مقالة منهجية

التصوير تلألؤ بيولوجي لنموذج مناعيا الحيوان ورم أرومي دبقي

16.2K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/53287

⸱

يناير 15, 2016

 ,  ,  , 
1Department of Neurological Surgery, University of California San Francisco, 2Department of Neurological Surgery, Northwestern University Feinberg School of Medicine, 3Biochemistry and Molecular Genetics, Northwestern University Feinberg School of Medicine

في هذه المقالة

ملخص

توفر خلايا الورم الدبقي

GL261 نموذجا حيوانيا مفيدا للمناعة للورم الأرومي الدبقي. تتمثل أهداف هذا البروتوكول في إظهار التقنيات المناسبة لمراقبة نمو الورم داخل الجمجمة باستخدام التصوير الحيوي في الجسم الحي ، والتحقق من فائدة خلايا GL261 المعدلة باللوسيفيراز لدراسة مناعة الورم وأساليب العلاج المناعي لعلاج الورم الأرومي الدبقي.

الملخص

على عكس النماذج الحيوانية للورم الدبقي البشري المبلغ عنها بشكل شائع ، تلخص الطعوم الغريبة للورم الدبقي الفأراني GL261 تقريبا جميع السمات السريرية والنسيجية المرضية ذات الصلة بالمرض البشري. عندما يتم زرع خلايا GL261 داخل الجمجمة في الفئران المتزاصلة C57BL / 6 ، يتمتع النموذج بميزة إضافية تتمثل في الحفاظ على بيئة مكروية مناعية سليمة. يسمح التعبير المستقر عن لوسيفيراز في خلايا GL261 بمراقبة التلألؤ البيولوجي غير الجراحي الفعال من حيث التكلفة لنمو الورم داخل الجمجمة. لقد أظهرنا مؤخرا أن تعبير لوسيفيراز في خلايا GL261 لا يؤثر على خصائص نمو الورم ، أو التعبير المناعي للخلايا السرطانية ، أو تسلل الخلايا المناعية إلى الورم ، أو البقاء الكلي للحيوانات التي تحمل الورم داخل الجمجمة. لذلك ، يبدو أن نموذج الورم الدبقي GL261 luciferase يمكن أن يكون مفيدا في دراسة طرائق العلاج الكيميائي والعلاج المناعي الجديدة. نبلغ هنا عن تقنية توليد تعبير لوسيفيراز مستقر في خلايا GL261 وكيفية دراسة النمو في المختبر وفي الجسم الحي للخلايا السرطانية عن طريق التصوير الحيوي.

المقدمة

الورم الدبقي الخبيث هو أورام الدماغ البشرية الأكثر شيوعا والأكثر فتكا. حتى عند العلاج بالاستئصال الجراحي الأقصى والعلاج الإشعاعي والعلاج الكيميائي ، يظل متوسط البقاء على قيد الحياة 15-20 شهرا في مراكز الإحالة الرئيسية لأورام المخ1 ، 2 ، 3. يتميز الشكل الأكثر عدوانية للورم الدبقي الخبيث ، وهو الورم الأرومي الدبقي ، بالأشكال الانقسامية ، والأوعية الدموية الجديدة ، والغزو إلى الدماغ المجاور ، والنخر الكاذب. لعبت الطعوم الغريبة لأورام الدماغ التقويمية باستخدام خلايا ورم الدماغ البشري وظيفة أساسية في أبحاث الأورام العصبية وسهلت الترجمة قبل السريرية لاختبار العوامل الجديدة ، قبل الدخول في التجارب السريرية البشرية. في حين أن معظم نماذج الطعم الغريب البشري تلخص العديد من ميزات المرض البشري ، فإن القيد الأساسي في جميع أنظمة نماذج الطعم الطبيعي القائمة على الإنسان هو استخدام التي تعاني من نقص المناعة4.

يؤدي عدم وجود استجابة مضيف سليمة إلى تعديل نمو الورم بوضوح من حيث مورفولوجيا الورم وكفاءة النقش. في حين أن بعض الافتراضات مقبولة في تفسير النتائج من النماذج المطعمة ، فإن تحقيق الاستنتاجات ذات الصلة في مجال التقييم العلاجي يمثل تحديا. من المحتمل أن تكون بعض السمات البيولوجية الأساسية متشابهة في التي تعاني من نقص المناعة والمناعة ، ولكن من المحتمل أن تكون السمات الأخرى مثل الالتهاب المرتبط بالورم ، وغزو الأنسجة ، والاستجابة للإصابة مختلفة تماما. في المقابل ، فإن GL261 عبارة عن خط خلية للورم الدبقي في الفئران مستحث كيميائيا يلخص بدقة الورم الدبقي عند زرعه في أدمغة الفئران المتزاوية C57BL / 6 ذات الكفاءة المناعية5. على غرار المرض البشري ، يؤدي نمو الورم داخل الجمجمة بسرعة وبشكل متكرر إلى أعراض عصبية وزوال6-10.

