مقالة منهجية

قياس درجة الحموضة يبلوع التي كتبها Ratiometric المجهر مضان

DOI:

10.3791/53402

⸱

ديسمبر 7, 2015

 ,  , 
1Department of Cellular Physiology and Metabolism, University of Geneva

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يؤثر الرقم الهيدروجيني البلعمي على نضوج البلعمة ، وإنتاج المؤكسدات ، والقتل البلعمي بالإضافة إلى عرض المستضد. نصف هنا طريقة القياس النسبي لقياس تغيرات الأس الهيدروجيني في المسار الزمني ونقطة النهاية في البلعمات الفردية في الخلايا البلعمية الحية باستخدام الفحص المجهري الفلوري.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

البلعمة هي عملية أساسية من خلالها الخلايا المناعية الفطرية تبتلع البكتيريا والخلايا أفكارك أو الجسيمات الأجنبية الأخرى من أجل قتل أو تحييد المواد المبتلعة، أو تقديمه كمستضدات والشروع في الاستجابات المناعية التكيفية. الرقم الهيدروجيني للphagosomes معلمة الحرجة التي تنظم الانشطار أو الاندماج مع endomembranes وتفعيل الانزيمات المحللة للبروتين، والأحداث التي تسمح للفجوة أكلة إلى أن تنضج في عضية الهادمة. بالإضافة إلى ذلك، هناك حاجة النبات من H + لإنتاج مستويات عالية من أنواع الاكسجين التفاعلية (ROS)، التي تعتبر ضرورية لقتل كفاءة ويشير إلى الأنسجة المضيفة الأخرى. العديد من مسببات الأمراض داخل الخلايا البلعمية تخريب قتل عن طريق الحد من phagosomal تحمض، وتسليط الضوء على أهمية درجة الحموضة في يبلوع علم الأحياء. نحن هنا تصف طريقة ratiometric لقياس درجة الحموضة phagosomal في العدلات باستخدام ثيوسيانات فلوريسئين (FITC) -labeled زيموزان كما أكلة TARGخدمات الاختبارات التربوية، والتصوير الخلية الحية. ويستند هذا الفحص على خصائص مضان FITC، التي تطفئ بواسطة الرقم الهيدروجيني الحمضية عندما متحمس في 490 نانومتر ولكن ليس عندما متحمس في 440 نانومتر، مما يتيح التقدير الكمي لنسبة تعتمد على درجة الحموضة، بدلا من مضان المطلق، من صبغة واحدة. وتقدم أيضا بروتوكول مفصلة لأداء الموقع صبغ المعايرة وتحويل النسبة إلى قيم الرقم الهيدروجيني حقيقية في. تعتبر الطرق ratiometric واحد صبغ عموما متفوقة على الطول الموجي واحد أو بروتوكولات الزائفة ratiometric ثنائي الصبغة، لأنها أقل حساسية للاضطرابات مثل تبيض، والتركيز التغييرات، والاختلافات الليزر، ووضع العلامات متفاوتا، التي تشوه الإشارة المقاسة. هذه الطريقة يمكن تعديلها بسهولة لقياس درجة الحموضة في غيرها من أنواع الخلايا البلعمية، وزيموزان يمكن الاستعاضة عن أي الجسيمات التي تحتوي على الأمينات الأخرى، من حبات الخاملة إلى الكائنات الحية المجهرية. وأخيرا، وهذه الطريقة يمكن تكييفها للاستفادة من تحقيقات الفلورسنت أخرى حساسة لدرجة الحموضة نطاقات مختلفة أو phagosom الآخرأنشطة القاعدة ويجعل من بروتوكول المعمم للتصوير وظيفي من phagosomes.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

البلعمة ، العملية التي تبتلع من خلالها الخلايا المناعية الفطرية الجزيئات الكبيرة ، تطورت من آلية أكل الكائنات وحيدة الخلية ، وتتضمن الارتباط بالهدف ، وتغليفه بغشاء وقرص الغشاء لتشكيل فجوة داخل العصارة الخلوية تسمى البلعمة. في حين أن الغشاء البلعمي مشتق من غشاء البلازما ، فإن فرز البروتين النشط والدهون ، بالإضافة إلى الاندماج مع الأغشية الداخلية أثناء تكوين البلعمة ، يحول البلعمة إلى عضية مميزة داخل الخلية ذات خصائص تحلل تسمح بقتل وتحييد وتكسير المادة المبتلعة1-3. تعتمد هذه العملية ، التي تسمى النضج البلعمي ، على توصيل مجموعة من الإنزيمات المحللة للبروتين ومبيدات الميكروبات ، بما في ذلك أوكسيديز فوسفات الأدينين ثنائي النوكليوتيد (NADPH) الذي ينقل الإلكترونات إلى البلعمات التي تنتج المؤكسد القوي O2- وأنواع الأكسجين التفاعلية المشتقة (ROS) 2،4.

