مقالة منهجية

نموذج الخلايا البطانية مستو التصوير المناعية سنبس حيوية

DOI:

10.3791/53288

⸱

ديسمبر 24, 2015

 , 
1Department of Medicine, Harvard Medical School - BIDMC

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتم التحكم في المناعة التكيفية من خلال "المشابك المناعية" الديناميكية المتكونة بين الخلايا التائية والخلايا العارضة للمستضد. يصف هذا البروتوكول طرق التحقيق في الخلايا البطانية على أنها APCs فسيولوجية غير مدروسة وكنوع جديد من "نموذج APC الخلوي المستوي".

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وينظم المناعة التكيفية التي كتبها التفاعلات الدينامية بين الخلايا T ومستضد الخلايا ("ناقلات الجنود المدرعة ') يشار إليها باسم" نقاط الاشتباك العصبي المناعية. داخل هذه الواجهات خلية خلية الحميمة مجموعات فرعية الخلوية منفصلة من MHC / حج-TCR، F-الأكتين، التصاق والجزيئات يشير شكل واعادة تشكيلها بسرعة. ويعتقد أن هذه الديناميات أن تكون العوامل الحاسمة من كفاءة ونوعية الاستجابات المناعية التي تقوم بتطوير وبالتالي حماية مقابل حصانة مرضية. الفهم الحالي للنقاط الاشتباك العصبي المناعية مع فيزيولوجي ناقلات الجنود المدرعة محدودة بسبب عدم كفاية القرار تصوير الحصول عليها. رغم أن النماذج الركيزة الاصطناعية (مثل طبقات ثنائية الدهون مستو) توفر قرار ممتاز، وكانت أدوات قيمة للغاية، فهي بطبيعتها غير فيزيولوجي والتبسيط. ظهرت الأوعية الدموية واللمفاوية الخلايا البطانية بمثابة حجرة الأنسجة الطرفية هامة (أو اللحمية) من "شبه مهنةآل ناقلات الجنود المدرعة. هذه ناقلات الجنود المدرعة (التي تعبر عن معظم الآلات الجزيئية المهنية ناقلات الجنود المدرعة) لديها ميزة فريدة من تشكيل سطح الخلية مستو تقريبا وهي transfectable بسهولة (على سبيل المثال، مع الصحفيين بروتين فلوري). هنا إحدى الوسائل الأساسية لتنفيذ الخلايا البطانية كما رواية وفيزيولوجي "مستو نموذج APC الخلوي 'لتحسين التصوير والاستجواب من عمليات إشارات المستضدات الأساسية سوف يمكن وصفها.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

T الليمفاوية هي فرع من نظام المناعة التكيفية التي تتميز القدرة على التعرف على كفاءة الببتيد المستضد (حج) منضمة إلى رئيسي معقد التوافق النسيجي (MHC) الجزيئات من خلال مستقبلات الخلايا T الخاصة بهم (TCRs) 1. اللمفاويات السذاجة تهاجر بشكل جوهري ومسح "حج تقديم الخلايا المهنية" (ناقلات الجنود المدرعة، على سبيل المثال، والخلايا الجذعية) داخل الغدد الليمفاوية، بينما تحتاج خلايا الذاكرة / T المستجيب لدراسة فعالية مجموعة واسعة جدا من ناقلات الجنود المدرعة والخلايا المستهدفة المحتملة داخل الأنسجة الطرفية.

في دقيقة بعد الاعتراف الأولي وما شابه ذلك حج على APC، الخلايا اللمفية اعتقال هجرتهم والبدء في تشكيل الحميمة واجهة خلية خلية متخصصة تسمى "المشبك المناعي" (IS). أصيب (أي 30-60 دقيقة) هو يطلب من الاتصالات لتضخيم والحفاظ يشير 2-7. دراسات الناشئة تحديد ذلك ضمن IS، هو تشكيل المستمر وص السريعemodeling من الإشارات المنفصلة شبه الخلوية مجموعات صغيرة (أي التي تحتوي على MHC / حج-TCR، F-الأكتين، التصاق والجزيئات يشير) التي تحدد قوة وجودة الناتج الاستجابات المناعية 2-7. ومع ذلك، تفاصيل ديناميكية وآلية تنظيمية لهذه العملية هي غير مفهومة تماما 8،9. هذا نابع إلى حد كبير من التحديات الفنية المرتبطة طبولوجيا عدم انتظام السطوح APC والتوجه سيئة تسيطر الطائرات التفاعل خلية خلية، المسائل التي تحد عميقا في التصوير الزمانية المكانية اللازمة النهج 10/08 (Figure1A).

figure-introduction-1

الشكل 1. فسيولوجي مستو نموذج APC خلية التصوير المناعية سنبس حيوية. ويوضح التخطيطي التصوير التقليدي للالمشبك المناعي بين الخلايا التائية والمهنيه نال APC (A) والخلايا التائية ومستو الدهون النموذج التقليدي طبقة ثنائية APC (B) بالمقارنة مع هذه البطانية نموذج مستو APC رواية (C). توفر ناقلات الجنود المدرعة المهنية نقاط الاشتباك العصبي المناعية الفسيولوجية ولكن تقدم سيئة موجهة اجهة خلية خلية (أي فيما يتعلق طائرة التصوير س ص المثلى؛ والقرار ~ 0.2 ميكرون)، والذي يعرض للخطر بشكل كبير المكاني (طائرة التصوير ض قرار ~ 1 ميكرون)، والزمانية (أي، بسبب الحاجة لمسح مرارا وتكرارا من خلال جميع الطائرات ض التصوير) قرار من التصوير. نماذج طبقة ثنائية لديها طوبولوجيا مستو الذي يوفر الأمثل القرار التصوير الزمانية المكانية، ولكن أيضا مبسطة للغاية، غير الفسيولوجية وجامدة. هذا النموذج الخلايا البطانية يجمع بين طوبولوجيا مستو من طبقات ثنائية الدهون مع الركيزة الفسيولوجية من APC الكلاسيكية لتقديم الأمثل القرار التصوير المكاني والزماني في وضع فيزيولوجي.م / ملفات / ftp_upload / 53288 / 53288fig1large.jpg "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

العمل السابق والتحايل جزئيا على هذه العقبات من خلال تطوير نماذج مستو الركيزة (أي طبقات ثنائية الدهون والأسطح المغلفة الأجسام المضادة) التي توفر قرار الزمانية المكانية الأمثل (أي عن طريق تحديد T تنشيط الخلايا السطحية في خطة واحدة التي هي موازية لتصوير س ص الأمثل الطائرة) 11-15 (الشكل 1B). وقد سهلت هذه النماذج معلومات هامة في ديناميات التحت خلوية / الجزيئية التي تتحكم في الإشارات المستضدات في الخلايا T، بما في ذلك اكتشاف الأكتين ديناميكية / TCR يشير-مجموعات الصغيرة 7،11-14. ومع ذلك، فإن التبسيط بطبيعتها مثل هذه النماذج، وكذلك جامدة (النافية للتنمية / دراسة الخصائص الطبوغرافية 3-الأبعاد) (الشكل 1B). ولذلك، فإنه لا يزال غير مؤكد كيفية ربط هذه النتائج إلى فيزsiologic خلية خلية المراقبة المناعية.

