مقالة منهجية

والطريقة الأمثل لعزل وتوسيع قسما ثابتا الطبيعية الخلايا التائية القاتلة من الماوس الطحال

DOI:

10.3791/53256

⸱

أكتوبر 29, 2015

 ,  , 
1Department of Rheumatology, Laboratory for Molecular Immunology and Inflammation, Ghent University Hospital, 2VIB Inflammation Research Center, Ghent University

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نقدم هنا بروتوكولا معدلا يمكن استخدامه لتوليد عدد كبير من الخلايا التائية الطبيعية القاتلة الثابتة للفئران من طحال الفأر. يحدد البروتوكول نهجا يمكن من خلاله إثراء خلايا iNKT الطحالية وعزلها وتوسيعها في المختبر باستخدام عدد محدود من والكواشف.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

القدرة على إفراز السيتوكينات بسرعة على التحفيز هو السمة الرئيسية للثابتة القاتلة الطبيعية T (حبر) نسب الخلية. لذا تتميز الخلايا حبر باعتبارها فطرية السكان الخلايا التائية قادرة على تفعيل وتوجيه الاستجابات المناعية التكيفية. تطوير تقنيات محسنة للثقافة والتوسع في خلايا الفئران حبر تسهل دراسة حبر بيولوجيا الخلية في في التجارب المختبرية ونظم نموذج الجسم الحي. نحن هنا وصف إجراء الأمثل لعزل وتوسيع الخلايا حبر الطحال الفئران.

تتم إزالة الطحال من C57BL / 6 الفئران، تشريح وتوتر والطبقات تعليق الخلوية الناتجة على وسائل الإعلام التدرج الكثافة. بعد الطرد المركزي، يتم جمع الخلايا وحيدة النواة الطحال (الشركات المتعددة الجنسيات) ويتم إثراء CD5 إيجابية (CD5 +) الخلايا الليمفاوية لاستخدام حبات مغناطيسية. هي ملطخة الخلايا حبر في جزء CD5 + وقت لاحق مع ^5؛ GalCer محملة CD1d tetramer وتنقيته بواسطة مضان تنشيط الخلايا الفرز (FACS). فرز FACS خلايا حبر ثم يتم تربيتها في المختبر في البداية باستخدام مزيج من السيتوكينات الفئران المؤتلف ومتجهة إلى لوحة مستقبلات الخلايا التائية (TCR) المنبهات قبل أن يتم توسيعها في وجود الفئران IL-7 المؤتلف. باستخدام هذه التقنية، ما يقرب من يمكن أن تتولد 10 8 خلايا حبر داخل 18-20 يوما للثقافة، وبعد ذلك يمكن أن تستخدم لفحوصات وظيفية في المختبر، أو في التجارب المجراة نقل في الفئران.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الفئران القاتل الطبيعي ثابتة T (حبر) الخلايا السكان متميزة من الخلايا الليمفاوية T الفطرية المحدد في الغدة الصعترية من قبل، معربا عن CD1d thymocytes القشرية 1،2. خلايا حبر تعبر عن مستقبلات الخلايا التائية (TCR) تتألف من سلسلة ثابتة Vα14-Jα18 TCR يقترن إما Vβ8، Vβ7 أو Vβ2 TCRs 3، التي هي قادرة على الاعتراف الذاتية فضلا عن مستضدات دهن الخارجية في سياق CD1d. على سبيل المثال، الخلايا حبر الفئران تعترف ويتم تفعيلها من قبل يسمى مستضد isoglobotrihexosylceramide الدهون الذاتية (iGb3) 4، وكذلك α-galactosylceramide (αGalCer) 5،6، وشحمي سكري معزولة من الإسفنج البحري. TCR التي تعتمد على تنشيط الخلايا حبر يعزز فتيلة من الاستجابات المناعية التكيفية، ونتيجة لذلك، وقد ثبت خلايا حبر أن تكون المشاركة وظيفيا في تحسين أو تطوير مجموعة واسعة من الأمراض بما في ذلك أمراض الروماتيزم 7 وسرطان <سوب> 8. حاليا، الاصطناعية بروابط خلية حبر تشكل المواد المساعدة لقاح جديدة واعدة قد تكون قادرة على تنظيم عدد من الشروط immunopathological.

