مضان وتلألؤ بيولوجي التصوير من التحت خلوية كا 2+ في المسنين الحصين الخلايا العصبية

ملخص

قد تساهم <إعادة تشكيل Ca²⁺ داخل الخلايا >jove_content في الشيخوخة في السمية المثيرة وتلف الخلايا العصبية ، وهي عمليات بوساطة الحمل الزائد Ca²⁺. كنا نهدف إلى التحقيق في إعادة تشكيل Ca^{2 +} في الدماغ المتقدم في السن باستخدام التصوير المضان والتلألؤ الحيوي للعزل الخلوي والميتوكوندريا Ca²⁺ في الثقافات طويلة المدى للخلايا العصبية في الحصين للفئران ، وهو نموذج لشيخوخة الخلايا العصبية.

الملخص

وزادت القابلية للموت الخلايا العصبية المرتبطة التنكس العصبي ونقص التروية جدا في الدماغ ولكن الذين تتراوح أعمارهم بين الآليات المسؤولة معروفة بشدة. التحفيز الزائدة، وهي عملية يعتقد أنها تساهم في تلف الخلايا العصبية الناجمة عن كل من الشتائم، وبوساطة تنشيط مستقبلات الغلوتامات يعزز الكالسيوم ²⁺ تدفق والميتوكوندريا الكالسيوم ²⁺ الزائد. تغيير كبير في الكالسيوم داخل الخلايا ²⁺ التوازن أو إعادة عرض من الكالسيوم داخل الخلايا ²⁺ التوازن قد تفضل تلف الخلايا العصبية في الخلايا العصبية القديمة. للتحقيق في كاليفورنيا ²⁺ إعادة عرض في الشيخوخة وقد استخدمنا تصوير الخلايا الحية في الثقافات على المدى الطويل من الخلايا العصبية قرن آمون الفئران التي تشبه في بعض الجوانب الخلايا العصبية في الجسم الحي الذين تتراوح أعمارهم. لهذه الغاية، وخلايا قرن آمون هي، في المقام الأول، فرقت حديثا من الحصين الفئران ولدت جديدة ومطلي على بولي-D-يسين coverslips المغلفة، والزجاج. ثم يتم الاحتفاظ الثقافات في وسائل الإعلام التي تسيطر عليها لعدة أيام أو عدة ثeeks عن التحقيق في الخلايا العصبية صغارا وكبارا، على التوالي. ثانيا، يتم تحميل الخلايا العصبية مثقف مع fura2 ويخضع لقياسات من عصاري خلوي تركيز الكالسيوم ²⁺ باستخدام التصوير الرقمي نسبة مضان. ثالثا، و transfected الخلايا العصبية مثقف مع البلازميدات معربا عن جنبا إلى جنب من aequorin منخفضة تقارب وGFP تستهدف الميتوكوندريا. بعد 24 ساعة، وإعادة تشكيل aequorin داخل الخلايا مع coelenterazine ويتعرضون الخلايا العصبية التصوير تلألؤ بيولوجي لرصد الميتوكوندريا تركيز الكالسيوم ^2+. يسمح هذا الإجراء ثلاث خطوات رصد عصاري خلوي وردود كا ²⁺ الميتوكوندريا لمحفزات ذات الصلة وعلى سبيل المثال ناهض مستقبلات الغلوتامات NMDA وقارن بين ما إذا كانت تتأثر هذه وغيرها من ردود الشيخوخة. هذا الإجراء قد تسفر عن رؤى جديدة عن كيفية تأثير الشيخوخة عصاري خلوي والميتوكوندريا الردود الكالسيوم ²⁺ للمؤثرات مختارة، فضلا عن اختبار عقاقير مختارة تهدف إلى منع الخلايا العصبيةالموت في الأمراض المرتبطة بالعمر.

