مقالة منهجية

بديل بسيط لحقن المجسم لالدماغ ضربة قاضية محددة من ميرنا

DOI:

10.3791/53307

⸱

ديسمبر 26, 2015

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1CSIR-Institute of Genomics and Integrative Biology, New Delhi, India, 2Academy of Scientific and Innovative Research (AcSIR), New Delhi, India

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
تلعب

MicroRNAs أدوارا حاسمة في الدماغ وهي أهداف محتملة لنمذجة التنكس العصبي. ومع ذلك ، فإن اضطراب مستويات miRNA يمثل تحديا بسبب قصر طول miRNA وعدم إمكانية الوصول إلى أنسجة المخ. يقدم هذا الفيديو طريقة لتصميم أنتاغومير والتسليم الخاص بالدماغ باستخدام الببتيد العصبي في الفئران.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
< p class = 'jove_content'>MicroRNAs (miRNAs) هي المنظمين الرئيسيين للتعبير الجيني. في الدماغ ، تعتمد العمليات الحيوية مثل النمو العصبي ووظائف الخلايا العصبية على التعبير الصحيح عن microRNAs. يمكن استخدام اضطراب microRNAs في الدماغ لنمذجة الأمراض التنكسية العصبية عن طريق تعديل موت الخلايا العصبية. حاليا ، يتم استخدام الحقن التجسيمي لتوصيل عوامل ضربة قاضية miRNA إلى موقع معين في الدماغ. هنا ، نناقش استراتيجيات تصميم أنتاغومير ضد miRNA مع تعديلات النيوكليوتيدات المغلقة (LNA). وصف لاحقا طريقة لتسليم أنتاغومير الخاص بالدماغ ، بشكل موحد عبر مناطق مختلفة من الدماغ. هذه الطريقة بسيطة وقابلة للتطبيق على نطاق واسع لأنها تتغلب على الجراحة والإصابة المرتبطة بها والحد من التوصيل الموضعي في الحقن التجسيمية. قمنا بإعداد مركب من البروتين السكري لفيروس داء الببتيد العصبي المخترق للخلايا (RVG) مع أنتاغومير ضد miRNA-29 وحقنها من خلال الوريد الذيل ، لتوصيله على وجه التحديد في الدماغ. تضمن تصميم أنتاغومير ميزات تسمح باستهداف محدد للميرنا وتشكيل مجمعات غير تساهمية مع الببتيد. أدى هدم miRNA في الخلايا العصبية إلى موت الخلايا المبرمج والعيوب السلوكية المرتبطة به. وبالتالي ، يمكن استخدام الطريقة للنماذج الحادة للتنكس العصبي من خلال اضطراب miRNAs.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ظهرت MicroRNAs كأهداف علاجية جديدة بسبب الدور العالمي في تنظيم التعبير الجيني وأدلة مباشرة للمشاركة في المرض. ويجري بحث MiRNAs بنشاط لإمكاناتهم كأهداف المخدرات 1،2. وعلاوة على ذلك، ترتبط التعديلات في التعبير ميرنا مع العديد من الأمراض 3 والمحاكاة من هذه التغييرات اضطراب الاصطناعي من ميرنا التعبير يمكن استخدامها لدراسة مسارات الخلوية المشاركة في مظاهر المرض. الأنسجة تسليم محددة من ميرنا المخدرات تستهدف حاليا تحديا كبيرا لتطوير الأدوية ميرنا القائمة. Antagomirs ويحاكي ميرنا وكلاء واعدة لاحداث بلبلة مستويات ميرنا 4-6. ومع ذلك، السمات الخاصة التي تعزز خصوصيتها والفعالية يجب أن تكون دمجها في تصميم antagomirs قبل أنها يمكن أن تستخدم في الجسم الحي اضطراب ميرنا التعبير.

