يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

ومحرض نموذج bm12 من الذئبة الحمامية الجهازية (SLE) في C57BL / 6 الفئران

18.3K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/53319

⸱

نوفمبر 1, 2015

 , 
1Division of Immunobiology, Cincinnati Children's Hospital Medical Center and University of Cincinnati College of Medicine

في هذه المقالة

ملخص

يعد نقل الخلايا الليمفاوية bm12 إلى متلقي C57BL / 6 نموذجا راسخا للذئبة الحمامية الجهازية. نصف هنا كيفية بدء المرض باستخدام هذا النموذج وكيفية توصيف الخلايا المساعدة المسامية التائية والخلايا البائية المركزية الجرثومية وخلايا البلازما عن طريق قياس التدفق الخلوي.

الملخص

الذئبة الحمامية الجهازية (SLE) هو مرض مناعي ذاتي له مظاهر سريرية ومناعية متنوعة. تعكس العديد من النماذج الحيوانية العفوية والمحفزة المكونات الشائعة للأمراض البشرية ، بما في ذلك نموذج نقل bm12. عند نقل خلايا الطحال bm12 أو الخلايا التائية CD4 المنقاة ، تطور الفئران C57BL / 6 بسرعة ترددات كبيرة من الخلايا المساعدة التائية (Tfh) ، والخلايا البائية للمركز الجرثومي (GC) ، وخلايا البلازما متبوعة بمستويات عالية من الأجسام المضادة للنواة المنتشرة. نظرا لأن هذا النموذج يستخدم الفئران على خلفية C57BL / 6 نقية ، يمكن للباحثين دراسة تطور المرض بسرعة وسهولة في سلالات الفئران المعدلة وراثيا أو بالضربة القاضية في فترة زمنية قصيرة نسبيا. نصف هنا بروتوكولات تحريض النموذج والكمية Tfh و GC B وخلايا البلازما عن طريق قياس التدفق الخلوي متعدد الألوان. الأهم من ذلك ، يمكن أيضا استخدام هذه البروتوكولات لتوصيف المرض في معظم نماذج الفئران من مرض الذئبة الحمراء وتحديد خلايا Tfh و GC B وخلايا البلازما في نماذج الأمراض الأخرى.

المقدمة

الذئبة الحمامية الجهازية (SLE) هو مرض مناعي ذاتي معقدة تتميز prototypically بواسطة الأجسام المضادة لمكافحة النووي (ANA) إنتاج والتهاب كبيبات الكلى. العديد من عقابيل الآخرين، بما في ذلك الجلد، القلب والرئتين، وآفات الكبد ترتبط مع المرض في بعض الأفراد. تقديرات الانتشار في الولايات المتحدة تختلف على نطاق واسع، من 150،000-1،500،000 1،2، مع ارتفاع معدل لا سيما في النساء والأقليات 3. على الرغم من أن مسببات مرض الذئبة الحمراء وكان من الصعب تمييز، ويعتقد أن تنشأ من التفاعل بين العوامل الوراثية والبيئية المختلفة، والتي تبلغ ذروتها في المناعة الذاتية النظامية.

وقد استخدمت نماذج حيوانية عديدة لدراسة العوامل التي تؤدي إلى ظهور المرض وتطور. نماذج الماوس كلاسيكية من SLE تشمل سلالات الفئران وراثيا بما في ذلك NZB X NZW F1 نموذج ومشتقاتها NZM لها، وMLR سلالة / لبر، وسلالة BXSB / الياء، وأنظمة محرض، مثل صristane والأمراض المزمنة الكسب غير المشروع ضد المضيف (cGVHD) نماذج 4. التقارير الأولية للإنتاج الأجسام المضادة في نماذج GVHD تستخدم سلالات الفئران مختلفة أو سلالات الهامستر لالأم إلى نقل F1 5-8. أكثر الأساليب شيوعا لدراسة أمراض مثل مرض الذئبة تشمل حاليا الوالد DBA / 2 → (C57BL / 6 × DBA / 2) F1، ونموذج نقل bm12 هو موضح هنا. يحتوي كل نموذج على المحاذير الخاصة بها، لكنها تشترك عموما مجموعة مشتركة من الميزات التي ترتبط بمظاهر سريرية من الأمراض التي تصيب البشر. وتشمل المعلمات في معظم الأحيان ورد في نماذج الماوس تضخم الطحال، تضخم العقد اللمفية، التهاب الكلية، وإنتاج ANA، وعلى المستوى الخلوي، والتوسع في الخلايا التائية المساعد الجريبي (مرفأ تونس المالي)، ومركز (GC) خلايا B جرثومي، وخلايا البلازما.

ويتحقق هذا النموذج bm12 محرض من قبل نقل بالتبني من الخلايا الليمفاوية من IA bm12 B6 (C) - H2 - AB1 bm12 / KhEgJ (bm12) الفئران، سلالة طdentical إلى C57BL / 6 فيما عدا 3 بدائل الأحماض الأمينية على الطبقة MHC II، إلى IA ب C57BL / 6 (B6) الفئران. Alloactivation من الجهات المانحة CD4 T خلايا من قبل المرسل إليه ناقلات الجنود المدرعة يؤدي إلى cGVHD مع بأعراض مشابهة لأعراض مرض الذئبة الحمراء. على وجه التحديد، وتشمل هذه توسيع مرفأ تونس المالي المستمدة من الجهات المانحة، والتوسع في GC خلايا B-المستمدة المستفيدة وخلايا البلازما، وإنتاج أنس بما في ذلك مكافحة لمكافحة dsDNA، ومكافحة ssDNA، ومكافحة الكروماتين، وأضداد RBC 9. مع مرور الوقت، الفئران المتلقي تطوير التهاب كبيبات الكلى المرتبطة الودائع مفتش في الكبيبي، فراغي، والمناطق الأوعية الدموية في الكلى 10. نحن في الآونة الأخيرة أنه، على غرار الأمراض التي تصيب البشر، وهناك أيضا دورا حاسما في النوع الأول الإنترفيرون في هذا النموذج 11. وتجدر الإشارة إلى المعايير المحددة لSLE البشري تشمل تطوير التهاب الكلية متوافق مع SLE بحضور المضادة لمكافحة dsDNA الأجسام المضادة 12، وكلاهما من السمات البارزة لهذا النموذج الماوس.