المقدمة

التحفيز الزائدة هي واحدة من أهم الآليات التي تسهم في تلف الخلايا العصبية وموت الخلايا العصبية في الشتائم مثل نقص التروية، وبعض الأمراض العصبية مثل مرض الزهايمر ^1. وتتوسط هذا النوع من العصبية أساسا من الغلوتامات التمثيل حول Ca ²⁺ -permeable، مستقبلات ionotropic NMDA (NMDAR) ^2. تعرض الخلايا العصبية مثقف لالغلوتامات يمكن أن يؤدي إلى التحفيز الزائدة ^3، والذي يسبب موت الخلايا المبرمج العصبية ^4. نحن وغيرنا قد ذكرت في وقت سابق ان ضعف الخلايا العصبية التي يسببها NMDA موت الخلايا المبرمج قد تتغير مع تطور في المختبر والشيخوخة ^5-8.

ومن المسلم به على نطاق واسع أن زيادة خالية من عصاري خلوي كا ²⁺ تركيز ([كا ^2+] _CYT) يؤدي إلى تنشيط الخلايا. ومع ذلك، إذا كان هذا الارتفاع مرتفع جدا و / أو المحافظة بما فيه الكفاية، يمكن أن تؤدي إلى موت الخلايا ^9. وعلاوة على ذلك، فقد تم اقتراحأن التحفيز الزائدة يتطلب الكالسيوم الميتوكوندريا ²⁺ امتصاص ^10، منذ علاج الخلايا العصبية مع الخلايا العصبية uncoupler الميتوكوندريا محمي ضد الغلوتامات التي يسببها خلية الموت ^11. إذا الميتوكوندريا يستغرق الكثير من الكالسيوم ^2+، قد تحدث افتتاح الميتوكوندريا نفاذية المسام الانتقالية، مما أدى إلى الإفراج عن السيتوكروم ج وغيرها من العوامل المؤيدة لأفكارك، ويحفز الخلايا. لقد أظهرنا مؤخرا أن هذه الميتوكوندريا الكالسيوم ²⁺ امتصاص يرتبط مباشرة إلى قابلية تعتمد على عمر إلى التحفيز الزائدة، عن طريق قياس مباشرة NMDA التي يسببها الميتوكوندريا الكالسيوم ²⁺ امتصاص الخلايا العصبية في قرن آمون واحدة ^5، الطريقة التي يتم عرضها في هذا المقال. الحصين، والمشاركة في العمليات الفسيولوجية مثل التعلم والذاكرة والعمليات المعرفية الأخرى ^12، هو عرضة للشيخوخة والاضطرابات العصبية ^13. وقد اقترح أنه بعد عدة أسابيع في المختبر، مثقفتظهر الخلايا العصبية الحصين عددا من الخصائص المميزة للخلايا العصبية الذين تتراوح أعمارهم بين ^14. وبناء على ذلك، يمكن أن توفر الخلايا العصبية الحصين مثقف على المدى الطويل نموذج شامل للتحقيق الكالسيوم ²⁺ آليات بوساطة من تعزيز التحفيز الزائدة في الشيخوخة.

الهدف العام من الطريقة المعروضة هي، بالتالي، للتحقيق تغييرات جوهرية في الكالسيوم داخل الخلايا ²⁺ التوازن أو الكالسيوم ²⁺ إعادة عرض في المخ من الشيخوخة بما في ذلك الردود والفرق الكالسيوم ²⁺ التي تسببها NMDA منبهات مستقبلات في المدى الطويل الخلايا العصبية الحصين مثقف . يتضمن الأسلوب وصفا تفصيليا للثقافة الجرذ الخلايا العصبية قرن آمون ورصد الكالسيوم ²⁺ تركيزات عصاري خلوي والميتوكوندريا التي كتبها مضان والتصوير تلألؤ بيولوجي في الخلايا العصبية الفردية، على التوالي. التصوير مضان من الكالسيوم عصاري خلوي ²⁺ في الخلايا العصبية مثقف هو الإجراء العادي. ومع ذلك، هذا الأسلوب هو أقل موثوقية لالفرعيةخلوي كا ²⁺ القياسات بما في ذلك الميتوكوندريا الكالسيوم ^2+. ومن أسباب ذلك عدم وجود استهداف السليم للتحقيقات الاصطناعية وتقارب غير مناسب ل Ca ²⁺ تركيزات التي قد تتغير في الميتوكوندريا من مستوى منخفض ميكرومتر حتى إلى مستوى ملي. استخدام الكالسيوم ²⁺ تحقيقات على أساس البروتينات كما على سبيل المثال aequorin، وقد سمح لاستهداف لعضيات التحت خلوية واستخدام مشتقات مختلفة كا ²⁺ الانتماءات باستخدام coelenterazines مختلفة أو تحقيقات تحور تفتقر إلى الكالسيوم محدد ²⁺ مواقع الربط ^15. في هذه الطريقة، التصوير تلألؤ بيولوجي من الخلايا معربا عن استهداف الميتوكوندريا aequorin قد تسمح رصد الميتوكوندريا الكالسيوم ²⁺ التركيزات في الخلايا العصبية الفردية. ومع ذلك قد يتطلب هذا الإجراء استخدام كاميرات العد الفوتون أو كاميرات CCD فائقة الحساسية للتلألؤ بيولوجي التصوير ^16-18. هذه الطريقة قد تسفر عن نتائج الرواية التي ينبغي تأكيد بمزيد من إسطبلished نماذج شيخوخة الدماغ كما، على سبيل المثال، شرائح الدماغ من الحيوانات القديمة.