وإن كان لا يزال دراسة سلوكه، الأوعية الدموية والخلايا البطانية اللمفاوية آخذة في الظهور كما كبيرة (أي أكبر في أعداد من جميع ناقلات الجنود المدرعة المهنية، التي كتبها ~ 1000 مرات) حجرة الطرفية من "شبه المحترفين ناقلات الجنود المدرعة 16-18. هذه الخلايا تعبر عن MHC-I-، MHC-II- وعدد كبير من الجزيئات المشارك مشجعا (على سبيل المثال، CD40، LFA3، ICOSL، 4-1BB، OX40L، TL1A، PD-L1، ولكن لا CD80 CD86 و) وهي استراتيجيا وضعه في واجهة الأنسجة الدموية التي يعملون فيها وظائف الحارس المتخصصة 16-18. وأظهرت دراسات سابقة أن الخلايا البطانية على نحو فعال إعادة تحفيز المستجيب / الذاكرة، ولكن ليس ساذجا، وخلايا T 19-25. وبالتالي، من المرجح أن يلعب أدوار APC فريدة من نوعها في المرحلة المستجيب من الاستجابات المناعية التكيفية داخل الأنسجة الطرفية، مثل التأثير المحلي على T تنشيط الخلايا، والتمايز، والذاكرة والتسامح 16،17،26 الخلايا البطانية. CRItically، عندما نمت في المختبر، الخلايا البطانية شكل سطوح الخلايا مستو تقريبا وهي transfectable بسهولة (على سبيل المثال، مع الصحفيين بروتين فلوري). هذه الميزات هي مثالية عالية الدقة التصوير الزمانية المكانية لديناميات الطوبوغرافية خلال التفاعلات خلية خلية 19،27. وهكذا الخلايا البطانية قد تكون بمثابة فيزيولوجي "مستو الخلوي APC" النموذجية مناسبة مميزة لدراسة آليات إعادة التحت خلوية / الجزيئية التي تدفع الاعتراف مستضد وتنظيم الاستجابات (الشكل 1C) 19،20.

أنشئت سابقا تقنيات التصوير التكميلية (بما في ذلك ترنسفكأيشن من خلايا بطائن مع صانعي بروتين فلوري من غشاء البلازما والعصارة الخلوية) لدراسة تفاصيل تفاعل الكريات البيض البطانية خلال الالتصاق والهجرة transendothelial 27، أظهرت أن الكريات البيض تسبر بنشاط سطح البطانة التي كتبها ديناميكية الإدراج فيد تراجع من ميكرون نطاق الفرعي، نتوءات أسطواني الأكتين الغنية (~ 200-1،000 نانومتر في القطر والعمق) يطلق مثل invadosome نتوءات (أي، "ILPs ') 27،28. تم زيادة توسيع هذه النهج التصوير جنبا إلى جنب مع إنشاء بروتوكولات للاستفادة من البطانية وظيفة APC لتطوير أساليب الأولى لارتفاع القرار التصوير الزمانية المكانية للT خلايا البطانية المشبك المناعي كما ورد 19،20 وكذلك وصف هذا القانون. وكان من النتائج المركزي المستمدة من هذه مستو رواية الخلوية نموذج APC هو أن T ILPs خلية تعمل سواء في تعزيز الكشف حج الأولي والحفاظ على الإشارات اللاحقة. في الواقع، صفائف ILPs متعددة (التي استقرت والمستحقة في الرد المبدئي تدفق الكالسيوم) عرض تخصيب اليورانيوم في TCR والجزيئات توحي الإشارات النشطة مثل PKC-Q، ZAP-70، فسفوتيروزين وHS1. ولذلك، يبدو ILPs لتمثيل يعادل فيزيولوجي ثلاثي الأبعاد لالجزئي TCR-إشاراتمجموعات ينظر في نماذج طبقة ثنائية مستو. هذا النهج، وبالتالي، يكشف بحساسية / تقارير الديناميات الجزيئية والهندسة المعمارية (والضمنية النشاط الحيوي) لا يمكن كشفها خلاف ذلك.

الطريقة الموضحة في هذه الوثيقة يجب أن يكون مفيدا في سد الفجوة بين APC المهنية والصناعية نماذج الركيزة APC من أجل تعزيز قدرتنا على استجواب الآليات الأساسية من الاستجابات المناعية التكيفية. بينما هنا يتم التركيز على تفعيل CD4 + TH1 من نوع المستجيب / خلية الذاكرة، وهذا النهج الأساسي يمكن تعديلها بسهولة لدراسة مجموعة واسعة من أنواع الخلايا T وقسم الخدمات الزراعية، كما هو مبين أدناه.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وتجرى جميع التجارب الموصوفة في هذا البروتوكول مع خلايا T الإنسان الأساسية والخلايا البشرية الأولية المتاحة تجاريا البطانية يجب الموافقة على (عن طريق الجلد أو الرئتين الاوعية الدموية الدقيقة ECS). أي بروتوكول البحوث التي تجرى على البشر من قبل مجلس المراجعة المؤسسية ويجب تقديم موافقة خطية من علم كل متبرع بالدم. تمت الموافقة على التجارب التي أجريت باستخدام هذا البروتوكول من قبل IRB من مركز بيث إسرائيل ديكونيس الطبي.