هناك حد ذاتهامزايا veral من طراز bm12 على نماذج عفوية. النماذج الكلاسيكية التي تنمي SLE تشبه علامات تلقائيا تعتمد على أي سلالات الفئران الهجينة، والسلالات الفطرية الماوس لا على خلفية B6، أو المواضع الجينية كبير على خلفية B6، والتي تجعل العبور إلى بالضربة القاضية أو الفئران المعدلة وراثيا إلا صعبة وتستغرق وقتا طويلا. مع نموذج محرض bm12، يمكن أن الفئران المعدلة وراثيا بمثابة إما الجهة المانحة أو المستفيدة، مما يتيح مزيدا من التحديد السريع للمقصورة الخلوية التي جينات معينة قد تكون مهمة لمرض. وعلاوة على ذلك، تطور المرض في نموذج bm12 هي أسرع بكثير، وتتطلب فقط 2 أسابيع حتى ظهور أنس، مقارنة عدة أشهر لنماذج أكثر عفوية. وعلاوة على ذلك، وعلى النقيض من نماذج العفوية التي تطور المرض عند نقاط زمنية مختلفة، وتزامن غاية بداية المرض والتقدم في نموذج B6 bm12 →. وهذا يسمح للجيل الأفواج بحجم مناسب يمكن أن بالبريد تستخدم لاستراتيجيات التداخلية العلاجية أو في أي مرحلة من مراحل تطور المرض.

ما يلي هو بروتوكول مفصل لبدء مثل SLE المناعة الذاتية عن طريق نقل بالتبني من الخلايا الليمفاوية bm12 إلى C57BL / 6 الفئران، أو المتغيرات الجينية على خلفية B6. بالإضافة إلى ذلك، نحن تصف البروتوكول تلطيخ تدفق cytometric تعداد مرفأ تونس المالي، وخلايا GC B، وأنواع خلايا البلازما خلايا ترتبط مع الأمراض التي تصيب البشر. الأهم من ذلك، يمكن أيضا أن تكون هذه البروتوكولات المستخدمة لوصف المرض في معظم نماذج الماوس من مرض الذئبة الحمراء وتحديد مرفأ تونس المالي، وخلايا GC B وخلايا البلازما في نماذج الأمراض الأخرى.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

تم تنفيذ العمل الحيوانية في ظل ظروف خالية من مسببات الأمراض المحددة وفقا للمبادئ التوجيهية التي وضعتها الجمعية للتقويم والاعتماد في مختبر رعاية الحيوان الدولية ولدينا رعاية الحيوان واللجنة المؤسسية الاستخدام (IACUC).

ملاحظة: دمج الفئران معربا عن علامة مسانج مثل CD45.1 على أي من الجهات المانحة أو الحيوانات المتلقي إذا كان ذلك ممكنا، لأن هذا يسمح للرصد كفاءة الكسب غير المشروع المانحة والتوسع محدد من CD4 T السكان الخلية المانحة. إذا النظر في استخدام الفئران المعدلة وراثيا غير ذلك متبرع أو متلقي، تأكد من backcrossed سلالة بشكل صحيح إلى خلفية B6، أو قد يتم رفض هذه الخلايا-نقل سيتم تناولها بمزيد من التفصيل في نتائج تمثيلية وأقسام المناقشة.

ملاحظة: وحدات التخزين من التفصيل الإجراءات التالية للحصاد 4 المانحة bm12 الفئران، والتي ينبغي أن تسفر ما يكفي من الخلايا لحقن الفئران 12-16. ستةإلى اثني عشر الفئران bm12 قبل أسبوع تقريبا تسفر 100-140٬000٬000 الخلايا الليمفاوية مع ما يقرب من 25٪ CD4 T الخلايا. إذا بدءا من أرقام مختلفة من الفئران، أو سلالات الفئران مختلفة، أحجام نطاق أعلى أو لأسفل وفقا لذلك. C57BL / 6 الفئران تعطي عموما عوائد مماثلة مع أقرب إلى 20٪ CD4 T خلايا فقط.

ملاحظة: تنفيذ جميع الخطوات في RT واستخدام وسائل الإعلام RT لتجنب الحرارة الباردة والصدمة، والذي يمكن أن تضعف قابلية الخلايا اللمفاوية على المدى الطويل. أداء الأنسجة الحصاد وخطوات معالجة الأنسجة في نسيج الثقافة هود باستخدام تقنية العقيم. جميع وسائل الإعلام في هذا البروتوكول هو IMDM مع 10٪ FBS، ما لم يرد خلاف ذلك، وسيتم مجرد يشار إلى الحرارة المعطل "وسائل الاعلام كاملة."

1. رواية طريقة لانماط bm12 الفئران

ملاحظة: يتم توفير بروتوكول تقييد وجيزة مقرها ملخص لالتنميط الجيني هنا، كبديل بسيطة وغير مكلفة لالتسلسل، الذي يشغل حاليا منصب طريقة التنميط الجيني نشرت الوحيدلهذه الفئران.