وقد سبق أن ثبت أن الخلايا حبر يمكن أن تتولد في المختبر التالية بمعزل عن الماوس الأنسجة ولكن؛ العديد من هذه الدراسات توظيف واستخدام الخلايا الأولية المقدمة للمستضد (ناقلات الجنود المدرعة) و / أو خطوط الخلايا 9، Vα14 TCR المعدلة وراثيا (تيراغرام) الفئران 10، أو thymomas لتوليد حبر المشتقة من الخلايا الهجينة 11،12. وعلاوة على ذلك، فإن أعدادا كبيرة من الفئران، كميات كبيرة من المواد الكيميائية مثل dimers CD1d αGalCer تحميلها، والأوقات ثقافة طويلة تجعل بعض البروتوكولات نشرت أقل من الناحية الأخلاقية وجذابة اقتصاديا 9،13.

في هذا التقرير وصفنا طريقة تكييفها لعزل والتوسع في المختبر من خلايا حبر من الماوس الطحال. وبشكل أكثر تحديدا، ويصف بروتوكول طريقةلتخصيب خلايا حبر من الطحال الماوس مما يقلل من الفئران والكواشف والوقت اللازم لFACS فرز الخلايا، ويقترح نهجا الأمثل لتوسيع خلايا الطحال حبر فرزها في المختبر.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في هذه الدراسة، تم استخدام الكبار (6-8 أسابيع) من الإناث C57BL / 6 الفئران. تم إيواء الفئران ولدت وفقا للمبادئ التوجيهية للالحظيرة جامعة غنت. وقد وافق جميع الإجراءات الحيوانية من لجنة الرعاية والأخلاقيات المؤسسية الحيوان.

1. إعداد الخلايا وحيدة النواة (الشركات المتعددة الجنسيات) من الماوس الطحال

  1. التضحية الماوس عن طريق خلع عنق الرحم.
  2. ضع الماوس أسفل الظهر على متن تشريح وتحديد هند واليدين مع دبابيس.
  3. تعقيم سطح الجلد مع 70٪ (المجلد / المجلد) الايثانول / H 2 O.
  4. قطع الجلد على طول خط الوسط في البطن إلى الصدر وفضح الطحال باستخدام الأدوات الجراحية المعقمة.
  5. بعد التشذيب الأنسجة الدهنية المحيطة بها، ووضع الطحال إلى لوحة 24 جيدا تحتوي على 1 مل 1X الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) في RT.
  6. تشريح الطحال باستخدام مشرط معقم ونقل القطع إلى تصفية 70 ميكرومتر النايلون وضعها داخل حوض 50 مله.
  7. باستخدام 2 مل حقنة الغطاس، الهريس بلطف قطع الطحال من خلال مصفاة الخلية ويغسل مع 5 مل 1X PBS.
  8. إضافة 3 مل من Ficoll-Paque إلى أنبوب 15 مل وتراكب المتوسطة الكثافة التدرج مع 5 مل تعليق الخلوية.
  9. أجهزة الطرد المركزي في 400 x ج لمدة 20 دقيقة في RT دون فرامل.
  10. نقل البيني لأنبوب 15 مل الطازجة، إضافة 10 مل الباردة برنامج تلفزيوني 1X وأجهزة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 10 دقيقة على 4 درجات مئوية.
  11. resuspend الخلايا في 2 مل 1X PBS تحتوي على 0.5٪ ألبومين المصل البقري (BSA) و1 ملم ثنائي أمين الإيثيلين رباعي حمض الخل (EDTA) (العازلة FACS). نقل 10 ميكرولتر من تعليق خلية إلى أنبوب صغير، وتخلط مع 10 ميكرولتر من 0.4٪