1. إعداد CD4 + الإنسان TH1 المستجيب / T خلايا الذاكرة

  1. تطبيق وقف النزف لذراع المانحة، ويمسح عرق مع الكحول، وإدراج إبرة. رسم ببطء 15 مل من الدم إلى vacutainer باستخدام EDTA كما تخثر. عندما تم وضع الدم، فك وقف النزف قبل إزالة الإبرة. تطبيق على الفور الضغط على الجرح بشاش معقم عند إزالة إبرة.
  2. نقل الدم إلى أنبوب 50 مل. إضافة RPMI-1640 في RT بنسبة 1: 1 تخفيف (الحجم النهائي 30 مل) تراكب بعناية مخففد الدم على اثنين من 50 مل أنابيب تحتوي على 15 مل من تصفيتها قبل الخلايا اللمفية المتوسطة العزلة مثل Ficoll-Paque في RT.
  3. أجهزة الطرد المركزي التدرج في RT لمدة 30 دقيقة في 1200 x ج في الدوار الدلو المتأرجح. في حين الطرد المركزي إعداد الخلايا التائية المتوسطة (500 مل من RPMI-1640، 50 مل FCS، 5 مل البنسلين / الستربتومايسين).
  4. على إزالة أنبوب 50 مل من أجهزة الطرد المركزي، ومراقبة أربع طبقات: بيليه من خلايا الدم الحمراء في الجزء السفلي، وpaque، وطبقة من الخلايا التي تحتوي على خلايا الدم البيضاء (بما في ذلك الخلايا الليمفاوية) والبلازما. إزالة بعناية طبقة خلايا الدم البيضاء مع ماصة باستور ونقل في أنبوب فالكون 50 مل.
  5. غسل طبقة خلايا الدم البيضاء عن طريق إضافة RT RPMI-1460 (ما يصل الى 20 مل)، والطرد المركزي في RT لمدة 5 دقائق في 1200 ز س. Resuspend وخلايا الدم البيضاء في 1 مل من الخلايا التائية المتوسطة. إضافة 5 ميكرولتر من تعليق 1 مل الخلية إلى 250 ميكرولتر المتوسطة الخلايا التائية في أنبوب 1.5 مل الطرد المركزي وتخلط بلطف صعودا وهبوطا بواسطة ماصة.
  6. إضافة 25 ميكرولتر تمييعد تعليق خلية إلى 25 ميكرولتر 0.4٪ التريبان الأزرق. إضافة 10 ميكرولتر من الخليط على كل جانب من عدادة الكريات القياسية.
  7. وضع عدادة الكريات على انخفاض المجهر ضوء السلطة. باستخدام الهدف 10X حساب عدد الخلايا التي استبعاد الصبغة الزرقاء التريبان وتكون موجودة في الساحة الأوسط من كلا الجانبين من عدادة الكريات الحية.
  8. لحساب تركيز الخلية، مضاعفة متوسط ​​المربعات 2 100 (عامل تمييع) ثم ضرب من قبل 10 4 إلى إعطاء عدد من خلية / مل.
  9. ضبط التركيز النهائي إلى 0.5 × 10 6 خلية / مل في الخلايا التائية المتوسطة. إضافة تركيز النهائي من 1 ميكروغرام / مل كل من superantigens بكتيريا المكورات العنقودية المعوي B (SEB) ومتلازمة الصدمة السامة السم 1 (TSST) إلى الخلايا. الثقافة لمدة 72 ساعة (37 درجة مئوية و 5٪ CO 2) لتوسيع السكان الخلية CD4 + T.
  10. خلايا بيليه T (1200 x ج، 5 دقائق) و resuspend في 0.5 × 10 6 خلية / مل في الخلايا التائية المتوسطة معإضافة البشري IL-15 (20 نانوغرام / مل). نقل الخلايا الليمفاوية إلى قارورة T150. مواصلة توسيع / تقسيم الخلايا في كامل متوسطة IL-15 كل 24-48 ساعة حسب الحاجة (على أساس اللون وسائل الإعلام، أي كلما تتحول وسائل الاعلام من الوردي إلى اللون الأصفر قليلا) بعد ذلك. الحفاظ الناتجة السكان الخلايا اللمفاوية لمدة تصل إلى 15 يوما.
    ملاحظة: حسب التصميم، وهذا البروتوكول تفعيل وتوسيع تحديدا فرعية من الخلايا CD4 + T التي هي رد الفعل لSEB وTSST ومن ثم دفعهم نحو TH1 تشبه النمط الظاهري المستجيب / الذاكرة. خلايا الدم البيضاء الأخرى تفشل في البقاء والنمو في ظل هذه الظروف، ان هذه خطوة 1.10 الخلايا سوف يكون 95٪ على الأقل CD4 +، CD45RO + T الخلايا 19، كما يمكن بسهولة المقررة من قبل التدفق الخلوي. إذا رغبت في ذلك، ويمكن بسهولة أن يتحقق مزيد من التنقية من خلال الأجسام المضادة متاح تجاريا / مغناطيسية حبة مجموعات مختارة إيجابية أو سلبية القائمة.

2. البدء الأولية غشائي الإنسان خلية الثقافة

<رأ>
  • معطف قارورة T25 مع فبرونيكتين (FN) 20 ميكروغرام / مل في برنامج تلفزيوني في ظروف معقمة. ترك في RT لمدة 30-60 دقيقة. إزالة FN وإضافة 5 مل المتوسطة كاملة (غشائي بصل متوسطة (EBM-2) متوسطة تستكمل مع غشائي متوسط ​​النمو (EGM-2) singlequots). قبل احتضان في 37   ° C ثقافة الخلية الحاضنة لمدة 30 دقيقة على الأقل.
  • ذوبان الجليد قارورة من الرئة أو الجلد الإنسان الاوعية الدموية الدقيقة الخلايا البطانية المجمدة (HLMVECs أو HDMVECs) في 37 ° C حمام الماء مع الإثارة لطيف عرضية ل~ 2-3 دقيقة. على الفور نقل الخلايا إلى T25 قارورة تحتوي على وسائل الاعلام قبل تحسنت. دوامة بلطف ووضعه في الحاضنة عند 37 درجة مئوية.
  • تغيير وسائل الاعلام بعد ~ 6/4 ساعة. الاستمرار في تغيير وسائل الاعلام تقريبا كل 48 ساعة (أو عندما يصبح الإعلام الأصفر قليلا) حتى تصل لوحة ~ 90-95٪ confluency.

    • 3. تقسيم العام والتوسع في الخلايا البطانية

    1. تنمو الخلايا إلى ~ 90-95 confluency. وهذا قد يستغرق 2-5 أيام. للتقسيم،إزالة وسائل الإعلام وشطف مع برنامج تلفزيوني. إزالة برنامج تلفزيوني واستبدالها مع حجم الحد الأدنى من 1X الطازجة التربسين (0.5 مل لT25 أو 1.5 مل لT75). دوامة بلطف لتغطية جميع السطح مع التربسين. في احتضان 37 ° C ~ لمدة 5 دقائق. مراقبة المفرزة من الخلايا من لوحة باستخدام المجهر ضوء منخفض الطاقة.
    2. عندما معظم الخلايا تظهر تقريب أو فصل، إضافة 5 الحجم (أي، مقارنة مع حجم التربسين المضافة) من قبل تحسنت الكامل EGM-2 متوسطة وماصة بلطف على سطح القارورة لفصل كل الخلايا.
    3. عد الخلايا البطانية مع عدادة الكريات كما هو موضح في 1،6-1،7. بيليه الخلايا بواسطة الطرد المركزي (5 دقائق، 1200 x ج). إزالة طاف. ضبط تركيز إلى 0.5 مليون خلية لكل مليلتر بإضافة قبل تحسنت الكامل EGM-2 MV وسائل الإعلام.
    4. نقل aliquots من الخلايا إلى أطباق أو قوارير FN المغلفة المناسبة للصيانة. دوامة بلطف ووضع في الحاضنة. تغيير وسائل الإعلام خلال 6-12 ساعة من الطلاء. شو سائل الإعلاميونيتبول أن تتغير تقريبا كل 48 ساعة بعد ذلك.

    4. غشائي ترنسفكأيشن الخلية

    ملاحظة: الابتدائية الخلايا البطانية الحرارية هي ترنسفكأيشن معظم الطرق الكيميائية شيوعا و electroporation. طريقة القائمة على ترنسفكأيشن النووي هو موضح أدناه يسمح للكفاءة ترنسفكأيشن عالية نسبيا (~ 50-70٪). طريقة بديلة الفعلي هو استخدام العدوى عن طريق ناقلات فيروسية المناسبة (انظر التعليقات في مواد الجدول).