  1. عزل الحمض النووي الجيني من ذيول الماوس. يرجى الرجوع إلى المادة إن الرب السابقة لبروتوكولات مفصلة عن ذيل الماوس لقطة وتوليد كدنا] من الذيل يساعد على هضم 13.
  2. إجراء العكسية الناسخ سلسلة بلمرة رد فعل (PCR) 14 لتضخيم المشترك 474 نقطة أساس جزء من الحمض النووي من MHC-II IA ب وIA bm12 باستخدام بادئات والشروط الحراري thermocycling المدرجة في الجدول 1.
  3. أداء تقييد هضم على ~ 7 ميكرولتر من المنتج PCR باستخدام انزيم PsuI، أو واحد من isoschizomers لها (BstX2I، BstYI، MflI، أو XhoII)، الذي يقطع النوع البري IA ب، ولكن ليس IA bm12 متحولة. اتبع هضم بروتوكول المقدمة من قبل الشركة المصنعة، والتي سوف تحدد خليط من الماء، العازلة والانزيم، والحضانة من 5 دقائق. لعدة ساعات في 37 ° C 15.
  4. تحميل هضم المنتج وتعمل على 1٪ هلام بولي أكريلاميد مع بروميد إيثيديوم 14 ل30-45 دقيقة. في 150V-على الرغم من إعدادات الجهد والوقت الأمثل سوف تختلف تبعا لجهاز PCR هلام المستخدمة. تصور العصابات DNA مع إضاءة الأشعة فوق البنفسجية. وتظهر نتائج ممثل في الشكل 1.

figure-protocol-1
الشكل 1. الممثل bm12 النتائج التنميط الجيني.
للتعرف على الفئران متماثل لIA bm12 / bm12، وقد تم عرض فيلم DNA الذيل لbm12 بواسطة PCR / تقييد هضم التنميط الجيني (الخطوة 1). النوع البري متماثل (IA ب / ب) DNA ينتج شريطين في 227 و 247 سنة مضت (تصور كما فرقة واحدة سميكة في ~ 250 شركة بريتيش بتروليوم)؛ bm12 متماثل (IA bm12 / bm12) غلة DNA فرقة واحدة على 474 سنة مضت. ومتخالف (IA bm12 / ب) DNA ينتج شريطين في ~ 250 و 474 نقطة أساس. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

2. حصاد المانحةالخلايا

  1. الفئران التضحية المانحة باستخدام المؤسسي رعاية الحيوان واللجنة الاستخدام (IACUC) وافق عليها أساليب القتل الرحيم الابتدائية والثانوية. على سبيل المثال، الموت ببطء الفئران خنقا مع CO 2 تليها خلع عنق الرحم.
  2. باستخدام تقنية العقيم، الطحال الحصاد والغدد الليمفاوية (عنق الرحم سطحية، الفك السفلي، العضدية، الإبطين، المساريقي، والاربية) إلى 15 مل أنابيب تحتوي على 10 مل وسائل الإعلام كاملة كما هو الحال في 11-13.
    ملاحظة: يرجى الرجوع إلى التقارير السابقة للالليمفاوية مفصل بروتوكولات عقدة تشريح 16-18. هذا النموذج هو أيضا ناجحة باستخدام الماوس splenocytes الوحيدة لنقل، ولكن بالإضافة إلى ذلك من الغدد الليمفاوية يقلل بشكل ملحوظ من العدد المطلوب من الفئران المانحة.
  3. تولد وحيدة الخلية تعليق من قبل يهرس الأنسجة اللمفاوية التي تم جمعها في الخطوة 2.2 خلال 70 ميكرومتر مصافى الخلية باستخدام المكبس من حقنة. لعائدات أفضل، لا تفرط مصافى استخدام ~ 6 مصافى لكل 4الفئران معالجة، وشطف مصافى كثيرا أثناء معالجة. الجمع بين الأنسجة من 4 الفئران إلى مجموعتين أنابيب مخروطية 50 مل، ثم خلايا الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 400 x ج وصب طاف.
  4. Resuspend الخلايا من كلا أنابيب مخروطية في 50 مل سائل الإعلام كاملة ونقل إلى أنبوب مخروطي الجديد. الحفاظ على هذا الأنبوب في RT.
    ملاحظة: الدهون تتمسك جانبي الأنبوب، وإذا لم يتم استبدال أنبوب، يمكن أن عوائد الخلوية النهائية يعانون.

3. المانحة العد خلية

ملاحظة: للحفاظ على أعلى الجدوى، خلايا الدم الحمراء (RBC) تحلل العينة كلها غير مستحسن.

  1. مزيج تعليق خلية واحدة من الخطوة 2.4 بشكل جيد، وإزالة 1 مل وتحويلها إلى منفصلة المخروطية 50 مل. جانبا المتبقية، خلايا يمسها (49 مل) في RT أثناء العد.
  2. إضافة 3 مل من الدم الحمراء العازلة تحلل الخلايا استنادا كلوريد الأمونيوم إلى عينة الخلايا 1 مل من الجهات المانحة. المزيج بلطف لمدة 1 دقيقة. هزاز، ثم ملء إلى 50 مل مع وسائل الإعلام الشامل، وهوالثانية الطرد المركزي لمدة 5 دقائق. في 400 x ج وطاف صب.
  3. الخلايا resuspend RBC هي lysed في 10 مل سائل الإعلام كاملة وعدد (على سبيل المثال، مع الأزرق التريبان باستخدام عدادة الكريات). نتيجة ضرب من قبل 49 عاما وهذا هو العدد الكلي للخلايا المتبقية في العينة غير هي lysed التي كانت توضع جانبا. تجاهل الخلايا RBC هي lysed.

4. المانحة خلية وصفها و / أو CD4 T خلية تنقية

  1. إذا رغبت في ذلك، وتنقية خلايا CD4 T في هذه المرحلة، رغم أن هذا ليس ضروريا. بالإضافة إلى ذلك، إذا رغبت في ذلك، وخلايا التسمية مع CFSE، كما في 19، أو غيرها من الأصباغ تتبع الخلية، ومثال على ذلك هو مبين في الشكل (4) من الباب النتائج تمثيلي.
    ملاحظة: للحصول على تنقية الخلايا CD4 T، فمن المستحسن اختيار المغناطيسية السلبية، كما أنه يمكن تحقيق عالية النقاء ويترك الخلايا يمسها مع قابلية عالية كما هو موضح في 20. من المهم أن تستخدم مخازن خالية من الذيفان الداخلي. لذا، بدلا من BSA، وجعل الفصل العازلة الطرافةح 2٪ FBS والتركيز الموصى به من EDTA.