البروتوكول

بيان الأخلاق: إجراءات التي تجرى على الحيوانات قد تم التعامل معها في إطار البروتوكولات التي وافق عليها مرفق إيواء الحيوانات جامعة بلد الوليد في اتفاق مع / مجلس الاتفاقية الأوروبية 123 من أوروبا والتوجيه 86/609 / EEC.

1. الثقافة قصيرة وطويلة الأجل من الفئران الحصين الخلايا العصبية

1. إعداد بولي-D-يسين المغلفة، 12 مم coverslips الزجاج.
   1. تعقيم 12 مم coverslips الزجاج قطر في الإيثانول لمدة لا تقل عن 24 ساعة. تسمح لهم لتجف تحت ظروف معقمة.
   2. توزيع لل coverslips على شريط من parafilm في طبق بتري. تغطية سطح كل ساترة مع 200 ميكرولتر من 1 ملغ / مل بولي-D-يسين. تسمح علاج O / N.
   3. في اليوم التالي يغسل لل coverslips مع الماء المعقم مزدوجة المقطر كل 15 دقيقة لمدة 90 دقيقة تحت ظروف معقمة.
   4. ملء طبق multidish أربعة جيدا مع 500 ميكرولتر من Neurobasal الثقافة المتوسطة لكل بئر. Neurobasal الثقافة المتوسطة يجب أن تستكمل مع10٪ مصل بقري جنيني، 2٪ B27، 1 ميكروغرام / جنتاميسين مل و 2 مم L-الجلوتامين.
   5. ضع لل coverslips في لوحة multidish. المحافظة عليها في ترطيب 37 درجة مئوية و 5٪ CO ₂ الحاضنة حتى الاستخدام.
2. عزل الخلايا العصبية قرن آمون من الفئران حديثي الولادة.
   1. إعداد 1.8 مل من محلول غراء (شراؤها مباشرة) في قارورة (20 ميكرولتر / مل) تحت ظروف معقمة: للحصول على التركيز النهائي من 20 ميكرولتر / مل إضافة نحو 40 ميكرولتر غراء في 1.8 مل من هانك بالإضافة إلى 0.6٪ BSA (يجب أن تحسب ميكرولتر تبعا للظروف المورد). يتم إعداد 0.6٪ BSA هانك عن طريق خلط 85 مل من HBSS المتوسطة مع 15 مل من الألبومين 4٪ المصل البقري (BSA، أعد حل 4 غرام من BSA في 100 مل HBSS). إعداده في غطاء العقيمة.
   2. احتضان غراء في لهانك بالإضافة إلى 0.6٪ BSA لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية قبل الاستخدام. تصفية الحل باستخدام فلتر 0.22 ميكرون قبل استخدامها.
   3. إعداد هام في F-12 المتوسطة عن طريق إضافة لDulbeccoتعديل متوسطة مسحوق النسر (13.5 غرام لكل لتر) في 900 مل من الماء المعقم مزدوجة المقطر. ثم إضافة 6 ز HEPES و 336 ملغ NaHCO ₃ وضبط درجة الحموضة إلى 7،42 باستخدام هيدروكسيد الصوديوم 4 N. أضف الماء المعقم للحصول على حل وتصفية 1 L ذلك باستخدام 0.20 ميكرون polyethersulfone (PES) زجاجة كبار التصفية. تحمل هذه العملية في غطاء العقيمة. أخيرا تشبع حل مع CO ₂ تحت ظروف معقمة قبل الاستخدام. مخزن الحلول في 4 درجة مئوية واستخدامها مبردة.
   4. الموت ببطء حديثي الولادة (P0) الفئران الوليدة عن طريق قطع الرأس وغسل الرأس في العقيمة المتوسطة HBS. فتح الجمجمة مع مساعدة من مقص العقيمة. استخراج الدماغ مع ملعقة، وأغسلها بسرعة في هام في F-12 متوسطة.
