مقالة منهجية

الليزر التقاط تسليخ مجهري من الإنسان البروستات الظهارة لتحليل الحمض النووي الريبي

DOI:

10.3791/53405

⸱

نوفمبر 26, 2015

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pathology, University of Illinois at Chicago, 2Department of Periodontics, University of Illinois at Chicago

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الهدف من هذا البروتوكول هو استخدام التشريح الدقيق بالليزر كطريقة فعالة لعزل مجموعات نقية من أنواع الخلايا من أنسجة البروستاتا غير المتجانسة لتحليل الحمض النووي الريبي النهائي.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تحتوي غدة البروستاتا على بيئة غير متجانسة من أنواع الخلايا اللحمية والظهارية والغدد الصم العصبية والمناعية. تتكون البروستاتا الصحية من السدى العضلي الليفي المحيط بالتجويف الإفرازي المنفصل المبطن بالظهارة ومجموعة صغيرة جدا من الخلايا المناعية والغدد الصم العصبية. في المقابل ، زادت مناطق سرطان البروستاتا من الظهارة اللمعية خلل التنسج مع انخفاض كبير أو غياب عدد اللحمة. نظرا للاختلاف العميق بين أنواع الخلايا اللحمية والظهارية ، من الضروري فصل أنواع الخلايا لأي نوع من التحليل الجزيئي النهائي. على الرغم من هذه المعرفة ، فإن الجزء الأكبر من دراسات التعبير الجيني يقارن البروستاتا الحميدة بالسرطان بدون تشريح دقيق ، مما يؤدي إلى التحيز اللحمي في العينات الحميدة. يعد التشريح الدقيق بالالتقاط بالليزر (LCM) طريقة فعالة لفصل أنواع الخلايا المختلفة جسديا عن قسم العينة. الهدف من هذا البروتوكول هو إظهار أنه يمكن عزل الحمض النووي الريبي بنجاح من ظهارة البروستاتا البشرية التي تم جمعها بواسطة LCM واستخدامه في دراسات التعبير الجيني النهائي مثل RT-qPCR و RNAseq.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

غدة البروستاتا هو نسيج غير متجانسة تتكون من ظهارة إفرازية مرتبة في عنيبات ​​غدي محاط عضلي ليفي سدى تتألف أساسا من العضلات الملساء 1. وتتألف المقصورة الظهارية من خمسة أنواع مختلفة من الخلايا ولكن المنظمة: الخلايا القاعدية والخلايا الإفرازية، خلايا الغدد الصم العصبية والخلايا العابر تضخيم والخلايا الجذعية 2. في سرطان البروستاتا (PCA)، الذي ينشأ من الخلايا الظهارية اللمعية، نمو غدية يسبب الانخفاض التدريجي الواضح من المقصورة اللحمية 3. لهذه الأسباب، فإن عينات الأنسجة لديها اختلافات واضحة في نسبة اللحمية ونوع الخلايا الظهارية على أساس مدى محكمة التحكيم الدائمة. هذه الاختلافات يمكن أن يؤدي إلى الافتراضات متحيزة للبيانات التعبير الجيني تم الحصول عليها من أنسجة كاملة دون النظر إلى تسليخ مجهري من نوع الخلايا المطلوبة. لذلك، لإزالة هذا التحيز من الضروري فصل أنواع الخلايا قبل استخراج الحمض النووي الريبي وتحليل التعبير الجيني.

Macrodissection أو تسليخ مجهري يمكن استخدامها لفصل جسديا المناطق الظهارية تتميز جيدا من سدى المحيطة 4 -6. وعادة ما يتم Macrodissection بشفرة حلاقة تحت المجهر تشريح ويعمل بشكل جيد لفصل كبير PCA العقيدات من سدى، ولكنها ليست قادرة على إزالة ظهارة حميدة من المحيط سدى (انظر مثال حميدة الأنسجة البروستاتا في الشكل 1). تسليخ مجهري مع ليزر (LCM) هو أكبر بكثير من العمل المكثف من macrodissection، ولكن يمكن تشريح دقيق للغاية ظهارة حميدة 4.