الأس الهيدروجيني اللمعي للبلعمات له تأثير عميق على العديد من الأحداث المطلوبة لوظيفة البلعمة. أولا ، يؤثر الرقم الهيدروجيني على تهريب الأغشية الداخلية بشكل عام ، حيث أن التغييرات التوافقية المعتمدة على الأس الهيدروجيني لمنظمات الاتجار عبر الغشاء تغير تجنيد محددات الاتجار مثل Arfs و Rabs وبروتينات الغلاف الحويصلية ، والتي بدورها تحدد الحويصلات التي قد تندمج مع البلعمات 5-8. ثانيا ، يتم أيضا تحويل التركيب الأيوني للتجويف البلعمي مع نضوج البلعمات ، وتعتمد بعض الناقلات الأيونية ، مثل مبادل Na + / H + أو مضادات الحمل من عائلة ClC Cl- / H + ، والتي تعزز وظيفة البلعمة ، على H + الانتقال 9،10. وبالمثل ، يرتبط إنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية ارتباطا وثيقا بدرجة الحموضة البلعمة. لطالما تم التعرف على ROS ومنتجاته الثانوية المؤكسدة السامة على أنها حاسمة لقتل البلعمة في العدلات 4،11،12 ، وقد ثبت أنها تلعب أدوارا حاسمة في الخلايا البلعمية الأخرى بما في ذلك البلاعم والخلايا المتغصنة (DCs) والأميبا 13-16. أوكسيديز NADPH هو إنزيم إلكترولجيني يطلق H + في العصارة الخلوية أثناء استهلاك NADPH ، وهذا يتطلب النقل المتزامن ل H + من خلال قنوات HVCN1 المصاحبة جنبا إلى جنب مع الإلكترونات المنقولة إلى تجويف البلعمة ، من أجل التخفيف من إزالة الاستقطاب الهائل الذي من شأنه أن يؤدي إلى التثبيط الذاتي للإنزيم 17-21. أخيرا ، تتمتع العديد من الإنزيمات المحللة للبروتين بنشاط مثالي عند درجة حموضة مختلفة ، لذلك يمكن أن تؤثر تغيرات الأس الهيدروجيني البلعمي المعتمدة على الوقت على الإنزيمات النشطة ومتى. يتم تسليط الضوء على أهمية الأس الهيدروجيني البلعمي من خلال الكائنات الحية مثل المتفطرة السلية و Franciscella tularensis و Salmonella typherium التي تخرب قتل البلعمة على الأقل جزئيا عن طريق تغيير درجة الحموضة البلعمية 22-24.

في الثدييات ، تكون الخلايا البلعمية الرئيسية هي العدلات والضامة والخلايا المتغصنة ، واعتمادا على نوع الخلية ، يمكن أن تختلف تغيرات الأس الهيدروجيني البلعمي المعتمدة على الوقت على نطاق واسع ، ويبدو أنها تلعب أدوارا مختلفة. في البلاعم ، يعد التحمض القوي والسريع بوساطة مضخة البروتون المعتمدة على ATP ، وهو أحد العوامل الرئيسية التي تتوسط في قتل 25-27 ، تشبه الآليات الموجودة في الأميبا التي تستخدم البلعمة كآلية لتناول الطعام 28. في هذه الخلايا ، يعتقد أن تنشيط البروتياز الحمضي يلعب دورا رئيسيا. في المقابل ، يعتمد قتل العدلات بشكل أكبر على ROS بالإضافة إلى HOCl الذي ينتجه مايلوبيروكسيداز (MPO) 11 ، ويظل الرقم الهيدروجيني محايدا أو قلويا خلال أول 30 دقيقة تحمض فقط في وقت لاحق 29،30. تم اقتراح الأس الهيدروجيني المحايد لصالح نشاط البروتياز المؤكسد مثل بعض الكاثيبسينات. في DCs ، يكون الرقم الهيدروجيني البلعمي مثيرا للجدل ، حيث أبلغ البعض عن تحمض والبعض الآخر الرقم الهيدروجيني المحايد أو القلوي 31،32 ، لكن ROS و pH قد يؤثران بشكل عميق على قدرة هذه الخلايا على تقديم مستضدات للخلايا التائية ، وهي إحدى وظائفها الرئيسية 33.

الأهم من ذلك ، أن الهرمونات والكيموكينات والسيتوكينات قد تنتج أحداث إشارات تحفز النضج والتغيرات في سلوك الخلايا البلعمية ، وبالتالي تؤثر على الرقم الهيدروجيني البلعمي 34،35. وبالمثل ، فإن الأدوية ، على سبيل المثال الكلوروكين المضاد للملاريا ، والذي يعتبر أيضا للعلاجات المضادة للسرطان 36 ، قد تؤثر على درجة الحموضة البلعمية وبالتالي على النتائج المناعية. وبالتالي ، قد يكون مجموعة متنوعة من علماء الأحياء الخلوية وعلماء المناعة وعلماء الأحياء الدقيقة ومطوري الأدوية مهتمين بقياس درجة الحموضة البلعمية عند السعي لفهم الآليات الكامنة وراء تأثيرات اضطراب جيني معين أو مركب نشط بيولوجيا أو كائنات دقيقة على الاستجابات المناعية الفطرية والتكيفية.

