كانت مفيدة في تحسين هذا البروتوكول. وفيما يتعلق التحميل الأمثل، وتحميل الميتوكوندريا قليلة جدا لا تثير استجابة قوية، أثناء تحميل الميتوكوندريا الكثير من واستنفاد الأكسجين داخل microchamber وتؤدي إلى قياسات غير دقيقة. روجرز وآخرون ⁹ يقدم أمثلة من تحديد كميات التحميل الأمثل الميتوكوندريا لكل بئر للصفيحة ميكروسكوبية مقرها المقايسات respirometric. في كثير من الأحيان، يتم تحميل الميتوكوندريا الكثير لكل بئر كما يتضح من الدولة 2 معدلات أكثر من 100-200 بمول / دقيقة / جيد والدولة 3 معدلات> 1500 بمول / دقيقة / جيد. إذا حدث الحمولة الزائدة، إجراء تجربة مع اختلاف تركيز البروتين الميتوكوندريا (على سبيل المثال، بين 1 - 10 ميكروغرام) للحصول OCRs داخل ص الديناميكيانجى للآلة قياس استهلاك الأوكسجين. إعداد واستخدام تركيزات الصحيحة من ركائز والأسهم هي ذات أهمية قصوى. دائما استخدام الحمض من ركائز / الحقن وضبط درجة الحموضة مع هيدروكسيد البوتاسيوم أو حمض الهيدروكلوريك. مخازن الصوديوم / لا ينصح الحلول. بالإضافة إلى ذلك، ركائز إعادة التعليق / الأسهم في DMSO أو الإيثانول بنسبة 100٪ سوف يؤدي إلى فشل قياس أو خطأ. تأكد من استخدام الايثانول 95٪ حيث لوحظ. ومن الشائع لبالميتويل الكارنيتين ليعجل خروج من الايثانول 95٪ بعد ذوبان المجمدة الأسهم، مما تسبب تقلبات كبيرة. ومن المؤكد أن الاحماء الأسهم بالميتويل الكارنيتين ودوامة جيدا قبل الاستخدام. بالإضافة إلى ذلك، قد تكون شديدة التباين البيروفات / مالات نتيجة الفحص نظرا لكائن الأسهم البيروفات> 2 أسابيع من العمر. مما لا شك فيه أن يعيد قسامات المجمدة البيروفات كل 2 أسابيع. تم تعديل المدى مقايسة لقياسات 2-دقيقة لضمان الهضاب الدولة الميتوكوندريا. إذا كان المطلوب مراقبة استنفاد ADP، يجوز للباحثتمديد وقت القياس تحت عنوان "البروتوكول" التبويب في إطار منتدى "معالج الفحص". أخيرا، يحدث تفاوت كبير عندما لا يتم المتجانس في الأوراق المالية والميتوكوندريا الميتوكوندريا بالإضافة إلى الركيزة حلول مسبق تماما التحميل. إذا التباين بين الآبار عالية بعد تشغيل الفحص، تأكد من مزيج تماما الحل الركيزة قبل التجربة المقبلة. أبدا دوامة الحلول الميتوكوندريا / الركيزة، وليس إثارة، والهريس، ويسحن بلطف مع اتساع فتحة طرف ماصة.

هناك بعض القيود المفروضة على هذه التقنية التي تستحق الملاحظة. أولا، عدد من الآبار على لوحة زراعة الخلايا المستخدمة لهذه المقايسات منخفض نسبيا (أي.، 24 بئرا و 2 على الأقل المعينة للآبار فارغة). إذا كان المطلوب من أداء كل 5 من هذه المقايسات على لوحة واحدة، الباحث هو فقط قادرة على فحص ردود من الماوس في وقت واحد. ومع ذلك، تجدر الإشارة إلى أن و96 أدوات جيدا المتاحة لhigheص الإنتاجية. ثانيا، هناك نقاط القوة ونقاط الضعف الكامنة في تقييم ضعف الميتوكوندريا في الميتوكوندريا المعزولة مقارنة في خلايا سليمة ^1. وتشمل بعض نقاط الضعف التي لها علاقة أقل الفسيولوجية بالمقارنة مع خلايا سليمة وحمل التحف من عملية العزل. وأخيرا، فإن نجاح هذه الطريقة يتوقف على نوعية العملية العزلة الميتوكوندريا.