   5. اجراء خفض قطري مع المعونة من مشرط في كل نصف الكرة الأرضية (الشكل 1B)، وحملها إلى طبق بتري تحتوي على لحم الخنزير F-12 متوسطة.
   6. السحايا تجاهل بعناية بمساعدة ملقط تشريح وتحت عدسة مكبرة.
   <لى> تحديد الحصين في موقع مقعر مميزة على القشرة باستخدام عدسة مكبرة. ثم، فصل الحصين من القشرة عن طريق سحب بعناية من الحدود واحدة وإزالته من موقعه باستخدام مقص العين.
   7. نقل الأنسجة الحصين إلى لوحة 4 بشكل جيد مليئة المتوسطة معقم هانك تفتقر إلى الكالسيوم والمغنيسيوم ^{2+ 2+} بالإضافة إلى 0.6٪ BSA وغسل الأنسجة قرن آمون. دون إزالة قطع وسائل الإعلام الأنسجة في قطع صغيرة (حوالي 2 × 2 مم) باستخدام مقص العين نفسها.
   8. نقل قطع الحصين إلى قارورة تحتوي على 1.8 مل من محلول غراء قبل تصفيتها. ثم احتضان لهم عند 37 درجة مئوية مع بعض الأحيان، الهز لطيف. بعد 15 دقيقة، إضافة 90 ميكرولتر من الدناز I الحل (50 ميكروغرام / مل النهائي)، واحتضان لمدة 15 دقيقة إضافية.
   9. نقل الأنسجة لأنبوب الطرد المركزي 10 مل وغسل شظايا مع الطازجة Neurobasal الثقافة المتوسطة. الحصول على تعليق خلية عن طريق تمرير شظايا الأنسجة من خلال البلاستيك 5 مل نقطةETTE.
   10. تعليق خلية الطرد المركزي في 160 x ج لمدة 5 دقائق. إزالة طاف باستخدام ماصة بلاستيكية معقمة باستور وتعليق بيليه بعناية مع 1 مل الآلي ماصة في 1 مل من Neurobasal الثقافة المتوسطة.
   11. قياس كثافة الخلايا باستخدام غرفة عد نويباور. وضع ساترة الزجاج على الحجرة نويباور. إضافة 10 ميكرولتر من التعليق الخلية. تأكد من تعليق خلية يدخل الغرفة بشكل موحد واتخاذ أي فقاعات. حساب عدد الخلايا تحت المجهر وتنفيذ العمليات الحسابية المقابلة للحصول على قطرة مناسبة من 40-80 ميكرولتر تحتوي على 30 × 10 ^{3 خلايا.} فإن العدد الكلي للخلايا تعتمد على عدد الحيوانات المستخدمة.
3. قصيرة الأجل وطويلة الأجل الثقافة من الخلايا العصبية قرن آمون الفئران.
   1. أكثر من لوحة multidish أربعة جيدا تحتوي على 500 ميكرولتر من Neurobasal الثقافة المتوسطة التي أعدت قبل وأبقى في الحاضنة، لوحة حوالي 30 × 10 ^{3 خلايا} في قطرة من حوالي 50 ميكرولتر على كلبئر من لوحة multidish تحتوي على واحد بولي المغلفة D-ليسين، 12 مم الزجاج قطر ساترة.
   2. الحفاظ على خلايا قرن آمون الأولية في ترطيب 37 درجة مئوية و 5٪ CO ₂ الحاضنة لمدة 2-5 أيام في المختبر (DIV، على المدى القصير، ثقافات الشباب) أو> 15 DIV (على المدى الطويل والثقافات الذين تتراوح أعمارهم بين) قبل التجارب دون تغيير الثقافة وسائل الإعلام.