2. والإثراء، كشف وتنقية خلايا الفأر حبر

  1. إثراء الماوس الطحال CD5positive (CD5 +) الخلايا الليمفاوية.
    1. (اختياري) وصمة عار 10 5 الخلايا مع FITC، مترافق مكافحة CD5 (4 ميكرولتر من 1:30 تخفيف / 10 6 خلايا)لمدة 30 دقيقة في 4 درجات مئوية في الظلام، ويغسل مع 200 ميكرولتر FACS العازلة و resuspend في 500 ميكرولتر العازلة FACS. إعداد 20 ميكرومتر حل عمل 4، 6-diamidino-2-phenylindole (دابي) في برنامج تلفزيوني 1X، إضافة 1 ميكرولتر منها إلى 10 5 خلايا في المخزن FACS واحتضانها في RT لمدة 5 دقائق. الحصول على 10 4 خلايا التخصيب قبل على تدفق عداد الكريات.
      1. باستخدام FCS-H وFCS-W، بوابة إلكترونية على خلايا لو FSC-W لاستبعاد الحلل الخلايا والمجاميع (الشكل 1A). ثم إلكترونيا بوابة الخروج دابي + (القتلى) الخلايا داخل FSC-W لو السكان (الشكل 1B)، وتستخدم SSC-A وFCS-A لتحديد إلكترونيا السكان اللمفاويات حسب الحجم (الشكل 1C).
      2. استخدام الخلايا داخل بوابة اللمفاويات، مؤامرة SSC-A مقابل CD5 وإلكترونيا بوابة CD5 + الخلايا الليمفاوية كما هو مبين في الشكل 1D. الحصول على ما تبقى من عينة ما قبل التخصيب على تدفق عداد الكريات.
    2. ضبط عدد الخلايا إلى 10 7 خلايا في 90 ميكرولتر في المخزن FACS وإضافة 10 ميكرولتر بلي مكافحة CD5.
    3. احتضان عند 4 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة، ويغسل مرة واحدة مع 4 مل FACS العازلة و resuspend في 500 ميكرولتر العازلة FACS الباردة. إثراء لCD5 + الخلايا اللمفية باستخدام فصل الخلايا المغناطيسي (MACS) أعمدة وفقا لتوصيات الشركة الصانعة.
    4. اختياري) وصمة عار 10 5 الخلايا مع FITC مترافق مكافحة CD5 (4 ميكرولتر من 1:30 تخفيف / 10 6 خلايا) ودابي كما في 2.1.1. الحصول على 10 4 الخلايا الليمفاوية المخصب على قياس التدفق الخلوي والتحقق من أن البوابات الإلكترونية خلقت في 2.1.1. حدد CD5 + الخلايا اللمفية في جزء الخلوي المخصب. الحصول على 10 5 الخلايا على قياس التدفق الخلوي وتحليل نسبة CD5 + الخلايا الليمفاوية الموجودة في جزء المخصب كما هو مبين في الشكل 1E - H.
  2. كشف وعزل الماوس حبر مLLS بواسطة FACS.
    1. و resuspend المخصب CD5 + الخلايا الليمفاوية بتركيز حوالي 10 6 خلايا في 20 ميكرولتر في FACS العازلة التي تحتوي على معاداة CD16 / CD32 (4 ميكرولتر من 1:50 تخفيف / 10 6 خلايا) وαGalCer PE-مترافق / CD1d tetramer (1 ميكروغرام / 10 6 خلايا).
    2. احتضان لمدة 30 دقيقة في RT في الظلام.
    3. تمييع الأجسام المضادة الماوس (MABS) المضادة للCD3ε V500 (4 ميكرولتر من 1:20 تخفيف / 10 6 خلايا)، ومكافحة CD19 E450 (4 ميكرولتر من 1:50 تخفيف / 10 6 خلايا) ومكافحة CD8α E450 (4 ميكرولتر من 1:50 تخفيف / 10 6 خلايا) في المخزن FACS، إضافة إلى CD5 + الخلايا الليمفاوية واحتضان لمدة 30 دقيقة على 4 درجات مئوية في الظلام.
    4. غسل الخلايا مع 1 مل FACS العازلة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 10 دقيقة على 4 درجات مئوية، وresuspend في 4 مل FACS العازلة بتركيز نهائي من 10 7 خلية / مل.
    5. تصفية الخلايا من خلال مصفاة الخلية 30 ميكرومتر ووضع الخلايا على الجليد.
    6. معايرة قياس التدفق الخلوي للخلية الفرز وفقا لتوصيات الشركة الصانعة 14،15.
      ملاحظة: معايرة من الكريات تدفق لفرز الخلايا تتطلب التدريب ويمكن أن يقوم بها عامل من ذوي الخبرة، أو فني مدرب.
    7. إضافة 10 ميكرولتر من 20 ميكرومتر حل عمل دابي في 10 6 خلايا ويحضن في RT لمدة 5 دقائق. الحصول على ما يقرب من 10 4 المخصب CD5 + الخلايا الليمفاوية على تدفق عداد الكريات. بوابة إلكترونيا على خلايا لو FSC-W لاستبعاد الحلل الخلايا والمجاميع (الشكل 2A). ثم إلكترونيا بوابة الخروج دابي + CD8 + CD19 + الخلايا (قناة تفريغ) في FSC-W لو السكان (الشكل 2B)، واستخدام SSC-A وFCS-A لتحديد إلكترونيا الخلايا الليمفاوية (الشكل 2C) كما هو موضح في 2.1.1.1 .
      1. مؤامرة αGalCer / CD1d tetramer التي كتبها CD3ε وإلكترونيا بوابة αGalCer / CD1dالخلايا tetramer + CD3ε + حبر كما هو مبين في الشكل 2D. الحصول على ما لا يزيد عن 2 × 10 5 CD5 + الخلايا الليمفاوية المخصب لتحديد النسبة المئوية للαGalCer / CD1d tetramer + CD3ε + حبر خلايا موجودة في جزء الخلوي المخصب.
    8. استخدام البوابات الإلكترونية التي تم إنشاؤها في 2.2.7. والخلايا FACS الفرز αGalCer / CD1d tetramer + CD3ε + حبر على قياس التدفق الخلوي في 70 رطل باستخدام فوهة 70 ميكرون بمعدل تدفق '1.5'. جمع الخلايا حبر فرزها في أنبوب FACS تحتوي على 1 مل 100٪ FCS. شطف بعد ذلك خلايا حبر مرتبة من جانب أنبوب FACS باستخدام 10 مل RMPI 1640 المتوسطة وأجهزة الطرد المركزي الخلايا في 300 x ج لمدة 10 دقيقة على 4 درجات مئوية.
    9. و resuspend فرز الخلايا حبر في 1 مل RPMI 1640 متوسطة والحصول على 40 ميكرولتر ذلك على تدفق عداد الكريات لتقييم نقاء من الخلايا حبر فرزها. حدد FSC-W لو دابي - اللمفاوياتالصورة كما هو موضح في 2.2.7. (الشكل 2E - G) وإلكترونيا بوابة αGalCer / CD1d الخلايا tetramer + CD3ε + حبر كما هو مبين في الشكل 2H.

