عالية الإنتاجية<em&gt; دانيو Rerio</em&gt; طاقة الإنفاق الفحص

ملخص

Zebrafish هي كائن حي نموذجي مهم لدراسة توازن الطاقة. من خلال استخدام مؤشر الأكسدة والاختزال الحساس NADH₂ ، alamar Blue ، قمنا بتطوير اختبار يقيس معدل الأيض ليرقات الزرد في شكل 96 لوحة بئر ويمكن تطبيقه على اكتشاف الأدوية أو الجينات.

الملخص

الزرد هي كائن نموذجا هاما مع المزايا الكامنة التي لديها القدرة على جعل الزرد نموذجا يطبق على نطاق واسع لدراسة توازن الطاقة والسمنة. صغر حجم الزرد يسمح لفحوصات على الأجنة التي ستجري في شكل لوحة 96- أو 384-جيدا والتكنولوجيات Morpholino وكريسبر أساس تعزيز سهولة التلاعب الجيني، والعلاج من تعاطي المخدرات من خلال تطبيق الحمام غير قابلة للحياة. وعلاوة على ذلك، الزرد مثالية لشاشات الوراثية إلى الأمام السماح لاكتشاف الجين الرواية. نظرا لحداثة النسبية للالزرد كنموذج للسمنة، فمن الضروري لتطوير الأدوات التي تستغل بشكل كامل هذه الفوائد. هنا، نحن تصف طريقة لقياس استهلاك الطاقة في الآلاف من الزرد الجنينية في وقت واحد. قمنا بتطوير كامل منصة صفيحة ميكروسكوبية الحيوانات التي نستخدمها لوحات 96-جيدا لعزل الأسماك الفردية ونقيم التراكمي إنتاج NADH ₂ باستخدام المتاحة تجاريا زراعة الخلايا جدوى إعادةوكيل alamarBlue. في متغيرات الحرارة ترتبط بإحكام العلاقة بين NADH ₂ إنتاج واستهلاك الطاقة. هذا الاختبار نفقات الطاقة يخلق القدرة على الشاشة بسرعة التلاعب الدوائية أو الوراثية التي تغير مباشرة نفقات الطاقة أو تغيير الاستجابة لدواء التطبيقية (على سبيل المثال محسسات الأنسولين).

المقدمة

الفأر هو حاليا النموذج السائد للأبحاث السمنة. كانت فترة جيل قصيرة والأدوات الجينية المتاحة في الماوس لا مثيل لها حتى الآن. ومع ذلك، فقد الزرد أيضا فاصل الجيل قصيرة (3-4 أشهر)، ويفوق حتى الماوس في سهولة التلاعب الجيني ^1،2. يحافظ على الزرد ما يقرب من 90٪ من الجينات الثدييات، في حين يتجاوز بكثير الماوس في عدد من ذرية والإمكانات للاستخدام في شاشات الوراثية والمخدرات ^3.

للاستفادة من إمكانات من طراز الزرد للدراسات في السمنة، ويجب وضع المقايسات للتحقيق في العوامل التي تؤثر على تنظيم وزن الجسم، بما في ذلك نفقات الطاقة. كما تتم معالجة الأيض من خلا....

البروتوكول

ملاحظة: هذا البروتوكول يتبع المبادئ التوجيهية للجامعة أريزونا مكتب للسلوك المسؤول من البحوث وتمت الموافقة من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسي

1. تربية اسماك الزرد والصيانة الأجنة

1. إعداد E3 المتوسط ​​الجنين ^8. جعل 60X حل سهم، ويحل 34.8 غرام كلوريد الصوديوم، 1.6 غرام بوكل، 5.8G CaCl ₂ ^● 2H ₂ O، و9.78 ز MgCl ₂ ^● 6H _{2 O} في 1.95 L ddiH ₂ O. ضبط درجة الحموضة إلى 7.2 باستخدام هيدروكسيد....

النتائج

حل الاختبار لا يزيد مضان في غياب الأسماك الجنينية (الشكل 1). ومع ذلك، فإن فحص حساس جدا لتغيرات صغيرة في معدل الأيض داخل البئر. سمكة واحدة داخل بئر يخلق إشارة مختلفة إلى حد كبير من الآبار فارغة في حدود 1 ساعة (P <0.0001). الشكل 2 يوفر التمثيل البصري من الإشارات التي تولدها الأسماك الجنينية بعد 24 ساعة من الحضانة. لغرض هذه الصورة استخدمت الآبار جانب واضحة. بعد، ويفضل الآبار جانب السوداء لأداء الاختبار لمنع الرشح من إشارة الفلورسنت من الآبار القري.......

المناقشة

سوف التلوث بالبكتيريا أو الفطريات يحد بشكل كبير من تطبيق هذا الاختبار. الأزرق الميثيلين في المتوسط ​​الجنين E3 يحد من إمكانية التلوث الفطري. في جميع أنحاء الجنين تربية فمن الأهمية بمكان أن الرعاية التي اتخذت لإزالة الأجنة الميتة مرتين كل يوم. بالإضافة إلى ذلك، فمن الضروري أن يشطف جيدا الأجنة مع E3 العقيمة المتوسط ​​الجنين في يوم الفحص بدء. هذه الخطوات من 2 إلى الحد من احتمالات التلوث الجرثومي للأجنة. إدراج الآبار فارغة هو موضح في الخطوة 3.2 يسمح للكشف عن أي تلوث بكتيري. التلوث الج.......

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
AlamarBlue	Fisher Scientific	10-230-103	المصنعة بواسطة Thermo Scientific
Fine Tip يمكن التخلص منهاTransfer Pipette	Fisher Scientific Scientific	13-711-26	المصنعة بواسطة Thermo Scientific
Fisherbrand Graduated Disposable Transfer Pipette	Fisher Scientific	13-771-9AM	المصنعة بواسطة Thermo Scientific
الجوانب صفيحة قاع شفافة 96 بئر	فيشر Scientific	50-320-785	المصنعة بواسطة E & شركة K Scientific Products Inc.

أسود