2. الإسفار التصوير الكالسيوم عصاري خلوي ²⁺ تركيز

1. إعداد اختبار الحلول للتصوير مضان.
   1. إعداد مخزنة المالحة HEPES (HBS) حل خارجي يتضمن، في ملي: كلوريد الصوديوم 145، بوكل 5، MgCl ₂ 1، CaCl ₂ 1، 10 الجلوكوز والصوديوم-HEPES 10 (الرقم الهيدروجيني 7.42).
   2. إعداد خارجي، والمغنيسيوم ²⁺ خالية، والمياه المالحة HEPES مخزنة (HBS) محلول يحتوي على، في ملي: كلوريد الصوديوم 146، بوكل 5، CaCl ₂ 1، الجلوكوز 10 و HEPES 10 (الرقم الهيدروجيني 7.42).
   3. حل المالحة NMDA في المغنيسيوم ²⁺ خالية، HEPES مخزنة (HBS) في الاتحاد الدولي للسباحةتركيز لتر من 100 ميكرومتر وتكمل مع 10 ميكرومتر الجلايسين.
   4. يعد حل HBS تحتوي على بوكل بدلا من كلوريد الصوديوم عن طريق حل (مم): 145 بوكل، MgCl ₂ 1، CaCl ₂ 1، الجلوكوز 10 و HEPES 10 (الرقم الهيدروجيني 7.42).
2. تحميل خلايا قرن آمون مع الفلورسنت التحقيق الكالسيوم fura2 / AM.
   1. خذ ثقافة الخلية التي تحتوي على coverslips من الحاضنة وغسلها مع HBS المتوسطة في RT بنقلهم إلى أربع سنوات جيدا لوحة multidish جديدة تحتوي على 500 ميكرولتر من HBS لكل بئر.
   2. احتضان الخلايا مع fura2 / AM 4 ميكرومتر (المعد في نفس HBS المتوسطة) لمدة 60 دقيقة في RT (25 درجة مئوية) في مكان مظلم.
   3. بعد 60 دقيقة، وغسل coverslips مع الطازجة المتوسطة HBS.
3. تسجيل الصور مضان من عصاري خلوي [كا ^2+] في الخلايا المستزرعة.
   1. تشغيل مصباح، المجهر، نظام الارواء، وكاميرا مضان والكمبيوتر.
   2. ضع لل coverslips في منصة thermostated لفتح 12 ملم coverslips الزجاج على مرحلة من مراحل المجهر المقلوب وحدد حقل مجهري باستخدام الهدف 40X (النفط، NA: 1،3). يروي الخلايا بشكل مستمر مع قبل حرارة (37 درجة مئوية) HBS المتوسطة في غياب أو وجود مواد الاختبار. الحفاظ على تدفق بمعدل حوالي 5-10 مل / دقيقة.
      ملاحظة: يتم تركيب نظام نضح الخلايا لخلايا حية في منصة thermostated لفتح 12 ملم coverslips الزجاج. 8-خطوط نظام نضح يحركها الجاذبية مجهزة مع وحدة تحكم صمام يستخدم ليروي الحلول. مضخة فراغ هي المسؤولة عن إزالة أي وسيط الزائد. يتم تسخين الحلول باستخدام نظام التدفئة في أنبوب.
   3. التقاط صورة الخلفية مع مصراع أغلق عند كل من موجات الإثارة.
   4. برنامج التحصين الموسع، تضيء الخلايا بالتناوب في 340 و 380 نانومتر. ضوء سجل تنبعث عند 520 نانومتر كل 5-10 ثانية مع كاميرا مضان، الذي تم تصفيته من قبل مزدوج اللون مرآة FURA-2.
   5. عند الانتهاء من فترة التسجيل، تخزين التسلسل الكامل سصور و تنبعث عند 520 نانومتر في الكمبيوتر لمزيد من التحليل.
4. تحليل الصور فلوري المسجلة.
   1. فتح ملف التجربة. باستخدام برنامج aquacosmos، انقر على 'نسبة' وحدد نطاق النسبة المطلوبة. حساب نسبة بكسل بكسل في الصور الناتجة من أجل الحصول على سلسلة من الصور النسبة.
   2. طرح الخلفية عن طريق ضبط "القضاء الخلفية". اضغط على "حساب بداية".
   3. اضغط على "جميع الأوقات تسلسل 'زر ومحو المناطق القديمة من الفائدة (رويس). للتحليل الكمي من الخلايا الفردية، وإنشاء مناطق جديدة في المصالح أو رويس الموافق الخلايا العصبية الفردية. متوسط ​​كل القيم النسبة في كل بكسل المقابلة لكل ROI وكل صورة للحصول على تسجيل القيم مضان نسبة لرويس الفردية (خلايا).
   4. إلى الرسم البياني التسجيلات الفردية تصدير القيم نسبة مضان المقابلة لكل ROI إلى progr الرسوم البيانيةصباحا.
   5. جعل الحسابات المقابلة لتقدير حجم الزيادات في fluorescences نسبة استجابة لكل التحفيز باستخدام تحليل البيانات مناسبة والرسوم البيانية البرمجيات.

