مقالة منهجية

خطوة محددة الفرز ماوس Spermatids بواسطة التدفق الخلوي

DOI:

10.3791/53379

⸱

ديسمبر 31, 2015

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biochemistry, Université de Sherbrooke, 2Department of Medicine, Université de Sherbrooke

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نصف استراتيجية فرز المنوية للفئران باستخدام قياس التدفق الخلوي. يتم فرز المنوية إلى أربعة مجموعات عالية النقاء ، بما في ذلك الجولة (خطوات تكوين المنوية 1-9) ، والاستطالة المبكرة (خطوات تكوين المنوية 10-12) ، والاستطالة المتأخرة (خطوات تكوين المنوية 13-14) المنوية الممدودة (خطوات تكوين المنوية 15-16). يتم استخدام تلطيخ الحمض النووي وحجمه وحدبته كمعلمات اختيار.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تمايز spermatids الفأر هو عملية حاسمة واحدة لإنتاج الأمشاج الذكور وظيفية مع الجينوم سليمة إلى أن تنتقل إلى الجيل التالي. حتى الآن، وقد أعاق الدراسات الجزيئية لهذا التحول الصرفي بسبب عدم وجود طريقة السماح للفصل الكافي لهذه الخطوات الهامة للتمايز النطف للتحليلات لاحقة. المحاولات السابقة في النابضة السليم لهذه الخلايا باستخدام التدفق الخلوي قد يكون صعبا بسبب زيادة غريبة في مضان DNA في spermatids تمر ونين التجديد. وبناء على هذه الملاحظة، ونحن نقدم تفاصيل تدفق بسيط الخلوي المخطط، مما يسمح تنقية استنساخه من أربعة سكان spermatids الماوس ثابتة مع الإيثانول، يمثل كل دولة مختلفة في عملية إعادة عرض النووية. وأكد تخصيب السكان الذين يستخدمون علامات خطوة محددة ومعيارا المورفولوجية. وspermatids النقاء يمكن استخدامها لالجينومية وproteomيحلل جيم.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تتمايز المنوية المستديرة أحادية الصيغة الصبغية إلى المنوية من خلال عملية تسمى تكوين المنوية. يتضمن ذلك العديد من الخطوات المختلفة بما في ذلك الحصول على إعادة تشكيل السوط والكروماتين والهيكل الخلوي وتكثيف النواة بالإضافة إلى فقدان معظم السيتوبلازم. يجب تنظيم هذه الأحداث الخلوية الفريدة بدقة من أجل إنتاج مشيج وظيفي ناضج مع جينوم سليم مناسب للإخصاب. بالكاد يمكن دراسة تكوين المنوية في المختبر حيث لم يتمكن أي نظام موثوق به لزراعة الخلايا حتى الآن من دعم التقدم من خلال الخطوات المختلفة للعملية. علاوة على ذلك ، تؤدي التقنيات الفعلية في المختبر إلى عائد ضعيف1,2. في الجسم الحي ، تعتبر التحولات المناسبة من خلال الخطوات المختلفة لتكوين المنوية أمرا بالغ الأهمية للسلامة الوظيفية الطبيعية للأمشاج الذكرية. لم يتم أبدا تحقيق التنقية الناجحة للحيوانات المنوية وفقا لخطوات التمايز الخاصة بها بمستوى من التخصيب الكافي للسماح بالتوصيف الجزيئي لتكوين المنوية. على سبيل المثال ، سيكون تنقية الخطوات الرئيسية لتمايز المنوية مفيدا بشكل خاص لدراسة الجسيم الأكرومي النامي ، وتشكيل القطعة الوسطى3 ، وديناميكيات تقاطع الخلية4 ، وديناميكيات الحمض النوويالريبي 5 ، وعملية إعادة تشكيل الكروماتين6،7 أو الاستقرار الجيني8. تم إعاقة تنقية المنوية بسبب تحولها المورفولوجي التدريجي ، وعدم وجود مؤشرات حيوية خارجية معروفة خاصة بالمرحلة ، وشكلها وحجمها الغريب.