يمكن قياس نمو الورم تحت الجلد < p class = 'jove_content'> مباشرة. لا يمكن قياس نمو الورم داخل الجمجمة إلا بالتضحية بالحيوانات أو من خلال دراسات التصوير المكلفة. يسمح التعبير المستقر لإنزيم لوسيفيراز بالتصوير التلألؤ البيولوجي داخل الجمجمة غير الغازية والفعالمن حيث التكلفة 11. يرتبط التلألؤ البيولوجي لخلايا GL261 المنقولة لوسيفيراز جيدا بنمو الورم داخل الجمجمة. لقد قارنا مؤخرا GL261 بشكل مباشر بخلايا GL261 المعدلة لوسيفيراز ولم نظهر أي اختلاف في النمو والغزو في المختبر ، أو ملف تعريف السيتوكين المناعي ، أو البقاء على قيد الحياة في الجسم الحي للورم داخل الجمجمة الذي يحمل الفئران C57BL / 6 ، أو تسلل الخلايا المناعية. هذه التقنية قابلة للتطبيق على الدراسات قبل السريرية للورم الأرومي الدبقي والتي تتضمن مراقبة غير جراحية لنمو الورم.

البروتوكول

وقد تم استعراض جميع الإجراءات الموضحة أدناه والموافقة عليها من قبل استخدام الحيوان واللجنة المؤسسية العناية في جامعة نورث وسترن وأجريت تحت ظروف معقمة.

1. تعديل الخلايا GL261 مع اليراع luciferase المراسل تعرب عن المراسل

ملاحظة: ناقلات lentiviral المستندة HIV-1 تعبر عن يراعة luciferase (Fluc) تحت سيطرة الطحال فيروس تشكيل التركيز (SFFV) المروج. وقد تم استنساخ الجين مراسل البصرية إلى البلازميد ناقلات pHRSIN-CSGW-dlNotI.