3. ضوء بارد التصوير من الميتوكوندريا الكالسيوم ²⁺ تركيز

1. ترنسفكأيشن من الخلايا العصبية الحصين مثقف مع البلازميد mitGAmut.
   و transfected خلايا أولا مع البلازميد mitGAmut تحتوي على تسلسل استهداف الميتوكوندريا وaequorin تحور تفتقر إلى موقع ملزم الكالسيوم ²⁺ تنصهر للبروتين الفلورية الخضراء (GFP): ملاحظة. هذا البناء بالكشف عن ارتفاع كبير في الميتوكوندريا الكالسيوم ²⁺ امتصاص ويسمح بتحديد الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل من قبل مضان GFP. وقد وضعت البلازميد وقدمت تفضلت P. Brûlet وزملاء العمل ¹⁸ (CNRS، باريس).
   1. إعداد Neurobasal TF، التي تحتوي على Neurobasal الثقافة المتوسطة، التي تفتقر إلى مصل بقري جنيني، B27، gentamicفي و2 مم L-الجلوتامين.
   2. إعداد 50 ميكرولتر من Neurobasal TF زائد 2.5 ميكرولتر كاشف ترنسفكأيشن في قارورة (الحل A). إعداد 50 ميكرولتر من Neurobasal TF بالإضافة إلى 4 ميكروغرام mitGAmut البلازميد في قارورة (الحل B). إضافة بلطف حل B على حل A. السماح خلط خلال 20 دقيقة، دون أن تهتز.
   3. نقل لل coverslips تحتوي على الخلايا العصبية الحصين لوحات multidish جديدة تحتوي على 200 ميكرولتر من TF Neurobasal الطازجة.
   4. إضافة قطرة قطرة 100 ميكرولتر من محلول A + B على كل ساترة. احتضان لمدة 30 دقيقة. إزالة المتوسطة. يغسل مرة واحدة الخلايا مع TF Neurobasal الطازجة. العودة لل coverslips إلى الأصلي Neurobasal الثقافة المتوسطة.
   5. الخلايا العصبية الثقافة ل24 ساعة إضافية عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO ₂ بعد ترنسفكأيشن للسماح التعبير كفاءة واستهداف لجنة التحقيق.
2. إعداد اختبار الحلول للتصوير تلألؤ بيولوجي.
   1. إعداد الحلول HBS تحتوي على NMDA 100 ميكرومتر أو 145 ملي بوكل كماأعلاه (الخطوة 2.1). إعداد HBS محلول يحتوي على 10 ملي كا ²⁺ بالإضافة إلى ديجيتونين 100 ميكرومتر.
3. إعادة تشكيل استهداف الميتوكوندريا aequorin مع coelenterazine ن.
   1. coverslips نقل تحتوي على الخلايا العصبية الحصين transfected إلى لوحة أربع جيدا تحتوي على 200 ميكرولتر من HBS.
   2. إضافة 4 ميكرولتر من coelenterazine ن (200 ميكرومتر) إلى 200 ميكرولتر من HBS لتركيز النهائي من 4 ميكرومتر وتخلط بلطف. احتضان لمدة 2 ساعة على RT (25 درجة مئوية)، وفي الظلام.
4. تسجيل الصور تلألؤ بيولوجي من الميتوكوندريا [كا ^2+].
   1. بدوره على المجهر، ومصباح، ونظام نضح، وكاميرا تلألؤ بيولوجي والكمبيوتر.
   2. نقل coverslips أعيد إلى thermostated (37 درجة مئوية) غرفة نضح ويروي باستمرار مع درجة حرارة ما قبل حل HBS بمعدل 5-10 مل / دقيقة.
   3. باستخدام الهدف 40X (النفط، NA: 1،3)، حدد الحقل المجهري تحتوي على خلايا معربا عن لpoaequorins كما يتضح من الانبعاثات مضان المرتبطة التعبير عن بروتين الفلورية الخضراء (GFP) باستخدام مرشحات FITC. قد يحتوي حقل نموذجي 1-2 الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل. التقاط صورة GFP مضان، وذلك باستخدام كاميرا CCD.
   4. إيقاف ضوء المجهر. إزالة مربع تحتوي على مزدوج اللون تقع في مسار الضوء. إيقاف ضوء الإثارة وإغلاق مربع مظلم لظلام دامس.
   5. يروي الخلايا في 5-10 مل / دقيقة مع HBS المتوسطة مع أو بدون حلول اختبار قبل تحسنت عند 37 درجة مئوية.
   6. التقاط صور الانبعاثات الضوئية كل 10 ثانية مع كاميرا الفوتون العد التعامل مع معالج الصور.
   7. في نهاية كل تجربة، permeabilize الخلايا مع 0.1 ملي ديجيتونين في 10 ملي CaCl ₂ في HBS من أجل الإفراج عن جميع الانبعاثات الضوئية المتبقية.
      ملاحظة: يجب أن تضاف هذه الانبعاثات الضوئية تصل من أجل تقدير مجموع الانبعاثات الضوئية، وهي القيمة المطلوبة للمعايرة في كا ²⁺ تركيزات <./ لى>
   8. تخزين الصور تلألؤ بيولوجي في الكمبيوتر مع GFP المرتبطة صورة مضان اعتقلت قبل التصوير الفوتون العد.
5. تحليل الصور تلألؤ بيولوجي يعكس الميتوكوندريا [كا ^2+].
   1. قياس الانبعاثات الضوئية باستخدام برامج معينة. ويمكن تحويل الانبعاثات الضوئية إلى الكالسيوم الحرة الميتوكوندريا ²⁺ تركيز ([كا ^2+] _{معهد ماساتشوستس للتكنولوجيا)} باستخدام الخوارزمية التي وصفها بريني وآخرون. ^15.
   2. فتح التجربة والصورة GFP مضان. اختر المناطق ذات الاهتمام (رويس) مع مساعدة من برنامج معين عن طريق رسم شكل الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل وفقا لصور مضان القبض في بداية التجربة.
   3. لصق نفس رويس في كل صورة. يتم احتساب مجموع الانبعاثات الضوئية في كل ROI مع برامج معينة للحصول على قيمة الانبعاثات التلألؤ (L) لكل خلية في كل نقطة في الوقت المناسب.
   4. تضيف ما يصل جميع emiss الضوئيةالأيونات في الصور تلألؤ بيولوجي، بما في ذلك تلك التي تم الحصول عليها بعد ديجيتونين permeabilization، وذلك باستخدام برامج معينة، للحصول على صورة تلألؤ بيولوجي يحتوي على جميع الانبعاثات الضوئية.
   5. قيمة الصادرات من الانبعاثات الضوئية عن كل منطقة من الفائدة لبرامج معينة لإجراء العمليات الحسابية. للقيام بذلك، انقر على 'الرسم البياني' من أجل حساب القيم تلألؤ بيولوجي لكل ROI في كل مرة. حدد "القيمة الإجمالية" و "استخدام ROI الحالي لجميع الصور. اضغط على "حساب". حفظ "txt.file 'وتصدير البيانات إلى ورقة عمل. لكل ROI، [كا ^2+] يحسب _{معهد ماساتشوستس للتكنولوجيا} باستخدام الخوارزمية التالية:
      
      [كا ^2+] (M) = [R + (R · K _TR) - 1] / [K _R - (R · K _R)].
      