وقد أظهرت المنشورات الحديثة من مختبرنا أن RNA يمكن استخراجها بنجاح LCM إما جزءا لا يتجزأ من البارافين (FFPE) الخزعات الثابتة الفورمالين أو الأنسجة المجمدة 4،7-9. التحديات الرئيسية في استخراج LCM-RNA هي 1) لتشريح دقيق للمناطق المطلوب من الأنسجة، و2) للحفاظ RNA سلامة خلال (4،10) LCM وعزل العملية. RNA معزولة عن السكان الخلية نقية يمكن استخدامها لتحليل التعبير الجيني عن طريق عدة طرق منها العكسية النسخ PCR الكمي (RT-QPCR) 7،8، ميكروأري 11، و-sequencing عمق 12-14.

والهدف من هذا البروتوكول هو عزل الحمض النووي الريبي مجموع من ظهارة LCM البروستاتا من الأنسجة المجمدة ليحلل المصب التعبير الجيني.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم الحصول على جميع الأنسجة البشرية المستخدمة في هذه التجارب عبر بروتوكول مجلس المراجعة المؤسسية المعتمدة و / أو الإعفاء في جامعة إلينوي في شيكاغو.

1. القسم الطازجة المجمدة البروستاتا على PEN-الشرائح وعلى شريحة زجاجية اتهم

  1. قبل يوم واحد أو بضع ساعات قبل باجتزاء العينة والأدوات نظيفة (أي فرشاة، ملقط، coplins، شفرات، والشرائح PEN مؤطرة (إن لم يكن بالفعل ريبونوكلياز الحرة)، علامة ETOH آمنة وقلم رصاص) والداخل ل RT ناظم البرد مع ريبونوكلياز تطهير حل باستخدام زجاجة رذاذ ومختبر مناديل.
    1. السماح حل تطهير ريبونوكلياز على الجلوس لمدة 5 دقائق قبل تمسح، شطف مع depcH 2 0 لإزالة خلفها ريبونوكلياز تطهير الحل وشطف النهائي مع 70٪ ETOH (أعدت مع depcH 2 0).
      ملاحظة: من الضروري المحافظة على مساحة خالية من ريبونوكلياز. جميع coplins والأدوات والمجمدة المتوسطة المتزايدة، شفرات والشرائح المستخدمة يجب أن تستخدم فقط لريبونوكلياز العمل الحروتستخدم أبدا في بيئة غير ريبونوكلياز القياسية الحرة. ويجب أن يعامل جميع الصكوك مع محلول تطهير ريبونوكلياز قبل كل تجربة.
  2. ناظم البرد بارد إلى -24 ° C.
  3. ضع تنظيف الأدوات ريبونوكلياز حرة بعد داخل ناظم البرد لتبرد 30 دقيقة على الأقل قبل باجتزاء: شريحة coplin المليئة مع الإيثانول بنسبة 100٪، والأدوات، والأشرطة الأنسجة المجمدة الصغيرة وتصاعد ظرف.
  4. استرداد المجمدة أنسجة البروستاتا من cryostorage ومكان في دلو رغوة مليئة الجليد الجاف للنقل. وضع الأنسجة في ناظم البرد لكي تتوازن إلى ناظم البرد درجة الحرارة لمدة 30 دقيقة على الأقل.
    ملاحظة: أنسجة البروستاتا البشرية ليزر التقاط الدقيقة تشريح يمكن أن تكون إما طازجة مجمدة أو الفورمالين الثابتة جزءا لا يتجزأ من البارافين (FFPE). لضيق الوقت وإعداد الشرائح تختلف قليلا بين مصادر الأنسجة. نحن هنا وصف الخطوات لأقسام المجمدة.