5. حقن الخلايا المانحة bm12

  1. بعد فرز الخلايا الليمفاوية المانحة في الخطوة 3 (وتنقيته أو المسمى كما في الخطوة 4، حسب الرغبة)، وخلايا جهاز الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 400 ز س. صب الخلايا وطاف resuspend في برنامج تلفزيوني على 120 مليون الخلايا الليمفاوية لكل مل (أو 30 مليون تنقية خلايا CD4 T لكل مل). نقل الخلايا إلى معقمة 5 مل أنبوب الجولة القاع، أو غيرها من أنبوب معقم أن يستوعب بسهولة حقنة 1 مل مزودة 27.5 × 13 مم G الإبرة.
  2. قبل الحقن، جانبا عينة صغيرة من الخلايا المانحة من الخطوة 5.1 في 4 درجات مئوية لتلطيخ تدفق لتحديد النسبة المئوية للخلايا CD4 T داخل عينات من الجهات المانحة. وصمة عار هذه العينات كما هو موضح في الخطوة 8 باستخدام لوحة الأجسام المضادة الحد الأدنى من (الجدول 2).
    ملاحظة: إذا تم استخدام الخلايا من سلالات مختلفة الماوس الجهات المانحة منفصلة، ​​وهذا هو أحد الاعتبارات الهامة، وإذا تختلف CD4 T نسب الخلايا بشكل كبير، بورification قد تكون مطلوبة.
  3. مزج خلايا بلطف، ولكن بدقة. ويمكن القيام بذلك من قبل pipetting الخلايا صعودا وهبوطا باستخدام حقنة 1 مل بدون إبرة المرفقة. بعد الاختلاط، ورسم الخلايا في حقنة 1 مل. إرفاق الإبرة بعد إزالة أي فقاعات الهواء. الحفاظ على إبرة في حين وفتيلة الحقنة يساعد في الحفاظ على بقاء الخلية.
  4. ضخ 250 ميكرولتر في الماوس (أي ما يعادل 30 مليون الخلايا اللمفية، أو 7500000 تنقية خلايا CD4 T في الماوس) البريتونى، كما هو موضح في 21.
    ملاحظة: في التجارب المعروضة هنا والعمل مسبق لدينا 11، يتم حقن كل فأر مع 30 مليون مجموع الخلايا الليمفاوية من bm12 المانحين، بدلا من 100 مليون مجموع splenocytes المستخدمة تقليديا. في بيانات غير منشورة من مختبرنا، لم يلاحظ أي فرق في مصل مضاد لمكافحة dsDNA في اليوم 14 بعد الحقن من 30 أو 100 مليون الخلايا الليمفاوية في الماوس. في حين أن هذا يقلل بشكل ملحوظ من عدد من الفئران اللازمة لإجراء التجارب، وتطوير التهاب الكلية الطرافةح لم يتم تقييم هذا العدد من الخلايا.

6. تحديد تطعيم الكفاءة

ملاحظة 1: هذا القسم سوف تصف كيفية تحديد درجة ترقيع الخلايا المانحة في المتلقي في يوم 3 من أجل تحديد أي الفئران التي قد تلقوا حقن دون المستوى الأمثل (على سبيل المثال، والكسب غير المشروع في الماوس واحد هو <10٪ من تلك التي شوهدت في كل الفئران الأخرى من نفس المجموعة). ويمكن لهذه البيانات تساعد أيضا في تحديد ما إذا كان يتم رفض الخلايا من سلالة الماوس المعدلة وراثيا في نقطة زمنية لاحقة (لمزيد من التفاصيل، راجع قسم نتائج ممثل، الشكل 6).

ملاحظة 2: هذا القسم هو ممكنا إلا إذا المانحين والمتلقين هي من الفئران على مختلف الخلفيات مسانج، على سبيل المثال، عند استخدام المانحين CD45.1 bm12 وCD45.2 C57BL / 6 المتلقين، أو عندما تتم تسمية الخلايا المانحة مع صبغة خلية تتبع. الأهم من ذلك، في 3 أيام بعد الحقن، خضعت خلايا CD4 T الحد الأدنى من التوسع (SEالبريد القسم تمثيلي النتائج، الشكل 4)، لذلك الفروق الملحوظة في درجة تطعيم ومن المقرر أن التباين في الحقن، وليس التوسع.