MicroRNAs هي ذات الصلة خاصة كأهداف في الاعصاب غير قابل للشفاء حاليا والأمراض العصبية التطورية. حاجز الدم في الدماغ يشكل قيدا لتسليم antagomirs في الدماغ. يتم استخدام الحقن المجسم على نطاق واسع في نماذج القوارض لتسليم الجزيئات في مواقع محددة في الدماغ 7. فهو يتطلب مهارة والاستثمار المكثف في الأجهزة والوقت. حقن المجسم هي الغازية، تنطوي عملية جراحية، تسبب ما لا يقل عن قاصر الإصابة وتقتصر على التسليم المحلي. استخدام الخلايا اختراق الببتيدات مع تفضيل الخلايا العصبية التي تستهدف يمكن مواجهة هذه القيود لأنها يمكن أن يتم تسليمها عبر الطريق عبر الأوعية الدموية ولكن اختراق حاجز الدم في الدماغ. هذا الببتيد المستمدة من فيروس داء الكلب البروتين السكري (RVG)، وكان يستخدم في السابق لتسليم سيرنا ضد فيروس التهاب الدماغ الياباني في الفئران 8. لقد وجدنا أن استخدام الببتيد لantagomir التسليم، miRNAs يمكن أن تكون فعالة ترسيتها في مخ الفأر 9.

ontent "> إن التحدي الرئيسي الثاني للميرنا تدق إلى أسفل ينشأ من صغر حجم miRNAs وجود إيسفورمس تسلسل ارتباطا وثيقا. نحن نأخذ مثال MMU-مير 29 عائلة التي تتكون من ثلاثة إيسفورمس ترتبط ارتباطا وثيقا، مير-29A و b و c. كما المعدلة Antagomirs عموما على طول العمود الفقري لزيادة استقرارها وجعلها مقاومة للهجوم من قبل nucleases. مغلق الأحماض النووية (LNAs) توفر ميزة أخرى أنها تعزز الاستقرار الحراري وتؤدي إلى استهداف تدهور أكثر وخارجها عائق الفراغية 10. تقديم تعديلات على طول العمود الفقري يمكن أن تكون فعالة ولكنها مكلفة. لقد رأينا في وقت سابق أن التعديلات يتجاوز العدد الأمثل قد لا تزيد من تعزيز فعالية. وبالتالي، فإن تصميم antagomir ينطوي على تعديل الأمثل للantagomir.

لمجمع antagomir غير تساهمي مع الببتيد موجه للعصب، واتهم سباعي لتمديد NONA أرجينين يستخدم. D-ارجينينوتستخدم المخلفات لأنها تمنح أعلى الاستقرار لأنها ليست عرضة للانشقاق من قبل البروتياز. سباعي إلى NONA أرجينين مساحات العمل خلية اختراق كلاء فعالة قدر، على الرغم من أنها لا تضفي نوع من الخلايا خصوصية. من خلال ربط تساهمي الببتيد RVG إلى رابط NONA أرجينين، وهو موجه للعصب، تم إنشاء خلية اختراق الببتيد. بقايا موجبة الشحنة من الببتيد تتفاعل مع الشحنة السالبة العمود الفقري الحمض النووي، لتشكيل المجمعات. هذه المجمعات يمكن استخدامها ل transfect فعال DNA أو RNA في الخلايا المستزرعة والحية في الأنسجة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ملاحظة: وقد تمت الموافقة على جميع الإجراءات بما في ذلك المواد الحيوانية جنة المؤسسي الحيوانات الأخلاقيات (هيئة الطاقة الذرية) في معهد علم الجينوم والبيولوجيا التكاملية، نيودلهي (IGIB / AEC / 10/2013). ويتم تعديل هذا البروتوكول خصيصا لاستهداف تسليم Antagomir-29 في الدماغ وضربة قاضية من مير-29.

1. استراتيجية تصميم Antagomir

  1. استرداد تسلسل ميرنا ناضجة من miRBase 11 (http://www.mirbase.org/).
  2. استرداد متواليات من أفراد الأسرة ميرنا المتعلقة باستخدام الرابط "جين العائلة" في السجل miRBase
    (http://www.mirbase.org/cgi-bin/mirna_summary.pl؟fam=MIPF0000009).
  3. عكس تكمل التسلسل: http://www.bioinformatics.org/sms/rev_comp.html يوفر أداة ملائمة لعكس تسلسل المتممة.
  4. بمناسبة المواقف التي يمكن تعديلها من قبل LNA باستخدام الإرشادات التالية:
    1. اختيار بقايا ثايمين وضعت 3-4 قواعد بصرف النظر عن تعديل LNA، منذ البريميدينات LNA هي أكثر استقرارا من البيورينات 12.
    2. اختيار بقايا السيتوزين مفصولة 3-4 بقايا إذا الخطوة السابقة تنتج أقل من خمسة تعديلات.
    3. أولويات التعديلات الخمسة إلى 5 'نهاية antagomir، لأن هذا يتجنب تسلسل البذور.

