يصف هذا البروتوكول استخدام مستحضرات الأنسجة المعوية المستأصلة أو "الأكياس المعوية" كنموذج خارج الجسم الحي لوظيفة الحاجز المعوي. يمكن استخدام هذا النموذج لتقييم سلامة كل من الحاجز الظهاري وطبقة الهلام المخاطي في مواقع معوية محددة في النماذج الحيوانية لأمراض الجهاز الهضمي.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
فيفو السابقين المعوية الحويصلات لتقييم الأغشية المخاطية النفاذية في نماذج من الأمراض المعوية
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
الحاجز الظهاري هو أول دفاع الفطرية في الجهاز الهضمي، وينظم بشكل انتقائي النقل من التجويف إلى المقصورات الأنسجة الكامنة، وتقييد نقل جزيئات أصغر عبر الظهارة وتقريبا تحظر تماما نقل الجزيئات الظهارية. يتم تحديد هذه الانتقائية من قبل طبقة جل المخاطية، مما يحد من نقل جزيئات محبة للدهون وكل من مستقبلات قمي والمجمعات البروتين صلي ضيقة من الظهارة. في المختبر نماذج ثقافة خلية من خلايا ظهارة هي مريحة، ولكن كنموذج، فإنها تفتقر إلى تعقيد التفاعلات بين الجراثيم، المخاطية هلام، ظهارة والجهاز المناعي. من ناحية أخرى، يمكن أداؤها في الجسم الحي تقييم امتصاص الأمعاء أو النفاذية، ولكن هذه المقايسات قياس امتصاص الجهاز الهضمي بشكل عام، مع عدم وجود دليل على خصوصية الموقع. فيفو السابقين فحوصات النفاذية باستخدام "الحويصلات المعوية". هي طريقة أسرع وأكثر دقة لقياس إما سلامة المعوية العامة أو وسائل النقل المقارن من جزيء محدد، مع ميزة إضافية تتمثل في الأمعاء الموقع خصوصية. نحن هنا وصف إعداد الحويصلات المعوية للدراسات النفاذية وحساب نفاذية واضحة (P التطبيق) من جزيء عبر الحاجز المعوي. ويمكن استخدام هذه التقنية كوسيلة لتقييم امتصاص الدواء، أو لفحص الخلل حاجز الظهارية الإقليمي في النماذج الحيوانية من الأمراض المعوية.
المقدمة
حاجز الظهارية في الأمعاء الجهاز الهضمي هو منطقة سطح الغشاء المخاطي تقدر ب 400 م 2 في الإنسان البالغ. ونتيجة لذلك، يتعرض باستمرار للطعن من الميكروبات، والمخدرات بلعها، المواد الغذائية والسموم البكتيرية. المضيف يجب أن لا يميز فقط بين البكتيريا المتعايشة مقبولة ومسببات الأمراض المحتملة، ولكن يجب منع هذه الأنواع والجزيئات التي يفرزها من عبور حاجز الظهارية، بينما في نفس الوقت مما يتيح امتصاص المواد الغذائية. وهكذا، فإن دور ظهارة الأمعاء هو بمثابة حاجز انتقائي لمحتويات اللمعية 1. ويتحقق ذلك، في جزء منه، من قبل نظام الدفاع الظهارية الفطري في الغشاء المخاطي، الذي يعمل من خلال نظام بيولوجي استجابة تتألف من آليات التأسيسية ومحرض 2.
فقدان وظيفة طلائي الحاجز هو علم الأمراض الذي هو سمة من عدد من أمراض الجهاز الهضمي. وفي الجسم الحييمكن تقدير فحص وظيفة حاجز الظهارية من خلال أنبوب تغذية عن طريق الفم من جزيء التتبع وتحليل مصل الدم لاحق 3. ومع ذلك، فإن هذا الأسلوب لا يقدم أي إشارة إلى موقع الخلل الحاجز. في المختبر، وبحكم فيفو تقييم المقاومة بطريق الظهارة باستخدام أنظمة Transwell 3 و غرفة أوسينج 4،5 على التوالي، يعملون عادة كعلامات بديلة من وظيفة حاجز الظهارية، ولكنها تفتقر إلى علم وظائف الأعضاء الأمراض المساهمة في النماذج الحيوانية 6. في هذا البروتوكول وصفنا نموذج إعداد الأنسجة خارج الحي الذي يسمح بتقييم مباشر ومترجم من سلامة الأمعاء والتي يمكن استخدامها لتقييم وظيفة حاجز المخاطية في عدد من المستويات. الأهم من ذلك، يمكن تطبيق هذه التقنية على نماذج حيوانية من المرض، أو قد يتم التلاعب بها دواء للسماح في عمق الاستجواب من ضعف الغشاء المخاطي الحاجز.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
يتم تنفيذ جميع الأعمال الحيوان في هذا البروتوكول مع الالتزام الصارم من جامعة نيوكاسل جنة الأخلاقيات الحيوانية وافق الإجراءات.