هنا نصف طريقة لقياس الأس الهيدروجيني البلعمي في العدلات التي سمحت لنا بإظهار أهمية قناة HVCN1 في تنظيم الرقم الهيدروجيني البلعمي 19 للعدلات. تعتمد الطريقة على الخاصية النسبية لفلورسين إيزوثيوسيانات (FITC) التي يكون انبعاثها الفلوري عند 535 نانومتر حساسا للأس الهيدروجيني عند إثارته عند 490 نانومتر ولكن ليس 440 نانومتر 37. عندما تقترن هذه الصبغة كيميائيا بهدف ، في هذه الحالة زيموسان ، يمكن متابعتها باستخدام الفحص المجهري الفلوري واسع المجال ، حيث يتم تصوير الخلايا أثناء البلعمة ، ويتم قياس تغيرات الأس الهيدروجيني البلعمي في الوقت الفعلي مع نضوج البلعمة. ثم يتم استخلاص الأس الهيدروجيني الفعلي عن طريق إجراء تجربة معايرة حيث تتعرض الخلايا التي تعرضت للبلعمة لمحاليل ذات درجة حموضة مختلفة تحتوي على الأيونوفورات nigericin و monensin ، والتي تسمح بالتوازن السريع للرقم الهيدروجيني داخل البلعمة مع المحلول الخارجي. ثم تتم مقارنة قيم النسبة بالأس الهيدروجيني المعروف للمحاليل ، ويتم إنشاء منحنى المعايرة عن طريق الانحدار غير الخطي والمعادلة الناتجة المستخدمة لحساب الأس الهيدروجيني من قيمة النسبة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

بيان الأخلاق: تم تنفيذ جميع التلاعب الحيوانية بما يتفق تماما مع المبادئ التوجيهية للجنة البحوث الحيوانية من جامعة جنيف.

1. إعداد الأهداف أكلة

  1. إضافة 20 ملغ من زيموزان المجففة إلى 10 مل الفوسفات العقيمة مخزنة المالحة (PBS). دوامة والحرارة في حمام الماء المغلي لمدة 10 دقيقة. بارد وأجهزة الطرد المركزي في 2000 x ج لمدة 5 دقائق.
  2. إزالة طاف، resuspend في 1 مل PBS ويصوتن لمدة 10 دقيقة في sonicator حمام الماء. نقل 500 ميكرولتر لاثنين من 1.5 مل أنابيب. أجهزة الطرد المركزي في 11000 x ج لمدة 5 دقائق.
  3. تكرار غسل مع 500 ميكرولتر PBS. يمكن aliquoted في زيموزان المغلي، المجمدة وتخزينها في -20 ° C.
  4. غسل زيموزان مرتين في 500 ميكرولتر الطازجة 0.1 M نا 2 CO 3، ودرجة الحموضة 9.3 على النحو الوارد أعلاه (الخطوة 1.2).
  5. resuspend في 490 ميكرولتر بعد غسل النهائي. إضافة 10 ميكرولتر من 10 ملغ / مل المنحل FITC في ثنائي ميثيل sulfoxidه ([دمس])، دوامة، مع تغطية احباط، واحتضان مع الانفعالات لمدة 4 ساعة على RT.
  6. لإزالة الصبغة غير منضم، وغسل النحو الوارد أعلاه (الخطوة 1.2)، لأول مرة مع 0.5 مل DMSO + 150 ميكرولتر PBS، ثم 0.5 مل DMSO + 300 ميكرولتر PBS، ثم 0.5 مل DMSO + 450 ميكرولتر PBS، ثم PBS وحده.
  7. عد زيموزان باستخدام haemocytometer. إضافة 1 ميكرولتر من زيموزان إلى 500 ميكرولتر PBS، الدوامة، ثم إضافة 10 ميكرولتر إلى حافة الغرفة haemocytometer، حيث يلتقي ساترة وضعت على الشبكة المركزية. تحميل haemocytometer على المجهر مشرق الميدان مجهزة الهدف 20X.
  8. التركيز على الزاوية العلوية اليسرى يحتوي على 16 الساحات والاعتماد جميع الجزيئات زيموزان في هذا المجال باستخدام عداد اليد رصيده. كرر مع الزاوية السفلى اليمنى. حساب تركيز زيموزان باستخدام المعادلة التالية: تركيز زيموزان = عدد / 2 × 500 × 10 4 زيموزان / مل. يمكن aliquoted زيموزان المسمى مثلجة وتخزينها في -20 ° C.
  9. يستطهي واي زيموزان المسمىث أرنب الأجسام المضادة لمكافحة زيموزان في التخفيف 1: 100. دوامة واحتضان لمدة 1 ساعة في 37 ° C حمام الماء. يغسل مع 500 ميكرولتر PBS على النحو الوارد أعلاه (الخطوة 1.2).
    ملاحظة: يوصى صوتنة للغاية، خصوصا بعد طهاية، حيث يميل زيموزان لتشكيل كتل التي يمكن أن تجعل تحليل أكثر صعوبة في وقت لاحق. طهاية مع 65٪ ت / ت الفئران أو المصل البشري يمكن أن تستخدم كبديل.
  10. عد زيموزان باستخدام haemocytometer كما هو موضح في الخطوات 1،7-1،8، وتمييع إلى 100 ​​× 10 6 الجسيمات / مل. طهاية مع التحفيز والتشجيع أكلة أخرى، مثل تكملة أو لا طهاية، قد يتم تنفيذ بدلا من ذلك.