على الرغم من أن معظم الخلايا الجرثومية الذكرية تظهر علاقة مباشرة بين تلطيخ الحمض النووي وصبغة (محتوى الحمض النووي) ، فقد لاحظنا أن هذا الارتباط الإيجابي لم يعد ينطبق على المنوية. ينبع هذا من ملاحظتنا المبكرة أن أقسام الأنابيب المنوية تظهر كثافة متغيرة لتلوين الحمض النووي خلال خطوات تكوين المنوية المختلفة. على الرغم من أن تلطيخ الحمض النووي يتوافق مع مجموعة الكروموسومات أحادية الصيغة الصبغية من خطوات تكوين المنوية من 1 إلى 7 (المنوية المستديرة) ، فقد لاحظنا زيادة حادة في شدة التألق مع DAPI أو SYTO 16 حول بداية إعادة التنظيم النووي وإعادة تشكيل الكروماتين (الخطوة 8 من تكوين المنوية) للوصول إلى ذروته في بداية التكثيف النووي (خطوات تكوين المنوية 11-12). بعد تكثيف النواة ، تقل شدة تلطيخ الحمض النووي حتى تكوين المنوية (الخطوة 16 من تكوين المنوية). لقد خمننا أن هذا كان مرتبطا على الأرجح بتكوين انتقال بنية الكروماتين الغريب حيث يتم استبدال الهستونات بالبروتامينات. لذلك قمنا بتطوير طريقة موثوقة لقياس التدفق الخلوي تسمح بفصل المنوية باستخدام تباين كثافة الحمض النووي للحيوانات المنوية كمعلمة اختيار رئيسية.

< p class = 'jove_content'> تم وصف نهج بسيط لقياس التدفق الخلوي لفصل المنوية الفئرانية ذات النقاء العالي (95-100٪) بناء على محتوى الحمض النووي الظاهر (تلطيخ SYTO16) وحجمها وحبيبتها. تنقسم المنوية إلى أربعة مجموعات سكانية. خطوات تكوين المنوية 1-9 و 10-12 و 13-14 و 15-16. المنوية المنقاة مناسبة للتحليل الجيني / الجيني ، بالإضافة إلى التطبيقات البروتينية كما هو موضح في منشور حديث من مجموعتنا9.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وكانت رعاية الحيوان وفقا للجنة رعاية الحيوان واستخدام جامعة شيربروك.

1. أنبوب إعداد

  1. قبل يوم واحد فرز الخلايا، إضافة 1-2 مل من الحرارة المعطل مصل بقري جنيني (FBS) إلى 5 مل من مادة البولي بروبيلين أنابيب أسفل الجولة، وإلى 15 مل و 50 مل أنابيب البولي بروبلين المخروطية.
    خطوة حاسمة: تأكد من أن كل أنبوب المستخدمة في البروتوكول هو المغلفة.
    ملاحظة: FBS طلاء يمنع الخلايا الجرثومية من الالتصاق على جدران الأنبوب.
  2. مزيج ببطء O / N التي كتبها قلب في 4 ° C إلى معطف الأنابيب موحد باستخدام المدورة.
  3. في اليوم التالي، وإزالة FBS من الأنابيب المغلفة من قبل الصب.
    1. * خطوة حاسمة: تأكد من أن 5 مل من مادة البولي بروبيلين أنابيب أسفل جولة و15 و 50 مل أنابيب تستخدم لإعداد الخلية (بروتوكول الخطوات 2،1-2،11) يتم تفريغ تماما من FBS لمنع تأجيج (أي انحراف غير دقيق من تيارات الجانب). استخدام الماصة P200 لإزالة FBS.
      ملاحظة: FBS المتبقية في أنابيب قبل الفرز قد يؤدي إلى فقدان الخلايا أو تلوث أنابيب الأخرى المستخدمة خلال الخلية الفرز،
    2. ترك حجم صغيرة متبقية من FBS (حوالي 100-200 ميكرولتر) في الجولة البولي بروبلين 5 مل أنابيب أسفل المستخدمة لجمع خلايا النقاء.