  1. تخدير الفئران مع 4٪ الأيزوفلورين أو أي طريقة أخرى وافق IACUC. اختبار ردود الافعال القدم الخلفية لضمان الفأر هو تخدير بشكل صحيح قبل الشروع في سحب الدم.
  2. حصاد 100-200 ميكرولتر الدم باستخدام أسلوب معتمد IACUC، مثل الرجعية المدارية ثقب كما في 22. جمع الدم إلى الفردية 0.5 مل أنابيب microcentrifuge تحتوي على مضاد للتخثر، مثل أنابيب جمع البلازما المشار إليها في الجدول المواد التي تحتوي على dipotassium مجفف بالتجميد EDTA. بعد جمع الدم، وتطبيق ضغط لطيف للعين الماوس باستخدام منشفة معقمة أو الشاش لضمان توقف النزيف، ثم ضع الماوس مرة أخرى في قفص وطنه حيث أنه سيبقى حتى موسم الحصاد الأنسجة النهائي (الخطوة 7).
    ملاحظة: لا تترك الفئران غير المراقب حتى استعادت الفئران الوعي الكافي لالحفاظ على الاستلقاء البطني، وعدم العودة الفئران للشركة الآخرين حتى تعافى تماما.
  3. يصل حجم الدم إلى 500 ميكرولتر مع 21 ° C PBS ونقل إلى المخروطية القاع أنبوب microcentrifuge، ثم تقوم عليها ببطء 200 ميكرولتر من 21 درجة مئوية عالية الكثافة حل فصل الخلايا مع 200 ميكرولتر الماصة، والحرص على التقليل من الخلط بين المرحلتين ( انظر المواد للطاولة الحلول الموصى بها). خلايا الطرد المركزي في 700 x ج لمدة 20 دقيقة في 20-25 درجة مئوية مع الفرامل أجهزة الطرد المركزي لتعيين منخفضة.
  4. إزالة الطبقة العليا التي تحتوي على الخلايا الليمفاوية مع الماصة 1 مل ونقل إلى أنبوب microcentrifuge جديدة تحتوي على 800 ميكرولتر وسائل الإعلام كاملة البارد. دوامة بلطف لمزج الخلايا. خلايا الطرد المركزي في 700 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية، وطاف صب.
  5. Resuspend الخلايا في 200 ميكرولتر وسائل الإعلام كاملة، نقل إلى لوحة 96-جيدا U-القاع، وصمة عار لتدفق كما الخلوي هو موضح في الخطوة 8 باستخدام لوحة الأجسام المضادة الحد الأدنى من (الجدول 2) لتحديد رانه الوفرة النسبية للخلية الكسب غير المشروع CD4 T كنسبة مئوية من PBMCs.

7. الأنسجة النهائية الحصاد

ملاحظة: التجارب الموضحة في قسم النتائج كانت تحصد بعد 14 يوما من حقن الخلايا المانحة (أو في بعض الحالات وقتا أقل)، كما أنها تركز على التطوير الأولي للخلايا مرفأ تونس المالي وخلايا البلازما. ومع ذلك، لأن هذا النموذج هو نموذج GVHD المزمن مرض الذئبة الحمراء، ويمكن رصد المرض في الكثير من نقاط وقت لاحق. والإطار الزمني الأمثل يتوقف على مسألة البحوث التي طرحت في كل تجربة على حدة.

  1. في نقطة زمنية محددة سلفا بعد حقن bm12 الخلايا المانحة (الخطوة 5.4)، التضحية الفئران باستخدام أسلوب معتمد IACUC من القتل الرحيم. ويوصى الاختناق مع CO 2 تليها استنزاف. خلع عنق الرحم يمكن أن تعمل كوسيلة الثانوي القتل الرحيم، ولكن هذا قد يقلل من العائد سحب الدم.
  2. الرطب البطن من الفأرة باستخفاف مع زجاجة رذاذ يحتوي على 70٪الإيثانول. جعل، شق سطحي صغير مع مقص جراحي حوالي 1 سم فوق الأعضاء التناسلية. التراجع في جلد البطن نحو القص، والحرص للحفاظ على لفافة البريتوني سليمة.
    ملاحظة: الفئران المريضة عادة ما تكون موجودة مع 0.5-3 مل الاستسقاء في يوم 14، والتي، على الرغم من أنه لم يتم حتى الآن يتميز بشكل جيد، ويمكن قياسها وتحليلها كمعلمة المرض إضافية.
  3. تناسب حقنة 5 مل مع إبرة 18 G. ادخال الإبرة في الربع السفلي الأيمن من البطن مع الإبرة الموجهة تصل نحو رأس الحيوان وعند 15 درجة زاوية لطائرة من اللفافة. ضع طرف الإبرة بالقرب من الأعور للمساعدة في منع الإبرة من الحصول على انسداد الأمعاء في حين الشفط مع استسقاء.
  4. تدوير بعناية الماوس على جانبها، ثم رسم ببطء استسقاء في حقنة. مرة واحدة وقد تم انتشال استسقاء، وإزالة حقنة وسجل حجم نضح، استنادا إلى علامات الحجمي على جانب بسوريانجى.
  5. استسقاء التفريغ إلى 5 مل أنبوب الجولة القاع ومتجر على الجليد للتجهيز لاحق.
  6. الدم الحصاد عن طريق السحب من الوريد الأجوف السفلي (IVC) في الأساس كما في 22. باستخدام ملقط مملة، تحرك بلطف الأمعاء إلى الجانب الأيسر من الفأرة، كشف IVC. ادخال ابرة 27.5 G تركيبها على حقنة 1 مل في IVC ورسم ببطء 400-500 ميكرولتر من الدم.
  7. للحد من انحلال الدم، وضخ الدم ببطء إلى 0.5 مل مصل microcentrifuge لأو جمع البلازما أنبوب. لتحليل مصل في وقت لاحق من قبل أنس ELISA، والحفاظ على الدم على الجليد.
  8. تشريح والحصول على الأنسجة ذات الصلة إضافية (الطحال، وإذا كان المطلوب، والعقد اللمفاوية والكلى، وخاصة إذا جمع في نقطة زمنية لاحقة، والتهاب كبيبات الكلى سيتم سجل). إزالة الطحال عن طريق وضع بلطف الأمعاء الى الوراء في اتجاه الجانب الأيمن للحيوان، وسحب على البنكرياس، والذي هو النسيج الضام الأولية الطحال و.
  9. إزالة أي البنكرياس المتبقية، ثم وزنالطحال على توازن عالية الدقة على الفور بعد تشريح، وتضخم الطحال الإجمالي معلمة شيوعا في نماذج الفئران من مرض الذئبة الحمراء. وضع الأنسجة اللمفاوية إلى الفردية 1.5 مل أنابيب مليئة 1ML وسائل الإعلام كاملة على الجليد. إصلاح الكلى في 10٪ من الفورمالين محايدة مخزنة أو المفاجئة تجميد الكلى للالأنسجة لاحقة كما في 23.
  10. الطرد المركزي الدم في غضون 2 ساعة من جمع لمدة 3 دقائق. في 10000 x ج (4 درجات مئوية). إزالة المصل وتخزينها في -80 درجة مئوية لتحليلها لاحقا من قبل ANA ELISA. الرجوع إلى التقارير السابقة للمفصل ANA ELISA بروتوكولات 24،25. مخزن المصل في مضاعفات 10-20 مكل للحد من دورات تجميد / الذوبان، والسماح لعدد أكبر من المقايسات في المستقبل.
  11. الطرد المركزي استسقاء 400 x ج لمدة 5 دقائق. إزالة طاف مع الماصة 1 مل وقسامة إلى عدة 0.5 مل أنابيب. تجميد طاف في -80 درجة مئوية لمدة تحليلات لاحقة من أضداد النووية (أنس) أو غيرها من وسطاء التهابات القابلة للذوبان.
  12. fract الخلوي و resuspend ايون في حوالي 1 مل سائل الإعلام كاملة ونقل 200 ميكرولتر إلى لوحة 96-جيدا U-أسفل لتلطيخ تدفق (كما في الخطوة 8).
  13. الهريس كل الطحال من خلال 70 ميكرومتر مصافى خلية في أنابيب منفصلة وشطف مع وسائل الإعلام كاملة. و resuspend splenocytes مع 1 مل الباردة RBC تحلل العازلة لمدة 1 دقيقة. والمزيج بلطف هزاز. يصل حجم 10 مل مع وسائل الإعلام كاملة الباردة وأجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 400 x ج وصب طاف.
  14. بيليه الخلية resuspend في 5 مل سائل الإعلام كاملة والعد باستخدام عدادة الكريات. ضبط مستوى الصوت بحيث 200 ميكرولتر من وسائل الإعلام كاملة يحتوي 1-3٬000٬000 الخلايا. تبدأ تلطيخ لالتدفق الخلوي (الخطوة 8) باستخدام لوحة طويلة (الجدول 2) لتحديد الجهات المانحة CD4 T الخلية والمتلقي B تمايز الخلايا والتوسع.
    ملاحظة: اعتمادا على ما الليزر، وأنبوب مضخم (PMT)، ومجموعة مرشح مجموعات المتاحة، فصل لوحة تحليل الخلايا T و B إلى لوحات متعددة قد يكون ضروريا.
ve_title "> 8. تلطيخ التدفق