على الرغم من أن بعض هذه المقايسات تم وضعها إما في مختلف النظم أو تم التحقق من صحتها في النماذج الحيوانية الأخرى، الأساليب الواردة في هذه الوثيقة هي الأولى لتجميع كل من المقايسات المذكورة أعلاه للاستخدام الأمثل في الماوس متعددة أيضا آلة قياس استهلاك الأكسجين باستخدام العضلات والهيكل العظمي. الأهم من ذلك، كل 5 من هذه المقايسات لا يمكن أن يؤديها مع كمية من الميتوكوندريا المعزولة من ~ 75-100 ملغ من الماوس العضلات والهيكل العظمي، وبالتالي توفير إنتاجية عالية مع الحد الأدنى من المواد. ذات أهمية كبيرة، وقدرة متعددة جيداتقنيات استهلاك الأكسجين لأداء المقايسات مع كميات ضئيلة من الميتوكوندريا، جنبا إلى جنب مع أسلوب العزل الأمثل، بما يسمح للباحث لإجراء العديد من التجارب الأخرى مع ما تبقى من أنسجة العضلات والهيكل العظمي (على سبيل المثال، البقع الغربية، RT-PCR، المقايسات الأنزيمية، وما إلى ذلك)، والتي غالبا ما يكون الصراع مع هذا النموذج الحيواني.

في الختام، الأساليب المقدمة في هذه الوثيقة توفر خطوة بخطوة تعليمات لأداء مجموعة من صفيحة ميكروسكوبية مقرها المقايسات respirometric باستخدام كميات ضئيلة من الماوس العضلات والهيكل العظمي. الأهم من ذلك أن الأساليب المقدمة تتطلب كميات ضئيلة من الأنسجة والميتوكوندريا. مرة واحدة يتقن، فإن الأساليب المذكورة في هذه الوثيقة تسمح للباحثين لتحديد آلية ممكنة لمركب أو الجين المنتج على استهلاك الأوكسجين الميتوكوندريا في نموذج حيواني تستخدم عادة.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
السكروز	Sigma Aldrich	S7903	المتجر في RT
D-Mannitol	Sigma Aldrich	63559	يخزن في RT
فوسفات البوتاسيوم أحادي القاعدة ، 99.0٪	على الأقل Sigma Aldrich	P5379	يخزن في RT
سداسي هيدرات كلوريد المغنيسيوم ، كاشف ACS ، 99.0-102.0٪	Sigma Aldrich	M9272	مخزن في RT
HEPES الحد الأدنى 99.5٪ المعايرة	بالتحليل الحجميمتجر Sigma Aldrich	H3375	في متجر RT
EGTA	Sigma Aldrich	E4378	في RT
Essential Fatty	متجر Sigma Aldrich	A6003	في 4 درجات ؛
C خالي من حمض - حمض البيروفيك BSA
، 98٪	Sigma Aldrich	107360	يخزن في 4 درجات ؛ C
Succinic Acid	Sigma Aldrich	S9512	Store في RT
L (-) حمض الماليك ، BioXtra ، & ge ؛ 95٪	Sigma Aldrich	M6413	Store في RT
L-Glutamic acid	Sigma Aldrich	G1251	Store at RT
N ، N ، N &prime ؛ N & Prime ؛ -Tetramethyl-p-phenylenediamine	Sigma Aldrich	T7394	يخزن في RT
99٪ ، مسحوق [TMPD]
Palmitoyl L-carnitine chloride	Sigma Aldrich	P1645	Store at -20 & deg ؛ C
Oligomycin A ، & ge 95٪ (HPLC)	Sigma Aldrich	75351	يخزن في -20 درجة ؛ C
Carbonyl cyanide 4- (ثلاثي فلوروميثوكسي)	Sigma Aldrich	C2920	يخزن في 2 - 8 درجة ؛ ج
فينيل هيدرازون
& جي ؛ 98٪ (TLC) ، مسحوق [FCCP]
Antimycin A من streptomyces sp.	متجر Sigma Aldrich	A8674	عند -20 درجة ؛ C
الأدينوزين 5 & prime ;-ثنائي الفوسفات أحادي البوتاسيوم الملح المجفف [ADP]	Sigma Aldrich	A5285	يحفظ في -20 & درجة ؛ متجر C
Rotenone	Sigma Aldrich	R8875	في RT
Pierce & trade ؛ مجموعة فحص البروتين BCA	ثرمو ساينتيك	23225	غير متاح