  1. الحفاظ على 293-T الخلايا في تعديل متوسطة النسر Dulbecco و(DMEM) تستكمل مع المصل 10٪ بقري جنيني (FBS) والخلايا GL261 في RPMI المتوسطة تستكمل مع 10٪ FBS و 1٪ البنسلين، الستربتومايسين عند 37 درجة مئوية في جو مرطب يحتوي على 95 ٪ الجوية و5٪ ثاني أكسيد الكربون (CO 2).
  2. عندما تصل زراعة الخلايا 293-T 80٪ confluency في T-75 قارورة، وغسل خلايا مرة واحدة مع فتاهosphate عازلة المالحة (PBS) دون CA2 + وMG2 +، احتضان الخلايا مع 3 مل من التربسين (0.05٪) عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق، يسحن مع ماصة 5 مل من خلال عقد القارورة مائل قليلا وجمع كل الخلايا من أسفل القارورة. نقل مل 3 من تعليق خلية trypsinized إلى 15 مل أنبوب مخروطي الشكل، وإضافة 7 مل من اللحم RPMI المتوسطة (أي ما مجموعه 10 مل من تعليق خلية).
  3. مزيج تعليق خلية بشكل جيد مع ماصة 5 مل. أخذ 100 ميكرولتر من تعليق خلية من الأنبوب وحساب عدد الخلايا باستخدام عدادة الكريات. للقيام بذلك، مزيج 100 ميكرولتر من تعليق خلية مع 300 ميكرولتر من محلول أزرق التريبان وإدراج 2 ميكرولتر من الخليط في عدادة الكريات. حساب عدد الخلايا دون تلطيخ الأزرق من أربع جهات منفصلة تحت المجهر. متوسط ​​عدد الخلايا من كل رأي، ويمثل هذا العدد 10 4 خلية / مل.
  4. وفي الوقت نفسه، الطرد المركزي الأنبوب الذي يحتوي على تعليق خلية في 300 x ج لمدة 7 دقائق. نضح وسائل الإعلام و resuspend الكريات الخلايا مع الطازجة المتوسطة RPMI لجعل التعليق خلية GL261 في كثافة 1.0 × 10 6 / مل. البذور 2.5 × 10 6 خلايا GL261 مع 2.5 مل من وسائل الاعلام RPMI في قارورة T-175 مع 27.5 مل DMEM (يوم 1).
  5. بعد 24 ساعة، استبدال المتوسطة مع 20 مل DMEM جديدة (اليوم 2).
  6. لإنتاج ناقلات lentiviral، مزيج 54 ميكرولتر كاشف ترنسفكأيشن مع 2 مل المصل DMEM مجانا لمدة 5 دقائق. إضافة 3 ميكروغرام من هفوة-POL، 3 ميكروغرام من فيروس التهاب الفم الحويصلي G المغلف (VSV-G)، و 4.5 ميكروغرام من Fluc (pSIN-Fluc) في DMEM مع ترنسفكأيشن الكاشف، واحتضان لمدة 20 دقيقة في RT. إسقاط خليط الحمض النووي بأكمله إلى 293-T قارورة (T-175)، واحتضان عند 37 درجة مئوية في غرفة ترطيب تحتوي على 95٪ الجوية و 5٪ CO 2 لمدة 48 ساعة (يوم 2).
  7. إضافة 10 مل من DMEM جديدة في 24 ساعة بعد ترنسفكأيشن (إجمالي حجم 293-T مستنبت الخلية يجب أن يكون حوالي 30 مل) (اليوم 3).
  8. لتقسيم الخلايا GL261 إلى24 لوحة جيدا، وغسل خلايا مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني دون CA2 + وMG2 +، احتضان الخلايا مع 5 مل من التربسين (0.05٪) عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق، يسحن مع ماصة 5 مل من خلال عقد القارورة مائل قليلا ، وجمع كل الخلايا من أسفل القارورة، وعدد الخلايا عبر عدادة الكريات كما في الخطوة 1.2. وفي الوقت نفسه، الطرد المركزي الأنبوب في 300 x ج لمدة 7 دقائق. نضح وسائل الإعلام و resuspend الكريات الخلايا مع الطازجة المتوسطة RPMI لجعل التعليق خلية GL261 في كثافة 2.5 × 10 4 / مل. البذور 2.5 × 10 4 خلايا GL261 مع 1 مل من وسائل الاعلام RPMI في 24 لوحة جيدا (اليوم 3).
  9. جمع 30 مل من طاف lentiviral مع 10 مل ماصة من 293-T قارورة (T-175) في 48 ساعة ترنسفكأيشن التالية ونقل طاف في أنبوب مخروطي 50 مل. نضح في 30 مل طاف lentiviral عن طريق حقنة 50 مل، من خلال مرشح حقنة 0.22 ميكرون، وقسامة وطاف الفيروسي في 1 مل قسامات (يوم 4).
  10. استبدال 1 مل من RPMI المتوسطة في لوحة الخلايا GL261 (24 أيضا) مع 1 مل من طاف lentiviral واحتضان عند 37 درجة مئوية في غرفة ترطيب (يوم 4).
  11. بعد 48 ساعة من الإصابة lentiviral، استبدل المتوسطة مع 1 مل من RPMI الطازجة (اليوم 6).
  12. بعد 24 ساعة، كرر عدوى lentiviral من الخلايا GL261 (يوم 7).
  13. بعد ساعة 2 الثانية 48 من عدوى lentiviral، استبدل المتوسطة مع 1 مل من RPMI الطازجة (اليوم 9).
  14. تستمر في النمو وluciferase المراسل تعديل الخلايا GL261 (أن يشار إلى خلايا GL261.luc) وتوسيع ثقافة الخلية إلى T-75 قارورة.
  15. عندما تصل زراعة الخلايا GL261.luc 70٪ confluency في T-75 قارورة، حصاد الخلايا trypsinization والاعتماد من قبل عدادة الكريات كما في الخطوة 1.2. لوحة الخلية GL261.luc في 24 لوحة جيدا بكثافات تخرجه (1.0 × 10 6، 5،0 × 10 5، 2.5 × 10 5، 1.0 × 10 5 و 5.0 × 10 4، 2.5 × 10 4 خلايا / جيد) و احتضان عند 37 درجة مئوية في humidified غرفة تحتوي على 95٪ الجوية و 5٪ CO 2 لمدة 3 ساعة.
  16. قياس luciferase النشاط الخلوية بالنسبة إلى luciferase المراسل تعديل U-87 MG (U87.luc) الخلايا باستخدام التصوير تلألؤ بيولوجي (الشكل 1).
    1. بدء تشغيل البرنامج صورة (انقر أيقونة على سطح المكتب) وتهيئة نظام التصوير (انقر على زر "تهيئة"). وسوف تبدأ التهيئة تلقائيا ويمكن أن يستغرق عدة دقائق لنظام فحص والكاميرا ليبرد إلى -90 ° C.
    2. إضافة 25 ميكرولتر من وسيفيرين (D-وسيفيرين ملح البوتاسيوم، 150 ملغ / كلغ) في كل بئر.
    3. احتضان الخلايا مع وسيفيرين لمدة 1 دقيقة في RT وصورة لوحة لمدة 10 ثانية. لإعداد نظام التصوير، حدد "الفلورسنت"، "10 ثانية" وقت التعرض، و "المتوسطة" binning. وضع لوحة 24-جيدا على محطة التصوير وانقر على زر "اكتساب" لبدء الصورة.
    4. بعد حصلت على الصورة بنجاح، سترى نافذة الصورة وأداة السلطة الفلسطينيةlette على الشاشة. انقر على زر "العائد على الاستثمار (المناطق ذات الاهتمام) أدوات" واختر 6 × 4 من رمز الشق. إنشاء 6 × 4 الشقوق لتغطية المنطقة من إشارة على صورة لوحة 24 جيدا وانقر فوق علامة التبويب القياسات (رمز القلم الرصاص). مراقبة نافذة مع جدول القياسات ROI كوحدة من الفوتونات في الثانية لكل ستيراديان لكل سم مربع (الفوتونات / ثانية / ريال / سم 2).
    5. الخلايا استخدام U87.luc أو تعديل من قبل مع نفس الفيروسة البطيئة المستخدمة هنا لGL261 تعديل 11، كعنصر تحكم لتقييم luciferase النشاط في خلايا GL261.luc transduced.