  1. نقل 1-3٬000٬000 splenocytes في 200 ميكرولتر وسائل الإعلام كاملة إلى الفردية 5 مل أنابيب جولة القاع، أو في آبار منفصلة لوحة 96-جيدا U-القاع.
    ملاحظة: استخدام لوحة 96-جيدا هو وسيلة فعالة لصبغ عينات متعددة، ولكن الحرص على لوحة العينات في كل البعض بشكل جيد من أجل منع التلوث المتبادل. يمكن للمرء وحة 96 جيدا وفقا لعقد 24 عينة.
  2. لوحة أجهزة الطرد المركزي في 500 x ج لمدة 3 دقائق، ثم طاف نفض الغبار من لوحة إلى مناسبة (بيولوجية) حاوية.
  3. Resuspend والكريات الخلايا مع 100 ميكرولتر من تدفق العازلة (1٪ FBS في PBS) التي تحتوي على صبغة الجدوى قابل للتثبيت في أوصى تركيز الشركة المصنعة وتنقيته مكافحة CD16 / مكافحة CD32 الأجسام المضادة كوكتيل في 1 ميكروغرام / مل. احتضان لمدة 10 دقيقة في 20-25 درجة مئوية، ثم إضافة 100 وسائل الاعلام كاملة الباردة ميكرولتر لإرواء بقاء الصبغة.
    ملاحظة: Splenocytes من الفئران المريضة عادة ما تحتوي على أعداد كبيرة نسبيا من الخلايا الميتة أو التي تحتضر.لذا، يوصى بإدراج صبغة حيوية لتجنب وضع العلامات الأجسام المضادة غير محددة من خلايا الموت، مما أدى إلى نظافة البيانات وأكثر موثوقية. وبالمثل، يتم تضمين كوكتيل لمكافحة CD16 / المضادة للCD32 لمنع غير محددة fluorescently المسمى الأجسام المضادة ملزمة مستقبلات لكرة القدم.
  4. لوحة أجهزة الطرد المركزي في 500 x ج لمدة 3 دقائق، ثم طاف نفض الغبار من لوحة في حاوية واقية. Resuspend الخلايا في 200 تدفق العازلة ميكرولتر. لوحة أجهزة الطرد المركزي في 500 x ج لمدة 3 دقائق، ثم طاف نفض الغبار من لوحة في حاوية واقية.
  5. خلايا Resuspend في 50 ميكرولتر تدفق العازلة التي تحتوي على الأجسام المضادة كوكتيل (الجدول 2). احتضان لمدة 20 دقيقة في 4 درجات مئوية، ثم إضافة 150 العازلة تدفق ميكرولتر. كرر الخطوة غسل 8.4.
  6. Resuspend الخلايا مع 100 ميكرولتر بارافورمالدهيد 2٪ في برنامج تلفزيوني. احتضان لمدة 30 دقيقة في 4 درجات مئوية، ثم إضافة 100 العازلة تدفق ميكرولتر. لوحة أجهزة الطرد المركزي في 500 x ج لمدة 3 دقائق، ثم طاف نفض الغبار من لوحة في حاوية واقية.
  7. Resuspeالثاني في 200 تدفق العازلة ميكرولتر، ونقل إلى تدفق إدراج أنبوب أو أنابيب تدفق القياسية، إضافة إضافي 100-200 ميكرولتر تدفق العازلة، وتخزينها في 4 درجات مئوية في الظلام حتى الحصول على قياس التدفق الخلوي.
  8. الحصول على تدفق مجهزة الكريات مع الليزر وهذه الفرق المناسبة لوحات الأجسام المضادة المختار في غضون عدة أيام من تلطيخ. سجل الأمام عرض مبعثر و / أو ارتفاع في بالإضافة إلى الأمام منطقة مبعثر، منطقة مبعثر الجانب، ومجال المعلمات الفلورية المستخدمة. للحصول على نتائج موثوقة، اكتساب ≥1،000 الخلايا المانحة في كل عينة WT، أو عدد مساو من مجموع الخلايا الليمفاوية في الفئران المعدلة وراثيا أو التلاعب التي تظهر توسع الحد الأدنى من الخلايا المانحة، حيث جمع هذا العدد الكبير من الأحداث قد لا يكون ممكنا.
    ملاحظة: التدفق الخلوي وصفت التحليلات بالتفصيل في قسم النتائج التمثيلي (الأرقام 3-6).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