1. إعداد الآلات، وسائل الإعلام الثقافة وصحون
- قبل دافئ وسائل الإعلام 199 (TC199) أو Dulbecco لتعديل النسر متوسطة (DMEM) وسائل الاعلام إلى 37 ° C. قبل الأوكسجين والمتوسطة التي ظهرت على السطح مع 95٪ O 2/5٪ CO 2. تأكد من وسيلة لديه درجة الحموضة النهائية من 7.3.
- إعداد خياطة بقطع اثنين من 5 أقسام سم لكل كيس. حلقة الغرز إلى عقدة مغلقة.
2. تشريح وإعداد الجهاز الهضمي
- سحب الصلبة الغذاء 12 ساعة قبل القتل الرحيم. إذا رغبت في ذلك، وضع الحيوانات على ملاحق جل المواد الغذائية خلال هذا الوقت.
- الموت ببطء الفئران عن طريق جرعة زائدة من الصوديوم بنتوباربيتون ([200 مغ / كغ]، حقن داخل الصفاق) تليها خلع عنق الرحم وفقا لأخلاقيات بروتو المؤسسيالعواميد ورذاذ الايثانول 70٪ على البطن والصدر.
- باستخدام مقص، وجعل شق أفقي في منتصف البطن وفضح البريتوني.
- انتقل إلى فصل وإزالة الجهاز الهضمي عن طريق خفض الأمعاء الدقيقة العلوي من المعدة في العضلة العاصرة البوابية وقطع الأمعاء الغليظة على حافة الشرج. استخدام ملقط لإزالة بلطف مساريق. ضع الأمعاء في قبل تحسنت والمتوسطة الاوكسيجين.
- تحديد الجزء من الأمعاء إلى تقييم للنفاذية (الشكل 1) وقطع هذا القسم الحر عن بقية الأمعاء.
- من أجل الحفاظ على الاتساق بين الحيوانات، وقياس أجزاء من العفج والصائم نسبة إلى المعدة، وقياس أجزاء من القولون والدقاق نسبة إلى الأعور.
- عند اختيار شرائح الأنسجة، لاحظ وجود الغشاء المخاطي المرتبطة الأنسجة اللمفاوية مثل بقع باير ل. ويمكن تحديد هذه كما إيماءة صغيرةules على الجانب المصلي من التجويف.
- باستخدام حقنة 1 مل، تدفق بلطف محتويات اللمعية الجزء الأمعاء في طبق بتري مع برنامج تلفزيوني قبل ساخنة (37 درجة مئوية). قد يتم تجاهل هذه المحتويات البرازية أو تخزينها في -80 ° C لتحليل المستقبل كما تريد.
3. إعداد المعوية الحويصلات
- تحضير حقنة 1 مل مع حجم 300 ميكرولتر من مركب اختبار أو الجزيء. لسلامة الغشاء المخاطي، 1 ملغ / مل حل من FITC-ديكستران M.Wt. 4400 يمكن استخدامها. تحقيقات تتراوح بين 4،400-70،000 دا في حجم يمكن أن تستخدم لزيادة حساسية. تناسب بشكل آمن صغيرة قسطرة الأوعية الدموية الحيوانية على الحقنة.
- قياس 5 سم من افتتاح الجزء الأمعاء وربط القطاع مغلقة بإحكام مع خياطة حلقة في هذه المرحلة. وضع بلطف خياطة حلقة مرتبطة مسبقا حول فتحة الأمعاء وادخال القسطرة أضعفت. سحب الخناق مغلقة وذلك لتأمين جزء الأمعاءوالافراج عن حجم 300 ميكرولتر من الحقنة في الأمعاء، وضمان أن كل حل يتم حقن.
- إزالة بلطف القسطرة في حين سحب في وقت واحد الخناق خياطة لتأمين إغلاق الكيس المعوي. قطع كيس معوي فضفاض من الأمعاء والمكان الى 50 مل أنبوب مخروطي الشكل مليئة 20 مل من المتوسط الاوكسيجين، مسخن الى 37 ° C.
4. قياس النفاذية
- مكان الأنابيب المخروطية التي تحتوي على الأكياس المعوية في حمام الماء الساخن لتعيين 37 ° C. في 0، 30، 60، 90، و 120 نقطة زمنية دقيقة، أخذ عينة 100 ميكرولتر من أنبوب مخروطي الشكل ونقل إلى 96 لوحة جيدا، لتحل محل وحدة التخزين مع 100 ميكرولتر من وسائل الإعلام الجديدة في كل حالة.