2. في المختبر انتشار الفحص

  1. عندما تصل إلى مزارع الخلايا GL261 وGL261.luc 70٪ confluency في T-75 قارورة، حصد كل من خطوط الخلايا التي trypsinization والاعتماد كما في الخطوة 1.2، وخلايا لوحة إلى لوحة 96-جيدا في كثافة الخلايا في 1500 80 ميكرولتر من RPMI المتوسطة لكل بئر باستخدام ماصة الأقنية لتقليل الوقت والخطأ pipetting ل. SEإد كل سطر الخلية إلى مجموعه 20 بئرا. للحد من تبخر في الآبار من قبل خلايا بالسكان، وملء الآبار فارغة مع 100 ميكرولتر من الطازجة المتوسطة RPMI.
  2. تقييم انتشار الخلوي باستخدام اللونية فحص تكاثر الخلايا. نحن هنا استخدام MTS تكاثر الخلايا الفحص. باستخدام ماصة متعدد القنوات، إضافة 20 ميكرولتر من MTS كاشف في كل بئر من لوحة 96-جيدا أن يحتوي على خلايا.
  3. احتضان لوحة عند 37 درجة مئوية في غرفة ترطيب تحتوي على 95٪ الجوية و 5٪ CO 2 لمدة 3 ساعة. قياس الامتصاصية في 490 نانومتر باستخدام قارئ صفيحة ميكروسكوبية. ويتكرر هذا في أيام 1 و 2 و 4 و 7، بعد الطلاء. لتطبيع القيم الامتصاصية، وتنقسم قيم كل يوم القراءات المقابلة التي تم الحصول عليها في يوم 1 (الشكل 2).

3. ورم زرع الخلايا

ملاحظة: الأوتوكلاف جميع المعدات. إعداد المنطقة الجراحية عن طريق الرش مطهر (حل الكلورهيكسيدين 2٪)، وتغطي مع مستمصر الستائر. من أجل الحفاظ على ظروف معقمة، وارتداء القفازات الجراحية المعقمة أثناء الجراحة، وتقسيم منطقة العمليات الجراحية إلى منطقتين بواسطة شريط اللون. منطقة 1 يسمى "نظيفة" وتحتوي على إمدادات تعقيمها. المنطقة 2 هو المسمى "القذرة" ويحتوي على المواد المستخدمة.

  1. قبل الجراحة الحيوانية، وإعداد تعليق خلية للحقن داخل القحف. حصاد الخلايا من متكدسة 70٪ T-75 قارورة من قبل trypsinization وعدد الخلايا عبر عدادة الكريات كما في الخطوة 1.2، وجعل التعليق خلية في مناطق ذات كثافة من 1.0 × 10 5 خلية / ميكرولتر في هانكس "محلول الملح المتوازن دون الكالسيوم و2+ ملغ 2+ (HBSS).
  2. تخدير الفئران مع حقن داخل الصفاق من 200 ميكرولتر خليط يحتوي على 100 ملغم / كغم من الكيتامين و 10 ملغم / كغم من زيلازين في المياه المالحة 0.9٪. لتأكيد التخدير المناسبة، قرصة إصبع القدم من الفأرة. إذا كان الماوس تماما تحت التخدير، ويجب أن الماوس لا يستجيب لحافز.
  3. إدارة 0.1 مترز / كغم البوبرينورفين عن طريق الحقن تحت الجلد لتخفيف الألم بعد الجراحة.
  4. حلاقة الجزء العلوي من الرأس من الحيوانات باستخدام كليبرز ونظيفة مع قضيب من القطن طرف مغموسة في 2٪ محلول الكلورهيكسيدين. تطبيق مرهم العين للحفاظ على تزييت كاف أثناء الجراحة.
  5. جعل شق السهمي حوالي 1 سم فوق العظم الجداري القذالي باستخدام مشرط معقم. لتصور bregma، ويمسح سطح الجمجمة مع قضيب من القطن طرف غارقة في 3٪ من محلول بيروكسيد الهيدروجين.
  6. حفر الجمجمة مع العقيمة إبرة 25-G لجعل صغير حفرة 3 مم إلى يمين bregma وخلف الدرز الإكليلي.
  7. للتأكد من أن موقع الحقن داخل القحف هو على عمق 3 مم من الجمجمة، وقطع 3 مم قبالة نهاية مدببة من طرف ماصة 20 ميكرولتر باستخدام مقص وإدراج حقنة في تلميح ماصة.
  8. إدراج حقنة عموديا إلى الحفرة التي تم إنشاؤها مسبقا، وحقن ببطء سوس الخلايا السرطانية التقاعد تحتوي على 3.0 × 10 5 خلايا في 3 ميكرولتر HBSS، خلال الفترة من 1 دقيقة. ترك الإبرة في المكان لمدة دقيقة أخرى، ثم سحب ببطء الإبرة.
  9. مسحة الجمجمة مع القطن طرف قضيب مغموسة في 3٪ بيروكسيد الهيدروجين وحل الكلورهكسيدين 2٪. تجف على سطح الجمجمة مع قضيب من القطن طرف. قطع الشمع العظام العقيمة 3mm وحوالي 3 في حجم وإرفاق الشمع العظام على الجانب نهاية قضيب من القطن طرف. تطبيق الشمع العظام لتغطية الحفرة مع قضيب من القطن طرف.
  10. رسم كل جانب من فروة الرأس معا خلال الجمجمة باستخدام ملقط، والعنصر الرئيسي لإغلاق الجرح. تنظيف الجرح مع طرف القطن مغموسة في 2٪ محلول الكلورهيكسيدين.
  11. رصد جميع الفئران بعد العملية حتى تصبح متنقل والاحتفاظ النشاط العادي. عادة، وقت الانتعاش ما يقرب من 30 دقيقة. لا عودة الفئران إلى قفص مع غيرها من الحيوانات إلا بعد أن تعافى تماما من التخدير.