2. خلية التحضير

  1. التضحية الماوس واحد من الذكور تحت التخدير باستخدام O 2 / الأيزوفلورين (الحث على 5٪ ثم الحفاظ على 2٪)، يليه CO 2 الاختناق.
  2. المكوس وdecapsulate كلا الخصيتين واللحم المفروم مع مقص صغير في 500 ميكرولتر من فرز العازلة في أنبوب 1.5 مل.
  3. الخلايا الجرثومية دافق من الأنابيب المنوية التي كتبها طيف pipetting صعودا وهبوطا في أنبوب 1.5 مل، أولا مع اقتطاع 100-1،000 ميكرولتر الحافة، ثم مع سليمة طرف 100-1،000 ميكرولتر.
  4. إزالة الأنقاض وكتل خطوة الترشيح واحد باستخدام مصفاة الخلية 40 ميكرومتر وجمع الرشاحة إلى 50 مل السابق أنبوب مخروطيالمغلفة iously مع FBS في الخطوة 1.
  5. غسل الفلتر مرة مع فرز عازلة تصل إلى الحجم الكلي لل3 مل ونقل الترشيح إلى 15 مل أنبوب مخروطي المغلفة سابقا في الخطوة 1.
  6. إضافة 16 ميكرولتر من 50 ملي درجة الحموضة 8 في الملليمتر الواحد من تعليق خلية (48 ميكرولتر لمدة 3 مل) EDTA وذلك للحصول على التركيز النهائي من 0.8 ملي EDTA.
  7. لإصلاح الخلايا الجرثومية، إضافة ببطء 3 مجلدات من الجليد الباردة الإيثانول بنسبة 100٪ باستخدام الماصة 10 مل مع الإثارة لطيف (الدوامة بسرعة منخفضة)، والتي سوف تنتج تعليق حليبي.
    خطوة حاسمة: إضافة ببطء الايثانول أمر حاسم ومهم للحفاظ على سلامة إعداد الخلية. لاحظنا أن إضافة السريع من الايثانول تسبب تحلل الخلايا مما أدى إلى انخفاض كبير في فرز الكفاءة. لخلية تعليق 3 مل، وينبغي أن يضاف 9 مل من الايثانول في حوالي 1 دقيقة.
  8. احتضان الخلايا على الجليد لمدة 15 دقيقة مع خلط في بعض الأحيان عن طريق الانقلاب.
  9. تعليق خلية الطرد المركزي في 800 x ج لمدة 5 دقائق وإزالة واضحةطاف.
  10. بلطف resuspend الخلايا الجرثومية الثابتة في 2 مل من فرز العازلة.
  11. إضافة 4 ميكرولتر من SYTO16 DNA صبغ (حل 1 ملم في DMSO)، واحتضان لمدة 30 دقيقة على الأقل (محمية من الضوء).
    ملاحظة: يتم الحصول على أفضل النتائج فرز باستخدام SYTO16 لأنها صبغة DNA قابلة للاختراق الذي يسهل إدراجها في نوى المضغوط للغاية من spermatids.

فارز 3. خلية محدد حتى

يستخدم 20 معلمة BDFACSAria III فارز الخلية وهنا 4-الليزر (أحمر 405 نانومتر - البنفسجي، 488 نانومتر - الأزرق، 561 نانومتر - - الأصفر والأخضر، 633 نانومتر): ملاحظة. يتم استخدام BD FACSDiva 6.1.3 برنامج لتصور وتحليل البيانات. قد تختلف إعدادات اعتمادا على نوع فارز المستخدمة.