الفئران المريضة تطوير تضخم الطحال في اقل من 14 يوما، واظهار الطحال 2-3 أضعاف حجم الفئران صحي من حيث الكتلة والخلوية (الشكل 2).

هي بوابات Splenocytes بالتتابع على الضوء المبعثر (FSC-A من قبل SSC-A)، والقضاء على الحلل (FSC-W أو -H من قبل FSC-A)، خلايا قابلة للحياة (تلطيخ انخفاض الجدوى صبغة)، وCD4 + TCRβ + (الشكل 3A). الخلايا المانحة متميزة من خلايا المتلقي على...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

نموذج محرض bm12 هو وسيلة سهلة وفعالة نسبيا لدراسة العمليات الخلوية والجزيئية لSLE. تفعيل مزمن في نقل adoptively خلايا CD4 T الموجهة ضد مستضدات الذات يؤدي إلى تراكم مرفأ تونس المالي، وخلايا GC B، وخلايا البلازما التي يمكن قياسها عن طريق التدفق الخلوي، كما هو موضح هنا. الدراسات المستقبلية باستخدام هذا النموذج بسرعة وبسهولة يمكن استجواب دور الجينات المرشحة وعلاجات جديدة في عمليات مركز جرثومي المناعة الذاتية التي تشبه تلك التي تحدث في المرضى الذين يعانون من مرض الذئبة الحمراء، ويحكم ف...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

تم دعم هذا العمل جزئيا من قبل معهد أبحاث الذئبة ، ومنح NCI CA138617 ، ومنحة NIDDK DK090978 ، وجائزة شارلوت شميدلاب (إلى EMJ) ، وزمالة ألبرت جيه رايان (إلى JK). نحن ممتنون للدعم والأجهزة التي يقدمها مركز قياس التدفق الخلوي للبحوث في قسم أمراض الروماتيزم في المركز الطبي لمستشفى سينسيناتي للأطفال ، بدعم جزئي من المعاهد الوطنية للصحة AR-47363 و NIH DK78392 و NIH DK90971.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
ب 6. SJL-Ptprca Pepcb / BoyJمختبر جاكسون001162CD45.1 + سلالة الفأر BoyJ
B6 (C) -H2-Ab1bm12 / KhEgJمختبر جاكسون001162سلالة الفأر Bm12
FastDigest PsuILife TechnologiesFD1554إنزيم هضم التقييد للتنميط الجيني
1X RBC Lysis BuffereBioscience00-4333-57
IMDMGE HealthcareSH30228.01
أنبوب فصل البلازما (PST)BD365974أنبوب جمع الدم مع أنبوب فصل مصل ثنائي البوتاسيوم EDTA
(SST) BD365967أنبوب جمع الدم مع منشط الجلطة / SST Gel
FicollGE Healthcare17-1440-02 حل فصل الخلايا عالي الكثافة
Lympholyte-MCedarlaneCL5030حل فصل الخلايا عالي الكثافة
GL-7-biotineBioscience13-5902-82  
ستربتافيدين-BUV395ديناربحريني 564176
CD138-BV421BioLegend142508
CD4-BV510BioLegend100559
TCR>-BV605دينار بحريني562840
CD45.1-BV711BioLegend110739
CD45.2-FITCBioLegend109806
PD-1-PEBioLegend135206
CD19-PerCPBioLegend115532
Fas-PE-Cy7BD557653
CXCR5-APCBioLegend145506
صبغة قابلية قابلة للإصلاح ef780eBioscience65-0865-18
CD4-BV421BioLegend100443
1.2 مل إدراج أنبوب FACS ، أرففالولايات المتحدة الأمريكية العلمية1412-1400
دينار بحريني فالكون والتجارة ؛ أنابيب مستديرة القاعBD352017