معشوقة = "jove_title"> 4. التصوير تلألؤ بيولوجي من GL261 نمو الأورام

  1. رش كمية سخية من مطهر (0.05٪ محلول كلوريد الأمونيوم ثنائي ميثيل) على منشفة ورقية نظيفة. استخدام منشفة ورقية غارقة في مطهر للقضاء تماما على ورقة سوداء، والأقماع الأنف والمفرق داخل غرفة التصوير حيث الحيوانات ستكون على اتصال مع الجهاز. مسح شامل لجميع الأسطح مع نظيفة، منشفة ورقية جافة. كرر هذا مرة أخرى وانتظر 5 دقائق.
  2. تهيئة المحطة التصوير كما في الخطوة 1.14.1.
  3. تخدير الفأر مع مزيج 300 ميكرولتر تحتوي على 200 ميكرولتر من الكيتامين / زيلازين و 100 ميكرولتر من وسيفيرين (D-وسيفيرين ملح البوتاسيوم، 150 ملغ / كلغ) عن طريق الحقن داخل الصفاق.
  4. انتظر 10 دقيقة بعد الحقن وتأكيد ما اذا كان الفئران هي تماما تحت التخدير عن طريق معسر الذيل. لإعداد نظام التصوير، حدد "الفلورسنت"، "السيارات" وقت التعرض، و "المتوسطة" binning. وضع الفئران في الستاتي التصويرعلى وانقر على زر "اكتساب" لبدء الصورة. تأكد من أن الوقت بعد الحقن يتسق مع كل دورة التصوير.
  5. بعد حصلت على الصورة بنجاح، يجب أن تظهر نافذة الصورة واللوحة الأداة. انقر على زر "أدوات ROI" وحدد "تلقائي" من رمز الدائرة. لتحديد رويس، تطويق المنطقة من إشارة على الصورة، ثم أخذ قياسات العائد على الاستثمار مع وحدة من الفوتونات / ثانية / ريال / سم 2.
  6. اتخاذ الفئران من غرفة التصوير ومراقبة الفئران حتى تصبح متنقل والاحتفاظ النشاط العادي. عادة وقت الانتعاش ما يقرب من 15 دقيقة. لا عودة الفئران إلى قفص مع غيرها من الحيوانات إلا بعد أن تعافى تماما من التخدير.
  7. مراقبة نمو الورم عن طريق التصوير تلألؤ بيولوجي مرتين في الأسبوع حتى الحيوانات تظهر الأعراض التالية: فقدان الوزن (فقدان أكثر من 20٪ نسبة إلى الوزن قبل الزرع)، inappetance (فقدان الشهية كامل لمدة 24 ساعة)، وعدم وجود purposefu استدامةاستجابة ل لمحفزات لطيف (محاولة ضعيفة الحصول على ما يصل)، في الوقت الذي كان ينبغي أن يتم التخلص. الموت ببطء الحيوانات مع هذه الأعراض باستخدام غرفة CO 2 تليها خلع عنق الرحم.
    1. مكان الفئران في غرفة القتل الرحيم (لا مكتظة الغرفة) وتدفق مضغوط CO 2 لمدة 5-6 دقيقة. نلاحظ أن جميع الحيوانات هي فقدان الوعي ولا يتنفس بعد حوالي 5 دقائق.
    2. اتخاذ الفئران من الغرفة. تأكد من أن القلب لا ينبض عن طريق الشعور الصدر بين الإبهام والسبابة وتحقق من عدم وجود رد فعل طرفة.
    3. كبح الماوس في وضعية الرقود على سطح مستو وفهم الجزء الخلفي من الرقبة في قاعدة الجمجمة مع يد واحدة وقاعدة الذيل مع الإبهام والإصبع الأول من ناحية أخرى.
    4. تقييد الرأس وبسرعة سحب الذيل إلى الوراء. ضمان فصل أن الجمجمة من أول فقارة عنق الرحم باستخدام الإبهام والإصبع الأول.
  8. معياراليز القيم التلألؤ عن كل يوم ضد قراءات المقابلة التي تم الحصول عليها في اليوم الأول من التصوير تلألؤ بيولوجي كما في الخطوة 2.3 (الشكل 3A).
  9. للتحليل الإحصائي، وتوليد منحنيات البقاء على قيد الحياة باستخدام مقدر كابلان ماير 12 و مقارنة الاختلافات بين منحنيات البقاء على قيد الحياة باستخدام اختبار سجل المرتبة 13.