2. لايف فيديو المجهر

  1. عزل العدلات الماوس الأولية كما هو موضح بالتفصيل في مكان آخر 38.
    1. بدلا من ذلك، استخدام أي نوع من الخلايا البلعمية. الحفاظ العدلات على الجليد في معهد روزويل بارك التذكاري (RPMI) 1640 متوسطة تستكمل مع 5٪ الجنين المصل في ربلة الساق (ت / ت)، 200 U البنسلين / streptomyciن، بتركيز 10 × 10 6 خلية / مل لتصبح جاهزة للاستخدام. قد يكون المصنف أنواع الخلايا الأخرى قبل 1-4 أيام.
  2. إضافة 2 × 10 5 (20 ميكرولتر) العدلات إلى وسط الزجاج السفلي 35 مم طبق، ونشر انخفاض بإضافة 50 ميكرولتر من المتوسطة واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق للسماح للخلايا الالتزام.
  3. إضافة الدفء 1 مل من محلول ملحي متوازن هانك (HBSS) إلى 37 درجة C الذي يحتوي على MPO محددة هيدرازيد المانع 4-أمينو (4 ABH، 10 ميكرومتر). مثبطات MPO غير محددة، مثل أزيد الصوديوم (5 ملم)، ويمكن أيضا أن تستخدم ولكن قد اقترحت مؤخرا لممارسة تأثيرات غير محددة إضافية على درجة الحموضة 39.
  4. تركيب الطبق على المجهر widefield مضان مجهزة 37 ° C نظام التدفئة والهدف النفط 40X. احتضان الخلايا دون التصوير لمدة 10 دقيقة للسماح للخلايا ومعدات للتوازن.
  5. ضبط إعدادات المجهر للحصول على نقل صورة مشرق الميدان [فاحد ذاتها أو على النقيض تدخل الفرق (DIC) إن وجدت] مع 440 نانومتر أو 490 نانومتر الإثارة و 535 نانومتر انبعاث كل 30 ثانية.
  6. ضبط وقت التعرض وتردد الاستحواذ وفقا لنظام المجهر لتجنب الكثير من photobleaching من والضيائية واعتمادا على الأسئلة التجريبية التي طلب منها ذلك. بدء الحصول على الصور.
  7. بعد 2 دقيقة، وإضافة 10 × 10 6 (50 ميكرولتر) opsonized FITC-زيموزان إلى وسط الطبق. ضبط الهدف: نسب الخلايا تبعا لنوع من بلعمية والهدف المستخدمة.
  8. يستمر التصوير لمدة 30 دقيقة. بعد 30 دقيقة وقف اكتساب الوقت الفاصل بين وبدء الموقت. تحريك خشبة المسرح والتقاط 10 أو أكثر لقطات في مختلف المجالات من أجل صورة phagosomes الآخرين، كل ذلك ضمن 5 دقائق.

3. المعايرة ومراقبة التجارب

  1. إعداد الحلول درجة الحموضة المعايرة (موصوفة وصفات في الجدول رقم 1) قبل يوم من التجربة وتجميد في 10 مل قسامات.ذوبان الجليد الحلول المعايرة ودافئة إلى 37 درجة مئوية في حمام مائي. تحقق من درجة الحموضة مع متر الرقم الهيدروجيني وتسجيل الرقم الهيدروجيني الفعلية من الحلول.
  2. جبل مضخة تحوي على الجزء السفلي صحن من الزجاج قبل الحصول على الصور وإجراء الفحص المجهري لقطات فيديو حية كما هو موضح أعلاه (القسم 2).
  3. في نهاية فترة شراء 30 دقيقة تشغيل المضخة لإزالة الحل في طبق، إضافة 1 مل من محلول المعايرة الأول ووقف ضخ.
  4. الانتظار حتى تستقر إشارة، عادة مدة 5 دقائق. أكرر مع كل حل المعايرة.
    1. أداء المعايرة واحدة على الأقل في اليوم التجريبي، ومعايرة بدءا من أعلى درجة الحموضة وبالتتابع عمل إلى أدنى مستوى، فضلا عن بدء من أدنى درجة الحموضة والعمل بشكل متتالي نحو الأعلى.
  5. كعنصر تحكم، إضافة 100 ميكرولتر من 100 ميكرومتر NADPH أوكسيديز المانع ثنائي الفينيل propionium يوديد (DPI) المخفف في HBSS إلى الخلايا في 900 ميكرولتر HBSS في طبق زجاجي القاع، واحتضان لمدة 10 دقيقة.
  6. بدء استحواذ وإضافة زيموزان على النحو الوارد أعلاه (الخطوة 2.7). بعد 15 دقيقة من البلعمة، إضافة 10 ميكرولتر من 10 ميكرومتر V-أتباز المانع concanamycin A (كونكا) المخفف في HBSS ويستمر التصوير لمدة 15 دقيقة إضافية.

تحليل 4.

