يتم التحكم في المناعة التكيفية من خلال "المشابك المناعية" الديناميكية المتكونة بين الخلايا التائية والخلايا العارضة للمستضد. يصف هذا البروتوكول طرق التحقيق في الخلايا البطانية على أنها APCs فسيولوجية غير مدروسة وكنوع جديد من "نموذج APC الخلوي المستوي".
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
نموذج الخلايا البطانية مستو التصوير المناعية سنبس حيوية
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
وينظم المناعة التكيفية التي كتبها التفاعلات الدينامية بين الخلايا T ومستضد الخلايا ("ناقلات الجنود المدرعة ') يشار إليها باسم" نقاط الاشتباك العصبي المناعية. داخل هذه الواجهات خلية خلية الحميمة مجموعات فرعية الخلوية منفصلة من MHC / حج-TCR، F-الأكتين، التصاق والجزيئات يشير شكل واعادة تشكيلها بسرعة. ويعتقد أن هذه الديناميات أن تكون العوامل الحاسمة من كفاءة ونوعية الاستجابات المناعية التي تقوم بتطوير وبالتالي حماية مقابل حصانة مرضية. الفهم الحالي للنقاط الاشتباك العصبي المناعية مع فيزيولوجي ناقلات الجنود المدرعة محدودة بسبب عدم كفاية القرار تصوير الحصول عليها. رغم أن النماذج الركيزة الاصطناعية (مثل طبقات ثنائية الدهون مستو) توفر قرار ممتاز، وكانت أدوات قيمة للغاية، فهي بطبيعتها غير فيزيولوجي والتبسيط. ظهرت الأوعية الدموية واللمفاوية الخلايا البطانية بمثابة حجرة الأنسجة الطرفية هامة (أو اللحمية) من "شبه مهنةآل ناقلات الجنود المدرعة. هذه ناقلات الجنود المدرعة (التي تعبر عن معظم الآلات الجزيئية المهنية ناقلات الجنود المدرعة) لديها ميزة فريدة من تشكيل سطح الخلية مستو تقريبا وهي transfectable بسهولة (على سبيل المثال، مع الصحفيين بروتين فلوري). هنا إحدى الوسائل الأساسية لتنفيذ الخلايا البطانية كما رواية وفيزيولوجي "مستو نموذج APC الخلوي 'لتحسين التصوير والاستجواب من عمليات إشارات المستضدات الأساسية سوف يمكن وصفها.
المقدمة
T الليمفاوية هي فرع من نظام المناعة التكيفية التي تتميز القدرة على التعرف على كفاءة الببتيد المستضد (حج) منضمة إلى رئيسي معقد التوافق النسيجي (MHC) الجزيئات من خلال مستقبلات الخلايا T الخاصة بهم (TCRs) 1. اللمفاويات السذاجة تهاجر بشكل جوهري ومسح "حج تقديم الخلايا المهنية" (ناقلات الجنود المدرعة، على سبيل المثال، والخلايا الجذعية) داخل الغدد الليمفاوية، بينما تحتاج خلايا الذاكرة / T المستجيب لدراسة فعالية مجموعة واسعة جدا من ناقلات الجنود المدرعة والخلايا المستهدفة المحتملة داخل الأنسجة الطرفية.
في دقيقة بعد الاعتراف الأولي وما شابه ذلك حج ع....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
وتجرى جميع التجارب الموصوفة في هذا البروتوكول مع خلايا T الإنسان الأساسية والخلايا البشرية الأولية المتاحة تجاريا البطانية يجب الموافقة على (عن طريق الجلد أو الرئتين الاوعية الدموية الدقيقة ECS). أي بروتوكول البحوث التي تجرى على البشر من قبل مجلس المراجعة المؤسسية ويجب تقديم موافقة خطية من علم كل متبرع بالدم. تمت الموافقة على التجارب التي أجريت باستخدام هذا البروتوكول من قبل IRB من مركز بيث إسرائيل ديكونيس الطبي.