النتائج

أصيب الخلايا GL261 مع luciferase المراسل تحتوي على الفيروسة البطيئة كما هو موضح أعلاه في خطوات يوضح 1. في المختبر التصوير تلألؤ بيولوجي قوي التعبير luciferase المراسل مشابهة للمستويات في السيطرة الإيجابية U87.luc ورم أرومي البشري خط الخلية (الشكل 1). كما هو متوقع، والخلايا GL261 غير المصابة تبين عدم التعبير luciferase المراسل الخلفية. هذه الخطوة هي بسيطة ولكنها حاسمة لأداء قبل إجراء المزيد من الدراسات باستخدام خط الخلية المصابة لتأكيد مستقر التعبير luciferase المراسل.

التعبير luciferase المراسل بعد زرع داخل الجمجمة.

قبل زرع داخل الجمجمة، أثبتنا أي اختلاف في معدل النمو المختبر من GL261.luc بالمقارنة مع خلايا GL261 (الشكل 2). للنمو داخل الجمجمة وتحليل البقاء على قيد الحياة، تم حقن الخلايا في غرفة واحدةتم تحليل اهلية ت من C57BL / 6 الفئران حسب بروتوكول الخطوة 3. نمو الاورام في الفئران الحاملة الأورام GL261.luc متسلسل للتصوير تلألؤ بيولوجي باستخدام بروتوكول خطوة 4 وأظهرت نمو الورم كشفها (الشكل 3A). أصبحت الفئران الحاملة الأورام GL261.luc بسرعة وباستمرار تحتضر والموت الرحيم كانت. الأهم من ذلك، لا يوجد فرق في البقاء على قيد الحياة بين GL261.luc وGL261 الورم تحمل الحيوانات (الشكل 3B). وبالتالي، يمكن في الجسم الحي تلألؤ بيولوجي التصوير استخدامها لمراقبة استجابة للعلاجات ورم أرومي التجريبية. السريع نمو الورم موثوق بها والبقاء على قيد الحياة قصيرة يمكن أن تسفر عن كميات كبيرة من البيانات في فترة قصيرة نسبيا من الزمن.

figure-results-1
الشكل 1. luciferase النشاط في خلايا GL261.luc. U87.luc، كانت مطلية خلايا GL261.luc وGL261 (المراقبة السلبية) في كثافة1.0 × 10 6، 5،0 × 10 5، 2.5 × 10 5، 1.0 × 10 5 و 5.0 × 10 4، و 2.5 × 10 4 خلايا / جيد من اليسار إلى اليمين. وقد تم قياس التلألؤ (الفوتون / ثانية / ريال / سم 2) من خلال محطة التصوير لومينا. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-2
الشكل 2. luciferase المراسل التعبير لا يؤثر على تكاثر الخلايا GL261. GL261.luc الخلايا لا يسبب الفرق في الانتشار كما يتبين من MTS تكاثر الخلايا الفحص. ويبين الرسم البياني أضعاف، مقارنة اليوم 1، على النحو الذي يحدده بمقارنة متوسط ​​قيمة الامتصاصية (يعني ± SEM) في نقطة زمنية thespecified إلى متوسط ​​قيمة في يوم 1 (المفردة ر القيم -test للمقارناتبين كل خط الخلية: P = 0.7796) 14. أشرطة الخطأ تمثل متوسط ​​القيم (يعني ± SEM) من عينات quadruplicate في كل يوم. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-3
الشكل 3. luciferase المراسل التعبير جرعة لا يؤثر على نمو الورم في الجسم الحي والبقاء على قيد الحياة الحيوانية. (A) رصد ضوء بارد يوضح النمو التدريجي للداخل الجمجمة الورم GL261.luc في C57BL / 6 الفئران. (B) يوضح كابلان ماير تحليل البقاء على قيد الحياة لا فرق في البقاء على قيد الحياة بالنسبة للفئران زرع intracranially مع أي GL261 (خط الصلبة) أو GL261.luc الخلايا (خط متقطع).الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

المناقشة

GL261 خلايا الورم الفئران، عندما زرعت intracranially إلى مناعيا مسانج C57BL / 6 الفئران، وتقديم العديد من المزايا مقارنة مع الورم طعم أجنبي نماذج حيوانية الإنسان. تنمو العديد من الأورام xenografted كما الآفات مغلفة التي لا ألخص بدقة الأمراض التي تصيب البشر الغازية. في المقابل، GL261 الورم يوضح ليس فقط الغزو في الدماغ المجاورة، ولكن أيضا اتساع الأوعية الدموية، والشخصيات الإنقسامية، ونخر عميق 7. الأهم من ذلك عند دراسة علم المناعة الورم أو استراتيجيات immunotherapeutic 15، 16، يحتفظ الماوس C57BL / 6 الجهاز المناعي سليمة 8. وقد أظهرت دراسات سابقة التعبير القوي للمناعة خلوى TGF-β والأورام داخل الجمجمة تحتوي على خلايا T التنظيمية المثبطة للمناعة مشابهة لورم أرومي البشري 9، 10.