  1. تعقيم فارز FACS عن طريق تشغيل 70٪ من الإيثانول كسائل غمد أثناء إجراء fluidics اغلاق (القائمة "عداد الكريات" في البرنامج) قبل الفرز. حدد "عداد الكريات" في شريط الأدوات من البرنامج واختيار "ش فلويديكutdown ". اتبع الخطوات من العمليات المذكورة.
  2. إعداد وتصفية 1X PBS مع مرشح 0.22 ميكرون وذلك للقضاء على أي بلورات والملوثات. ملء خزان غمد إلى خط اللحام العلوي في داخل الخزان.
  3. بدء تشغيل البرنامج وتسجيل الدخول. بدء فارز FACS في عملية الاحماء الليزر لمدة 30 دقيقة على الأقل قبل الفرز. تشغيل اثنين عمليات بدء التشغيل الموائعية لطرد الإيثانول من fluidics. حدد "عداد الكريات" في شريط الأدوات من البرنامج واختر "بدء التشغيل فلويديك". اتبع الخطوات من العمليات المذكورة.
    ملاحظة: هذا يعيد fluidics مع الطبيعي السائل غمد (1X PBS).
  4. تنظيف كتلة الفرز واللوحات انحراف بالماء المقطر وتجفيفها جيدا. يصوتن فوهة 100 ميكرومتر وضعت في أنبوب من الماء المقطر لمدة 2 دقيقة في حمام صوتنة. مسح فوهة بدقة.
  5. أدخل فوهة 100 ميكرومتر في خلية تدفق وتحويل قفل فوهة رافعة عقارب الساعة إلى 12موقف ساعة. ضبط ضغط غمد إلى 20 رطل.
  6. بدوره على تيار وضبط السعة للحصول على القيم المستهدفة للتردد (حوالي 30)، قطرة 1 (حوالي 150) وجاب (حوالي 12) وإلى تأسيس نمط قطرة breakoff مستقر (قطرات قليل من الأقمار الصناعية). إيقاف التوهين.
  7. تأكد من أن تيار مستقيم ويضرب وسط الشافطة النفايات عن طريق تغيير زاوية من كتلة النوع. ملاحظة: تم اختبار فوهة 130 ميكرومتر في 10 رطل أيضا وتوجد فروق واضحة.
  8. تعيين تأخير الليزر ل0 ل-77.39 الأزرق، للأحمر، 37.33 لالبنفسجي و-39.85 ليزر الأصفر والأخضر.
  9. المناطق المحددة لرفع 1.14 ل1.0 الأزرق، للأحمر، 0.75 لالبنفسجي و0.96 لأشعة الليزر الأصفر والأخضر.
  10. باستخدام ترتيب اختبار (في "الجانب ستريم" نافذة البرنامج)، تأكد من أن تيارات الجانب لا تثيران. في "الجانب ستريم" نافذة، وضبط المتزلجون الجهد من كل تيار الجانب بحيث تصل إلى middl(ه) من أنبوب جمع اختبار. إذا كان تيار الوسط غير محكم، وضبط الثاني 2، 3 الثالثة، وإعدادات قطرة ال 4 لكبح تيار الوسط.
  11. بدء الإعداد الكريات وتتبع (CS & T) التطبيق في البرنامج ("عداد الكريات" القائمة).
  12. استخدام الإعداد وتتبع حبات الكريات في 1 قطرة في 350 ميكرولتر لأتمتة توصيف وتتبع أداء الكريات باستخدام تعليمات الشركة الصانعة.
  13. إنهاء التطبيق CS & T. تطبيق الإعداد CS & T، تأكد من المعلمات تيار لا تزال تسمح نمط قطرة breakoff مستقر، وبدوره على زر الحلو بقعة كما هو موضح في تعليمات الشركة الصانعة (في "نافذة Breakoff").
  14. تعظيم قيمة قطرة تأخير باستخدام الخرز فلوري (انظر الجدول المواد).
    1. تثبيت أنابيب جمع في حامل. فتح باب كتلة النوع. في "الجانب ستريم" نافذة، بدوره على الجهد ثم حدد "اختبار نوع "وانقر فوق الزر المضخة درج لفتح درج والحصول على أنابيب جمع.
    2. تحسين تيارات جانب ذلك يذهبون إلى وسط الأنبوب. ضبط القيم والمتزلجون حسب الحاجة.
    3. إغلاق كتلة الباب فرزها والتأكد من ضبط الطلب ميكرومتر للحصول على ألمع بقعة حبة في المركز. درج النفايات غير منتقى، اختبار الفرز والجهد. إزالة أنابيب جمع.