      الى اين،
      R = [L / (L _مجموعه λ)] ^{1 / ن}
      L هو التلألؤ المنبعثة في وقت القياس في كل منطقة من الفائدة.
      L _{المجموع هو}التلألؤ الكلي المتبقي بعد إضافة التهم موجودة في الأنسجة في ذلك الوقت في وقت القياس لكل منطقة من الفائدة. λ، K _TR، K _R و N ثوابت القيم التي تعتمد على مزيج من aequorin (النوع البري أو تحور) وcoelenterazin المستخدمة (النوع البري أو نوع ن) وكذلك تسجيل درجة حرارة ^16. لمزيج المستخدمة هنا (تحور AEQ وcoelenterzine ن)، في 37 درجة مئوية، استخدمنا القيم التالية: K _{R =} 8.47 × 10 ^7، K _TR = 165،6 × 10 ^3، ن = 1204 وλ = 0138.
6. جعل الحسابات المقابلة لتقدير حجم الزيادات في تلألؤ بيولوجي ردا على كل التحفيز باستخدام تحليل البيانات مناسبة والرسوم البيانية البرمجيات.

النتائج

نحن هنا وصف طريقة بسيطة لتقييم الكالسيوم ²⁺ إعادة عرض وآثار NMDA على عصاري خلوي والميتوكوندريا [كا ^2+] في الخلايا العصبية المسنين. ويبين الشكل 1 التخطيطي من إجراءات عزل وزراعة الخلايا العصبية قرن آمون من الفئران حديثي الولادة. قبل البدء، نحتاج إلى إعداد العقيمة، وبولي-D-يسين المغلفة، coverslips الزجاج والعثور عليهم في طبق 4-جيدا. ثم، الفئران حديثي الولادة يتعرضون للقتل والدماغ إزالتها. بعد عزل الحصين، وفرقت الأنسجة بعناية باس...

المناقشة

ارتبط في إعادة بناء الكالسيوم داخل الخلايا ²⁺ التوازن في المخ من الشيخوخة إلى فقدان المعرفية، وزيادة التعرض للنقص تروية الضرر، التحفيز الزائدة والتنكس العصبي. لتحقيق هذه الفرضية في المختبر، تتوفر إجراءات التصوير الكالسيوم ^2+. للأسف، ثقافات قابلة للحياة الخلايا العصبية الحصين القديمة لا يمكن التعويل عليها. في الآونة الأخيرة، فقد لوحظ أن الثقافات على المدى الطويل من الخلايا العصبية قرن آمون الفئران العديد الحالي من السمات المميزة نموذجية الشيخوخة

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
ثقافة عصبية متوسطة	جيبكو	21103-049
HBSS متوسط	جيبكو	14170-088
هام F-12 متوسط	جيبكو	31330-038
DNase I (من البنكرياس البقري)	سيجما	D5025-15KU
مصل بوبين الجنين	لونزا	DE14-801E
B27	جيبكو	17504-044
Gentamicin	Gibco	15750
L-glutamine	Gibco	25030-032
12 مم غطاء زجاجي	Labolan	0111520/20012
Papain	Worthington	LS003127
آبار لوحات متعددة	Nunc	176740
أطباق بيتري	JD Catalan s.l.	2120044T
ماصات معقمة	فيشر Scientific	431030
Fura2-AM	Life Technologies	F1201
Lipofectamine2000	Invitrogen	11668-027
Coelenterazine n	Biotium	BT-10115-2250 uG
Digitonin	Sigma	D5628
NMDA	Sigma	M3262
Glycine	Sigma	50046
Zeiss Axiovert S100 مجهر التلفزيون	Carl Zeiss Inc.
نظام إضاءة Xcite	EXFO
ORCA ER	كاميرا مضان Hamamatsu
VIM فوتون عد CCD	Hamamatsu
VC-8 وحدة تحكم الصمام	Warner Instruments
SH-27B نظام التدفئة	وارنر إنسترومنتز
أكواكوزموس سوفتونيكس			هاماماتسو