  1. تحليل الأفلام الوقت الفاصل بين واللقطات يبلوع.
    ملاحظة: الإرشادات التالية هي محددة ليماغيج. خطوة بخطوة قد تختلف الإرشادات على نطاق واسع اعتمادا على البرمجيات المستخدمة، ولكن هي وظائف الموضحة في هذا القسم متاح في معظم البرامج المهنية تحليل الصور.
    1. فتح الصور مع البرامج المهنية تحليل الصور. طرح الخلفية في القناة 490 عن طريق رسم ROI مربع صغير مع مربع أداة التحديد المضلع في منطقة حيث لا توجد الخلايا، والنقر الإضافات> BG الطرح من العائد على الاستثمار. ثم تحميل نفس ROI على قناة 440 بالنقر فوق تحرير> اختيار> استعادة التحديد وتكرار.
    2. جعل 32 بت نسبة صورة القناة 490 مقسوما على قناة 440 بالضغط العملية> حاسبة صورة ...، واختيار الصور المناسبة في Image1 وو Image2 القوائم المنسدلة، ثم اختيار 'تقسيم' في القائمة المنسدلة عملية ، والتحقق من 32 بت (تعويم) نتيجة الاختيار مربع.
    3. تغيير نظرة متابعة الجدول الترميز اللوني لنسبة المتوافقة مع لون الترميز بالضغط صورة> طاولات بحث> قوس قزح RGB. عتبة الصورة نسبة إلى القضاء 0 واللانهاية بكسل بالضغط صورة> ضبط> العتبة .... ضبط أشرطة التمرير بحيث يظهر أن زيموزان باللون الأحمر وانقر فوق تطبيق، والتأكد من تحديد مجموعة بكسل خلفية خانة الاختيار نان ل.
    4. الجمع بين هذه النسبة كومة مع قناة مشرق الميدان في مركب متعدد القنوات بالضغط صورة> اللون> دمج القنوات، واختيار الصورة مشرق الميدان في القائمة قناة المنسدلة الرمادي وصورة نسبة في القائمة المنسدلة قناة خضراء، و اختيارإبقاء مصدر الصور فحص مربع. مسح الأفلام مرور الزمن أو لقطات لتحديد أي phagosomes هم لتحليلها. قناة مشرق الميدان مفيدة لهذا الغرض.
    5. رسم مناطق الفائدة (ROI) باستخدام أداة التحديد البيضاوي المضلع حول phagosomes، وإضافتها إلى مدير ROI بالضغط تحليل> أدوات> مدير ROI> إضافة. قياس نسبة كثافة زيموزان من خلال النقر المزيد> متعددة للقياس واجتثاث اختيار صف واحد لكل شريحة الاختيار مربع.
    6. للأفلام مرور الزمن، المسار phagosomes في وقت واحد من خلال الاعتماد على العائد على الاستثمار، وكتابة على Ctrl + M لقياس كل نقطة زمنية، وتحريك ROI عند الضرورة لتتبع القيم شدة مع مرور الوقت. نسخ القياسات من نافذة نتائج في برنامج جداول البيانات.
      ملاحظة: تحليل 15 (5 دوام دورات في التجربة × 3) تجارب مستقلة غير مثالية، ولكن أكثر أو أقل قد تكون هناك حاجة تبعا لتقلب الملاحظة. إنقاذ رويس ينصح دائما. بعض حزم البرمجيات تسمح ريجي صورةstration والتحديث الحيوي رويس، وتسهيل هذا الجزء من التحليل.
  2. التحويل من مضان للقيم الرقم الهيدروجيني
    1. قياس نسبة 490/440 لphagosomes في معايرة الأفلام مرور الزمن كما هو موضح في القسم 4.1.
    2. في جدول بيانات، رسم القيم نسبة مع مرور الوقت، وحساب متوسط ​​قيم نسبة من كل phagosomes داخل مجال الرؤية (عادة ما بين 5-20) من 5 نقاط وقت خلال منتصف الفترة الزمنية المقابلة لكل درجة الحموضة المعايرة حل. (انظر أيضا مربعات حمراء في الشكل 5A).
    3. رسم هذه 490/440 متوسط ​​قيم نسبة الرقم الهيدروجيني ضد المقاسة الفعلية. الجمع بين ما لا يقل عن 3 المعايرة مستقلة في رسم بياني واحد. استخدام حزمة البرامج الإحصائية أو العددية لإجراء الانحدار غير الخطية (أفضل منحنى نوبة)، وعادة لمعادلة السيني.
      ملاحظة: على سبيل المثال، في الشكل 5B كانت المعادلة المستخدمة لالسيني بولتزمان [Y = أسفل + ((من أعلى إلى أسفل)/ (1 + EXP ((V50-X) / المنحدر))]، حيث قيم Y هي نسب 490/440، X هي قيم الرقم الهيدروجيني وأعلى، أسفل، وتحسب V50 والمنحدر المعلمات من قبل البرنامج.
    4. استخدام المعادلة التي تم الحصول عليها لتحويل القيم نسبة لدرجة الحموضة.
      ملاحظة: على سبيل المثال، في الشكل 5B المعادلة التي حصل عليها لمنحنى المعايرة بحضور أزيد الصوديوم 490/440 نسبة = 1.103 + [(2،89-1،103) / (1 ​​+ EXP ((6.993 درجة الحموضة) /0.9291)] . حل لدرجة الحموضة يعطي المعادلة التالية: الرقم الهيدروجيني = 6،993-0،9291 * [LN ((1.178 / (نسبة 1.103)) - 1))].