1. إعداد CD4 + الإنسان TH1 المستجيب / T خلايا الذاكرة
- تطبيق وقف النز....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
وقد تم تطوير نهج التصوير رواية باستخدام الخلايا البطانية والجمع بين مزايا حل مستو طبقات ثنائية الدهون النموذج مع تعقيد فيزيولوجي والتشوه المهنية ناقلات الجنود المدرعة (الشكل 1). الشكل 2 أمثلة للهجرة نموذجية، تدفق الكالسيوم وديناميات الطوبوغرافية لاحظ مع هذا مقاربة. في حالة عدم وجود الترهل على البطانة، الخلايا الليمفاوية تبلد محددة CD4 + TH1 ينتشر بسرعة، الاستقطاب وتهاجر أفقيا على سطح البطانية (ال.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
عموما، يصف هذا البروتوكول أساليب التحقيق الخلايا البطانية وأنا) الكافي في ناقلة جنود مصفحة الفسيولوجية والثاني) كنوع من رواية 'مستو نموذج APC الخلوي. وفيما يتعلق السابق، فقد أصبح موضع تقدير على نحو متزايد أن ناقلات الجنود المدرعة غير لدم الطرفية (أو اللحمية ') تلعب أدوارا حاسمة، غير المكرر (أي مقارنة للدم ناقلات الجنود المدرعة) في تشكيل الاستجابات المناعية التكيفية 16-18. بين هؤلاء "شبه المحترفين ناقلات الجنود المدرعة، الأوعية الدموية والخلايا البط.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.
شكر وتقدير
نشكر الدكتور بيتر تي سيج على مساعدته في إنشاء بعض الصور التمثيلية. تم دعم هذا العمل بمنحة من المعاهد الوطنية للصحة R01 إلى C.V.C. (HL104006).
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| BD Vacutainer مطاطي عاصبة خالية من اللاتكس | BD Biosciences | 367203 | |
| مسحات كحول BD | BD Biosciences | 326895 | |
| BD Vacutainer Safety-Lok | BD Biosciences | 367861 | K2 EDTA |
| BD Vacutainer بضغطة | BD Biosciences | 367335 | |
| RPMI-1640 | Sigma-Aldrich | R8758-1L | |
| Ficoll-Paque | Sigma-Aldrich | GE17-1440-02 | أحضره إلى RT قبل الاستخدام |
| FCS-Optima | Atlanta Biologics | s12450 | |
| البنسلين الستربتومايسين | سيجما-ألدريتش | P4458-100ML | |
| تريبان الأزرق | سيجما-ألدريتش | T8154-20ML | |
| السموم المعوية بالمكورات العنقودية | بتقنية | السمومBT202RED | محلول المخزون 1 مجم / مل في |
| متلازمة الصدمة السمية | تقنية السموم | TT606RED | محلول المخزون 1 مجم / مل في PBS |
| البشري IL-15 | R & D Systems | 247-IL-025 | محلول مخزون 50ug / ml في PBS |
| PBS | Life Technologies | 10010-049 | |
| Fibronectin | Life Technologies | 33016-015 | محلول مخزون 1 مجم / مل في H20 |
| HMVEC-d Ad-Dermal MV Endo Cells | Lonza | CC-2543 | يمكن استخدام ECs البشرية الأخرى للأوعية الدموية الدقيقة ، أي HLMVECs |
| EGM-2 MV bullet kit | Lonza | CC-3202 | |
| مخزون Trypsin-EDTA | Sigma-Aldrich | T-4174 | 10x ، مخفف في PBS |
| amaxa-HMVEC-L Nucleofector Kit | Lonza | vpb1003 | المجموعة المطلوبة للخطوة 4 |
| IFN-g | Sigma-Aldrich | I3265 | محلول مخزون 1 مجم / مل في H20 |
| TNF-alpha 10ug ، تقنيات الحياة البشرية | PHC3015 | محلول المخزون 1 مجم / مل في H20 | |
| الفينول HBSS الخالي من الأحمر | لايف تكنولوجيز | 14175-103 | |
| هيبس | فيشر سينتيفيك | BP299-100 | |
| كلوريد الكالسيوم | سيجما-ألدريتش | C1016-100G | محلول مخزون 1 متر في H20 |