    1. إعداد T25 T75 أو قوارير (حسب الحاجة) من HLMVECs أو HDMVECs إلى الكثافة النهائية من 90-95٪ confluency.Coat مع فبرونيكتين (FN) 20ug / مل في برنامج تلفزيوني في ظروف معقمة إما لوحات ثقافة المجهر مثل دلتا-T لوحات (ل الخطوة 5) أو 12 ملم coverslips الزجاج الدائرية وضعها داخل بئر من 24-جيدا لوحة الثقافة الخلية (للخطوة 6) مع كما هو موضح أعلاه (2.1).
    2. إضافة 1 مل من EGM-2 وسائل الإعلام ثقافة إلى أخرى المجهر platesor 0.5 مل لكل 24 جيدا وتتوازن لوحات فيترطيب 37 ° C / 5٪ CO 2 الحاضنة.
    3. الحصاد وعدد الخلايا البطانية كما هو الحال في 3.1-3.3.Centrifuge الخطوات حجم المطلوب من الخلايا (0.5 مليون خلية لكل عينة) في 1200 x ج لمدة 5 دقائق على RT. resuspend الكرية خلية بعناية في 100 ميكرولتر RT الحل ترنسفكأيشن النووي لكل عينة.
    4. الجمع بين 100 ميكرولتر من تعليق خلية مع 1-5 DNA ميكروغرام. نقل خلية / DNA تعليق في كفيت شهادة. يجب أن تغطي عينة أسفل كفيت دون فقاعات الهواء.
      تم استخدام التركيبات التي تستهدف YFP أو DsRed لغشاء الخلية (من خلال N-محطة 20 الأحماض الأمينية من neuromodulin التي تحتوي على إشارة لpalmitoylation posttranslational) وحدها (غشاء YFP وحدها أو غشاء DsRed وحده) أو transfected المشترك مع ملاحظة: علامة الحجمية حشوية (على سبيل المثال، غشاء YFP وقابل للذوبان DsRed). ويمكن استخدام العديد من التباديل من علامات بروتين فلوري.
    5. إغلاق كفيت مع غطاء. إدراج كفيت معتعليق خلية / الحمض النووي في حامل كوفيت من electroporator وتطبيق برنامج Electroporation للS-005. اتخاذ كفيت من صاحب بمجرد الانتهاء من البرنامج.
    6. إضافة ~ 500 ميكرولتر من وسائل الإعلام معايرتها قبل الثقافة لكفيت وإزالة بلطف تعليق خلية من كفيت باستخدام الماصات البلاستيكية نقل المنصوص عليها في عدة ترنسفكأيشن النووية.
    7. لإجراء التجارب باستخدام لوحات ثقافة المجهر تقسيم تعليق خلية من رد فعل واحد بالتساوي بين اثنين من الأطباق التي تحتوي على وسائل الاعلام قبل تحسنت (خطوات 4،2-4،3). لإجراء التجارب باستخدام 24 جيد / لوحة، تقسيم رد فعل واحد بالتساوي بين 3 آبار.
    8. احتضان خلايا في ترطيب 37 ° C / 5٪ CO 2 الحاضنة وتغيير وسائل الاعلام 6/4 ساعة، ومرة أخرى في 12-16 ساعة بعد ترنسفكأيشن.