3. الثقافة والتوسع في خلايا الفأر حبر

اليوم 0

  1. معطف 96 لوحة جيدا مسطحة القاع مع تنقيته مكافحة CD3ε (3 ميكروغرام / مل) لكل بئر لمدة 1 ساعة على RT. يغسل مرتين مع 200 ميكرولتر برنامج تلفزيوني 1X ومرة ​​واحدة مع 200 ميكرولتر كاملة RPMI 1640 متوسطة (10٪ المجلد / المجلد FCS، 100 U / مل البنسلين، الستربتومايسين، 5.5 ميكرومتر β المركابتويثانول).
  2. حساب عدد خلايا قابلة للحياة مرتبة حبر (الخطوة 2.2.8) باستخدام 0.4٪ عدادة الكريات كما في 1.11.، الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية و resuspend في 5 × 10 5 خلية / مل في كامل RPMI 1640 متوسطة تحتوي المؤتلف IL-2 الفئران (10 نانوغرام / مل)، المؤتلف الفئران IL-12 (1 نانوغرام / مل)، وذوبان لمكافحة فأر CD28 (5 ميكروغرام / مل). لوحاتorted خلايا حبر في 10 5 خلايا / جيد في مكافحة CD3ε لوحات المغلفة واحتضان عند 37 درجة مئوية في CO 2 الحاضنة لمدة 2 أيام.