2. Antagomir-نيوروبيبتيدي إعداد مجمع

ملاحظة: هذه هي الخطوة الأكثر أهمية في البروتوكول ويحتاج التوحيد. لتوحيد بروتوكول أي قليل النوكليوتيد fluorescently المسمى (FLO) يمكن استخدامها في مكان antagomir 9. يجب أن يكون الببتيدات عالية النقاء (HPLC الصف، 98٪ نقاء) وترد .Sequences والمسؤول عن الببتيد وantagomir في الجدول 1.

  1. قرر عدد من موليه من antagomir ليتم حقنه على أساس تهمة المولي على antagomir، سميتها والوزن من الفأرة. احسب عدد مولات الببتيد ليتم حقنه على أساس نسبة تهمة المولي من antagomir: الببتيد.
    ملاحظة: توحيد نسبة تهمة المولي من antagomir: الببتيد لسمية والتسليم الفعال في دماغ الفأر. استخدام نسب مختلفة تهمة المولي من قليل النوكليوتيد fluorescently المسمى: الببتيد لتوحيد. وجدنا أن Antagomir-29 و الرقابة سواء كانت سامة في 4microgram / غرام من وزن الجسم من الماوس. واستخدمت Antagomir-29 والسيطرة على 2microgram / غرام من وزن الجسم، ولكن من المرجح أن تختلف عن كل الرنا الميكروي هذا التركيز الفعال.
  2. تمييع الببتيد وantagomir في أنابيب microfuge منفصلة عن الحلول الأسهم العقيمة مع 10٪ D-الجلوكوز إلى التركيز النهائي على النحو المرغوب فيه المحسوبة في الخطوة 1.
  3. الحفاظ على microfuge أنبوب مع حل الببتيد في دوامة في معتدلة السرعة vortexing ل.
  4. إضافة 1/3 الثالثة من لحل ntagomir إلى أنبوب حل الببتيد، ببطء، وانخفاض الحكمة، في حين يتم مزجه جيدا في خلاط دوامة.
  5. مواصلة خلط الحلول على دوامة لمدة 1 دقيقة المقبل ومن ثم السماح للخليط الوقوف لمدة 1 دقيقة.
  6. كرر الخطوة 4 و 5 مرتين أكثر لمزج ما تبقى من antagomir الحل مع حل الببتيد في نفس microfuge أنبوب. إضافة بطيئة أمر بالغ الأهمية لتشكيل المجمعات أحادية تفريق تكون فعالة في ترنسفكأيشن. السريعة بالإضافة إلى ذلك يمكن أن يؤدي إلى تجميع المجمعات وهطول الأمطار بهم.
  7. احتضان المجمع لمدة 30 دقيقة في RT دون vortexing ل. خلال هذا الوقت من الحضانة، والتأقلم الفئران إلى المختبر حيث سيتم إجراء الحقن.

3. الذيل الوريد حقن مجمع Antagomir-نيوروبيبتيدي

  1. لكبح جماح الحيوان، ضع الماوس في رادع أو decapicone من الحجم المناسب.
  2. تنظيف السطح من الذيل باستخدام مسحة القطن العلاقات العامةفي ماء دافئ (حوالي 40 درجة مئوية) غارقة ه. وهذا تشجيع توسع الأوعية وزيادة وضوح الوريد.
  3. الاقتراب من الذيل مع حجم صغير (0،5-1،0 سم مكعب) حقنة الانسولين في زاوية 15-20 درجة. يجب الحرص على عدم إدخال أي الهواء في حقنة. تبدأ في الجزء الأعلى من الذيل. حقن المجمع. إزالة الإبرة وتطبيق مسحة مطهر مباشرة إلى موقع الحقن (حوالي 5-10 ثانية) لوقف أي نزيف.
  4. استبدال الماوس في قفص التهوية بشكل فردي في مجموعة من 3-5، مع كوز الذره والمناديل الورقية كما تخصيب اليورانيوم. لا تبقي الفئران uninjected وحقن في نفس القفص.

4. السلوكي فحوصات

ملاحظة: الحفاظ على الفاصل الزمني من 3-4 ساعة في المقايسات بين الحقن والسلوكية للسماح للانتعاش بعد الحقن. جلب الماوس إلى غرفة هادئة. لا تخل هذه الحيوانات خلال هذه الفترة من التأقلم.