    5. يعيش التصوير خلية وتحليل

    1. إعداد البطانة Endothelium
      1. اليوم 0: شارك في transfect HLMVECs الابتدائي مع غشاء YFP وقابل للذوبان DsRed عبر nucleofeالتكنولوجيا ction كما هو موضح في الخطوة 4 وطبق على الخلية الحية لوحات ثقافة التصوير.
      2. اليوم 1: استبدال المتوسطة مع المتوسطة الطازجة التي تحتوي على IFN-γ (100 نانوغرام / مل) للحث على MHC-II التعبير. في يوم 2. تحفيز الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل عن طريق إضافة 20 نانوغرام / مل TNF-α الى وسائل الاعلام القائمة.
      3. في يوم 3، واحتضان البطانة مع 1 ميكروغرام / مل كل من superantigens الجرثومي المعوي العنقودية B (SEB) ومتلازمة الصدمة السامة السم 1 (TSST) في 37 ° C لمدة 30-60 دقيقة قبل على الفور إلى التجارب. حذفت هذه الخطوة لظروف السيطرة "-Ag.
    2. إعداد الخلايا اللمفاوية
      1. بالتوازي مع خطوة 5.1.3، وإعداد العازلة A (الفينول الحمراء الخالية HBSS) تستكمل مع 20 ملي HEPES، ودرجة الحموضة 7.4 و 0.5٪ ت / ت ألبومين المصل البشري قبل تحسنت إلى 37 ° C. أخذ عينة من الخلايا الليمفاوية مثقف وتحديد كثافة عن طريق العد مع عدادة الكريات (الخطوة 1،12-1،17).
      2. الطرد المركزي 2000000 خلايا لكل عينة في 1،200 x ج لمدة 5 دقائق على RT في 15 مل أنبوب مخروطي الشكل. A بحيث لا تبقى مجموعات الخلايا وسائل الإعلام نضح وبيليه الخلية و resuspend برفق في 2 مل من العازلة.
      3. إزالة قسامة جديدة من FURA-2 صبغ الكالسيوم وresuspend في DMSO لجعل تركيز الأسهم من 1 ملم.
      4. إضافة 2 ميكرولتر من FURA-2 الحل الأسهم إلى تعليق خلية T (2 ميكرومتر تركيز النهائي)، غطاء الأنبوب وتخلط على الفور من قبل قلب الأنبوب لضمان حتى تشتت الصبغة. في احتضان 37 ° C لمدة 30 دقيقة.
      5. الطرد المركزي كما في الخطوة 5.2.2. نضح العازلة-A والخلايا الليمفاوية بلطف ولكن بدقة Resuspend في 20-40 ميكرولتر من الطازجة العازلة-A.
    3. الخلية الحية الإعداد التصوير واكتساب
      ملاحظة: مجموعة واسعة من أنظمة يمكن استخدامها لخلية حية التصوير مضان على المجاهر ضوء تستقيم ومقلوب. وتشمل المتطلبات الأساسية مصدر مضان ضوء والمرشحات، كاميرا CCD، بمحركات تبديل فلتر ومصاريع، مرحلة ساخنة (أو microscغرفة ساخنة مكتب مستشار رئيس الوزراء، ركوب) وبرامج لاكتساب صورة الآلي. لهذا البروتوكول الفتحة العددية العالية، تضخم عالية (أي، 40X، 63X) يطلب من العدسات غمر النفط لتحقيق القرار المكانية اللازمة. يجب توخي الحذر خاصة في اختيار مصدر مضان المناسب والعدسات لتصوير الكالسيوم المستندة FURA-2 وليس كل متوافقة مع موجات المطلوبة 340/380 نانومتر الإثارة. نهج بديل (متوافقة مع معيار مجموعات مرشح مضان الخضراء والحمراء) يمكن استخدامها مع الأصباغ غير ratiomentic الكالسيوم حساسة (مثل فلوو-4، Rhod-3)، رغم أن هذه لا يمكن quantitate بدقة تدفق الكالسيوم وتوفر سوى قريب / قراءات الكمية.
      1. تشغيل نظام المجهر (PC للعملية، المجهر، وكاميرا CCD، عجلة تصفية وزينون مصباح).
      2. فتح برنامج المعين.
      3. انشاء المجهر / برنامج لالأقنية الآلي الوقت الفاصل بين التصوير. تشمل الاستحواذ متتابعة من الإعلاناتعلى النقيض ifferential تدخل (DIC)، مخضر القياسية، يتألق الأحمر القياسية ومستوى 340 و 380 نانومتر الإثارة FURA-2 الصور. تعيين الفاصل الزمني لاقتناء لمدة 10-30 ثانية، وتبلغ مدته ~ 20-60 دقيقة.
        1. تعيين أوقات التعرض لFURA-2 التصوير.
          1. إضافة زيت موضوعي الطازجة وجبل طبق المجهر تحتوي على 0.5 مل من العازلة-A على محول مرحلة التسخين وتتحول على الفور لكي تتوازن إلى 37 ° C (سيستغرق ~ 2-3 دقيقة).
          2. إضافة يستريح الخلايا الليمفاوية Fura2 تحميلها إلى غرفة طبق المجهر شنت باستخدام ماصة 20 ميكرولتر.
          3. بدوره على التصوير حقل مشرق. حدد مسار الضوء إلى العدسات. استخدام مقبض التركيز الخشنة لتحقيق الهدف في اتصال مع الجزء السفلي من الطبق miscoscope. استخدام العدسة ومقبض التركيز بشكل جيد في التركيز على خلايا T استقرت في قاع الطبق.
          4. استخدام الضوابط مرحلة س ص لتحديد حقل يحتوي على 10 على الأقل الخلايا. تجنبمزدحمة على الحقول وكتل الخلايا وهذه سوف تخلق التحف التصوير.
          5. التحول من حقل مشرق لفلوري مصدر الضوء. التحول من تصوير العدسة إلى كاميرا CCD. تعيين المعلمات اقتناء (على سبيل المثال، وقت التعرض، وزيادة كاشف وbinning). باستخدام حصول على برامج يستريح Fura2-340 والصور Fura2-380 (بدءا من وقت التعرض متطابقة لكل منهما، عادة في حدود ~ 200-1،000 ميللي ثانية).
          6. استخدام الأساليب المذكورة في الخطوة 5.4.1 لحساب Fura2-340 / Fura2-380 لكل الخلايا اللمفاوية. أداء التكرار المتكرر لضبط Fura2-340 ومرات التعرض Fura2-380، والحصول على صور واحتساب النسب حتى متوسط ​​قيم قريبة إلى 1.
        2. تعيين أوقات التعرض لم-YFP وDsRed.
          1. استبدال طبق الاداة المستخدمة في الخطوة 5.3.3.1 مع طبق miscroscope تحتوي على transfected، تنشيط وتعامل تبلد (أو دون علاج، والسيطرة) HLMVECs أو HDMVECs من حاضنة الثقافة الخلية (خطوات 4.5.1). استخدام ماصة نقل القابل للتصرف لإزالة بسرعة وسائل الإعلام، وشطف مرة واحدة عن طريق إضافة ~ 1 مل من قبل تحسنت العازلة-A. نضح ثم قم بإضافة 0.5 مل من العازلة-A.
          2. تحديد المجالات التي الخلايا البطانية transfectant الإيجابية الفلورسنت الزاهية موجودة وتظهر صحية مع تقاطعات بين الخلايا بشكل جيد.
          3. ضبط المعلمات اقتناء (على سبيل المثال، وقت التعرض، وزيادة كاشف وbinning) لم-YFP وDsRed. مما لا شك فيه أن متوسط ​​كثافة إشارة مضان في كل قناة تقع بين 25٪ و 75٪ من النطاق الديناميكي للكشف.
      4. إجراء تجربة التصوير الخلية الحية.
        1. استخدام برامج الحاسوب الآلي لبدء الحصول على الصور والتقاط عدة فترات من الصور لإنشاء خط الأساس.
        2. خلال الاستحواذ تطبيق ~ 5 ميكرولتر من الخلايا الليمفاوية FURA-2 تحميلها المركزة (من الخطوة 5.2) إلى وسط الميدان التصوير طبق المجهر عن طريق إدراج غيض من الحجم الصغير (P-5أو P-20) ماصة في وسائل الإعلام على مقربة من مركز للهدف وإخراج ببطء.
        3. كما تستقر الخلايا الليمفاوية في مجال التصوير، وإجراء تعديلات الجميلة في التركيز لضمان أن الخلية بطائن اجهة الخلايا التائية (المشابك المناعية) يتم الاحتفاظ بها في المستوى البؤري. مع 40 والهدف 63X، ~ 10-20 خلايا لكل حقل هي الأمثل. إذا لوحظت أقل من الخلايا في كرر الخطوة مجال التصوير 5.3.4.2.
        4. بعد تنافس الفاصل المراقبة المرجوة من التجربة، ومواصلة التصوير وماصة على الفور ionomycin مباشرة في طبق miscoscope (باستخدام تقنية كما هو الحال في 5.3.4.2) لتركيز النهائي من 2 ميكرومتر للحث على تدفق الكالسيوم القصوى / FURA-2 إشارة الإشارات (أي ، وسيلة للمعايرة، انظر التحليل 5.4).
        5. كما تنافس بديلا ل5.3.4.4after الفاصل المراقبة المرجوة من التجربة، ونضح على الفور العازلة-A واستبدالها مع 0.5 مل من محلول تثبيتي (3.7٪ الفورمالديهايد في PBS) لمدة 5 دقائق فيRT، تليها الشطف ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني. ثم انتقل إلى الخطوة 6.
    4. تحليل تعيش خلية التصوير
      ملاحظة: بعد حفظ الملفات المكتسبة، قد يتم تحليلها بشكل مباشر أو تصديرها لتحليلها من قبل مجموعة واسعة من خارج خط تطبيقات البرمجيات تحليل الصور. يماغيج هو، حزمة تنوعا للغاية قيمة خاصة التي هي متاحة بحرية ومتوافقة مع كل حزمة البرامج اكتساب تقريبا. سوف تصميم تجارب التصوير هو موضح في الخطوات 5،1-5،3 تسفر ديناميكية القرار المكانية والزمانية عالية من التفاعل بين الخلايا الليمفاوية والبطانية APC في غياب وجود الترهل وما شابه ذلك. تقريبا التحليلات بلا حدود ممكنة عند معالجة البيانات التصوير الخلوية ديناميات كيمونسيجيا / الإشارات. الأهداف المحددة الموضحة في هذه بروتوكول معين هي لتحديد coordinately الهجرة اللمفاويات إشارة، (أي حركية ومستويات تدفق الكالسيوم داخل الخلايا) جنبا إلى جنب مع ديناميةآل التغيرات في بنية المشبك المناعية مع التركيز على ميزات معينة (أي ILPs / بودو يطبع). وفيما يلي أمثلة على معيار مستقل وغير القياسية (أي وضعت خصيصا لهذه التجارب / أسئلة) يحلل.
      1. قياس تدفق الخلايا الليمفاوية الكالسيوم
        1. حدد الأولي Fura2-340 (340 EX-510 نانومتر EM نانومتر) وFura2-380 (380 نانومتر EX-510 نانومتر EM) الصور التي تم الحصول عليها قبل إضافة الخلايا الليمفاوية. استخدام هذه كصور خلفية ورقميا طرح عليهم من كل الصور في السلسلة الزمنية لكل قناة منها.
        2. لكل نقطة زمنية خلق صورة نسبة الرقمية للFura2-340-طرح الخلفية والصور Fura2-380-طرح الخلفية (أي 340 نانومتر EX-510 نانومتر EM-الخلفية / 380 نانومتر EX-510 نانومتر EM-الخلفية).
        3. حدد أداة برنامج الرسم المناسبة. انقر على الشاشة لرسم منطقة دائرية من أنادفع الفوائد (ROI) حول كل الخلايا اللمفاوية. وهذه تولد قيمة نسبة متوسط ​​بكسل لكل اللمفاويات والإطار الزمني.
        4. مؤامرة نسبة تحسب بوصفها وظيفة من الوقت باستخدام تطبيق البرمجيات المناسبة (على سبيل المثال، برنامج جداول البيانات). حساب تدفق الكالسيوم متوسط ​​للتجربة عن طريق جمع قيم نسبة كل من الخلايا الليمفاوية في الميدان، وتقسيم تلك القيمة من قبل عدد من الخلايا الليمفاوية عن كل نقطة زمنية
      2. إجراء تحليل lympocyte تتبع هجرة.
        1. تحليل الخلايا T الهجرة الخلية باستخدام التطبيق المناسب تتبع الخلية برنامج (على سبيل المثال، يماغيج) باستخدام قناة مدينة دبي للإنترنت من كل فيديو. باستخدام يماغيج خلية تتبع البرنامج المساعد، وتحديد في كل إطار النقطه الوسطى من كل خلية يدويا عن طريق النقر عليه في كل إطار التدريجي.
        2. استخدام الناتجة إحداثيات س ص التسلسلي (أي آثار مسارات الهجرة) لحساب سرعة المتوسط ​​(المسافة الإجمالية هاجر / مجموع الفاصلة سو التصوير) وتعرج (المسافة الإجمالية هاجر / المسافة الخطية نهاية إلى نهاية بين موقع الخلية في الصورة الأولى والأخيرة).
        3. عبر ربط هذه المعلمات مع تدفق الكالسيوم (5.4.1) ديناميكية على أساس الخلية من قبل الخلايا.
      3. تقييم الكثافة بودو الطباعة / ILP داخل IS
        1. عد العدد الإجمالي للILP شكلت في كل خلية T فترات يعرف (على سبيل المثال، 5 دقائق بالإضافة منصب خلايا T). ويمكن تحديد هذه المنفصلة نطاق ميكرون الفلورسنت حلقات غشاء YFP أن شارك في توطين مع الهالات السوداء في هيولي DsRed على APC البطانية في موقع من اللمفاويات التصاق.
        2. عبر ربط الناتجة 'الفهارس ILP "مع تدفق الكالسيوم (5.4.1) ديناميكية على أساس الخلية من قبل الخلايا.
      4. قياس بودو الطباعة / عمر ILP.
        1. لكل بودو الطباعة / ILP في معين هو حساب عمر بوصفها نقطة زمنية الماضية عندما كان ILP مرئية - نقطة وقت أن بودو الطباعة ILP فاي /ظهر RST. متوسط ​​أعمار ILP على حد سواء في IS.
        2. عبر ربط هذه الأعمار مع تدفق الكالسيوم (5.4.1) ديناميكية على أساس الخلية من قبل الخلايا.
      5. تقييم العلاقة الزمنية بين تشكيل ILP الأولي وتدفق الكالسيوم.
        1. لكل اللمفاويات تحديد نقطة زمنية (الإطار) الذي الكالسيوم أولا ترتفع فوق خط الأساس 19.
        2. لكل اللمفاويات تحديد نقطة الوقت الذي أول بودو الطباعة / يبدو ILP.
        3. لكل اللمفاويات حساب على "تعويض الوقت" من خلال طرح تدفق الكالسيوم نقطة زمنية الأولية عن ذلك من الأولي بودو الطباعة / ILP. متوسط ​​القيم لجميع الخلايا الليمفاوية في حقل. القيم الإيجابية تدل على تشكيل ILP تسبق تدفق الكالسيوم بينما الأرقام السالبة تشير إلى عكس ذلك.
          ملاحظة: هذه التجارب يمكن بسهولة أن يؤديها تحت تدفق الصفحي القص ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية باستخدام المتاحة تجاريا موازيا الجدار غرف التصوير التدفق كما هو موضح 19.

