مقالة منهجية

تعطيل المضادة للضراوة من الممرضة الأغشية الحيوية باستخدام المهندسة النصاب القانوني-التبريد Lactonases

DOI:

10.3791/53243

⸱

يناير 1, 2016

 ,  ,  , 
1Department of Biochemistry, Yong Loo Lin School of Medicine, 2Department of Chemistry, University of Utah, 3Synthetic Biology Research Consortium, National University of Singapore

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

إنزيمات تبريد النصاب هي خيارات مضادة للضراوة ومضادة للبكتيريا يمكنها التخفيف من التسبب في المرض دون التعرض لخطر المقاومة ، عن طريق منع التعبير عن عوامل الفوعة والجينات المرتبطة بمقاومة المضادات الحيوية وتكوين الأغشية الحيوية. في هذه الدراسة ، أبلغنا عن طريقة توضح فعالية إنزيمات تبريد النصاب في اضطراب الأغشية الحيوية البكتيرية.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أدى الظهور السريع للبكتيريا المقاومة للأدوية المتعددة إلى تسريع الحاجة إلى أساليب علاجية جديدة لمواجهة الالتهابات التي تهدد الحياة. غالبا ما يرتبط استمرار العدوى البكتيرية بتكوين الأغشية الحيوية بوساطة استشعار النصاب. وبالتالي ، فإن تعطيل دائرة الإشارات هذه يقدم استراتيجية جذابة لمكافحة الضراوة. تم الإبلاغ عن أن اللاكتونازات التي تروي النصاب هي عوامل فعالة لتعطيل دوائر استشعار النصاب. ومع ذلك ، كان هناك عدد قليل جدا من التقارير عن الاستخدام الفعال لهذه الإنزيمات في تعطيل تكوين الأغشية الحيوية البكتيرية. يصف هذا البروتوكول طريقة لتعطيل تكوين الأغشية الحيوية في سلالة A. baumannii S1 ذات الصلة سريريا من خلال استخدام لاكتوناز مصمم هندسيا لإخماد النصاب التجريبي. Acinetobacter baumannii هو أحد مسببات الأمراض البشرية الرئيسية المتورطة في العدوى الخطيرة المكتسبة من المستشفيات على مستوى العالم وتعزى ضراوته في الغالب إلى مثابرة الأغشية الحيوية. حقق علاج اللاكتوناز المصمم هندسيا انخفاضا كبيرا في الأغشية الحيوية A. baumannii S1. أظهرت هذه الدراسة أيضا إمكانية استخدام إنزيمات تبريد النصاب المهندسة في العلاج المستقبلي للأمراض البكتيرية بوساطة الأغشية الحيوية. أخيرا ، يمكن استخدام الطريقة لتقييم كفاءة إنزيمات تبريد النصاب الواعدة.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

خيارات العلاج للأمراض المعدية قد تعقدت بسبب الزيادة السريعة في البكتيريا المقاومة للأدوية المتعددة التي هي في مأمن من مجموعة واسعة من المضادات الحيوية 1. مع ارتفاع معدلات المراضة والوفيات من مقاومة العدوى البكتيريا بوساطة، هناك حاجة لتصعيد عمليات التنمية المخدرات و / أو البحث عن بدائل مضادة للبكتيريا أفضل لتحسين الخيارات العلاجية. في الآونة الأخيرة، ونهج معاداة الفوعة تكتسب الفائدة نظرا إمكاناتها في منع الفوعة عبر وسائل غير جراثيم، وبالتالي التخفيف من مخاطر آليات المقاومة 2.

النصاب الاستشعار هو "المفتاح الرئيسي في الفوعة البكتيرية وتعطل هذه الظاهرة يشير هو وسيلة لمكافحة الفوعة واعد ضد المرضية 3. بداية الفوعة يتطلب تراكم الجزيئات النصاب في البيئة خارج الخلية بعد الوصول إلى الكثافة السكانية البكتيرية حرجة. كما الراهنجزيئات الروم منتشر مرة أخرى إلى مصفوفة الخلايا، ملزم مع مستقبلاتها وما شابه ذلك يؤدي إلى تفعيل عوامل الفوعة وكذلك الجينات المرتبطة بمقاومة المضادات الحيوية وتشكيل بيوفيلم 4. في العام، واختلال نصاب الاستشعار ينطوي على تثبيط جزيء النصاب والتفاعل مستقبلات دون التأثير على المسارات الأيضية الأساسية. وبالتالي، فإنه ليس لديها أي تأثير مباشر على نمو الخلايا. لأنه لا شبهة اللياقة البدنية، وهناك الحد الأدنى من ضغط اختيار البكتيريا في التطور واكتساب مقاومة ضد مثل هذه العلاجات 5. بالإضافة إلى ذلك، يمكن تعطيل النصاب الاستشعار تتداخل مع آليات الحماية البكتيرية الكامنة، كما في حالة تشكيل بيوفيلم، الذي يوفر حماية من العوامل المضادة للبكتيريا واستضافة الاستجابات المناعية.