    4. تحسين تأخير هبوط وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
      1. لفترة وجيزة، ويهز حبة قارورة بقوة وتمييع 1 قطرة من الخرز في 0.5 مل من برنامج تلفزيوني.
      2. باستخدام تعليمات الصانعين، تعيين التأخير قطرة باستخدام القالب تجربة قطرة تأخير المتاحة في البرنامج. بدلا من ذلك، استخدم ميزة السيارات قطرة تأخير لضبط تأخير الهبوط.
      3. تحميل أنبوب من الخرز الفلورسنت وضبط معدل تدفق حتى معدل عتبة هو ~ 3000 إلى 4000 أحداث / ثانية. تعيين دقة الفرز إلى "الأولية" ونهائيلاي ل"تهذيب" في إطار "تخطيط ترتيب". حدد مرشح بصري وفرز الخرز. ضبط قطرة تأخير حتى ~ يتم فرز 100٪ إلى اليسار.
        ملاحظة: هذه الخطوة الحاسمة للتأكد من أن الخلايا التي تهم النوع الى تيار الجانب. يتم استخدام الخرز ومرشح بصري لتحقيق ما يقرب من 100٪ قطرة الانحراف.
  15. وضع FSC 1.5 ND (الكثافة المحايدة) مرشح في الطرف الأيسر من كتلة كشف FSC. تعيين ملحق نافذة إلى 2.00 ميكرو ثانية والتحجيم FSC منطقة إلى 1.00 (في "ليزر" في علامة التبويب "عداد الكريات" نافذة).
  16. قبل تحميل أنبوب عينة، ضع خط مرشح عينة من 50 ميكرون في نهاية السطر عينة لتجنب تراكمها. للقيام بذلك، حدد "تغيير نموذج تصفية" في القائمة "عداد الكريات".
  17. اختبار تكوين السائل عينة لتحقيق فصل جيد من دون اثارة بين تيار الجانب ومنع الخلايا من الالتصاق على بولي بروبلينأنابيب ني.
    1. تحميل أنبوب عينة، بدوره على لوحات انحراف واختر "اختبار النوع" مع درج مغلق. ننظر إلى تيارات الجانب في حال حدوث الانفصال دون الكثير من تأجيج.
      ملاحظة: من المحتمل فانينغ بسبب تركيز نسبة عالية من البروتين في عينة العازلة.
  18. تحميل أنبوب العينة إلى أداة FACS. حدد التحريض عينة من 300 دورة في الدقيقة ودرجة حرارة العينة من 4 ° C. حدد "الحصول على البيانات" في "اقتناء لوحة".
  19. إذا لزم الأمر، وتمييع العينة إلى تحقيق معدل الحدث المناسب إلى حد أقصى قدره 5000 أحداث / ثانية (بمعدل تدفق الأقصى من 3.0). بدقة احترام هذه الحدود وذلك للحفاظ على نقاء خلايا فرزها.
  20. لتحليل وفرز الخلايا، وتحسين قيمة عتبة FSC للقضاء على الحطام دون التدخل مع السكان من الاهتمام. في مقياس لوغاريتمي، وضبط الجهد من الأنبوب الصور المضاعف (PMT) كاشف مع فلتر 530/30 من أجل جعلالتأكد من أن إشارة مضان من مجموع السكان يناسب داخل نطاق، وبوابة على السكان الإيجابي (الشكل 1، بوابة 1).
  21. إنتاج مبعثر في منطقة الأمام (FSC-A) / جانبية مبعثر في منطقة (SSC-A) قطعة من السكان إيجابي SYTO16 وضبط FSC-A إلى حوالي 110 V في مقياس خطي، وSSC-A إلى حوالي 150 V في مقياس لوغاريتمي لتصور كل الأحداث مع استبعاد الخلايا الكبيرة جدا والمجاميع الخلية.
  22. في إطار "ترتيب تخطيط"، تعيين "وضع الدقة ترتيب" إلى "النقاء 4-الطريق" (قناع الغلة: 0، الطهارة قناع: 32، قناع المرحلة: 0). حدد "مستمر" من "أحداث الهدف" القائمة على الفرز مستمر.
  23. إضافة السكان لفرز في مجال المطابقة للأنابيب (في إطار "ترتيب تخطيط"). سكان المكان مع ترددات أعلى في الوسط، وتلك مع ترددات منخفضة نسبيا في نهايات. ضبط لوحات الجهد ل2500 V. أثناء الفرز، والحفاظ على تي جمع العيناتubes على الجليد.