  1. التأقلم الماوس إلىغرفة جديدة لمدة 30 دقيقة ثم بدء فحوصات السلوكية التالية. الحفاظ على فجوة من 10 دقيقة بين كل فحص السلوكي.
  2. الشبك Hindlimb:
    ملاحظة: هذا الاختبار يبين ضعف الحركية وإعاقة للجهاز العصبي.
    1. رفع الماوس بلطف من خلال عقد بالقرب من قاعدة الذيل في الخلفية واضحة.
    2. التحقق من موقف hindlimb لمدة 10-15 ثانية. النوع البري splays الماوس hindlimbs بعيدا عن البطن، في حين أن الماوس رنحي يميل إلى التراجع واحد أو كلا hindlimbs نحو البطن أكثر من 50٪ من وقت علقت 13.
    3. عودة الماوس إلى القفص
  3. الحافة الاختبار:
    1. رفع الماوس برفق عن طريق الضغط على الذيل ويبقيه على الحافة من القفص.
    2. مراقبة الماوس على وجه التحديد في ركن من أركان القفص. النوع البري الماوس يمكن أن تمر زوايا بسهولة دون خوف وفقدان التوازن. الماوس رنحي يفقد توازنه، تجميد أو يهز في حين أن المشي على طول الحافة القفص وعند الزوايا.
    4. فحص الفأر الطباعة القدم:
    ملاحظة: للحصول على هذا الاختبار حفاظ على ورقة ماصة على استعداد، على أرضية مدرج الضيق (~ 70 سم طويلة، ~ على نطاق 5 سم، وبها ~ الجدران 5 سم عالية).
    1. عقد الماوس بلطف بواسطة يد واحدة وتطبيق حبر على أطرافه الخلفية بواسطة فرشاة.
    2. وضع ورقة ماصة على أرضية مدرج ضيق.
    3. السماح الماوس على المشي أو الجري على ورقة ماصة في خط مستقيم في المدرج واحدة من نهاية إلى أخرى.
    4. تكرار هذه العملية مرتين أخريين مع كل فأر باستخدام ورقة ماصة جديدة.
    5. قياس المسافة بين خطوتين متتاليتين في حركة إلى الأمام. لا تشمل آثار أقدام القليلة الأولى والأخيرة حيث الحيوان هو مجرد بدء والانتهاء من شوطه، على التوالي.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

باستخدام الإجراء المقدمة هنا والمجمعات من قليل النوكليوتيد 50microgram fluorescently المسمى (FLO) و ~ 850microgram RVG الببتيد من 1:15 المولي نسبة المسؤول: تم إعداد (FLO الببتيد) وحقنه مرة واحدة فقط خلال الوريد الذيل. وقد استخدم المجمع من غير موجه للعصب مصفوفة فيروس داء الكلب (RVM) الببتيد وFLO كعنصر تحكم التسليم. وفي اليوم التالي، الفئران الدماغ والكبد وقد تم عزل وأعدت تعليق خلية واحدة. وقد لوحظت الخلايا تحت المجهر لمخضر. تم تسليم مجمع FLO-RVG بنجاح مع أقصر وقت يوم واحد والكشف عن...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نوضح هنا منهجية يمكن الوصول إليها على نطاق واسع لدراسة تأثيرات تعديل الحمض النووي الريبي. حاليا ، تتضمن معظم محاولات التوصيف في الجسم الحي لوظائف miRNA إنشاء فئران بالضربة القاضية أو معدلة وراثيا تعبر عن إسفنجة miRNA. يتم التعبير عن معظم miRNAs ، حتى أنواع الخلية المحددة في أكثر من عضو. على سبيل المثال ، يتم أيضا التعبير عن miRNAs التي يعتقد في البداية أنها خاصة بنظام المكونة للدم في الدماغ ، بسبب وجود الخلايا الدبقية الصغيرة. وبالتالي ، حتى استراتيجية الضربة القاضية الخاصة بنوع الخلية ، والتي تعبر عن عوامل ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نشكر Souvik Maiti على المساعدة في تصميم أنتاغومير. كما نعرب عن تقديرنا ل Rangeetha J. Naik و Rakesh Dey و Bijay Pattnaik لمساعدتهم في الأساليب التجريبية. تم تمويل هذا العمل من قبل مجلس البحث العلمي والصناعي (BSC0123). تعترف HS و MV و RR بالزمالة من مجلس البحوث العلمية والصناعية في الهند. تعترف MAS بالزمالة من لجنة المنح الجامعية ، الهند.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
دوامة
Restrainer أو Decapicone
مدرج~ 70 سم بطول ، ~ 5 سم بعرض مع جدران بارتفاع ~ 5 سم.
الكواشف
قليلة النوكليوتيدات ذات العلامات الفلورية (siGLO) GEHealthcare Dharmacon INCD0016300120
10٪ معقمة D-glucose
Antagomir-29Exiqonالتوليف
Antagomir-controlExiqonالتوليف
Neuropeptide RVGG.L.Biochem ( شنغهاي) المحدودة.التوليف المخصص>98٪ نقاء
الببتيد العصبي RVMG.L.Biochem (شنغهاي) المحدودة.التوليف المخصص>98٪ نقاء
أخرى
القطن
الماء الدافئ
محاقن
صفائح
فرشاة الحبر
مطهر
ضيق المخصصالمخصصالأنسولينماصة