المراجع

  1. Helmick, C. G., Felson, D. T., et al. Part I. Arthritis Rheum. Estimates of the prevalence of arthritis and other rheumatic conditions in the United States. 58, 15-25 (2008).
  2. Lupus Foundation of America Web Site. , Available from: http://www.lupus.org/answers/entry/what-is-lupus (2015).
  3. Somers, E. C., Marder, W., et al. Population-based incidence and prevalence of systemic lupus erythematosus: The Michigan lupus epidemiology and surveillance program. Arthritis and Rheumatol. 66, 369-378 (2014).
  4. Perry, D., Sang, A., Yin, Y., Zheng, Y. -Y., Morel, L. Murine models of systemic lupus erythematosus. J Biomed Biotechnol. 2011, 271694(2011).
  5. Lindholm, L., Rydberg, L., Strannegård, O. Development of host plasma cells during graft-versus-host reactions in mice. Eur J Immunol. 3 (8), 511-515 (1973).
  6. Fialkow, P. J., Gilchrist, C., Allison, A. C. Autoimmunity in chronic graft-versus-host disease. Clin Exp Immunol. 13, 479-486 (1973).
  7. Streilein, J. W., Stone, M. J., Duncan, W. R. Studies on the Specificity of Autoantibodies Produced in Systemic Graft-vs-Host Disease. J Immunol. 114 (1), 255-260 (1975).
  8. Gleichmann, E., Gleichmann, H. Diseases caused by reactions of T lymphocytes to in compatible structures of the major histocompatibility complex. I. Autoimmune hemolytic anemia. Eur J Immunol. 6 (12), 899(1976).
  9. Morris, S., Cohen, P. L., Eisenberg, R. Experimental induction of systemic lupus erythematosus by recognition of foreign Ia. Clin Immunol Immunopathol. 57 (2), 263-273 (1990).
  10. Chen, F., Maldonado, M., Madaio, M., Eisenberg, R. The Role of Host (Endogenous) T Cells in Chronic Graft-Versus-Host Autoimmune Disease. J Immunol. 161 (11), 5880-5885 (1998).
  11. Klarquist, J., Hennies, C. M., Lehn, M. A., Reboulet, R. A., Feau, S., Janssen, E. M. STING-Mediated DNA Sensing Promotes Antitumor and Autoimmune Responses to Dying Cells. J Immunol. 193, 6124-6134 (2014).
  12. Petri, M., Orbai, A. -M., et al. Derivation and validation of systemic lupus international collaborating clinics classification criteria for systemic lupus erythematosus. Arthritis Rheum. 64 (8), 2677-2686 (2012).
  13. Zangala, T. Isolation of genomic DNA from mouse tails. J Vis Exp. (6), e246(2007).
  14. Lorenz, T. C. Polymerase Chain Reaction: Basic Protocol Plus Troubleshooting and Optimization Strategies. J Vis Exp. (63), e3998(2012).
  15. Product information: Thermo Scientific FastDigest PsuI. , Thermo Scientific. Available from: https://tools.lifetechnologies.com/content/sfs/manuals/MAN0012567_FastDigest_PsuI_UG.pdf (2012).
  16. Matheu, M. P., Parker, I., Cahalan, M. D. Dissection and 2-photon imaging of peripheral lymph nodes in mice. J Vis Exp. (7), e265(2007).
  17. Harrell, M. I., Iritani, B. M., Ruddell, A. Lymph node mapping in the mouse. J Immunol Methods. 332 (1-2), 170-174 (2008).
  18. Covelli, V. Chapter 3, Internal examination. Guide to the necroscopy of the mouse. , Available from: http://eulep.pdn.cam.ac.uk/Necropsy_of_the_Mouse/index.php?file=Chapter_3.html (2009).
  19. Quah, B. J. C., Parish, C. R. The use of carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) to monitor lymphocyte proliferation. J Vis Exp. (44), e2259(2010).
  20. Matheu, M. P., Cahalan, M. D. Isolation of CD4+ T cells from mouse lymph nodes using Miltenyi MACS purification. J Vis Exp. (9), e53319(2007).
  21. Machholz, E., Mulder, G., Ruiz, C., Corning, B. F., Pritchett-Corning, K. R. Manual Restraint and Common Compound Administration Routes in Mice and Rats. J Vis Exp. (67), e2771(2012).
  22. Hoff, J. Methods of Blood Collection in the Mouse. Lab Animal. 29 (10), 47-53 (2000).
  23. Cohen, M., Varki, N. M., Jankowski, M. D., Gagneux, P. Using Unfixed, Frozen Tissues to Study Natural Mucin Distribution. J Vis Exp. (67), e3928(2012).
  24. Cohen, P. L., Maldonado, M. A. Animal models for SLE. Curr Protoc Immunol.. Chapter 15, Unit 15.20(2003).
  25. Seavey, M. M., Lu, L. D., Stump, K. L. Animal models of systemic lupus erythematosus (SLE) and ex vivo assay design for drug discovery. Curr Protoc Pharmacol. Chapter 5, Unit 5(2011).
  26. McKenna, K. C., Vicetti Miguel, R. D., Beatty, K. M., Bilonick, R. A. A caveat for T cell transfer studies: generation of cytotoxic anti-Thy1.2 antibodies in Thy1.1 congenic mice given Thy1.2+ tumors or T cells. J Leukoc Biol. 89 (2), 291-300 (2011).
  27. Scott, D. M., Ehrmann, I. E., et al. Identification of a mouse male-specific transplantation antigen H-Y. Nature. 376, 695-698 (1995).
  28. Joly, E., Hudrisier, D. What is trogocytosis and what is its purpose. Nat Immunol. 4 (9), 815(2003).
  29. Brown, D. R., Calpe, S., et al. Cutting edge: an NK cell-independent role for Slamf4 in controlling humoral autoimmunity. J Immunol. 187 (1), 21-25 (2011).
  30. Morris, S. C., Cheek, R. L., Cohen, P. L., Eisenberg, R. A. Allotype-specific immunoregulation of autoantibody production by host B cells in chronic graft-versus host disease. J Immunol. 144 (3), 916-922 (1990).
  31. Choudhury, A., Cohen, P. L., Eisenberg, R. A. B cells require “nurturing” by CD4 T cells during development in order to respond in chronic graft-versus-host model of systemic lupus erythematosus. Clin Immunol. 136 (1), 105-115 (2010).
  32. Slifka, M. K., Antia, R., Whitmire, J. K., Ahmed, R. Humoral immunity due to long-lived plasma cells. Immunity. 8 (3), 363-372 (1998).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

نموذج BM12الخلايا التائية المساعدة الجريبيةخلايا B في المركز الجرثوميالخلايا البلازميةقياس التدفق الخلوينقل الخلايا الطحاليةالأجسام المضادة للنواةتكوين المركز الجرثومي
ومحرض نموذج bm12 من الذئبة الحمامية الجهازية (SLE) في C57BL / 6 الفئران
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.