    التصوير 6. خلية الثابتة والتحليل

    1. نقطة النهاية الثابتة T خلايا البطانية IS تشكيل وتلطيخ
      1. إعداد الخلايا T كما هو موضح في 1. إعداد الخلايا البطانية (- / + SAG) كما في الخطوة 5.1 (ترنسفكأيشن، الخطوة 5.1.1 اختيارية). أخذ عينة من الخلايا الليمفاوية مثقف وتحديد كثافة عن طريق العد مع عدادة الكريات (القسم 1).
      2. نقل حجم يعادل الثقافة اللمفاويات للا يقل عن 3 × 10 5 الخلايا الليمفاوية / العينة إلى 15 مل أنبوب مخروطي الشكل والطرد المركزي في 200 x ج لمدة 3 دقائق. إزالة طاف و resuspend بيليه الخلايا اللمفاوية في الواق-A (الخطوة 5.2.1) تركيز 6 × 10 5 الخلايا الليمفاوية / مل.
      3. إزالة الخلايا البطانية من الحاضنة زراعة الخلايا و (الشروع عينة واحدة في وقت واحد) وسائل الاعلام نضح تباعا واستبدالها مع 0.5 مل من تعليق لمفاوية (3 × 10 5 الخلايا الليمفاوية / عينة) ويستعاض إلى 37 ° C طncubator.
      4. بعد مرات الحضانة المناسبة، ذكر أعلاه، نضح المتوسط ​​من الآبار وإضافة الحل كافية تثبيتي (3.7٪ الفورمالديهايد في PBS) لتغطية كامل العينة (على سبيل المثال، في 24 لوحة جيدا ~ 300-500 ميكرولتر). في احتضان RT لمدة 5-10 دقيقة.
      5. شطف العينة 3 مرات مع برنامج تلفزيوني. وصمة عار وذلك بإضافة الأجسام المضادة الأولية لمدة 60 دقيقة في RT (انظر القائمة). إذا تم توجيه الأجسام المضادة الأولية إلى البروتين داخل الخلايا، تحتاج خطوة permeabilization إضافية ليتم تنفيذها عن طريق إضافة حل permeabilization كافية (0.01٪ TritonX-100 في PBS) لتغطية كامل العينة لمدة 1 دقيقة في RT. شطف العينة 3 مرات مع برنامج تلفزيوني. إضافة الأجسام المضادة الثانوية المناسبة (في بعض الحالات phalloidin الفلورسنت بالتزامن) لمدة 60 دقيقة في RT.
      6. جبل ساترة الزجاج الدائرية على شريحة التصوير. نقطة النهاية الثابتة T خلايا البطانية IS تشكيل وتلوين. لبدء مكان التصوير الشريحة التصوير التي تحتوي على عينات على المسرح المجهر وحدد النفط 63Xموضوعي. تطبيق زيت الغمر الطازجة.
    2. استخدام وضع التصوير مشرق الميدان وعدسات العين لتحديد موقع الطائرة التنسيق. التبديل إلى epifluorescence وتفتيش عينة عن طريق عدسات العين. اختر مجال الاهتمام. التبديل إلى وضع الليزر المسح الضوئي.
    3. باستخدام طريقة المسح السريع والعمل في أوسع مجال ممكن ضبط فردي قوة الليزر وكسب كل قناة لتحسين إشارة مثل هذا، من الناحية المثالية، تصل كثافة إشارة محددة على الأقل ~ 25٪ ولا تزيد على 75٪ من مجموعة ديناميكية من كاشفات.
    4. استخدام عناصر تحكم التركيز اليدوي والمسح الضوئي بسرعة من خلال Z-محور وتحديد الحدود العليا والدنيا من باجتزاء (عادة كل المعلومات التي ينبغي الواردة في سمك ~ 15 ميكرون). حدد القسم سمك Z-axis في نطاق ~ 0،2-1،0 ميكرون.
    5. وأخيرا، والتكبير / اقتصاص مجال التصوير إلى منطقة محددة من الفائدة والسلوك المسح الضوئي. بالإضافة إلى وجود مشرق جدا ومحددة سي مضانgnal في العينة، الحصول عالية الدقة 3D التصوير يتطلب تكرار المسح وإجراء تعديلات على المعلمات الاستحواذ. الهدف هو الحصول على س ص الأقصى وقرار ض محور، دون ملموس الصور التبييض.
    6. تحليل نوعي طوبولوجيا طوبولوجيا 3D من أبرز بإجراء إعادة الإعمار 3D الرقمية من المقاطع البصرية الناتجة من خلال تطبيق البرامج المناسبة (على سبيل المثال، J صورة). من خلال تطبيقات مماثلة تقييم كمي لتوزيع إشارة مضان (على سبيل المثال، وشارك في توطين وكثافة مضان المتلازم تحليل بيرسون خط المسح الضوئي وعرض متعامد).

    الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

    النتائج

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    وقد تم تطوير نهج التصوير رواية باستخدام الخلايا البطانية والجمع بين مزايا حل مستو طبقات ثنائية الدهون النموذج مع تعقيد فيزيولوجي والتشوه المهنية ناقلات الجنود المدرعة (الشكل 1). الشكل 2 أمثلة للهجرة نموذجية، تدفق الكالسيوم وديناميات الطوبوغرافية لاحظ مع هذا مقاربة. في حالة عدم وجود الترهل على البطانة، الخلايا الليمفاوية تبلد محددة CD4 + TH1 ينتشر بسرعة، الاستقطاب وتهاجر أفقيا على سطح البطانية (ال...

    الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

    المناقشة

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    عموما، يصف هذا البروتوكول أساليب التحقيق الخلايا البطانية وأنا) الكافي في ناقلة جنود مصفحة الفسيولوجية والثاني) كنوع من رواية 'مستو نموذج APC الخلوي. وفيما يتعلق السابق، فقد أصبح موضع تقدير على نحو متزايد أن ناقلات الجنود المدرعة غير لدم الطرفية (أو اللحمية ') تلعب أدوارا حاسمة، غير المكرر (أي مقارنة للدم ناقلات الجنود المدرعة) في تشكيل الاستجابات المناعية التكيفية 16-18. بين هؤلاء "شبه المحترفين ناقلات الجنود المدرعة، الأوعية الدموية والخلايا البط...

    الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

    الإفصاحات

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

    شكر وتقدير

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    نشكر الدكتور بيتر تي سيج على مساعدته في إنشاء بعض الصور التمثيلية. تم دعم هذا العمل بمنحة من المعاهد الوطنية للصحة R01 إلى C.V.C. (HL104006).

    الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

    المواد

    قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
    الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
    BD Vacutainer مطاطي عاصبة خالية من اللاتكسBD Biosciences367203
    مسحات كحول BDBD Biosciences326895
    BD Vacutainer Safety-LokBD Biosciences367861K2 EDTA
    BD Vacutainer بضغطةBD Biosciences367335
    RPMI-1640Sigma-AldrichR8758-1L
    Ficoll-PaqueSigma-AldrichGE17-1440-02أحضره إلى RT قبل الاستخدام
    FCS-OptimaAtlanta Biologicss12450
    البنسلين الستربتومايسينسيجما-ألدريتشP4458-100ML
    تريبان الأزرقسيجما-ألدريتشT8154-20ML
    السموم المعوية بالمكورات العنقوديةبتقنيةالسمومBT202REDمحلول المخزون 1 مجم / مل في
    متلازمة الصدمة السميةتقنية السمومTT606REDمحلول المخزون 1 مجم / مل في PBS
    البشري IL-15R & D Systems247-IL-025محلول مخزون 50ug / ml في PBS
    PBSLife Technologies10010-049
    FibronectinLife Technologies33016-015محلول مخزون 1 مجم / مل في H20
    HMVEC-d Ad-Dermal MV Endo CellsLonzaCC-2543يمكن استخدام ECs البشرية الأخرى للأوعية الدموية الدقيقة ، أي HLMVECs
    EGM-2 MV bullet kitLonzaCC-3202
    مخزون Trypsin-EDTASigma-AldrichT-417410x ، مخفف في PBS
    amaxa-HMVEC-L Nucleofector KitLonzavpb1003المجموعة المطلوبة للخطوة 4
    IFN-gSigma-AldrichI3265محلول مخزون 1 مجم / مل في H20
    TNF-alpha 10ug ، تقنيات الحياة البشريةPHC3015محلول المخزون 1 مجم / مل في H20
    الفينول HBSS الخالي من الأحمرلايف تكنولوجيز14175-103
    هيبسفيشر سينتيفيكBP299-100
    كلوريد الكالسيومسيجما-ألدريتشC1016-100Gمحلول مخزون 1 متر في H20
    كلوريد المغنيسيومسيجما ألدريتش208337محلول مخزون 1 متر في H20
    ألبومين مصل بشريسيجما ألدريتشA6909-10 مل
    Immersol 518 F زيت الغمر الخالي من التألقفيشر سيتفوScientific12-624-66A
    Fura-2 AM 20x50ugLife TechnologiesF1221محلول مخزون 1 ملم في DMSO
    pEYFP-Mem (Mem-YFP)Clontech6917-1
    pDsأحمر مونومر (سيتوبلازمي قابل للذوبان DsRed)Clontech632466
    pDsغشاء أحمر مونومر (Mem-DsRed)Clontech632512
    pEGFP-ActinClontech6116-1
    Alexa Fluor 488 PhalloidinLife TechnologiesA12379
    محلول الفورمالديهايد 37٪فيشر ScientificBP531-500سام ، استخدم الدخان
    Triton X-100Sigma-AldrichX100-5ML
    & nbsp ؛ Falcon 15mL أنابيب الطرد المركزي المخروطيةفيشر Scientific14-959-70C
    فالكون 50 مل أنابيب الطرد المركزي المخروطيةفيشر Scientific14-959-49A & nbsp ؛
    قوارير Falcon Tissue Culture المعالجة T25Fisher Scientific10-126-9
      قوارير زراعة أنسجة الصقر المعالجة T75Fisher Scientific  13-680-65
      ثقافة خلايا كورنينج المعالجة T175فيشر Scientific10-126-61 
    أغطية زجاجية فيشر العلمي12-545-85 قطر 12 مم
      لوحات زراعة أنسجة الصقر 24 بئرفيشر ساينتفيك08-772-1
    لوحات دلتا-تيBioptechs04200415B
    ويتون المتاح باستور بيبيتسفيشر Scientific13-678-8D
    1.5 مل أنبوب Eppendorf   ؛فيشر ساينتفيك05-402-25
      ICAM1 الفأر المضاد للإنسانBD Biosciences555509
    HS1 الفأر المضاد للإنسانBD Biosciences610541
    المضاد للإنسان CD11a (LFA-1alpha) تنقيةebioscienceBMS102
    Anti-Human CD3 Alexa Fluor & reg; 488ebioscience53-0037-41
    الأجسام المضادة لمعقد التوافق النسيجي الكبير من الفئة الثانية  Abcamab55152
    Anti-Talin 1 الأجسام المضادةAbcamab71333
    الأجسام المضادة ل PKC theta  Abcamab109481
    phosphotyrosine (4G10 Platinum)Millipore50-171-463
    Nucleofector IIAmaxa Biosystemsالمطلوب جهاز ثقب كهربائي للخطوة 4
    Zeiss AxiovertCarl Zeiss MicroImaging
    Zeiss LSM510  Carl Zeiss MicroImaging
    Zeiss Axiovison SoftwareCarl Zeiss MicroImaging
    NU-425 (Series 60) خزانة السلامة البيولوجيةNuAIRENu-425-600
      ؛ فورما STRCYCLE 37 ° C ، 5٪ CO2 حاضنة ثقافة الخلايافيشر Scientific202370
    أجهزة الطرد المركزي 5810EppendorfEW-02570-02
    مقياس الدمSigma-Aldrich& nbsp ؛ Z359629مقياس الدم
    الساطع Isotemp Waterbath نموذج 202فيشر Scientific15-462-2
    زر جمع الدم مجموعة سم PBS 1 محلول ذو الخط