تقنية بسيطة وصفها هنا يسمح للتعبير مستقر من luciferase المراسل من قبل خلايا GL261. لقد ذكرت مؤخرا سيميلار في التجارب المختبرية ونمو الجسم الحي من خلايا GL261.luc بالمقارنة مع خلايا GL261، بالإضافة إلى خصائص الورم نسيجية مماثلة، والخلايا المناعية تسلل 17. خلايا GL261.luc التعبير عن ثابت luciferase المراسل الذي يحفز أكسدة الركيزة luciferin تحويل الطاقة الكيميائية إلى فوتونات الضوء وبالتالي يمكن كشفها. وسيفيرين يمكن أن تدار بشكل آمن للحيوانات ويعبر حاجز الدم في الدماغ بعد الحقن داخل الصفاق أو عن طريق الوريد. في حيوانات التجارب الصغيرة مثل الفئران، ويمكن أن يتم الكشف عن تلألؤ بيولوجي في الخارج بطريقة غير الغازية 11. ولذلك، نمو الورم يمكن تقييمها بشكل متسلسل دون الحاجة إلى التضحية الحيوانية أو مكلفا MRI أو التصوير CT.

الخطوات الحاسمة في البروتوكول تشمل، ليس فقط تنبيغ lentiviral، ولكن أيضا التحقق من التعبير مستقر من luciferase المراسل في المختبر قبل البدء في أي التجارب في الجسم الحي. فقدان تنبيغ قد REQUIإعادة عدوى الفيروسة البطيئة تكرار. ويمكن أيضا إدخال الجينات المقاومة للمضادات الحيوية في ناقلات التعبير أن تستخدم لتحديد للتعبير عن luciferase المراسل. مطلوب تقنية دقيقة لزرع داخل الجمجمة لوضع بتكاثر عدد ثابت من الخلايا في الموقع التشريحي الدقيق للسماح للمقارنة بين مجموعات العلاج المختلفة. وهناك فرق كبير بين الدراسة الحالية والدراسات السابقة من luciferase المراسل معربا عن الخلايا GL261 هو استخدام تقنية الحرية لزرع خلايا مقارنة مع استخدام إطار المجسم 18. لقد أثبتنا سابقا نتائج زرع متسقة مع اليد تقنية حرة (19). الاستفادة من تقنية الحرية هي القدرة على إجراء تحليلات إنتاجية عالية وكلاء معاملة مختلفة. في أيدينا، ونحن يمكن زرع حوالي 60 حيوانا في 1 ساعة.

بعد إتقان هذه التقنية، والتطبيقات المستقبلية للتقنية لا حدود لهما. كما GL261 demonstrآتش مرتفعة mitoses ونمو الأورام السريع مشابه لورم أرومي البشري، يمكن تقييم العلاجات المضادة للالتكاثري. وبالمثل، العلاجات المضادة للالغازية والمعادية للعائية ويمكن استخدام الأورام GL261 هي الغازية وعائية. ينبغي توخي الحذر عند تقييم تأثير العلاج الكيميائي وكلاء تستهدف أهدافا الإنسان. مقارنة مع الدراسات السابقة باستخدام xenografts ورم أرومي الإنسان معربا عن luciferase المراسل 20، وهذا من شأنه أن يعتبر الحد من نموذجنا. أيضا، وأثر استراتيجيات immunotherapeutic من نمو الورم يمكن دراستها في نموذج xenografted GL261.

الإفصاحات

لا يوجد تضارب في المصالح للإفصاح عنه.

شكر وتقدير

نود أن نشكر راجوانت كور على المساعدة الفنية. نود أن نشكر ماكسويل توم على المساعدة في إعداد فيروس العدس. تم دعم هذا العمل من قبل كرسي رضا وجورجيانا الخطيب الممنوح في جراحة أورام قاعدة الجمجمة في جامعة كاليفورنيا في سان فرانسيسكو ، وأستاذ ورئيس مايكل جيه مارشيز في جامعة نورث وسترن.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
D-Luciferin, ملح البوتاسيومالذهب BiotechonologyLUCK-100تخزين بعيدا عن الضوء
برنامج الصور الحيةالفرجار علومالحياة الاتصال للحصول على اقتباسلا شيء
XenogenLumina الفرجار علومالحياة الاتصال للحصول على اقتباسلا
24-بئر; ثقافة الأنسجة القياسية; Falcon353047
CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay PromegaG3582none
Synergy 2 Multi-Mode ReaderBioTekContact for Quotenone
96 well Assay Plate ، لوحة سوداء ، قاع شفاف مع غطاء ، ثقافة الأنسجة TretaedCoster3603none
KetasetPfizerNDC 0856-2013-01مادة التحكم
XylazineSigma-Aldrich23076-35-9none
28G إبرة (مع حقنة) فيشر   22-004-270AKA حقنة الأنسولين
2٪ الكلورهيكسيدينفيشرNC9756995AKA " نولفاسان"
3٪ بيروكسيد الهيدروجينفيشرH312P-4يخزن بعيدا عن مرهم
العيونالخفيف Cardinal Health1272830AKA " دموع أكوا"
25G 1 1/2 إبرةBD Becton Dickinson305127لا شيء
مشارط يمكن التخلص منهاريشة2975رقم 21
شاشفيشر22028563الأوتوكلاف قبل الاستخدام
وسادة تسخينDunlapHP950لا شيء
دباسة الجلد ، الدبابيس ، مزيلStoelting59020لا شيء
PDI Alchol Prep PadsFisher23-501-711لا شيء
Reflex 7 مم مشابك الجرح 100 عبوةBrain Tree Scientific ، INC203 1000الأوتوكلاف قبل الاستخدام
Reflex 7 مم مشبك الجرح تطبيقشجرة الدماغ العلمية ، INC204 1000الأوتوكلاف قبل الاستخدام
Reflex 7 مم مزيل مشبك الجرحشجرة الدماغ العلمية ، INC205 1000لا شيء
طرف دائري أحادية النهاية بمقبض خشبيQosmedix10107الأوتوكلاف قبل الاستخدام
محلول الملح المتوازن هانكس بدون Ca2 + و Mg2 + (HBSS)Gibco14170-112none
Hamilton SyringeHamilton80300none
FuGENE 6 كاشف التعداءPromegaE2961لا شيء
شمع العظامهارفارد599864لا شيء
شيء مسحة جهاز