- بعد أخذ العينة النهائية، وقطع الأكياس المفتوحة عند نقطة خياطة ونزولا على طول هذا الجزء، وتعريض سطح الغشاء المخاطي.
- قياس طول وعرض كل جزء في الأمعاء. إذا دسالأحمر، والمفاجئة تجميد شرائح ومخزن في -80 ° C للبروتين أو تحليل الكيمياء الحيوية، أو بدلا من ذلك، مخزن في حل استقرار RNA لفحوصات الجزيئية.
- بناء منحنى مستوى التخفيفات سجل لجزيئات ذات الكلمات الدلالية FITC النطاق 1-1 × 10 -6.
- عينات قياس ومعايير لFITC على قارئ لوحة نيون، FITC الإثارة / الانبعاثات: 495 نانومتر / 519 نانومتر.
5. حساب نفاذية على ما يبدو، لكل المعوية كيس الفردية
- تحويل وحدات الوقت للثانية.
- لكل نقطة زمنية، وحساب تركيز التراكمي، س
س ر = (C ر * V ص) + (س ر المبلغ * V ق)، حيث:
س ر = تركيز التراكمي في الوقت t
C ر = تركيز في الوقت t
V ص = حجم التداول في الجانب المتلقي
س ر مبلغ = مجموع كل س ر السابق
V ق =حجم عينات - مؤامرة س مقابل الوقت (T) وحساب المنحدر: δQ / δt
- حساب نفاذية واضحة (التطبيق P)
P التطبيق = (δQ / δt) / (A * التعاون)، حيث:
A = مساحة من الأنسجة
C 0 = تركيز الأولي
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
ويمكن استخدام هذا البروتوكول لدراسة التغيرات الإقليمية في وظيفة حاجز المعوية في النماذج الحيوانية من الأمراض المعوية. عن طريق قياس تدفق تحقيق paracellular عبر سطح الغشاء المخاطي في مناطق مختلفة من الجهاز الهضمي 7، وسلامة منعطفات ضيقة الظهارية يمكن تقييم. وبالإضافة إلى ذلك، من خلال تغيير طبيعة التحقيق paracellular حسب الحجم (الشكل 2) أو للا مائية (الشكل 3)، ودرجة الاضطراب الظهارية، أو سلامة طبقة جل المخاط...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
هنا، نحن في تفصيل العزلة وإعداد الحويصلات في الأمعاء لتقييم وظيفة حاجز المخاطية خارج الحي. وقد استخدمت الاستعدادات كيس معوي في المقام الأول في مجال البحوث الدوائية، دراسة امتصاص الأدوية مرشح عبر الأمعاء. ومع ذلك، هذا الاختبار هو على قدم المساواة مناسبة تماما لدراسة مرض معوي. نفاذية الأمعاء قد تختلف اختلافا كبيرا حسب المنطقة والموقع تقييم محدد من نفاذية تسمح لفهم أفضل لأهمية إقليمية للسلامة الغشاء المخاطي في أمراض الجهاز الهضمي. فحص قوي وتحت الظروف الفسيولوجية الصحيحة، لا ...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
الكتاب تعلن أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.
شكر وتقدير
تم تمويل هذا العمل من قبل منحة المشروع الوطني للبحوث الصحية والطبية APP1021582 ومنحة معهد هانتر للبحوث الطبية برعاية Sparke Helmore / NBN Triathlon وملكية الراحل ليزلي كينيث ماكفارلين.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| Dekantel خياطة حريرية غير قابلة للامتصاص | Braintree Scientific | SUT-S 116 | |
| Media 199 (TC199) | تقنيات الحياة | 11043-023 | لا يوجد فينول أحمر لأن هذا يتداخل مع التألق |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Life Technologies | 21063-045 | لا يوجد فينول أحمر لأن هذا يتداخل مع التألق |
| N-acetylcysteine | Sigma Aldrich | استخدم عند 10 ملي مولار في الوسائط | |
| قيثير الأوعية الدموية للحيوانات الصغيرة: Physiocath | Data Sciences International | 277-1-002 | |
| FITC-Dextern 4,400 ميجاوات | Sigma Aldrich | FD-4 | |
| FITC-Dextaren 20,000 ميجاوات | Sigma Aldrich | FD-20 | |
| FITC-Dextaren 70,000 ميجاوات | Sigma Aldrich | FD-70 |
المراجع
- Goggins, B. J., Chaney, C., Radford-Smith, G. L., Horvat, J. C., Keely, S. Hypoxia and Integrin-Mediated Epithelial Restitution during Mucosal Inflammation. Frontiers in immunology. 4, 272(2013).
- Otte, J. M., Kiehne, K., Herzig, K. H. Antimicrobial peptides in innate immunity of the human intestine. Journal of gastroenterology. 38, 717-726 (2003).
- Robinson, A., et al. Mucosal protection by hypoxia-inducible factor prolyl hydroxylase inhibition. Gastroenterology. 134, 145-155 (2008).