يوم 2

  1. نقل الخلايا إلى غير المصقول 96 لوحة جيدا مسطحة القاع الطازجة والثقافة الخلايا تحت الظروف يستريح في كامل RPMI 1640 متوسطة عند 37 درجة مئوية في CO 2 الحاضنة لمدة 2 أيام.

اليوم 4

  1. إزاحة الخلايا من لوحة طيف من قبل pipetting ونقل الخلايا إلى أنبوب 15 مل الطازجة. أجهزة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية، و resuspend في 5 × 10 5 خلية / مل في كامل RPMI 1640 متوسطة تحتوي على المؤتلف IL-7 الفئران (5 نانوغرام / مل)، وصفيحة 10 5 خلايا / جيد في flat- القاع 96 لوحة جيدا لمدة 4 أيام في 37 درجة مئوية في CO 2 الحاضنة.

اليوم 8

  1. جمع الخلايا في أنبوب جديد، الطرد المركزي في 300 ×ز لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية و resuspend في 5 × 10 5 خلية / مل في كامل RPMI 1640 متوسطة تحتوي على ذوبان مكافحة CD28 (5 ميكروغرام / مل).
  2. معطف 96 لوحة جيدا مسطحة القاع مع تنقيته مكافحة CD3ε (3 ميكروغرام / مل) لكل بئر وغسل كما في 3.1. لوحة 5 10 خلايا / جيد في مكافحة CD3ε لوحات المغلفة واحتضان عند 37 درجة مئوية في CO 2 حاضنة حتى يوم 11.

اليوم 11-18

  1. كرر الخطوات من 3،4-3،6.

اليوم 19-20

  1. نقل الخلايا إلى أنبوب 15 مل الطازجة، الطرد المركزي في 300 x ج و resuspend في 5 × 10 5 خلية / مل في كامل RPMI 1640 متوسطة.
  2. لوحة الخلايا في 10 5 خلايا / جيد في 96 لوحة جيدا مسطحة القاع وتسمح للخلايا للراحة لمدة 2 أيام عند 37 درجة مئوية في حاضنة CO 2 قبل استخدامها في تجربة.

4. خلوى الإنتاج عن طريق خلايا حبر ماوس باستخدام CD1d بلاتالفحص محددة ه

  1. معطف 96 لوحة جيدا مسطحة القاع مع 100 ميكرولتر من الفئران المؤتلف CD1d (10 ميكروغرام / مل في برنامج تلفزيوني 1X) لكل بئر واحتضان لمدة 1 ساعة على 37 درجة مئوية.
  2. غسل أربع مرات مع 200 ميكرولتر 1X PBS، إضافة 200 ميكرولتر من 2٪ FCS في برنامج تلفزيوني 1X (حل حجب) لكل بئر واحتضان لمدة 2 ساعة على 37 درجة مئوية.
  3. إزالة عرقلة الحل، إضافة 200 ميكرولتر من αGalCer (5 نانوغرام / ميكرولتر) لكل بئر، واحتضان لوحة عند 37 درجة مئوية لمدة 16 ساعة. [للإعداد الحل αGalCer، إضافة 1085 μ برنامج تلفزيوني 1X إلى 55 ميكروغرام من αGalCer الذائبة في السيارة تحتوي على 96 ملغ / مل السكروز، 10 ملغ / مل deoxycholate الصوديوم و 5 ملغ / مل توين 20].
  4. بعد الحضانة، وتجاهل الحل αGalCer ويغسل جيدا مرتين مع 200 ميكرولتر 1X PBS تليها 200 ميكرولتر كاملة RPMI 1640 متوسطة.
  5. جمع الخلايا في المختبر حبر توسعت في يوم 21، الطرد المركزي الخلايا في 300 x ج لمدة 10 دقيقة على 4 درجات مئوية، وresuspend في R الكاملPMI 1640 المتوسطة بتركيز 0.5 × 10 6 خلية / مل.
  6. إضافة 200 ميكرولتر من إعادة تعليق الخلية حبر لكل بئر واحتضان لمدة 72 ساعة على 37 درجة مئوية في CO 2 الحاضنة.
  7. جمع طاف وقياس السيتوكينات من الفائدة عن طريق انزيم مرتبط immunosorbant فحص (ELISA) وفقا لبروتوكول الشركة الصانعة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