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وفيما يلي نتائج ممثل للتجربة حيث درجة الحموضة phagosomal العدلات الماوس الابتدائية معزولة عن نخاع العظام من النوع البري أو Hvcn1 - / - وتمت مقارنة الفئران. لتجربة ناجحة، فمن المهم الحصول على ما يكفي من phagosomes داخل مجال الرؤية خلال فترة كاملة من الفيلم الوقت الفاصل، مع تجنب الكثير من phagosomes، والتي سوف تكون في وقت لاحق من الصعب قطاع خلال تحليل الصور. يبين الشكل 1 أمثلة من confluencies الخير والشر. للمرة التي تعتمد على لقطة ويحل...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

على الرغم من أن أكثر استهلاكا للوقت من الطرق البديلة، مثل التحليل الطيفي وFACS، التي تستخدم استراتيجية مماثلة باستخدام صبغة حساسة درجة الحموضة بالإضافة إلى أهداف ولكن قياس متوسط ​​درجة الحموضة من سكان phagosomes و الفحص المجهري ويقدم العديد من المزايا. الأول هو أن الداخلية والخارجية ملزمة، ولكن ليس المنضوية، يمكن أن تكون الجسيمات بسهولة المتميزة دون الحاجة إلى إضافة مواد كيميائية أخرى، مثل التريبان الأزرق أو الأجسام المضادة، لإرواء أو التسمية الجسيمات الخارجية، على التوالي. هي ثان...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتم دعم المؤلفين ماليا من قبل المؤسسة الوطنية السويسرية للعلوم من خلال منحة تشغيلية رقم 31003A-149566 (إلى N.D.) ، و The Sir Jules Thorn Charitable Overseas Trust من خلال إعانة المحققين الشباب (إلى P.N.).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

مسحوق الخدمات الخدمات الخدمات يكون الخدمات الخدمات يوجد يمكن مقياس يوجد المجال يوجد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
Zymosan ASigma-AldrichZ4250يوجد العديد من مقدمي
الخدمات الفلوريسئين إيزوثيوسياناتسيجما-ألدريتشF7250يوجد العديد من مقدمي
الخدمة الجسم المضاد المضاد للزيموزان (كاشف ضاغط للجسيمات الحيوية Zymosan A) LifeTechnologiesZ2850Sigma-Aldrich O6637 هو منتج مكافئ. بدلا من ذلك ، يمكن استخدام مصل 25٪ ككاشف مضاد.
4-أمينوبنزويك هيدرازيد (4-ABH)سانتا كروزsc-204107سامة ، استخدم القفازات ، يوجد العديد من مقدمي
كلوريد ثنائي فينيل يودونيوم (DPI)Sigma-AldrichD2926سام ، استخدم القفازات ، يوجد العديد من مقدمي
الخدمات Concanamycin A (ConcA)Sigma-Aldrich27689سامة ، استخدم القفازات ، يوجد العديد من مقدمي الخدمات
NigericinSigma-AldrichN7143سامة ، استخدم القفازات ، يوجد العديد من مقدمي
الخدمات MonensinEnzoALX-380-026-G001سامة ، استخدم القفازات ، يوجد العديد من مقدمي
محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS)Life Technologies14200-075سامة ، استخدم القفازات ، يوجد العديد من مقدمي
محلول ملح التوازن من Hankقد 14025092 قدمحلول الملح المتوازن من Ringer أو غيرها من المخازن المؤقتة الفسيولوجية الواضحة يتم استبدالها.
كربونات الصوديوم (Na 2< / sub >CO3< / sub>)Sigma-AldrichS7795يوجد العديد من مقدمي
2- (N-Morpholino) حمض الإيثان سلفونيك (MES)سيجما ألدريتشM3671   ؛يوجد العديد من مقدمي الخدمات
4- (2-هيدروكسي إيثيل) بيبيرازين -1-حمض إيثان سلفونيك (HEPES)سيجما ألدريتشH3375يوجد العديد من مقدمي
الخدمات N-Methyl-D-glucamine (NMDG)Sigma-AldrichM2004   ؛يوجد العديد من مقدمي الخدمات
الإيثيلين جلايكول مكرر (2-أمينوإيثيل إيثر) -N ، N ، N & رئيس ؛ حمض رباعي الأسيتيك (EGTA)سيجما ألدريتش3777يوجد العديد من مقدمي
تريس (هيدروكسي ميثيل) أمينوميثان (تريس)سيجما ألدريتشT1503   ؛يوجد العديد من مقدمي الخدمات
كلوريد البوتاسيوم (KCl)سيجما ألدريتشP9333يوجد العديد من مقدمي
الخدمات كلوريد الصوديوم (NaCl)Sigma-AldrichS7653يوجد العديد من مقدمي
الخدمات كلوريد المغنيسيوم (MgCl2< / sub>)Sigma-AldrichM8266العديد من مقدمي
الإيثانول المطلق (EtOH)Sigma-Aldrich2860يوجد
العديد من مقدمي الخدماتأطباق بتري زجاجية مقاس 35 مم (فلوروديش)أدوات الدقة العالميةFD35-100Ibidi & - أطباق أو أغطية شفافة مع غرف تصوير مناسبة يمكن تعليقها حمام
مائي صوتيO. Kleiner AGاستخدام جهاز صوتي بدلا من ذلك ، يوجد العديد من مزودي الأدوات
الدمMarienfeld GmbHالعديد من مزودي الأدوات
مجهر التصوير الحي واسعCarl Zeiss AGيوجد العديد من مزودي الأدوات ، ولكن يجب أن يكون المجهر قادرا على تصوير 440/535 و 490/535 الإثارة / الانبعاث المحترمة. قد يتم استبدال إعدادات البؤر للقرص الدوار مع قدرات المجال الساطع ، لكن zymosan تميل إلى الخروج عن التركيز في كثير من الأحيان.  
المضخة التمعجية (Dynamax RP-1)Raininيوجد العديد من مزودي الأدوات
مقياس الأس الهيدروجينيSchott Gerate GmbHيوجد العديد من مزودي الأدوات
العداد اليدويMilian SAالعديد من مزودي الأدوات