    المراجع

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
    1. von Andrian, U. H., Mackay, C. R. T-cell function and migration. Two sides of the same coin. N. Engl. J. Med. 343 (14), 1020-1034 (2000).
    2. Springer, T. A. Adhesion receptors of the immune system. Nature. 346 (6283), 425-434 (1990).
    3. Shaw, A. S., Dustin, M. L. Making the T cell receptor go the distance: a topological view of T cell activation. Immunity. 6 (4), 361-369 (1997).
    4. Monks, C. R., Freiberg, B. A., Kupfer, H., Sciaky, N., Kupfer, A. Three-dimensional segregation of supramolecular activation clusters in T cells. Nature. 395 (6697), 82-86 (1998).
    5. Delon, J., Stoll, S., Germain, R. N. Imaging of T-cell interactions with antigen presenting cells in culture and in intact lymphoid tissue. Immunol Rev. 189, 51-63 (2002).
    6. Brossard, C., et al. Multifocal structure of the T cell - dendritic cell synapse. Eur J Immunol. 35 (6), 1741-1753 (2005).
    7. Dustin, M. L. The cellular context of T cell signaling. Immunity. 30 (4), 482-492 (2009).
    8. Balagopalan, L., Sherman, E., Barr, V. A., Samelson, L. E. Imaging techniques for assaying lymphocyte activation in action. Nat Rev Immunol. 11 (1), 21-33 (2011).
    9. Cebecauer, M., Spitaler, M., Serge, A., Magee, A. I. Signalling complexes and clusters: functional advantages and methodological hurdles. J Cell Sci. 123, 309-320 (2010).
    10. Oddos, S., et al. High-speed high-resolution imaging of intercellular immune synapses using optical tweezers. Biophys J. 95 (10), L66-L68 (2008).
    11. Grakoui, A., et al. The immunological synapse: a molecular machine controlling T cell activation. Science. 285 (5425), 221-227 (1999).
    12. Bunnell, S. C., et al. T cell receptor ligation induces the formation of dynamically regulated signaling assemblies. J Cell Biol. 158 (7), 1263-1275 (2002).
    13. Yokosuka, T., et al. Newly generated T cell receptor microclusters initiate and sustain T cell activation by recruitment of Zap70 and SLP-76. Nat Immunol. 6 (12), 1253-1262 (2005).
    14. Seminario, M. C., Bunnell, S. C. Signal initiation in T-cell receptor microclusters. Immunol Rev. 221, 90-106 (2008).
    15. Dustin, M. L. Supported bilayers at the vanguard of immune cell activation studies. J Struct Biol. 168 (1), 152-160 (2009).
    16. Martinelli, R., Carman, C. V. Lymphocyte Endothelilal Interactions. Encyclopedia of Cell Biology. Bradshaw, R. A., Stahl, P. , Elsevier. London. (2015).
    17. Choi, J., Enis, D. R., Koh, K. P., Shiao, S. L., Pober, J. S. T lymphocyte-endothelial cell interactions. Annu Rev Immunol. 22, 683-709 (2004).
    18. Marelli-Berg, F. M., Jarmin, S. J. Antigen presentation by the endothelium: a green light for antigen-specific T cell trafficking? Immunol Lett. 93 (2-3), 109-113 (2004).
    19. Sage, P. T., et al. Antigen recognition is facilitated by invadosome-like protrusions formed by memory/effector T cells. J Immunol. 188 (8), 3686-3699 (2012).
    20. Kumari, S., et al. Actin foci facilitate activation of the phospholipase C-gama in primary T lymphocytes via the WASP pathway . eLife. , (2015).
    21. Marelli-Berg, F. M., et al. Major histocompatibility complex class II-expressing endothelial cells induce allospecific nonresponsiveness in naive T cells. J Exp Med. 183 (4), 1603-1612 (1996).
    22. Ma, W., Pober, J. S. Human endothelial cells effectively costimulate cytokine production by, but not differentiation of, naive CD4+ T cells. J Immunol. 161 (5), 2158-2167 (1998).
    23. Perez, V. L., Henault, L., Lichtman, A. H. Endothelial antigen presentation: stimulation of previously activated but not naive TCR-transgenic mouse T cells. Cell Immunol. 189 (1), 31-40 (1998).
    24. Epperson, D. E., Pober, J. S. Antigen-presenting function of human endothelial cells. Direct activation of resting CD8 T cells. J Immunol. 153 (12), 5402-5412 (1994).
    25. Shiao, S. L., et al. Human effector memory CD4+ T cells directly recognize allogeneic endothelial cells in vitro and in vivo. J Immunol. 179 (7), 4397-4404 (2007).
    26. Marelli-Berg, F. M., Okkenhaug, K., Mirenda, V. A two-signal model for T cell trafficking. Trends Immunol. 28 (6), 267-273 (2007).
    27. Carman, C. V., et al. Transcellular diapedesis is initiated by invasive podosomes. Immunity. 26 (6), 784-797 (2007).
    28. Carman, C. V. Mechanisms for transcellular diapedesis: probing and pathfinding by 'invadosome-like protrusions'. J Cell Sci. 122 ((Pt 17)), 3025-3035 (2009).
    29. Dustin, M. L., Tseng, S. Y., Varma, R., Campi, G. T. T cell-dendritic cell immunological synapses. Curr Opin Immunol. 18 (4), 512-516 (2006).
    30. Saito, T., Yokosuka, T. Immunological synapse and microclusters: the site for recognition and activation of T cells. Curr Opin Immunol. 18 (3), 305-313 (2006).
    31. Gomez, T. S., et al. HS1 functions as an essential actin-regulatory adaptor protein at the immune synapse. Immunity. 24 (6), 741-752 (2006).
    32. Burbach, B. J., Medeiros, R. B., Mueller, K. L., Shimizu, Y. T-cell receptor signaling to integrins. Immunol Rev. 218, 65-81 (2007).
    33. Vicente-Manzanares, M., Sanchez-Madrid, F. Role of the cytoskeleton during leukocyte responses. Nat Rev Immunol. 4 (2), 110-122 (2004).
    34. Ma, Z., Janmey, P. A., Finkel, T. H. The receptor deformation model of TCR triggering. Faseb J. 22 (4), 1002-1008 (2008).
    35. Ma, Z., Sharp, K. A., Janmey, P. A., Finkel, T. H. Surface-anchored monomeric agonist pMHCs alone trigger TCR with high sensitivity. PLoS Biol. 6 (2), e43(2008).
    36. Groves, J. T. Bending mechanics and molecular organization in biological membranes. Annu Rev Phys Chem. 58, 697-717 (2007).
    37. Xu, C., et al. Regulation of T cell receptor activation by dynamic membrane binding of the CD3epsilon cytoplasmic tyrosine-based motif. Cell. 135 (4), 702-713 (2008).

    الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

    إعادة الطباعة والأذونات

    طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

    طلب إذن

    الوسوم

    مقالات ذات صلة