وتشير التقديرات إلى أن 99٪ من الميكروبات على الأرض موجودة في المصفوفات مثل بيوفيلم معقدة، منح مزايا البقاء على قيد الحياة حاسمة في الكائنات الحية الدقيقة التي تعيش داخل الهياكل جنوب شرقي 6. الأهم من ذلك، تشكيل هذه المجالات اطئة هو سبب العدوى المكتسبة من المستشفيات الأكثر المستمرة والمزمنة 7. راكدة بومانية هي واحدة من مسببات الأمراض البشرية الكبرى مقترن العدوى المكتسبة من المستشفيات العالمية ويعزى الفوعة إلى حد كبير إلى النصاب الاستشعار تشكيل بيوفيلم بوساطة 8. وقد استخدمت إنزيمات التبريد النصاب القانوني بنجاح في تعطيل النصاب بوساطة نقل الإشارة من خلال استهداف مجموعة من المركبات المعروفة باسم N -acyl اكتونات homoserine (AHLs) التي تنتجها البكتيريا سالبة الجرام 9. وقد وسعت العديد من الدراسات أيضا على استخدام هذه الانزيمات لمنع المرضية البكتيرية من خلال الحد من أعداد عامل الفوعة التعبير وخلية في الأغشية الحيوية 10،11. للأسف، لا يزال هناك نقص في مظاهرة اضح من الاستخدام الفعال للإنزيمات التبريد النصاب القانوني ضد تشكيل بيوفيلم عن طريق الجراثيم البكتيرية. الوقد تم إعادة محاولات لاستخدام مثبطات النصاب (نظائرها AHL)، بدلا من الانزيمات التبريد النصاب، لتعطيل A. تشكيل بيوفيلم baumannii 12. على الرغم من أن هذه الطريقة من استخدام الجزيئات الصغيرة مثبطات هو نهج صحيح، واستدامة التوافر البيولوجي في استخدامات متعدية يمكن أن يشكل تحديا. على العكس من ذلك، يمكن استخدام إنزيمات التبريد النصاب الحفازة تحايل على قضية التوافر البيولوجي كإنزيمات اكثر سهولة نحو تجميد على أسطح الطبية الأجهزة الآثار العلاجية.

هنا، نحن تصف تقييم آثار المهندسة lactonases-التبريد النصاب القانوني من Geobacillus kaustophilus (GKL) 13 على تشكيل بيوفيلم البكتيرية، وذلك باستخدام تلطيخ البنفسجي الكريستال ومتحد البؤر المجهر الليزر (CLSM). هذه الدراسة هي أول مظاهرة ناجحة تعطل بيوفيلم في A. ذات الصلة سريريا سلالة baumannii S1 باستخدام أنزيمات التبريد النصاب. الطرق وصفتفي هذه الدراسة هي مفيدة لتقييم فعالية أخرى إنزيمات التبريد النصاب القانوني في جهود التنمية العلاجية اللاحقة ضد الجراثيم سلبية الغرام المسببة للأمراض.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. كريستال البنفسج الكميات من تشكيل بيوفيلم في A. baumannii S1

