موجهة بالليزر العصبية للبحث عن المفقودين في إإكسبلنتس الدماغ

Summary

وصفنا تقنية لتسمية الخلايا العصبية والعمليات الخاصة بها عن طريق تقدمي أو رجعي التتبع الحقن في نوى الدماغ باستخدام إعداد في المختبر. نحن تعديل طريقة القائمة ط ن معمليا التتبع Electroporation للمن خلال الاستفادة من fluorescently المسمى المسوخ الماوس وأجهزة بصرية الأساسية من أجل زيادة دقة وضع العلامات.

Abstract

نقدم الأسلوب الذي يجمع في المختبر التتبع بروتوكول الحقن، والذي يستخدم سلسلة من النبضات الكهربائية والضغط لزيادة امتصاص الصبغة من خلال Electroporation للفي إإكسبلنتس الدماغ مع استهداف إضاءة الليزر ومطابقة نظارات مرشح أثناء العملية. تقنية الموضحة في المختبر Electroporation للفي حد ذاته ينتج المراقبة البصرية جيدة نسبيا لاستهداف مناطق معينة من الدماغ. من خلال الجمع بين ذلك مع الإثارة ليزر علامات وراثية الفلورسنت وعلى القراءة من خلال نظارات مرشح تمرير الفرقة، والتي يمكن التقاط انبعاثات المسمى وراثيا الخلايا / نوى وصبغة الفلورسنت البحث عن المفقودين، يمكن للباحث زيادة كبيرة في دقة الحقن من خلال إيجاد مساحة من الاهتمام والسيطرة على الصبغة الانتشار / الامتصاص في منطقة الحقن بشكل أكثر كفاءة. وبالإضافة إلى ذلك، فإن تقنية الإضاءة الليزر يسمح لدراسة وظيفة neurocircuit التي قدمها الأقليمiding المعلومات حول نوع من الخلايا العصبية إسقاط لمنطقة معينة في الحالات التي يتم فيها ربط التعبير GFP لنوع الارسال التي أعربت عنها جزء من السكان من الخلايا العصبية.

Introduction

من أجل تحديد بعض الخلايا العصبية (الصغرى) الدائرة، يجب على المرء أن يبدأ من خلال إيجاد المشاركين من مختلف الدوائر وقال، ونمط علاقتهم. من أي وقت مضى منذ تم تأسيس نشر الر حول neurofiber البحث عن المفقودين من خلال lesioning ¹ مجموعة كبيرة ومتنوعة من تقنيات تتبع تشريحي عصبي. بعض هذه التقنيات يمكن تطبيقها في الأنسجة ثابتة بعد الوفاة ^2-4، والبعض الآخر يعتمد على النقل النشط من الصبغة في الخلايا العصبية الحية، كما اكتشف في عام 1971 ^5-6. هذا الأخير يمكن أيضا تقسيم في مجموعتين التمييز بين أساليب الاستفادة من الوراء النشط (من منطقة حقن لمصدر إسقاط معينة، أي. وsomata من الخلايا العصبية الت....

Protocol

1. التنميط الجيني البصري

1. بصري انماط من الفأر الجراء

1. تحقق من التعبير عن علامة فلوري منها باستخدام مؤشر الليزر الطول الموجي الإثارة المناسب (405 نانومتر في التجارب وصفها هنا) ونظارات واقية فلتر حجب الطول الموجي الإثارة المقابلة ولكن يمر الطول الموجي الانبعاثات (450-700 نانومتر في التجارب وصفها هنا) . يشير مؤشر ليزر في الجزء الخلفي من الرأس أو النخاع الشوكي من الجرو الماوس (انظر الشكل 1). تجنب تسليط الليزر في عيون والتعرض طويل من الجلد لضوء....