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Yeung, T., Grinstein, S. Lipid signaling and the modulation of surface charge during phagocytosis. Immunol Rev. 219, 17-36 (2007).
  2. Flannagan, R. S., Jaumouille, V., Grinstein, S. The cell biology of phagocytosis. Annu Rev Pathol. 7, 61-98 (2012).
  3. Fairn, G. D., Grinstein, S. How nascent phagosomes mature to become phagolysosomes. Trends Immunol. 33 (8), 397-405 (2012).
  4. Nunes, P., Demaurex, N., Dinauer, M. C. Regulation of the NADPH oxidase and associated ion fluxes during phagocytosis. Traffic. 14 (11), 1118-1131 (2013).
  5. Binder, B., Holzhutter, H. G. A hypothetical model of cargo-selective rab recruitment during organelle maturation. Cell Biochem Biophys. 63 (1), 59-71 (2012).
  6. Hurtado-Lorenzo, A., et al. V-ATPase interacts with ARNO and Arf6 in early endosomes and regulates the protein degradative pathway. Nat Cell Biol. 8 (2), 124-136 (2006).
  7. Weisz, O. A. Acidification and protein traffic. Int Rev Cytol. 226, 259-319 (2003).
  8. Huynh, K. K., Grinstein, S. Regulation of vacuolar pH and its modulation by some microbial species. Microbiol Mol Biol Rev. 71 (3), 452-462 (2007).
  9. De Vito, P. The sodium/hydrogen exchanger: a possible mediator of immunity. Cell Immunol. 240 (2), 69-85 (2006).
  10. Moreland, J. G., Davis, A. P., Bailey, G., Nauseef, W. M., Lamb, F. S. Anion channels, including ClC-3, are required for normal neutrophil oxidative function, phagocytosis, and transendothelial migration. J Biol Chem. 281 (18), 12277-12288 (2006).
  11. Winterbourn, C. C., Kettle, A. J. Redox reactions and microbial killing in the neutrophil phagosome. Antioxid Redox Signal. 18 (6), 642-660 (2013).
  12. Seredenina, T., Demaurex, N., Krause, K. H. Voltage-Gated Proton Channels as Novel Drug Targets: From NADPH Oxidase Regulation to Sperm Biology. Antioxid Redox Signal. , (2014).
  13. Kotsias, F., Hoffmann, E., Amigorena, S., Savina, A. Reactive oxygen species production in the phagosome: impact on antigen presentation in dendritic cells. Antioxid Redox Signal. 18 (6), 714-729 (2013).
  14. Grimm, M. J., et al. Monocyte- and macrophage-targeted NADPH oxidase mediates antifungal host defense and regulation of acute inflammation in mice. J Immunol. 190 (8), 4175-4184 (2013).
  15. West, A. P., et al. TLR signalling augments macrophage bactericidal activity through mitochondrial ROS. Nature. 472 (7344), 476-480 (2011).
  16. Bloomfield, G., Pears, C. Superoxide signalling required for multicellular development of Dictyostelium. J Cell Sci.. 116 (Pt 16), 3387-3397 (2003).
  17. Ramsey, I. S., Moran, M. M., Chong, J. A., Clapham, D. E. A voltage-gated proton-selective channel lacking the pore domain. Nature. 440 (7088), 1213-1216 (2006).
  18. El Chemaly, A., Demaurex, N. Do Hv1 proton channels regulate the ionic and redox homeostasis of phagosomes? Mol Cell Endocrinol. 353 (1-2), 82-87 (2012).
  19. El Chemaly, A., Nunes, P., Jimaja, W., Castelbou, C., Demaurex, N. Hv1 proton channels differentially regulate the pH of neutrophil and macrophage phagosomes by sustaining the production of phagosomal ROS that inhibit the delivery of vacuolar ATPases. J Leukoc Biol. , (2014).
  20. Decoursey, T. E. Voltage-gated proton channels. Compr Physiol. 2 (2), 1355-1385 (2012).
  21. Ramsey, I. S., Ruchti, E., Kaczmarek, J. S., Clapham, D. E. Hv1 proton channels are required for high-level NADPH oxidase-dependent superoxide production during the phagocyte respiratory burst. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (18), 7642-7647 (2009).
  22. Sturgill-Koszycki, S., et al. Lack of acidification in Mycobacterium phagosomes produced by exclusion of the vesicular proton-ATPase. Science. 263 (5147), 678-681 (1994).
  23. Clemens, D. L., Lee, B. Y., Horwitz, M. A. Virulent and avirulent strains of Francisella tularensis prevent acidification and maturation of their phagosomes and escape into the cytoplasm in human macrophages. Infect Immun. 72 (6), 3204-3217 (2004).