عزل الخلايا وحيدة النواة الطحال باستخدام التدرج الكثافة يستغرق حوالي 1 ساعة ويلغي استخدام الكواشف اللازمة لليز خلايا الدم الحمراء (كرات الدم الحمراء). يتم الحصول على عائد مرتفع من خلايا قابلة للحياة باستخدام هذه الطريقة والحطام ولدت خلال توتير من الجهاز يتم إزالة. عادة، وتواتر الخلايا حبر ضمن مجموعة اللمفاويات الطحال يتراوح بين 1 و 5٪ من مجموع الخلايا الليمفاوية T ولكن هذا يمكن أن تختلف تبعا لحالة العمر والجنس وصحة الحيوانات المستخدمة. ما يقرب من 10 6 خلايا حبر يمكن الح...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وتشمل الخطوات الحاسمة في البروتوكول الحالي العزلة وإثراء لاحق من CD5 + الخلايا اللمفية (القسم 1 & 2)، FACS الفرز (القسم 3) والطلاء الأولي من خلايا حبر (القسم 4). من الخطوات التي تؤدى في القسم 1، تذكر أن طبقة بعناية تعليق الخلوي الطحال على التدرج الكثافة المتوسطة بحيث يتم إنشاء البيني الخلوية متميزا التالية الطرد المركزي. إثراء لاحق لCD5 + الخلايا اللمفية المغناطيسي فصل الخلية (القسم 2) يقلل من الكواشف والوقت اللازم لوصمة عار لوFACS خلايا النوع حبر (القسم ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين مصالح متنافسة للإفصاح عنها.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

DE و M.B.D. أعضاء في منصة بحثية متعددة التخصصات (MRP) في جامعة غنت ، واتحاد باحثي غنت حول البروتينات غير المطوية في الأمراض الالتهابية (GROUP-ID).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
المواد
الفئران المؤتلف IL-2eBiosciences14-8021
الفئران المؤتلف IL-12eBiosciences39-8122-65
الفئران المؤتلف IL-7eBiosciences14-8071
منقى مضاد للفأر CD3e (145-2C11)eBiosciences16-0032-86
منقى مضاد للفأر CD28 (37.51)eBiosciences16-0281-85
e450 مترافق مضاد للفأر CD19 (eBio1D3)eBiosciences48-0193-82
e450 مترافق مضاد للفأر CD8 & ألفا ؛ (53-6.7)eBiosciences48-0081-82
CD5 مضاد للفأر مترافق FITC (53-7.3)eBiosciences11-0051-81
V500 مترافق مضاد للفأر CD3 & epsilon ؛ (500 أ 2)BD Biosciences560771
الميكروبيدات CD5 المضادة للفأر (Ly-1)Macs Miltenyi Biotec130-049-301
النقية المضادة للفأر CD16 / 32 (2.4G2)Macs Miltenyi Biotec130-092-575
MACS MS ColumnsMacs Miltenyi Biotec130-042-201
Trypan Blue ، 0.4٪ (بالوزن / المجلد)Gibco15250-061
RPMI 1640 متوسطGibco12633-020
1x PBSGibco10010-056[Ca2 + < / sup> / Mg 2 + < / sup> - مجاني]
مصل ربلة الساق الجنينيةGibco10270
L-GlutamineGibco25030-123
Penicillin-StreptomycinSigma-AldrichP4458-100ML
مصل الألبومينالبقريسيجما ألدريتشA7906-100MG
& beta - MercaptoethanolSigma-AldrichM3148
حمض الإيثيلين ديامين تترا أسيتيك   ;سيجما ألدريتشEDS-1KG
Ficoll-Paque plusGE Healthcare71-7167-00 AF
Equipment
96-well لوحة F-bottomGreiner-bioone 657-160
24-بئر لوحةGreiner-bio one665-180 6-6-180
لوحةGreiner-bio واحدة655-180
15 مل فالكون أنبوبGreiner-bio واحد188-271
50 مل Falcon TubeGreiner-bio one227-261
70 & micro; مرشح مGreiner-bio واحد542-070
30 & مرشح mMilliporeSVGP01050
فاصل MiniMACSMac Miltenyi Biotec130-042-102
MS ColumnsMacs Miltenyi Biotec130-042-201
حاضنة CO2 مغلفة بالماءVWR
طقم تشريحVWR
FACSAria ثالثادكتوراه في العلوم البيولوجية
مقياس الدم VWR BD