4. خلية الفرز

  1. على الفور قبل الفرز، والخلايا مرشح باستخدام فلتر 50 ميكرون في المغلفة سابقا 5 مل البولي بروبلين الجولة أنبوب أسفل.
  2. غسل المرشح على نطاق واسع مع 1-2 مل من فرز العازلة.
  3. الخلايا الجرثومية نوع ثابتة باستخدام مجهزة ليزر فارز خلية 488 نانومتر التالية مخطط النابضة المفصل في الشكل 1. جمع الكسور النقاء في 5 مل من مادة البولي بروبيلين أنابيب أسفل الجولة المغلفة سابقا في القسم 1 على الجليد.
    1. تأكد من 100-200 ميكرولتر من FBS يتم الاحتفاظ بها في أنابيب جمع لتجنب التصاق الخلايا مرتبة على الجدار أنبوب.
    2. تأكد من أن تركيز SYTO16 والإشباع لتجنب تقلبات مضان خلال الفترة الفرز. SYTO16 وتشبع عندما لا يكون هناك تباين المزيد من شدة تلطيخ الخلية في اليكسا فلور 488 معلمة (تلطيخ DNA) في الرسومات الفرز. إذا لزم الأمر، إضافة 1 ميكرولتر منSYTO16 إلى أنبوب الفرز للوصول إلى الإشباع.
    3. عرض مجموع الأحداث على الرسم تظهر المعلمات التالية: عدد من الأحداث مقابل اليكسا فلور 488-A.
    4. حدد الخلايا تلطيخ DNA إيجابية مع بوابة 1، كما هو مبين في الشكل 1.
      1. عرض الخلايا من بوابة 1 على الرسم باستخدام SSC-A مقابل FSC-A كمعلمات
        1. حدد الخلايا مع بوابة 2، أظهرت كما في الشكل 1.
        2. عرض الخلايا من بوابة 2 على الرسم باستخدام FSC-A مباراة اليكسا فلور 488-A كمعلمات.
        3. حدد الخلايا مع بوابة 5 و 6 على بوابة بوابة 2 الرسم، أظهرت كما في الشكل 1.
        4. عرض منفصل بوابة 5 و 6 على بوابة الرسومات باستخدام اليكسا فلور 488-W مقابل اليكسا فلور 488-A كمعلمات.
        5. حدد تكون النطاف الخطوات 1-9 spermatids على بوابة 5 الرسم وتكون النطاف الخطوات 10-12 spermatids على بوابة 6 الرسومات، وأظهرت كما في الشكل 1.
      2. عرضخلايا من بوابة 1 على الرسم باستخدام FSC-A مباراة اليكسا فلور 488-A كمعلمات
        1. حدد الخلايا مع بوابة 3 وبوابة 4، وأظهرت كما في الشكل 1.
        2. عرض منفصل بوابة 3 و 4 على بوابة الرسومات باستخدام اليكسا فلور 488-W مقابل اليكسا فلور 488-A كمعلمات.
        3. حدد تكون النطاف الخطوات 13-14 spermatids على الرسم البوابة رقم 3 وتكون النطاف الخطوات 15-16 spermatids على الرسم بوابة 4، وأظهرت كما في الشكل 1.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