- Feighery, L., et al. Increased intestinal permeability in rats subjected to traumatic frontal lobe percussion brain injury. The Journal of trauma. 64, 131-137 (2008).
- Keely, S., et al. Chloride-led disruption of the intestinal mucous layer impedes Salmonella invasion: evidence for an 'enteric tear' mechanism. Cellular physiology and biochemistry : international journal of experimental cellular physiology, biochemistry, and pharmacology. 28, 743-752 (2011).
- Keely, S., et al. Contribution of epithelial innate immunity to systemic protection afforded by prolyl hydroxylase inhibition in murine colitis. Mucosal immunology. 7, 114-123 (2014).
- Sourisseau, T., et al. Regulation of PCNA and cyclin D1 expression and epithelial morphogenesis by the ZO-1-regulated transcription factor ZONAB/DbpA. Mol Cell Biol. 26, 2387-2398 (2006).
- Ruehl-Fehlert, C., et al. Revised guides for organ sampling and trimming in rats and mice--part 1. Exp Toxicol Pathol. 55, 91-106 (2003).
- Barthe, L., Woodley, J. F., Kenworthy, S., Houin, G. An improved everted gut sac as a simple and accurate technique to measure paracellular transport across the small intestine. European journal of drug metabolism and pharmacokinetics. 23, 313-323 (1998).
- Marks, E., et al. Oral Delivery of Prolyl Hydroxylase Inhibitor: AKB-4924 Promotes Localized Mucosal Healing in a Mouse Model of Colitis. Inflammatory bowel diseases. 21, 267-275 (2015).
- Keely, S., et al. Hypoxia-inducible factor-dependent regulation of platelet-activating factor receptor as a route for gram-positive bacterial translocation across epithelia. Mol Biol Cell. 21, 538-546 (2010).
- Brayden, D. J., Bzik, V. A., Lewis, A. L., Illum, L. CriticalSorb promotes permeation of flux markers across isolated rat intestinal mucosae and Caco-2 monolayers. Pharmaceutical research. 29, 2543-2554 (2012).
- Hubbard, D., Ghandehari, H., Brayden, D. J. Transepithelial transport of PAMAM dendrimers across isolated rat jejunal mucosae in ussing chambers. Biomacromolecules. 15, 2889-2895 (2014).
- Keely, S., et al. In vitro and ex vivo intestinal tissue models to measure mucoadhesion of poly (methacrylate) and N-trimethylated chitosan polymers. Pharmaceutical research. 22, 38-49 (2005).
- Maher, S., et al. Evaluation of intestinal absorption enhancement and local mucosal toxicity of two promoters. I. Studies in isolated rat and human colonic mucosae. European journal of pharmaceutical sciences : official journal of the European Federation for Pharmaceutical Sciences. 38, 291-300 (2009).
- Balda, M. S., et al. Functional dissociation of paracellular permeability and transepithelial electrical resistance and disruption of the apical-basolateral intramembrane diffusion barrier by expression of a mutant tight junction membrane protein. The Journal of cell biology. 134, 1031-1049 (1996).
- Behrens, I., Stenberg, P., Artursson, P., Kissel, T. Transport of lipophilic drug molecules in a new mucus-secreting cell culture model based on HT29-MTX cells. Pharmaceutical research. 18, 1138-1145 (2001).
- Stefka, A. T., et al. Commensal bacteria protect against food allergen sensitization. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, 13145-13150 (2014).
- Keely, S., et al. Activated fluid transport regulates bacterial-epithelial interactions and significantly shifts the murine colonic microbiome. Gut microbes. 3, 250-260 (2012).
- Barrett, K. E., Keely, S. J. Chloride secretion by the intestinal epithelium: molecular basis and regulatory aspects. Annual review of physiology. 62, 535-572 (2000).
- Soni, J., et al. Rat, ovine and bovine Peyer's patches mounted in horizontal diffusion chambers display sampling function. Journal of controlled release : official journal of the Controlled Release Society. 115, 68-77 (2006).
- Justino, P. F., et al. Regulatory role of Lactobacillus acidophilus on inflammation and gastric dysmotility in intestinal mucositis induced by 5-fluorouracil in mice. Cancer chemotherapy and pharmacology. , (2015).
- Tran, C. D., Sundar, S., Howarth, G. S. Dietary zinc supplementation and methotrexate-induced small intestinal mucositis in metallothionein-knockout and wild-type mice. Cancer biology & therapy. 8, 1662-1667 (2009).
- Musch, M. W., Wang, Y., Claud, E. C., Chang, E. B. Lubiprostone decreases mouse colonic inner mucus layer thickness and alters intestinal microbiota. Digestive diseases and sciences. 58, 668-677 (2013).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
الوسوم