  24. Alpuche-Aranda, C. M., Swanson, J. A., Loomis, W. P., Miller, S. I. Salmonella typhimurium activates virulence gene transcription within acidified macrophage phagosomes. Proc Natl Acad Sci U S A. 89 (21), 10079-10083 (1992).
  25. Lukacs, G. L., Rotstein, O. D., Grinstein, S. Determinants of the phagosomal pH in macrophages. In situ assessment of vacuolar H(+)-ATPase activity, counterion conductance, and H+ 'leak'. J Biol Chem. 266 (36), 24540-24548 (1991).
  26. Watanabe, K., Kagaya, K., Yamada, T., Fukazawa, Y. Mechanism for candidacidal activity in macrophages activated by recombinant gamma interferon. Infect Immun. 59 (2), 521-528 (1991).
  27. Ip, W. K., et al. Phagocytosis and phagosome acidification are required for pathogen processing and MyD88-dependent responses to Staphylococcus aureus. J Immunol. 184 (12), 7071-7081 (2010).
  28. Clarke, M., Maddera, L. Phagocyte meets prey: uptake, internalization, and killing of bacteria by Dictyostelium amoebae. Eur J Cell Biol. 85 (9-10), 1001-1010 (2006).
  29. Jankowski, A., Scott, C. C., Grinstein, S. Determinants of the phagosomal pH in neutrophils. J Biol Chem. 277 (8), 6059-6066 (2002).
  30. Segal, A. W., Geisow, M., Garcia, R., Harper, A., Miller, R. The respiratory burst of phagocytic cells is associated with a rise in vacuolar pH. Nature. 290 (5805), 406-409 (1981).
  31. Savina, A., et al. NOX2 controls phagosomal pH to regulate antigen processing during crosspresentation by dendritic cells. Cell. 126 (1), 205-218 (2006).
  32. Rybicka, J. M., Balce, D. R., Chaudhuri, S., Allan, E. R., Yates, R. M. Phagosomal proteolysis in dendritic cells is modulated by NADPH oxidase in a pH-independent manner. EMBO J. 31 (4), 932-944 (2012).
  33. Mantegazza, A. R., et al. NADPH oxidase controls phagosomal pH and antigen cross-presentation in human dendritic cells. Blood. 112 (12), 4712-4722 (2008).
  34. Balce, D. R., Allan, E. R., McKenna, N., Yates, R. M. gamma-Interferon-inducible lysosomal thiol reductase (GILT) maintains phagosomal proteolysis in alternatively activated macrophages. J Biol Chem. 289 (46), 31891-31904 (2014).
  35. Sanjurjo, L., et al. The scavenger protein apoptosis inhibitor of macrophages (AIM) potentiates the antimicrobial response against Mycobacterium tuberculosis by enhancing autophagy. PLoS One. 8 (11), e79670(2013).
  36. Yuan, Z., Zhi, L., Li-Juan, Z., Hong-Tao, X. The Utility of Chloroquine in Cancer Therapy. Curr Med Res Opin. , 1-12 (2015).
  37. Ohkuma, S., Poole, B. Fluorescence probe measurement of the intralysosomal pH in living cells and the perturbation of pH by various agents. Proc Natl Acad Sci U S A. 75 (7), 3327-3331 (1978).
  38. El Chemaly, A., et al. VSOP/Hv1 proton channels sustain calcium entry, neutrophil migration, and superoxide production by limiting cell depolarization and acidification. J Exp Med. 207 (1), 129-139 (2010).
  39. Levine, A. P., Duchen, M. R., Segal, A. W. The HVCN1 channel conducts protons into the phagocytic vacuole of neutrophils to produce a physiologically alkaline pH. bioRxiv. , (2014).
  40. Al-Fageeh, M. B., Smales, C. M. Control and regulation of the cellular responses to cold shock: the responses in yeast and mammalian systems. Biochem J. 397 (2), 247-259 (2006).
  41. Yui, N., et al. Basolateral targeting and microtubule-dependent transcytosis of the aquaporin-2 water channel. Am J Physiol Cell Physiol. 304 (1), C38-C48 (2013).
  42. Griffiths, G. On phagosome individuality and membrane signalling networks. Trends Cell Biol. 14 (7), 343-351 (2004).
  43. Poburko, D., Santo-Domingo, J., Demaurex, N. Dynamic regulation of the mitochondrial proton gradient during cytosolic calcium elevations. J Biol Chem. 286 (13), 11672-11684 (2011).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

FITC

مقالات ذات صلة