استراتيجية النابضة استخدامها مع التدفق الخلوي

الشكل 1 يمثل استراتيجية النابضة المستخدمة في التدفق الخلوي لفرز أربعة السكان النطف نقية للغاية. لفترة وجيزة، والخلايا مع تلطيخ DNA الإيجابي (فلور اليكسا 488-A) ويتم اختيار أولا مع بوابة الخطوات يتم اختيار 1. Spermatids من النطاف 1-12 (بوابة 2) على قطعة نقطة تظهر كتلة تحببية (SSC-A) مقاب...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الخلايا المنوية دائما تحديا للدراسة نظرا لتعقيد ظهارة المنوية، وكذلك النجاح المحدود للثقافة في المختبر. على مر السنين، وقد وضعت الخلايا الجرثومية من الأنواع المختلفة العديد من الطرق لتنقية. تقنيات الترسيب باستخدام تنقية الجاذبية مع Percoll أو الأبقار مصل الزلال التدرجات عادة ما توفر عائد جيد للخلايا جرثومي سليمة، ولكنها تفتقر تعريف مناسب بين بعض أنواع الخلايا مثل الخلايا وspermatids 10 الانتصافي رباعي الصيغة الصبغية. وعلاوة على ذلك، تتطلب هذه التقنيات أجهزة خاص...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعلن المؤلفون عدم وجود مصالح مالية متنافسة.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب أود أن أشكر الدكتور ليونيد فولكوف واريك بوشار للحصول على المشورة التقنية بشأن المجهر epifluorescence.

الدعم المالي

بتمويل من قبل المعاهد الكندية لأبحاث الصحة (منحة # MOP-93781) لGB

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
IsofluraneABBOT05260-05لتخدير الفأر قبل القتل الرحيم
مصل الأبقار الجنينيWisent90150لطلاء الأنبوب
1x PBS
EDTABioShopEDTلفرز تحضير العازلة
HEPESSigmaHلفرز تحضير العازلة
100٪ الإيثانولLes alcools de commerce092-09-11Nلتثبيت الخلايا
SYTO 16Life TechnologiesS7578تلطيخ الحمض النووي
5 مل أنابيب القاع المستديرة من مادة البولي بروبيلين BDFalcon352063مجموعة الخلايا المصنفة
15 مل أنابيب سفلية مخروطية من مادة البوليبروبيلين PROgene1500
50 مل أنابيب سفلية مخروطية من مادة البوليبروبيلين PROgene5000
مبخر مخدر TEC4Ohmeda1160526للفأر القتل الرحيم
CO2< / sub> خزان الغازPraxairC799117902للقتل الرحيم للفأر
O2< / sub> خزان الغازPraxairO254130501للقتل الرحيم للفأر
غرفةللقتل الرحيم للفأر
40 & micro ؛ م مصفاة خلية الصقرCorning Incorporated352340
50 & mu ؛ مرشحات خط العينة مBD Biosciences649049
خلاط VortexLabnet international، inc.S0200لتثبيت الخلايا
Dynac جهاز الطرد المركزيكلاي آدامز101
Celltrics 50 & مرشحات mPartec04-004-2327
488 نانومتر فارز الخلايا بالليزر بالليزرBD BiosciencesFACSAria III
Accudop حبات الفلورسنتBD Biosciences345249
المخزن المؤقت للفرز: 1x PBS ، 1 ملي مولار EDTA درجة الحموضة 8.0 ، 25 ملي مولار HEPES درجة الحموضة 7.0 ، 1٪ FBSFBS معطل بالحرارة. اصنع محلولا جديدا ، 0.22 مو ؛ م مفلتر والحفاظ على 4 درجات مئوية.
غاز الفأر محلية الصنع

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Sato, T., et al. In vitro production of functional sperm in cultured neonatal mouse testes. Nature. 471 (7339), 504-507 (2011).
  2. Sato, T., et al. In vitro production of fertile sperm from murine spermatogonial stem cell lines. Nat. Commun. 2, 472(2011).
  3. Sun, X., Kovacs, T., Hu, Y. -J., Yang, W. -X. The role of actin and myosin during spermatogenesis. Mol. Biol. Rep. 38 (6), 3993-4001 (2011).
  4. Cheng, C. Y., Mruk, D. D. Cell junction dynamics in the testis: Sertoli-germ cell interactions and male contraceptive development. Physiol. Rev. 82, 825-874 (2002).
  5. Laiho, A., Kotaja, N., Gyenesei, A., Sironen, A. Transcriptome profiling of the murine testis during the first wave of spermatogenesis. PLoS ONE. 8 (4), (2013).
  6. Leduc, F., Maquennehan, V., Nkoma, G. B., Boissonneault, G. DNA damage response during chromatin remodeling in elongating spermatids of mice. Biol. Reprod. 78 (2), 324-332 (2008).
  7. Meistrich, M. L., Mohapatra, B., Shirley, C. R., Zhao, M. Roles of transition nuclear proteins in spermiogenesis. Chromosoma. 111 (8), 483-488 (2003).
  8. Grégoire, M. -C., et al. Male-driven de novo mutations in haploid germ cells. Mol. Hum. Reprod. 19 (8), 495-499 (2013).
  9. Simard, O., et al. Instability of trinucleotidic repeats during chromatin remodeling in spermatids. Hum. Mutat. , (2014).
  10. Wykes, S. M., Krawetz, S. Separation of spermatogenic cells from adult transgenic mouse testes using unit-gravity sedimentation. Mol. Biotechnol. 25 (2), 131-138 (2003).
  11. Yoshida, S., et al. The first round of mouse spermatogenesis is a distinctive program that lacks the self-renewing spermatogonia stage. Development (Cambridge, England). 133 (8), 1495-1505 (2006).
  12. Moreno, R. D., Lizama, C., Urzúa, N., Vergara, S. P., Reyes, J. G. Caspase activation throughout the first wave of spermatogenesis in the rat. Cell Tissue Res. 325 (3), 533-540 (2006).
  13. Meistrich, M. L., Trostle-Weige, P. K., Van Beek, M. E. Separation of specific stages of spermatids from vitamin A-synchronized rat testes for assessment of nucleoprotein changes during spermiogenesis. Biol. Reprod. 51 (2), 334-344 (1994).
  14. van Pelt, A. M., de Rooij, D. G. Synchronization of the seminiferous epithelium after vitamin A replacement in vitamin A-deficient mice. Biol. Reprod. 43, 363-367 (1990).
  15. Getun, I. V., Torres, B., Bois, P. R. J. Flow cytometry purification of mouse meiotic cells. J. Vis. Exp. , (2011).
  16. Kovtun, I. V., McMurray, C. T. Trinucleotide expansion in haploid germ cells by gap repair. Nature Genet. 27 (4), 407-411 (2001).
  17. Bastos, H., et al. Flow cytometric characterization of viable meiotic and postmeiotic cells by Hoechst 33342 in mouse spermatogenesis. Cytometry A. 65 (1), 40-49 (2005).
  18. Lassalle, B., Ziyyat, A., Testart, J., Finaz, C., Lefèvre, A. Flow cytometric method to isolate round spermatids from mouse testis. Hum. Reprod. 14 (2), 388-394 (1999).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Alexa Fluor 488

مقالات ذات صلة