| كلوريد المغنيسيوم | سيجما ألدريتش | 208337 | محلول مخزون 1 متر في H20 |
| ألبومين مصل بشري | سيجما ألدريتش | A6909-10 مل | |
| Immersol 518 F زيت الغمر الخالي من التألق | فيشر سيتفوScientific | 12-624-66A | |
| Fura-2 AM 20x50ug | Life Technologies | F1221 | محلول مخزون 1 ملم في DMSO |
| pEYFP-Mem (Mem-YFP) | Clontech | 6917-1 | |
| pDsأحمر مونومر (سيتوبلازمي قابل للذوبان DsRed) | Clontech | 632466 | |
| pDsغشاء أحمر مونومر (Mem-DsRed) | Clontech | 632512 | |
| pEGFP-Actin | Clontech | 6116-1 | |
| Alexa Fluor 488 Phalloidin | Life Technologies | A12379 | |
| محلول الفورمالديهايد 37٪ | فيشر Scientific | BP531-500 | سام ، استخدم الدخان |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-5ML | |
| & nbsp ؛ Falcon 15mL أنابيب الطرد المركزي المخروطية | فيشر Scientific | 14-959-70C | |
| فالكون 50 مل أنابيب الطرد المركزي المخروطية | فيشر Scientific | 14-959-49A & nbsp ؛ | |
| قوارير Falcon Tissue Culture المعالجة T25 | Fisher Scientific | 10-126-9 | |
| قوارير زراعة أنسجة الصقر المعالجة T75 | Fisher Scientific | 13-680-65 | |
| ثقافة خلايا كورنينج المعالجة T175 | فيشر Scientific | 10-126-61 | |
| أغطية زجاجية | فيشر العلمي | 12-545-85 | قطر 12 مم |
| لوحات زراعة أنسجة الصقر 24 بئر | فيشر ساينتفيك | 08-772-1 | |
| لوحات دلتا-تي | Bioptechs | 04200415B | |
| ويتون المتاح باستور بيبيتس | فيشر Scientific | 13-678-8D | |
| 1.5 مل أنبوب Eppendorf ؛ | فيشر ساينتفيك | 05-402-25 | |
| ICAM1 الفأر المضاد للإنسان | BD Biosciences | 555509 | |
| HS1 الفأر المضاد للإنسان | BD Biosciences | 610541 | |
| المضاد للإنسان CD11a (LFA-1alpha) تنقية | ebioscience | BMS102 | |
| Anti-Human CD3 Alexa Fluor & reg; 488 | ebioscience | 53-0037-41 | |
| الأجسام المضادة لمعقد التوافق النسيجي الكبير من الفئة الثانية | Abcam | ab55152 | |
| Anti-Talin 1 الأجسام المضادة | Abcam | ab71333 | |
| الأجسام المضادة ل PKC theta | Abcam | ab109481 | |
| phosphotyrosine (4G10 Platinum) | Millipore | 50-171-463 | |
| Nucleofector II | Amaxa Biosystems | المطلوب جهاز ثقب كهربائي للخطوة 4 | |
| Zeiss Axiovert | Carl Zeiss MicroImaging | ||
| Zeiss LSM510 | Carl Zeiss MicroImaging | ||
| Zeiss Axiovison Software | Carl Zeiss MicroImaging | ||
| NU-425 (Series 60) خزانة السلامة البيولوجية | NuAIRE | Nu-425-600 | |
| ؛ فورما STRCYCLE 37 ° C ، 5٪ CO2 حاضنة ثقافة الخلايا | فيشر Scientific | 202370 | |
| أجهزة الطرد المركزي 5810 | Eppendorf | EW-02570-02 | |
| مقياس الدم | Sigma-Aldrich | & nbsp ؛ Z359629 | مقياس الدم |
| الساطع Isotemp Waterbath نموذج 202 | فيشر Scientific | 15-462-2 |
المراجع
- von Andrian, U. H., Mackay, C. R. T-cell function and migration. Two sides of the same coin. N. Engl. J. Med. 343 (14), 1020-1034 (2000).
- Springer, T. A. Adhesion receptors of the immune system. Nature. 346 (6283), 425-434 (1990).
- Shaw, A. S., Dustin, M. L.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