  1. تنمو ثقافة 5 مل من A. baumannii S1 في استذابة مرق (LB) (تريبتون 10 ز / L، خلاصة الخميرة 5 جم / لتر) عند 30 درجة مئوية في حاضنة تهتز (220 دورة في الدقيقة) لمدة 16 ساعة.
  2. ضبط ثقافة A. baumannii S1 إلى OD المطلوب 600 من 0.8. باستخدام لوحة 96-جيدا، تطعيم ثقافة البكتيريا (1: 100 تمييع) في LB الطازجة التي تحتوي على 10 ميكرولتر من تنقية GKL انزيم (40 ملغ / مل). الحجم النهائي الثقافة الجديدة هو 100 ميكرولتر.
  3. إعداد ثقافة السيطرة كذلك؛ هذا لن يحتوي على أي الانزيم. كرر ظروف مماثلة لانتاج العدد المطلوب من مكررات.
  4. تغطية لوحة مع غطاء ووضعه في 10 L عاء من البلاستيك مختوم. احتضان لوحة عند 30 درجة مئوية لمدة 3 ساعات قبل إزالة بلطف وسائل الإعلام.
  5. إضافة 100 ميكرولتر آخر من الطازجة المتوسطة LB إلى البئر واحتضان لوحة لمدة 21 ساعة على 30 ° C.
  6. بعد الفترة الثانية من الحضانة، وإزالة بلطف كافة وسائل الإعلام. يغسل البكتيريا خلية العوالق مع 200 ميكرولتر الماء المعقم. ضمان أنه لا يوجد سوى اضطراب الحد الأدنى للخلايا أثناء الغسل.
  7. إضافة 100 ميكرولتر من 1٪ محلول الكريستال البنفسجي إلى كل بئر واحتضان لمدة 15 دقيقة في RT. إزالة الحل الكريستال البنفسجي غسل جيدا مع 200 ميكرولتر الماء المعقم. تكرار غسل مرتين أكثر.
  8. إضافة 100 ميكرولتر من حامض الخليك 33٪ على كل بئر واحتضان لمدة 15 دقيقة مع اهتزاز لطيف؛ هذا سوف تذوب الصبغة.
  9. Quantitate كمية بيوفيلم تشكلت من خلال قياس الامتصاصية من الكريستال البنفسجي في 600 نانومتر. كمية من الكريستال البنفسجي يتناسب مع كمية بيوفيلم تشكيلها.

2. متحد البؤر الليزر الضوئي المجهري للA. baumannii S1 بيوفيلم

  1. تنمو ثقافة 5 مل من A. baumannii S1 في LB عند 30 درجة مئوية في حاضنة تهتز (220 دورة في الدقيقة) لمدة 16 ساعة.
  2. ميلاديمجرد ثقافة A. baumannii S1 إلى OD المطلوب 600 من 0.8. باستخدام 35 ملم ذات القاع الزجاجي μ-الصحن، تطعيم ثقافة البكتيريا (1: 100 تمييع) في LB الطازجة التي تحتوي على 30 ميكرولتر من تنقية GKL انزيم (40 ملغ / مل). الحجم النهائي الثقافة الجديدة هو 1 مل.
  3. تغطية μ-صحن مع غطاء ووضعه في 10 L عاء من البلاستيك مختوم. احتضان μ-الطبق عند 30 درجة مئوية لمدة 3 ساعات قبل إزالة بلطف وسائل الإعلام. إضافة 30 ميكرولتر من تنقية إنزيم GKL ومتوسطة جديدة، ليصل إلى الحجم الكلي لل1 مل. احتضان لمدة ساعة 21 آخرين في 30 ° C.
  4. كرر الخطوة 2.3 واحتضان μ-طبق لمدة 24 ساعة أخرى في 30 ° C. ثم، وإزالة وسائل الإعلام بلطف.
  5. إضافة 500 ميكرولتر من 5 ميكروغرام / مل اليكس فلوو 488 مترافق جنين القمح راصة (WGA) الذائب في محلول ملحي متوازن هانك (HBSS) إلى μ-صحن واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. هذا وصمة عار على بيوفيلم تشكيلها. إزالة حل تلطيخ وغسل رانه ميكرون-صحن 2 مل من HBSS. كرر الخطوة غسل واحد مزيد من الوقت.
  6. إضافة 500 ميكرولتر من 3.7٪ الفورمالديهايد الذائبة في HBSS واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. هذا سوف إصلاح بيوفيلم على μ-الصحن. يغسل μ-الطبق مرة واحدة مع 2 مل من HBSS ثم قم بإزالة الحل تماما. يمكن تخزين μ-صحن ثابت مع بيوفيلم في الظلام في 4 درجات مئوية قبل التصوير CLSM.
  7. للتصوير CLSM والتحليل، استخدم 63 مرات التكبير لتوليد 97 رزمة لكل صورة مع فاصل من 0.21 ميكرون في كومة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في التجربة الكميات الكريستال البنفسجي، واستخدمت اثنين من الانزيمات والتبريد النصاب القانوني لإثبات جدوى في تعطيل تشكيل بيوفيلم: من النوع البري GKL وتحسين متحولة مزدوج GKL (E101G / R230C). وقد تبين أن كلا من الأنزيمات لإثبات النشاط lactonase ضد 3-هيدروكسي-decanoyl-L-homoserine اكتون (3-OH-C 10 -HSL)، جزيء النصاب الرئيسية المستخدمة من قبل أ. baumannii S1 14. لتقييم صحيح من تعطل بيوفيلم، أدرجت أيضا إنزيمات نشطة ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في كلتا المجموعتين من التجربة، A. تم مثقف baumannii S1 في LB سائل الإعلام دون كلوريد الصوديوم حيث تركيز الملح العالية قد يقلل من كمية بيوفيلم التي شكلتها البكتيريا 15. وجود مثل هذه الأداة يمكن أن نقلل من كمية بيوفيلم تشكيلها، وكذلك آثار إنزيمات التبريد النصاب في ظروف معاملة مختلفة. استخدام انزيم نشط حفاز مهم كوسيلة لمراقبة سلبية للقضاء على الآثار المحتملة للاحتباس انزيم الشكل 1 يبين أنه حتى لو إنزيمات نشطة تصادر الجزيئات النصاب، لا يتم...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعلن المؤلفون أنه ليس لديهم مصالح مالية متنافسة.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم هذا العمل بمنح من صندوق البحث الأكاديمي التابع لوزارة التربية والتعليم، والمجلس الوطني للبحوث الطبية والمؤسسة الوطنية للبحوث في سنغافورة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
التربتون مستخلصBD 211705
BD212750
96 بئر صفيحةكوستار3596
كريستال البنفسجيسيجما-ألدريتشC6158
حمضالخليكPLA00654Xتحذير: قابل للاشتعال
أبيدي80136
أليكس فلو 488 مترافق WGAInvitrogenW11261
هانك محلول ملح متوازن Invitrogen141475095
الفورمالديهايدسيجما - AldrichF8775تحذير: تآكل  
قارئ الصفيحة الدقيقة SynergyHT BioTek
1X-81 مجهر مضان مقلوبأوليمبوس
الخميرة مختبر طبق