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Roshan, R., Ghosh, T., Scaria, V., Pillai, B. MicroRNAs: novel therapeutic targets in neurodegenerative diseases. Drug discovery today. 14, 1123-1129 (2009).
  2. Maes, O. C., Chertkow, H. M., Wang, E., Schipper, H. M. MicroRNA: Implications for Alzheimer Disease and other Human CNS Disorders. Current Genomics. 10, 154-168 (2009).
  3. Soifer, H. S., Rossi, J. J., Saetrom, P. MicroRNAs in Disease and Potential Therapeutic Applications. Mol Ther. 15, 2070-2079 (2007).
  4. Bader, A. G., Brown, D., Winkler, M. The Promise of MicroRNA Replacement Therapy. Cancer research. 70, 7027-7030 (2010).
  5. Stenvang, J., Petri, A., Lindow, M., Obad, S., Kauppinen, S. Inhibition of microRNA function by antimiR oligonucleotides. Silence. 3, 1-17 (2012).
  6. Trang, P., et al. Systemic Delivery of Tumor Suppressor microRNA Mimics Using a Neutral Lipid Emulsion Inhibits Lung Tumors in Mice. Molecular Therapy. 19, 1116-1122 (2011).
  7. Barbash, S., Hanin, G., Soreq, H. Stereotactic Injection of MicroRNA-expressing Lentiviruses to the Mouse Hippocampus CA1 Region and Assessment of the Behavioral Outcome. J Vis Exp. (76), e50170(2013).
  8. Kumar, P., et al. Transvascular delivery of small interfering RNA to the central nervous system. Nature. 448, 39-43 (2007).
  9. Roshan, R., et al. Brain-specific knockdown of miR-29 results in neuronal cell death and ataxia in mice. RNA. 20, 1287-1297 (2014).
  10. Kaur, H., Wengel, J., Maiti, S. Thermodynamics of DNA−RNA Heteroduplex Formation: Effects of Locked Nucleic Acid Nucleotides Incorporated into the DNA Strand. Biochemistry. 47, 1218-1227 (2008).
  11. Griffiths-Jones, S., Grocock, R. J., Van Dongen, S., Bateman, A., Enright, A. J. miRBase: microRNA sequences, targets and gene nomenclature. Nucleic Acids Research. 34, D140-D144 (2006).
  12. Kaur, H., Babu, B. R., Maiti, S. Perspectives on Chemistry and Therapeutic Applications of Locked Nucleic Acid (LNA). Chemical Reviews. 107, 4672-4697 (2007).
  13. Guyenet, S. J., et al. A Simple Composite Phenotype Scoring System for Evaluating Mouse Models of Cerebellar Ataxia. J. Vis. Exp. (39), (2010).
  14. Bergen, J. M., Park, I. -K., Horner, P. J., Pun, S. H. Nonviral Approaches for Neuronal Delivery of Nucleic Acids. Pharmaceutical Research. 25, 983-998 (2008).
  15. Zou, L. -L., Ma, J. -L., Wang, T., Yang, T. -B., Liu, C. -B. Cell-Penetrating Peptide-Mediated Therapeutic Molecule Delivery into the Central Nervous System. Current Neuropharmacology. 11, 197-208 (2013).
  16. Hwang, D. W., et al. A brain-targeted rabies virus glycoprotein-disulfide linked PEI nanocarrier for delivery of neurogenic microRNA. Biomaterials. 32, 4968-4975 (2011).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة