مقالة منهجية

جيل وثقافة الدم ثمرة غشائي خلايا من الدم المحيطي الإنسان

20K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/53384

⸱

ديسمبر 23, 2015

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Medicine, University of Cambridge, 2Papworth Hospital

في هذه المقالة

ملخص

يسمح هذا البروتوكول بتوليد وتوصيف الخلايا البطانية لنمو الدم (BOECs) من حجم صغير من الدم المحيطي للبالغين. يمكن استخدام BOECs كبديل للخلايا البطانية من المرضى الذين يعانون من اضطرابات الأوعية الدموية وكركيزة لتوليد الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات.

الملخص

تاريخيا ، أدى التوافر المحدود للخلايا البطانية الأولية من المرضى الذين يعانون من اضطرابات الأوعية الدموية إلى إعاقة دراسة الآليات الجزيئية الكامنة وراء الخلل البطاني لدى هؤلاء الأفراد. ومع ذلك ، فإن التحديد الأخير للخلايا البطانية لنمو الدم (BOECs) ، الناتجة عن الأسلاف البطانية المنتشرة في الدم المحيطي للبالغين ، قد يتحايل على هذا القيد من خلال تقديم بديل خلية أولية تشبه البطانة للخلايا البطانية المشتقة من المريض. بالإضافة إلى قيمتها في فهم بيولوجيا البطانة ونمذجة الأمراض ، فإن BOECs لها استخدامات محتملة في علاجات زرع الخلايا البطانية. كما أنها ركيزة خلوية مناسبة لتوليد الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات (iPSCs) عن طريق إعادة البرمجة النووية ، مما يوفر عددا من المزايا مقارنة بأنواع الخلايا الأخرى. نصف طريقة لتوليد وثقافة وتوصيف BOECs الموثوقة من الدم المحيطي للبالغين لاستخدامها في هذه التطبيقات وغيرها. يسمح هذا النهج (i) بتوليد الخلايا البطانية الخاصة بالمريض من حجم صغير نسبيا من الدم المحيطي للبالغين و (ii) ينتج خلايا تشبه إلى حد كبير الخلايا البطانية الأولية في التشكل وإشارات الخلية والتعبير الجيني.

المقدمة

حتى وقت قريب، كان يعتقد أن جيل ما بعد الولادة الأوعية الدموية الجديدة أن تحدث بشكل حصري من خلال عملية تعرف باسم الأوعية الدموية، الذي يعرف بأنه تنتشر سفن جديدة من الخلايا البطانية للأوعية موجودة من قبل. 1 هذه العملية تتناقض من تكون الأوعية، أو تشكيل دي نوفو الأوعية الدموية من أسلاف البطانية، الذي كان يعتقد أن يحدث حصرا أثناء التطور الجنيني. 2 ومع ذلك، وقد حددت الدراسات الأكثر حداثة وعزل تعميم الخلايا الاصلية البطانية (EPCS) في الدم المحيطي الكبار. هذه الخلايا تمتلك القدرة على التمايز إلى خلايا البطانية ناضجة في الثقافة ويعتقد على المشاركة في تكون الأوعية بعد الولادة. 3،4

بروتوكولات للعزلة وتوسيع هذه EPCS وعادة ما تشمل ثقافة الخلايا الطرفية وحيدة النواة في الدم (PBMNCs) في وسائل الإعلام التي تحتوي على عوامل النمو البطانية، بما في ذلك vasculعامل AR البطانية النمو (VEGF)، وعامل نمو الخلايا الليفية-2. 5-8 الثقافات EPC تنتج مجموعة متنوعة من أنواع مختلفة من الخلايا بشكل كبير. الثقافات الأولية (<7 أيام) ويغلب عليها نوع من الخلايا الوحيدات، والمعروف في الأدب بأنه "في وقت مبكر" EPCS. على الرغم من اسمها، وهذه الخلايا تعبر عن CD14 الوحيدات علامة، هي سلبية للCD34 السلف علامة والتعبير عن مستويات الحد الأدنى فقط من الكلاسيكية البطانية علامات CD31 وVEGF مستقبلات 2 (VEGFR2). 5 الثقافة استمرار يثير سكان الثانوي من الخلايا، المعروفة باسم EPCS أواخر ثمرة أو الخلايا البطانية ثمرة الدم (BOECs)، والتي تظهر المستعمرات سرية اعتبارا من خلايا تشبه الخلايا البطانية. وخلافا للEPCS مبكرة الوحيدات، BOECs، والتي أيضا تم استدعاء مستعمرة تشكيل الخلايا البطانية (ECFCs)، الخلايا البطانية ثمرة أو الخلايا البطانية في وقت متأخر من ثمرة، يحمل التشكل المرصوفة بالحصى التي هي الحال في الطبقات الوحيدة الخلية البطانية وتشبه إلى حد كبير في علامة السطح5 والتعبير الجيني 9 إلى أن تنضج الخلايا البطانية.

توليد خلايا تشبه الخلايا البطانية من الدم المحيطي يوفر العديد من المزايا، وخاصة لدراسة الخلل الخلايا البطانية المرتبطة اضطرابات الأوعية الدموية مثل ارتفاع ضغط الدم الرئوي الشرياني (PAH) 10 أو فون ويلبراند المرض. 11 قبل توافر BOECs، البطانية لا يمكن إلا أن تكون مشتقة من خلايا أجهزة explanted في وقت الوفاة أو زرع الأعضاء، أو معزولة من الوريد السري عند الولادة. هذا انخفاض توافر يمثل قيدا خطيرا على فهم بيولوجيا الخلايا البطانية من المرضى الذين يعانون من اضطرابات القلب والأوعية الدموية، وكذلك التفاعلات بين الخلايا البطانية وإما خلايا الدم أو الخلايا الجدارية. وعلاوة على ذلك، عزل وزراعة السكان نقية من الخلايا البطانية من هذه المصادر يشكل تحديا فنيا والخلايا التي يحصل عليها هذه الأساليب يحمل سوى يميتالقدرة التكاثري د. لذا BOECs تقديم بديل قيمة للعزلة وثقافة من الخلايا البطانية الأولية المستمدة من المريض.

بالإضافة إلى المختبر في طلباتهم، BOECs أيضا يمكن أن تكون مفيدة في علاج ذاتي زرع الخلايا. وتشمل هذه التطبيقات على حد سواء زرع البطانية خلية لتعزيز اتساع الأوعية الدموية (انظر 12 والمراجع فيه)، فضلا عن توليد الخلايا الجذعية المحفزة (iPSCs). 13 iPSCs BOEC المشتقة يمكن أن تستخدم لنمذجة المرض وتوفر إمكانات هائلة مثل الانطلاق المواد اللازمة لعلاج الخلايا ذاتي. BOECs برمجة أسرع وبكفاءة أعلى من الخلايا الليفية الجلد. وعلاوة على ذلك، BOECs أيضا السماح لتوليد iPSCs أن تكون خالية من العيوب النمط النووي، الذي هو سمة أساسية من سمات أي تكنولوجيا من شأنها أن تكون مناسبة لتطبيقات متعدية. القدرة على توليد iPSCs من عينة دم المريضيسوتو يلغي الحاجة لخزعة الجلد وتوليد الخلايا الليفية الجلد، مما يسهل توليد الخلايا من المرضى الذين يعانون من اضطرابات التئام الجروح، أو الصغار جدا.

بروتوكول المفصلة أدناه، التي وافقت عليها والتي تتم وفقا للمبادئ التوجيهية للجنة الخدمة أخلاقيات القومي للبحوث (شرق انجلترا)، يوفر طريقة بسيطة وموثوق بها لتوليد BOECs مع كفاءة أكبر من 90٪ من حجم صغير نسبيا (60 مل) من الدم المحيطي. هذه الخلايا هي التكاثري للغاية ويمكن passaged مرارا وتكرارا، مما يسمح لتوليد مئات الملايين من الخلايا من عينة دم واحدة.

البروتوكول

ويرد التخطيطي للبروتوكول الجيل BOEC في الشكل 1.

1. جمع الدم والتدرج الكثافة الطرد المركزي

  1. لكل الجهات المانحة، إضافة 3 مل من سترات الصوديوم إلى كل من اثنين من 50 مل أنابيب الطرد المركزي المخروطية. جمع 60 مل من الدم عن طريق بزل الوريد وإضافة 30 مل لكل أنبوب. عكس بلطف 2-3 مرات لخلط. استخدام اقل من 40 مل من الدم في البروتوكول، مع وحدات التخزين سترات تبعا لذلك.
    ملاحظة: من الضروري أن تتم معالجة عينات الدم في غضون 2 ساعة من جمعها. تأخر تجهيز نتائج فحص الدم في انخفاض ملحوظ في العائد مستعمرة ثمرة.
  2. إعداد أنابيب مخروطية جديدة تحتوي على كثافة التدرج الطرد المركزي المتوسطة التي كتبها قلب أول الزجاجة عدة مرات لخلط. في غطاء العقيمة، إضافة 15 مل من التدرج الكثافة الطرد المركزي المتوسطة في 50 مل أنبوب مخروطي الشكل (1 أنبوب لكل 10 مل من الدم، 6 أنابيب في المانحة).
  3. تمييع الدم 1: 1 مع الفوسفات Dulbecco ل-Buffered المالحة (DPBS). إمالة الأنبوب الذي يحتوي على الطرد المركزي متوسطة الكثافة التدرج إلى زاوية 20 درجة مع سطح العمل. باستخدام المساعدات ماصة و25 مل ماصة المصلية، طبقة ببطء 21 مل من الدم المخفف على أعلى من المتوسطة بإضافة الدم تدريجيا جدار أنبوب مائل.
    ملاحظة: وسوف نفعل ذلك تقليل اختلاط الدم مع طبقة التدرج الكثافة وسوف تنتج معطف الشهباء تشديد، فضلا عن العائد المحسنة.
  4. عينات الطرد المركزي في 400 x ج لمدة 35 دقيقة في RT مع دواسة البنزين والفرامل خارج.
  5. خلال هذه الفترة الطرد المركزي، والبدء في طلاء الكولاجين هو مفصل في الخطوات 2،1-2،4. ضمان الانتهاء من هذه الخطوات قبل الشروع في الخطوة 3.1.

2. الكولاجين طلاء من T-75 قارورة وإعداد الثقافة المتوسطة

ملاحظة: إجراء الخطوات التالية في غطاء ثقافة الخلية.

  1. إعداد / مل من محلول الكولاجين 50 ميكروغرام عن طريق تمييع الأسهم تايالمؤسسة العامة I الكولاجين في 10 مل من حمض الخليك 0.02M مثال: لمخزون الكولاجين بتركيز 4.05 ملغ / مل، إضافة 123.5 ميكرولتر من الكولاجين إلى 10 مل من حمض الخليك 0.02 M. تصفية العقيمة الكولاجين تعليق قبل استخدامها.
  2. باستخدام ماصة المصلية، إضافة 7.5 مل من محلول الكولاجين إلى T-75 خلية ثقافة القارورة. يعطي هذا الحجم 5 ميكروغرام الكولاجين / سم 2 (أو 375 ميكروغرام / قارورة). معطف قارورة لمدة 1 ساعة على RT.
  3. إعداد المتوسطة نمو بطانة المستخدمة لتوليد BOEC من خلال استكمال البطانية المتوسطة القاعدية مع مكملات عامل نمو المقدمة من قبل الشركة المصنعة. إضافة كافة الملاحق، ولكن لا تضيف مصل. لإعداد 15 مل من الجيل BOEC المتوسطة، إضافة 2.5 مل من تعريف مصل بقري جنيني (FBS) إلى 12.5 مل من متوسط ​​النمو البطاني التي تحتوي على ملاحق عامل النمو.
  4. المضي قدما في الخطوات الموضحة في القسم 3. بعد فترة طلاء 1 ساعة، نضح الحل الكولاجين ويغسل حامض الخليك المتبقية قبل pipettingفي 10 مل DPBS. نضح قبالة DPBS وكرر هذه الخطوة يغسل مرة أخرى. إذا كان تعليق الخلية التي تم الحصول عليها خلال الخطوة 3.3 ليست مستعدة لتصفيح في هذا الوقت، إضافة 5ml من الجيل BOEC المتوسط ​​إلى القارورة للحفاظ على طلاء الكولاجين من الجفاف التدريجي.

3. جمع وطلاء من PBMNCs

  1. بعد الطرد المركزي التدرج الكثافة هو موضح في الخطوة 1.4، وجمع بعناية طبقة معطف الشهباء باستخدام معقم نقل البلاستيك ماصة. جمع من معطف الشهباء ينبغي أن تسفر حوالي 20 مل من تعليق خلية والبلازما من كل أنبوب. تجنب نقل متوسطة الكثافة التدرج.
  2. تمييع تعليق خلية وحيدة النواة 1: 1 في DPBS وعكس إلى المزيج. أجهزة الطرد المركزي في RT لمدة 20 دقيقة في 300 x ج مع الفرامل ودواسة البنزين كحد أقصى.
  3. بعد الطرد المركزي، ونضح الخلايا طاف و resuspend عن طريق إضافة 1 مل من الجيل BOEC المتوسط ​​إلى كل بيليه وpipetting صعودا وهبوطا بشكل متكرر. خلية تجمع تعليق لد أعلى حتى الحجم الإجمالي إلى 10 مل مع المتوسطة المتبقية.
  4. للحصول على تقدير من إجمالي عدد الخلايا، عينة 10 ميكرولتر من تعليق الخلية وتمييع 50X مع 490 ميكرولتر من محلول الترك، والتي سوف ليز خلايا الدم الحمراء. عد عينة 10 ميكرولتر من تعليق خلية المخفف باستخدام haemocytometer.
    ملاحظة: 60ML الدم ينبغي أن تسفر حوالي 100-150 × 10 6 خلايا الدم البيضاء للطلاء.
  5. لوحة تعليق الخلية بأكملها في عملية واحدة، المغلفة الكولاجين T-75 قارورة، أعلى متابعة حجم المتوسط ​​إلى 15ML / قارورة والثقافة عند 37 درجة مئوية في جو مرطب يحتوي على 5٪ CO 2. خلايا مطلي في هذا الوقت تمثل مرور 0.
    ملاحظة: من الممكن تجميد PBMNCs معزولة قبل العزلة BOEC من أجل استخلاص BOECs في وقت لاحق أو لنقل PBMNCs إلى مختبر مختلف حيث يمكن إنشاء BOECs. ومع ذلك، فمن المهم أن نلاحظ أن PBMNCs تجميد يمكن أن تقلل من كفاءة العزل BOEC. Sه ه القسم 8 أدناه للحصول على الأسلوب.

الثقافة خلية 4. على المدى الطويل

  1. تغيير المتوسطة كل أيام 2 وذلك بإضافة 15 مل من الطازجة المتوسطة الجيل BOEC (5: 1 خليط من البطانية المتوسطة نمو الخلايا وتعريف FBS). لعطلة نهاية الأسبوع، والتغيرات المتوسطة يمكن أن يتأخر إلى كل 3 أيام.
    ملاحظة: يجب أن تظهر المستعمرات ثمرة ما بين 7 و 14 أيام للثقافة.
  2. مراقبة قارورة الثقافة BOEC في أيام 7-14 لظهور المستعمرات ثمرة. تحديد المستعمرات كمجموعات دائرية من الخلايا اظهار مورفولوجيا الحصوه البطانية الكلاسيكية.
  3. مرة واحدة يتم تحديد مستعمرة أو مستعمرات متعددة في قارورة، تواصل مع التغييرات المتوسطة والسماح المستعمرات ليصل إلى ما يقرب من 1000 حتي 2000 خلية لكل مستعمرة قبل الركض. تحديد عدد الخلايا في مستعمرة من خلال تقدير البصري الخام.
    ملاحظة: كدليل، فمن المعتاد أن مرور المستعمرات ثمرة الأولية بعد أسبوع من تحديد أول مستعمرة ثمرة.
    4. <لى> خلايا الممر من قبل الشطف القوارير مرتين مع 10 مل من DPBS. إضافة 5 مل من 1X التربسين-EDTA واحتضان في الحاضنة 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. بعد 5 دقائق، تحييد التربسين مع 10 مل من المتوسط ​​(التي تحتوي على FBS) وجلب الخلايا في تعليق مع pipetting لالمتكررة.
  4. تعليق الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 5 دقائق، resuspend في 15 مل من الجيل BOEC الطازجة المتوسطة وصفيحة تعليق خلية بأكمله في جديدة T-75 قارورة (التي تمثل الممر 1، P1). مطلوب أي طلاء الكولاجين.
  5. مواصلة التغييرات المتوسطة كما هو موضح أعلاه حتى الخلايا هي متكدسة (حوالي 3-5 × 10 6 خلايا في قارورة). مرة واحدة متموجة، خلايا مرور كما هو موضح في الخطوة 4.3.
    ملاحظة: من مرور 2 فصاعدا، والخلايا لم تعد تتطلب جيل BOEC المتوسطة ويمكن تربيتها في البطانية المتوسطة نمو الخلايا و10٪ معيار الحرارة المعطل FBS. الكولاجين طلاء يمكن أن تستخدم خطوة اختيارية للمضي قدما، كما أن هناك أدلة تشير إلى أن وجود الكولاجين يمكن أن تعزز مؤيد للBOECأسعار أوجه.
  6. لاستمرار الركض، لوحة لا يقل عن 750،000 الخلايا في T-75 قارورة كما يمكن أن كثافة الخلية منخفضة تتسبب في BOECs لوقف تكاثر.

5. تجميد والثقافات ذوبان BOEC

  1. يعرض للتريبسين الخلايا كما هو موضح في القسم 4.3 وأجهزة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 5 دقائق. نضح في وطاف resuspend في 10 مل من المتوسط. هذا لا يتطلب البطانية المتوسطة نمو الخلايا. سوف DMEM مع FBS القياسية 10٪ تكون كافية. جمع عينة 10 ميكرولتر من تعليق خلية لإجراء تعداد خلايا اليدوي باستخدام haemocytometer.
  2. الطرد المركزي مرة أخرى و resuspend في الخلايا 2x10 6 / مل في الجليد الباردة المتوسطة الحفظ بالتبريد (40٪ DMEM مع 50٪ FBS و 10٪ DMSO). إضافة 0.5 مل (10 6 خلايا) إلى كل قارورة، قارورة مكان في الجليد الباردة الأيزوبروبانول سفينة الحفظ بالتبريد وضعها في الفريزر -80 درجة مئوية لمدة 2 ساعة على الأقل قبل أن ينتقل إلى النيتروجين السائل. لا تترك الخلايا في -80 درجة مئوية لمدة أكثر من 24 ساعة.
  3. لذوبان الجليد الخلايا، إضافة 10 مل من المتوسط ​​قبل تحسنت إلى 15 مل المخروطية أنبوب الطرد المركزي.
    ملاحظة: عندما يذوب من مرور 1 الخلايا، ذوبان الجليد في البطانية المتوسطة نمو الخلايا تستكمل مع 20٪ تعريف FBS ل 2 أيام الأولى بعد الذوبان. وهذا يؤدي إلى العزلة الخلية أكثر استقرارا للمضي قدما.
  4. إزالة الخلايا من النيتروجين السائل وذوبان الجليد في 37 ° C حمام الماء مع الإثارة لطيف حتى لا يتبقى سوى الكريستال الجليد الصغيرة في القارورة. إضافة محتويات القارورة قطرة من الحكمة لأنبوب الطرد المركزي مخروطي الشكل وتدور باستمرار في 300 x ج لمدة 5 دقائق.
  5. طاف نضح و resuspend الخلية بيليه في 10 مل EGM-2MV + 10٪ FBS. إضافة إلى T-75 قارورة وأعلى حتى المتوسطة إلى 15 مل.

6. توصيف BOECs بواسطة التدفق الخلوي

  1. مرة واحدة وقد تم السماح للمستعمرات BOEC هو موضح في القسم 4 في التوسع، ويعرض للتريبسين الخلايا كما هو موضح في القسم 4.4 و resuspend بتركيز 10 6 خلايا لكل مل العازلة تلطيخ (DPBS الطرافةح 2٪ FBS و 2 ملي EDTA).
  2. الجمع بين 10 5 الخلايا مع الأجسام المضادة تألقي مترافق الموجهة ضد CD45، CD14، CD34، CD31 (استخدام جميع في 01:20 تمييع) أو VEGFR2 (تمييع 01:10) (انظر الجدول 1 للاطلاع على التفاصيل كاملة). احتضان لمدة 30 دقيقة على 4 درجات مئوية في الظلام.
  3. غسل الخلايا مع 1 مل تلطيخ العازلة وأجهزة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 5 دقائق. طاف نضح و resuspend في 400 ميكرولتر العازلة تلطيخ للتحليل. إبقاء الخلايا في 4 درجات مئوية، ومحمية من الضوء قبل التحليل.
  4. إجراء تحليل cytometric على الكريات مجهزة للكشف عن الأجسام المضادة مترافق fluorescently المستخدمة في الفحص.
  5. استخدام عينة BOEC غير ملوثين لتحديد السكان الخلية على الكريات عن طريق ضبط الفولتية إلى الأمام والجانب مبعثر، وكذلك الفولتية للقنوات FITC وAPC.
  6. تحديد النابضة عتبات استخدام الخلايا نمط إسوي الملون لكل تألقي. تقييم الإيجابية لكل علامة سطح الخلية على أساس presenc(ه) تحولا الذروة في كثافة مضان مقابل isotype السيطرة لتألقي يجري تحليلها.

7. توصيف BOECs بواسطة مناعي المجهر

  1. BOECs وحة في جيدا 24، مسطحة القاع لوحة زراعة الأنسجة دون coverslips في كثافة 5 × 10 4 خلايا في 500 ميكرولتر من البطانية المتوسطة نمو الخلايا + 10٪ FBS لكل بئر وترك على الالتزام وينمو بمعدل 37 المعطل الحرارة ° C، 5٪ CO 2 حتى الخلايا تغطي 70-80٪ على الأقل من مساحة سطح كل بئر (تقديرات confluency عن طريق التفتيش البصري تحت microsope الخفيفة).
  2. غسل الخلايا في كل بئر لمدة 5 دقائق مع 1 مل من DPBS.
  3. إصلاح الخلايا O / N عند 4 درجات مئوية مع 500 ميكرولتر من 4٪ محلول امتصاص العرق في DPBS.
  4. غسل الخلايا لمدة 3 × 5 دقائق مع 1 مل من DPBS لكل بئر. إضافة وإزالة DPBS باستخدام ماصة والشافطة، على التوالي.
  5. Permeabilize الخلايا لمدة 3 × 10 دقيقة مع 0.2٪ بوليسوربات 20 في DPBS.
  6. احتضان الخلايا لمدة 1 ساعة على RT في عرقلة العازلة التي تحتوي على 10٪ FBS في DPBS.
  7. خلايا وصمة عار في 4 درجات CO / N في 300 ميكرولتر من العازلة الضد التخفيف (0.1٪ ألبومين المصل البقري في DPBS) التي تحتوي على الأجسام المضادة الأولية الموجهة ضد CD34 (10 ميكروغرام / مل)، CD144 (1: 300) أو VWF (1: 250) . انظر الجدول رقم 1 للحصول على التفاصيل كاملة.
  8. يغسل الأجسام المضادة الأولية غير منضم لمدة 5 × 10 دقيقة مع DPBS.
  9. احتضان الخلايا لمدة 1 ساعة على RT مع الأجسام المضادة الثانوية fluorescently المسمى المناسب، كما هو مفصل في الجدول 1 (في كل 1: 200).
  10. يغسل الأجسام المضادة الثانوية غير منضم لمدة 5 × 10 دقيقة مع DPBS.
  11. احتضان الخلايا مع 1 ميكروغرام / مل 4، 6-diamidino-2-phenylindole (دابي) في DPBS لمدة 10 دقيقة في RT.
  12. غسل الخلايا مع DPBS ل3 × 5 دقيقة أخرى.
  13. خلايا الصورة في التكبير 100X باستخدام مجهر مقلوب مجهزة مصدر ضوء خارجي لمضان الإثارة، والتقاط الصور باستخدام إرفاقكاميرا رقمية إد لتحليلها لاحقا دون اتصال.

8. التجميد والذوبان PBMNCs

  1. في نهاية المرحلة 3.2 بعد الطرد المركزي، ونضح المتوسطة وتعطيل بيليه الخلية مع pipetting لتكرار صعودا وهبوطا باستخدام طرف P1000 ماصة يدويا. إضافة 1 مل من تجميد المتوسطة، و 90٪ مصل و 10٪ DMSO، مع التأكد من المزيج برفق لإنتاج تعليق خلية. نقل تعليق خلية إلى cryovial وتجميد والذوبان كما هو موضح في القسم 5.

النتائج

عزل الشهباء الخلايا وحيدة النواة معطف من 60 مل من الدم وعادة ما ينتج 100-150x10 6 مجموع خلايا الدم البيضاء. عندما مطلي في واحدة T-75 قارورة، وعدد كبير من الخلايا في تعليق خلية unlysed يجعل من الصعب حل الخلايا الملتصقة الفردية باستخدام brightfield المجهري. تغييرات المتوسطة المتكررة تؤدي إلى إزالة الخلايا غير ملتصقة وتسمح لتصور من السكان ملتصقة من وحيدي "في وقت مبكر" EPCS. في يوم 7، سوف تحتوي على T-75 حوالي 7x10 6 من هذه الخلايا الملتصقة ممدود. من يوم 7-14، يجب أن تظهر مستعمرات BOECs داخل قارورة (الشكل 2A). لأول مرة تظهر المستعمرات كما 3-5 الخلايا المجاورة. عدد مستعمرة ثمرة يمكن أن تختلف 1-10 المستعمرات في 60 مل من الدم. عموما، والجهات المانحة الأصغر سنا (أي 20-25 سنة) تميل إلى إنتاج عدد أكبر من المستعمرات ثمرة، والتي تظهر أيضا في الثقافة في وقت سابق.BOECs تتكاثر من هذه المجموعة المركزية من الخلايا لتشكل مستعمرات دائرية تتكون من عدة مئات من الخلايا. الخلايا داخل هذه المستعمرات يحمل مورفولوجيا الحصوه البطانية الكلاسيكية.

فمن الأفضل أن مرور المستعمرات الأولية عندما كانت تحتوي على حوالي 1000 خلية لكل مستعمرة. وعادة ما تصل المستعمرات ثمرة هذا الحجم بعد 7 أيام المظهر الأصلي في الثقافة. مرة واحدة و passaged المستعمرات الأصلية في جديدة T-75 قارورة، ينبغي لها أن تتكاثر لتشكيل أحادي الطبقة متموجة (3-5x10 6 خلايا في قارورة) خلال 5 أيام أو أقل (الشكل 2B). في نسبة صغيرة من العزلة (<10٪)، تفشل المستعمرات ثمرة لتظهر أو لا تتكاثر بما فيه الكفاية بعد هذه الخطوة الركض الأولية. BOECs التي تظهر انخفاض انتشار بعد أول الركض بها نادرا ما تستمر لتصبح العزلة BOEC مستقرة، وكثيرا ما وقف المتكاثرة في غضون شهرين إلى ثلاثة مقاطع. وحيديEPCS الأولى الواردة في الثقافات BOEC غير قابلة للالتكاثري وعادة ما يتم تطهيرها من الثقافات في غضون 1-2 الممرات. هو إزالة هذه الخلايا في وقت مبكر يرجع إلى موت الخلايا، فشل الخلايا الأولى لإعادة الالتزام بعد الركض والتخفيف من EPCS غير التكاثري في وقت مبكر مع الركض المتكرر.

إما أن مرور 1 الخلايا يتم passaged كذلك في الثقافة أو تجميد أسفل لاستخدامها لاحقا. مرة واحدة يتم إنشاء العزلة مستقرة، والخلايا يمكن passaged بمعدل 1 متكدسة قارورة إلى 3-5 جديدة T-75 قوارير حتى مرور 8 أو 9 قبل أن يصبح هادئة. مرة أخرى، كثافة الخلية هي الحاسمة في جميع أنحاء الثقافة. في تجربتنا، ينبغي مطلي ما لا يقل عن 750،000 الخلايا في T-75 قارورة، وأقل كثافة الخلية يمكن أن يسبب توقف نمو. وعلى الرغم من إمكانية التكاثري عالية من BOECs، وينبغي أيضا عدم السماح الخلايا لتصبح overconfluent (أي.،> 5X10 6 خلايا في قارورة) وهذا يمكن أن يسبب CONVERS أيون من BOECs إلى النمط الظاهري غير التكاثري.

ونقترح أن أي خلية وصفها بأنها ينبغي أن BOEC عرض سطح الخلية المناسب وتلطيخ الخلايا البطانية للعلامات. لا يمكن أن يتحقق توصيف BOECs التدفق الخلوي (الشكل 3) أو المجهري مضان (الشكل 4)، وبعد تلطيخ لعلامات الخلايا البطانية نموذجية. BOECs إيجابية لCD31 علامات سطح البطانية وVEGFR2 وهي سلبية للCD14 الوحيدات علامة وعموم الكريات البيض علامة CD45. كما posess BOECs الهيئات ويبل-بالادي وبالتالي التعبير عن عامل فون ويلبراند (VWF) كما منفصلة، ​​وتلطيخ حشوية منقط. خلافا لغيرها من أنواع الخلايا البطانية ناضجة، مثل الشريان الرئوي أو الخلايا البطانية الأورطي، BOECs أيضا أن أعرب عن السلف وتفعيل علامة CD34 على سطحها.

ftp_upload / 53384 / 53384fig1.jpg "/>
الشكل 1. رسم تخطيطي من BOEC بروتوكول جيل. يتم عزل الخلايا وحيدة النواة في الدم المحيطي من الدم الوريدي قبل التدرج الكثافة الطرد المركزي ومثقف على لوحات المغلفة الكولاجين في البطانية المتوسطة النمو التي تحتوي على تعريف FBS. تظهر المستعمرات BOEC في غضون 7-14 أيام للثقافة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-1
الشكل 2. صور Brightfield الثقافات BOEC التمثيلية. (A) تظهر المستعمرات ثمرة في الثقافات بين أيام 7 و 14. المستعمرات الحالية إلى مجموعات من الخلايا مثل الخلايا البطانية، التي يتم ترتيبها في أحادي الطبقة المرصوفة بالحصى وتتكاثر شعاعيا الخروج من نقطة مركزية. المحيطة المستعمرات ثمرة هي أحادية تمسكاإختر التصميم الخلايا التي تشكل الغالبية العظمى من الخلايا في الحضارات القديمة. هذه الخلايا، التي سبق وصفها بأنها "في وقت مبكر" الخلايا الاصلية البطانية، لديها التشكل مثل مغزل والتعبير عن علامة CD14 الوحيدات. (B) وبعد الركض، وBOECs التكاثري للغاية تولي الثقافات، والخلايا الوحيدات غير التكاثري إما تموت أو تفشل في إعادة نعلق بعد الركض. مقياس شريط 250μm. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-2
الشكل 3. توصيف BOECs التدفق الخلوي. تم trypsinized BOECs وملطخة الأجسام المضادة isotype السيطرة fluorescently مترافق (الرمادي شغل الذروة) أو الأجسام المضادة الموجهة ضد علامات سطح معينة (خط أحمر). علامات سطح لتوصيف cytometricوتشمل العلامات المكونة للدم CD45 CD14 و، علامات البطانية CD31 وVEGFR2 وprogentior والبطانية تنشيط علامة CD34. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-3
الرقم 4. مناعي تلطيخ BOECs للعلامات الخلايا البطانية. الصور المناعي التمثيلية للBOECs immunostained مع الأجسام المضادة الموجهة ضد البطانية علامة سطح الخلية CD144 (VE كادهيرين، أعلى اللوحة اليمنى) وبروتين سكري الدم عامل فون ويلبراند (VWF، لوحة اليمنى السفلى) . وأظهرت المقابلة لوحات تبين تلطيخ دابي النووي إلى اليسار. مقياس شريط 50μm. لCD144. الرجاء انقر هنا لعرض أكبرنسخة من هذا الرقم.

المناقشة

نقدم بروتوكولا مفصلا يسمح بالاشتقاق القوي والفعال ل BOECs من خلايا الدم أحادية النواة المحيطية البالغة (PBMNCs). يتضمن بروتوكولنا تحسينين مهمين يمثلان تقدما في الطرق السابقة لعزل BOEC. 14-16 وتشمل هذه عدم وجود الهيبارين في وسط ثقافة PBMNC الأولي واستخدام مصل محدد ومؤهل للخلايا الجذعية الجنينية. هذا التنقيح الأخير له أهمية خاصة. المصل المؤهل للخلايا الجذعية الجنينية (ESC) هو درجة أكثر اتساقا من المصل ، وعلى الرغم من أنه من غير المعروف حتى الآن ما هي المكونات (المكونات) المخصب المخصب التي تفيد عزل BOEC ، إلا أن تأثير هذا المصل المحدد على كفاءة توليد BOEC واضح في أيدينا. بالإضافة إلى ذلك ، حققنا أيضا نجاحا في عزل BOECs باستخدام المصل البشري ، مما يسمح بتوليد BOECs للترجمة السريرية. في أيدينا ، ينتج عن هذا البروتوكول المكرر العزل الناجح لمزارع BOEC المستقرة عن أكثر من 90٪ من المتبرعين ، مما يجعلها واحدة من أكثر طرق توليد BOEC موثوقية التي تم الإبلاغ عنها حتى الآن. على الرغم من أن استخدام مصل معين أمر بالغ الأهمية لتوليد BOEC ، إلا أنه يمثل أيضا قيدا أساسيا للبروتوكول الحالي. يمكن أن تشمل التحسينات المستقبلية على هذه التقنية توليد هذه الخلايا في ظروف ثقافة محددة خالية من المصل.

تشمل الخطوات الحاسمة في البروتوكول معالجة عينات الدم في أسرع وقت ممكن بعد جمعها ، والحصاد الكامل لخلايا الطبقة المصفرة بعد الطرد المركزي المتدرج الكثافة وتمرير المستعمرات الأولية في الوقت المناسب من P0 إلى P1. هذه الخطوة العابرة حاسمة لإقامة عزلة مستقرة. مثل الخلايا البطانية الأخرى ، يبدو أن BOECs حساسة جدا لكثافة الطلاء. إذا كانت كثافة الطلاء بعد المرور منخفضة جدا ، فلن تتكاثر BOECs. على العكس من ذلك ، إذا سمح للمستعمرات بأن تصبح مفرطة في التقارب قبل المرور ، فستتوقف الخلايا أيضا عن التكاثر وتميل إلى التحول إلى نمط ظاهري ممدود للخلية الوسيطة. إذا ظهرت بعض المستعمرات من الأيام 7 إلى 14 ، أو إذا كانت المستعمرات صغيرة الحجم ، يمكن أن يشمل استكشاف الأخطاء وإصلاحها زيادة كثافة الخلايا عن طريق تمرير مستعمرات P0 إلى قارورة T-25 بدلا من T-75.

بمجرد إتقان التقنية ، يمكن استخدام BOECs الناتجة في العديد من التطبيقات ، بما في ذلك الدراسات في المختبر لبيولوجيا الخلايا البطانية ، ونمذجة الأمراض وفحص الأدوية ، وكذلك علاجات زرع الخلايا في الجسم الحي . أحد الاعتبارات المهمة لتطوير أي عملية علاج بالخلايا هو استخدام الخلايا الخالية من الطفرات المسببة للأمراض. لقد أظهرنا سابقا أن BOECs المعزولة باستخدام بروتوكولنا تمتلك جينومات خالية من اختلافات عدد النسخ وبالتالي فهي تمثل الفرد الذي تم جمعها منه. بالإضافة, وقد أثبتنا أيضا أن غالبية خطوط iPSC المشتقة من BOEC خالية من اختلافات رقم النسخ. 13 هذا يتناقض مع التقارير السابقة عن تباين رقم النسخ في iPSCs المشتقة من الخلايا الليفية. حتى الآن, لا تزال هذه الخلايا iPSCs الوحيدة التي تم الإبلاغ عن هذه الدرجة من الإخلاص الجيني. هذه الميزة مهمة لمجال علم الأحياء iPSC واستخدام iPSCs في نمذجة الأمراض, فحص المخدرات وعلاجات زرع الخلايا في المستقبل.

الإفصاحات

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

تم دعم هذا العمل من خلال المنح الممولة من مؤسسة القلب البريطانية (BHF) ، و Dinosaur Trust ، ومؤسسة McAlpine Foundation ، و Fondation Leducq ، و Fight for Sight ، ومركز كامبريدج للأبحاث الطبية الحيوية ، والمعهد الوطني للبحوث الصحية بما في ذلك (i) مركز BHF Oxbridge للطب التجديدي [RM / 13/3/30159] ، (ii) مركز BHF Cambridge للتميز البحثي ، (iii) مستشفى Addenbrooke ، ومستشفيات جامعة كامبريدج NHS Foundation Trust و (iv) مستشفى بابوورث NHS Foundation Trust ، ودعم مركز كامبريدج NIHR BRC Cell Phenotyping Hub. يتم تمويل MLO من قبل زمالة BHF المتوسطة. يتم تمويل FNK من قبل BHF PhD Studentship.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
<قوي>لجمع الدم< / قوي>
60 مل حقنة بطرف لويرBD309653
19G Surflo Winged Infusion SetTerumoSV-19BL
50 مل أنبوب الطرد المركزي المخروطيStarLabE14502 لكل متبرع
سترات الصوديومMartindale Pharmaceuticals270541
nameCompany Catalog NumberComments
For buffy coat isolation
Ficoll-Paque PlusGE Healthcare17-1440-03
Dulbecco' s PBS (بدون Ca2 + < / sup> و Mg2 + < / sup>)Sigma-AldrichD8537
ماصات نقل بلاستيكية ملفوفةمعقمة Appleton WoodsKC231
Turk ' s الحلMillipore1.093E + 09
Name< / strong>Company Catalog NumberComments
لزراعة الخلايا وتمرير الخلايا < / قوي >
النوع 1 كولاجين (مشتق من ذيل الفئران)BD Biosciences35-4236
دولبيكو s PBS (بدون Ca2 + < / sup> و Mg2 + < / sup>)Sigma-AldrichD8537
0.02M حمض الخليك   ؛Sigma-AldrichA6283المحضرة في كاشف الماء
الصف Endothelial Growth Medium-2MV
(تحتوي على Bullet Kit ، ولكن ليس مصل)		LonzaCC-3202ملاحظة: < / قوي> من الضروري ألا يحتوي الوسيط على الهيبارين.  
لا تستخدم< / قوي> EGM-2.
مصل الأبقار الجنينية (الولايات المتحدة) ، تعريفHycloneSH30070
10x Trypsin EDTAGibcoT4174تمييع إلى 1x في PBS قبل الاستخدام
معطل بالحرارة FBSGibco10500-064
DMEMGibco41965-039
DMSOSigma-Aldrich276855
Nalgene Mr. Frosty Frozen ContainerSigma-AldrichC1562
NameCompanyCatalog NumberComments
for تدفق التوصيف الخلوي
FITC المترافق للفأر المضاد للإنسان CD14BD Biosciences555397الماوس IgG 1< / sub>k ، الاستنساخ: WM59
التخفيف: 1:20
فأر مترافق FITC مضاد للإنسان CD31BD Biosciences555445Mouse IgG 1< / sub>k ، استنساخ: WM59
التخفيف: 1:20
ماوس مترافق APC مضاد للإنسان CD34BD Biosciences555824ماوس IgG 1 < / sub >k ، استنساخ: 581 / CD34
التخفيف: 1:20
فأر مترافق FITC مضاد للإنسان CD45BD Biosciences560976ماوس IgG 1< / sub>k ، استنساخ: HI30
التخفيف: 1:20
& nbsp ؛ ماوس مترافق APC مضاد للإنسان VEGFR2R & D SystemsFAB357Aالماوس IgG 1 < / sub > ، الاستنساخ: 89106
التخفيف: 1:10
الماوس المترافق FITC IgG 1 < / sub>k التحكم في النمط المتشاويBD Biosciences555748استنساخ: MOPC-21
التخفيف: 1:20
الماوس المترافق APC IgG 1k < / sub > التحكم في النمط المتقاربBD Biosciences555751استنساخ: MOPC-21
التخفيف: 1:20
الماوس المترافق APC IgG 1k < / sub > التحكم في النمط المتشاحيR & D SystemsIC002A
التخفيف: 1:10		استنساخ: 11711
EDTA, 0.5M حلSigma-AldrichE7889
NameCompanyCatalog NumberComments
for immunofluorescent المجهري  < / قوي >
Corning Costar 24 بئر لوحة زراعة الأنسجةسيجما ألدريتشCLS3527
بارافورمالدهايدسيجما ألدريتش158127
BSAسيجما ألدريتشA7906
بولي سوربات 20سيجما ألدريتشP2287
فأر أحادي النسيلة مضاد للجسم المضاد للإنسان CD34R & D SystemsMAB72271استنساخ 756510 ، IgG 1< / sub > ، تستخدم في 10 & mu ؛ جم / مل
الماعز متعدد النسيلة المضادة للإنسان VE-cadherin (CD144) R& D SystemsAF938Antigen Affinity- IgG المنقى ، استخدم في 1: 300
أرنب أحادي النسيلة مضاد للإنسان Von Willebrand Factor (vWF) Abcamab154193Clone EPSISR15 ، استخدم في 1: 250
الحمار المضاد للفأر IgG (H + L) الجسم المضاد الثانوي ، Alexa Fluor 488 المترافقLife TechnologiesA-21202متعدد النسيلة ، 2 مجم / مل ، استخدم عند 1: 200
الحمار المضاد المضاد IgG (H + L) ، Alexa Fluor 488 المترافقLife TechnologiesA-11055متعدد النسيلة ، 2 مجم / مل ، 1: 200
الحمار المضاد IgG (H + L) الجسم المضاد الثانوي ، Alexa Fluor 568 المترافقLife TechnologiesA-10042متعدد النسيلة ،   ؛ 2 مجم / مل ، 1: 200
DAPI (4 & prime ؛ 6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride)استخدام Sigma-AldrichD9542عند 1 & mu ؛ جم / مل
لوك

المراجع

  1. Yancopoulos, G. D., Klagsbrun, M., Folkman, J. Vasculogenesis, angiogenesis, and growth factors: ephrins enter the fray at the border. Cell. 93, 661-664 (1998).
  2. Flamme, I., Frölich, T., Risau, W. Molecular mechanisms of vasculogenesis and embryonic angiogenesis. J Cell Physiol. 173, 206-210 (1997).
  3. Asahara, T., et al. Isolation of putative progenitor endothelial cells for angiogenesis. Science. 275, 964-967 (1997).
  4. Shi, Q., et al. Evidence for circulating bone marrow-derived endothelial cells. Blood. 92, 362-367 (1998).
  5. Ormiston, M. L., Deng, Y., Stewart, D. J., Courtman, D. W. Innate immunity in the therapeutic actions of endothelial progenitor cells in pulmonary hypertension. Am J Respir Cell Mol Biol. 43, 546-554 (2010).
  6. Hur, J., et al. Characterization of two types of endothelial progenitor cells and their different contributions to neovasculogenesis. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 24, 288-293 (2004).
  7. Lin, Y., Weisdorf, D. J., Solovey, A., Hebbel, R. P. Origins of circulating endothelial cells and endothelial outgrowth from blood. J Clin Invest. 105, 71-77 (2000).
  8. Yoder, M. C., et al. Redefining endothelial progenitor cells via clonal analysis and hematopoietic stem/progenitor cell principals. Blood. 109, 1801-1809 (2007).
  9. Toshner, M., et al. Transcript analysis reveals a specific HOX signature associated with positional identity of human endothelial cells. PLOS ONE. 9, e91334(2014).
  10. Toshner, M., et al. Evidence of dysfunction of endothelial progenitors in pulmonary arterial hypertension. Am J Respir Crit Care Med. 180, 780-787 (2009).
  11. Wang, J. W., et al. Analysis of the storage and secretion of von Willebrand factor in blood outgrowth endothelial cells derived from patients with von Willebrand disease. Blood. 121, 2762-2772 (2013).
  12. O'Neill, C. L., et al. Therapeutic revascularisation of ischaemic tissue: the opportunities and challenges for therapy using vascular stem/progenitor cells. Stem Cell Res & Ther. 3, 31(2012).
  13. Geti, I., et al. A Practical and Efficient Cellular Substrate for the Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Adults: Blood-Derived Endothelial Progenitor Cells. Stem Cells TM. 1, 855-865 (2012).
  14. Prasain, N., Meador, J. L., Yoder, M. C. Phenotypic and functional characterization of endothelial colony forming cells derived from human umbilical cord blood. Journal of Vis Exp: JoVE. , (2012).
  15. Martin-Ramirez, J., Hofman, M., van den Biggelaar, M., Hebbel, R. P., Voorberg, J. Establishment of outgrowth endothelial cells from peripheral blood. Nat Prot. 7, 1709-1715 (2012).
  16. Hofmann, N. A., Reinisch, A., Strunk, D. Isolation and large scale expansion of adult human endothelial colony forming progenitor cells. Journal of Vis Exp: JoVE. , (2009).

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

عزل الدم المحيطيالطرد المركزي بتدرج الكثافةطلاء الكولاجينوسط توليد الخلايا البطانية المشتقة من الدمبروتوكول زراعة الخلايامؤشرات الخلايا البطانيةالتألق المناعي لـ CD144تلوين عامل فون ويلبراندطريقة الحفظ بالتجميد
جيل وثقافة الدم ثمرة غشائي خلايا من الدم المحيطي الإنسان
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.