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Alanis, A. J. Resistance to antibiotics: are we in the post-antibiotic era? Archives of medical research. 36, 697-705 (2005).
  2. Cegelski, L., Marshall, G. R., Eldridge, G. R., Hultgren, S. J. The biology and future prospects of antivirulence therapies. Nature reviews. Microbiology. 6, 17-27 (2008).
  3. LaSarre, B., Federle, M. J. Exploiting quorum sensing to confuse bacterial pathogens. Microbiology and molecular biology reviews : MMBR. 77, 73-111 (2013).
  4. Waters, C. M., Bassler, B. L. Quorum sensing: cell-to-cell communication in bacteria. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 21, 319-346 (2005).
  5. Rasko, D. A., Sperandio, V. Anti-virulence strategies to combat bacteria-mediated disease. Nature reviews. Drug discovery. 9, 117-128 (2010).
  6. Lazar, V. Quorum sensing in biofilms--how to destroy the bacterial citadels or their cohesion/power? Anaerobe. 17, 280-285 (2011).
  7. Costerton, J. W. Bacterial Biofilms: A Common Cause of Persistent Infections. Science. 284, 1318-1322 (1999).
  8. Perez, F., et al. Global challenge of multidrug-resistant Acinetobacter baumannii. Antimicrob Agents Chemother. 51, 3471-3484 (2007).
  9. Tay, S. B., Yew, W. S. Development of quorum-based anti-virulence therapeutics targeting Gram-negative bacterial pathogens. International journal of molecular sciences. 14, 16570-16599 (2013).
  10. Igarashi, J., Suga, H. Ch. 19. Quorum Sensing. Rumbaugh, K. P. 692, Methods in Molecular Biology. Humana Press. 265-274 (2011).
  11. Ng, F. S., Wright, D. M., Seah, S. Y. Characterization of a phosphotriesterase-like lactonase from Sulfolobus solfataricus and its immobilization for disruption of quorum sensing. Applied and environmental microbiology. 77, 1181-1186 (2011).
  12. Stacy, D. M., Welsh, M. A., Rather, P. N., Blackwell, H. E. Attenuation of quorum sensing in the pathogen Acinetobacter baumannii using non-native N-Acyl homoserine lactones. ACS chemical biology. 7, 1719-1728 (2012).
  13. Chow, J. Y., et al. Directed evolution of a thermostable quorum-quenching lactonase from the amidohydrolase superfamily. The Journal of biological chemistry. 285, 40911-40920 (2010).
  14. Chow, J. Y., Yang, Y., Tay, S. B., Chua, K. L., Yew, W. S. Disruption of biofilm formation by the human pathogen Acinetobacter baumannii using engineered quorum-quenching lactonases. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 58, 1802-1805 (2014).
  15. Pour, N. K., et al. Biofilm formation by Acinetobacter baumannii strains isolated from urinary tract infection and urinary catheters. FEMS immunology and medical microbiology. 62, 328-338 (2011).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

A baumannii S1

مقالات ذات صلة