المراجع

  1. Clark, A. J., et al. Neurosurgical management and prognosis of patients with glioblastoma that progresses during bevacizumab treatment. Neurosurgery. 70 (2), 361-370 (2012).
  2. Stupp, R., et al. Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma. N Engl J Med. 352 (10), 987-996 (2005).
  3. Grossman, S. A., et al. Survival of patients with newly diagnosed glioblastoma treated with radiation and temozolomide in research studies in the United States. Clin Cancer Res. 16 (8), 2443-2449 (2010).
  4. Sughrue, M. E., et al. Immunological considerations of modern animal models of malignant primary brain tumors. J Transl Med. 7 (84), (2009).
  5. Ausman, J. I., Shapiro, W. R., Rall, D. P. Studies on the chemotherapy of experimental brain tumors: development of an experimental model. Cancer Res. 30 (9), 2394-2400 (1970).
  6. Zagzag, D., Zhong, H., Scalzitti, J. M., Laughner, E., Simons, J. W., Semenza, G. L. Expression of hypoxia-inducible factor 1alpha in brain tumors: association with angiogenesis, invasion, and progression. Cancer. 88 (11), 2606-2618 (2000).
  7. Cha, S., et al. Dynamic, contrast-enhanced perfusion MRI in mouse gliomas: correlation with histopathology. Magn Reson Med. 49 (5), 848-855 (2003).
  8. Ksendzovsky, A., et al. Investigation of immunosuppressive mechanisms in a mouse glioma model. J Neurooncol. 93 (1), 107-114 (2009).
  9. Biollaz, G., et al. Site-specific anti-tumor immunity: differences in DC function, TGF-beta production and numbers of intratumoral Foxp3+ Treg. Eur J Immunol. 39 (5), 1323-1333 (2009).
  10. El Andaloussi, A., Han, Y., Lesniak, M. S. Prolongation of survival following depletion of CD4 + CD25+ regulatory T cells in mice with experimental brain tumors. J Neurosurg. 105 (3), 430-437 (2006).
  11. Dinca, E. B., et al. Bioluminescence Monitoring of Intracranial Glioblastoma Xenograft Response to Primary and Salvage Temozolomide Therapy. J. Neurosurg. 107 (3), 610-616 (2007).
  12. Kaplan, E. L., Meier, P. Non-parametric estimation from incomplete observations. J. Am. Stat. Assoc. 53, 457-481 (1958).
  13. Peto, R., Peto, J. Asymptotically efficient rank invariant procedures. J. R. Stat. Soc. Ser. A. Stat. Soc. 135, 185207(1972).
  14. Armitage, P., Berry, G., Matthews, J. N. S. Statistical Methods in Medical Research. , 4th ed, Blackwell Science. Oxford. (2001).
  15. Newcomb, E. W., et al. The combination of ionizing radiation and peripheral vaccination produces long-term survival of mice bearing established invasive GL261 gliomas. Clin Cancer Res. 12 (15), 4730-4737 (2006).
  16. Pellegatta, S., et al. Neurospheres enriched in cancer stem-like cells are highly effective in eliciting a dendritic cell-mediated immune response against malignant gliomas. Cancer Res. 66 (21), 10247-10252 (2006).
  17. Clark, A. J., et al. Stable luciferase expression does not alter immunologic or in vivo growth properties of GL261 murine glioma cells. J Transl Med. 12, 345-34 (2014).
  18. Abdelwahab, M. G., Sankar, T., Preul, M. C., Scheck, A. C. Intracranial implantation with subsequent 3D in vivo bioluminescent imaging of murine gliomas. J Vis Exp. (57), e3403(2011).
  19. Ozawa, T., James, C. D. Establishing intracranial brain tumor xenografts with subsequent analysis of tumor growth and response to therapy using bioluminescence imaging. J Vis Exp. (41), (2010).
  20. Baumann, B. C., Dorsey, J. F., Benci, J. L., Joh, D. Y., Kao, G. D. Stereotactic intracranial implantation and in vivo bioluminescent imaging of tumor xenografts in a mouse model system of glioblastoma multiforme. J Vis Exp. (67), (2012).

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

GL261
التصوير تلألؤ بيولوجي لنموذج مناعيا الحيوان ورم أرومي دبقي
اتصل بنا
أوصِ بها للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

2026 © حقوق الطبع والنشر MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.