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bendelac, A., Rivera, M. N., Park, S. H., Roark, J. H. Mouse CD1-specific NK1 T cells: development, specificity, and function. Annu Rev Immunol. 15, 535-562 (1997).
  2. Kronenberg, M., Gapin, L. The unconventional lifestyle of NKT cells. Nat Rev Immuno. 2, 557-568 (2002).
  3. Park, S. H., et al. The mouse CD1d-restricted repertoire is dominated by a few autoreactive T cell receptor families. J Exp Med. 193, 893-904 (2001).
  4. Zhou, D., et al. Lysosomal glycosphingolipid recognition by NKT cells. Science. 306, 1786-1789 (2004).
  5. Cardell, S., et al. CD1-restricted CD4+ T cells in major histocompatibility complex class II-deficient mice. J Exp Med. 182, 993-1004 (1995).
  6. Kawano, T., et al. CD1d-restricted and TCR-mediated activation of valpha14 NKT cells by glycosylceramides. Science. 278, 1626-1629 (1997).
  7. Drennan, M. B., Aspeslagh, S., Elewaut, D. Invariant natural killer T cells in rheumatic disease: a joint dilemma. Nat Rev Rheumatol. 6, 90-98 (2010).
  8. Terabe, M., Berzofsky, J. A. NKT cells in immunoregulation of tumor immunity: a new immunoregulatory axis. Trends Immunol. 28, 491-496 (2007).
  9. Molling, J. W., et al. Generation and sustained expansion of mouse spleen invariant NKT cell lines with preserved cytokine releasing capacity. J Immunol Methods. 322, 70-81 (2007).
  10. Chiba, A., et al. Rapid and reliable generation of invariant natural killer T-cell lines in vitro. Immunology. 128, 324-333 (2009).
  11. Gumperz, J. E., et al. Murine CD1d-restricted T cell recognition of cellular lipids. Immunity. 12, 211-221 (2000).
  12. Behar, S. M., Podrebarac, T. A., Roy, C. J., Wang, C. R., Brenner, M. B. Diverse TCRs recognize murine CD1. J Immunol. 162, 161-167 (1999).
  13. Watarai, H., Nakagawa, R., Omori-Miyake, M., Dashtsoodol, N., Taniguchi, M. Methods for detection, isolation and culture of mouse and human invariant NKT cells. Nature protocols. 3, 70-78 (2008).
  14. Houtz, B., Trotter, J., Sasaki, D. BD FACService TECHNOTES. 9 (4), (2004).
  15. Osborne, G. W. A method of quantifying cell sorting yield in 'real time'. Cytometry. Part A : the journal of the International Society for Analytical Cytology. 77, 983-989 (2010).
  16. Drennan, M. B., et al. The thymic microenvironment differentially regulates development and trafficking of invariant NKT cell sublineages. J Immunol. 193, 5960-5972 (2014).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

iNKT CD1d

مقالات ذات صلة