Results

أرقام 1 و 2 إظهار كيف يمكن استخدام مؤشر ليزر ونظارات ليزر بسرعة وبتكلفة زهيدة إلى التركيب الوراثي الحيوانات إيجابية GFP من القمامة. في حالات الجراء الماوس الشباب، ويمكن استخدام هذه التقنية لتحديد noninvasively التسمية GFP في أدمغة الحيوانات من خلال الجمجمة والجلد المغطي (الشكل 1A - D). ويمكن رؤية مضان المنبعثة من خلال الجلد والجمجمة من الجراء الماوس على الأقل حتى يوم ما بعد الولادة 3 (الشكل 1C). يظهر الإجراء في الشكل رقم 1.......

Discussion

A القوة العامة في المختبر التتبع Electroporation لل، خلافا لفي الدراسات المجراة البحث عن المفقودين، هو أنه يعطي الباحثين أفضل للوصول إلى منطقة الدماغ من الفائدة، وبالتالي، لا تنطوي على المجسم مكلفة (وغالبا الكهربية) المعدات. وبالإضافة إلى ذلك، فإن فترة بقاء اللازمة لإإكسبلنتس الدماغ يمتد سوى بضع ساعات (1-4) بدلا من أيام أو حتى أسابيع في حالة في الجسم الحي حقن التتبع (انظر استعراض مفصل عن استخدام الأمينات ديكستران واستشفاف أخرى في في حقن الجس.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
كلوريد الصوديوم	Sigma-Aldrich	S7653	جميع المواد الكيميائية من Sigma-Aldrich ، ما لم يذكر خلاف ذلك.
كلوريد البوتاسيوم		P9333
فوسفات البوتاسيوم أحادي القاعدة		P5655
فوسفات الصوديوم ثنائي القاعدة		S907
كلوريد		M2670
كلوريد		C5080
الجلوكوز		G7528
بيكربونات		S6297
حمض		A4544
Myo-inositol		I5125
بيروفات		P2256
مصل الأبقار الألبومين		A2153	اختياري ، للكيمياء النسيجية الإضافية (المناعية)
Triton-X-100		X100	اختياري ، للكيمياء النسيجية الإضافية (المناعية)
بولي (جلايكول الإيثيلين) ، 8000 ميجاوات		P2139	اختياري ، لتطهير الدماغ
فورماميد	فيشر Scientific	F84	اختياري ، لتطهير الدماغ
الوحدة الفرعية للكولراتوكسين - ب	المجسات الجزيئية	C-34776 (Alexa 555)   ؛
ديكستران رباعي ميثيل الرودامين	المجسات الجزيئية	D-7162 (Alexa 555)
الفلورسنت Nissl	Invitrogen	N-21479 (الأزرق)	اختياري
Paraformaldehyde	Fisher Scientific	SF93
Agarose	Invitrogen	16520
Fluoromount-G	Southern Biotech	0100-01
Pentobarbi-tal	Vortech Pharmaceuticals	Fatal-Plus
خيوط زجاجية من البورسليكات	جهاز هارفارد	G150F-10
مجتذب ماصة	Zeitz Instruments ، ألمانيا	DMZ Universal Puller
Perfusion Setup	مؤشر
؛	laserpointerpro.com ، هونغ كونغ	HK-88007294 (405 نانومتر) مرشح
/ نظارات واقية	من ليزر التنين ، الصين	LSG09 (تمرير النطاق 450-700 نانومتر) المجهر
ذي العين   ؛	وايلد هيربروج ، سويسرا	وايلد M3	مجهزة بإضاءة عالية الكثافة (MI-150; شركة دولان جينر)
Picospritzer	Parker Instruments	Picospritzer III
PC مع برنامج MC Stimulus المثبت	متعدد القنوات Sys-tems ، ألمانيا (برنامج)
محفز 2 قناة	متعدد القنوات Sys-tems ، ألمانيا	STG-1002
وحدة عزل التحفيز	A.M.P.I. ، إسرائيل	Iso-Flex
Micromanipulator	Narishige ، اليابان	YOU-1
Vibratome	Leica ، ألمانيا	VT1000S