  5. العمل مع الأنسجة في وقت واحد، وبخ المجمدة المتوسطة المتزايدة في بوتوم الكاسيت وبسرعة جبل أنسجة البروستاتا المجمدة في المتوسط ​​المجمدة تصاعد باستخدام ملقط المبردة.
  6. وضع الكاسيت مع الأنسجة على المبرد في ناظم البرد لمدة 5 دقائق لتعيين المجمدة المتوسطة المتزايدة.
  7. بخ كمية صغيرة من المجمدة المتوسطة المتزايدة على تشاك واضغط بعناية الجانب السفلي الأنسجة صعدت على المدى المتوسط ​​المجمدة في تصاعد مستمر. اسمحوا المنصوص عليها في ناظم البرد لمدة 5 دقائق للسماح للمتوسطة المجمدة متزايدة ليصلب تماما.
  8. ضع ظرف في حامل وتشديد.
  9. قفل المقبض في وضع القفل ووضع شفرة جديدة على ناظم البرد. بالنسبة لنهايات الجزيئية المصب التي تشمل خطوة التضخيم (أي QPCR) فمن المستحسن استخدام شفرة جديدة لكل مريض لمنع التلوث (أو نقل شفرة على استخدام المجال لنصل للعينة القادمة).
  10. فتح المقبض ودفع بعناية الأنسجة عن طريق اليد أو مع دواسة القدم لمعادلة وفضح الأنسجة مع 50 μأقسام م حتى تعرض الأنسجة المطلوب هو التوصل إليها.
  11. ضبط ناظم البرد إلى 5 ميكرون، وقطع واحد أو قسمين ووضعها على شريحة زجاجية اتهم لالهيماتوكسيلين ويوزين (H & E) تلطيخ (راجع الخطوة 2).
  12. المكان على الفور الشريحة في البرد الإيثانول بنسبة 100٪ لمدة 2 دقيقة.
  13. إزالة شريحة زجاجية اتهم من الإيثانول واتركها لتجف في RT قبل الشروع في H & E تلطيخ (الخطوة 2).
  14. وضع RT PEN-إطار الشريحة على مؤيد الإطار.
  15. ضبط ناظم البرد إلى 10 ميكرون ومكان أقسام على RT PEN إطار الشرائح. يمكن للمرء أن يكون مكان أربعة أقسام على كل شريحة اعتمادا على حجم الأنسجة.
  16. يغرق فورا الشريحة في البرد الإيثانول بنسبة 100٪ لمدة 2 دقيقة.
  17. إزالة الشرائح PEN-الإطار من الإيثانول وتخزين الشريحة في مربع الشريحة في مربع المجفف في الفريزر -80 درجة مئوية لتصبح جاهزة للLCM. ثلاثة أيام هي فترة التخزين القصوى لاسترداد RNA الأمثل.
  18. المضي قدما في الخطوة 2 فقط تراجع الزجاج مشحونةه. المضي قدما في الخطوة 3 لPEN-إطار الشريحة.

2. الهيماتوكسيلين ويوزين-Y (H & E) وصمة عار لالنسيجية الأقسام المتابعة

ملاحظة: هذا إذا لالأنسجة على شريحة زجاجية اتهم وليس الشريحة PEN-الإطار لLCM.

  1. هيدرات المقاطع على شريحة زجاجية اتهم غمس الشريحة من خلال الإيثانول متدرج على النحو التالي: تراجع الشريحة مرتين في الإيثانول بنسبة 100٪ لمدة 3 دقائق، مرتين في الايثانول 95٪ لمدة 3 دقائق، مرة واحدة في الايثانول 70٪ لمدة 3 دقائق واثنين مرات في المقطر H 2 O لمدة 3 دقائق.
    1. تحضير حامض حل الكحول: 99 مل 70٪ من الإيثانول + 1 مل 1٪ حمض الهيدروكلوريك و 0.1٪ محلول بيكربونات الصوديوم: 0.1 ز بيكربونات الصوديوم في 100 مل المقطر H 2 O
  2. تراجع الشرائح في الهيماتوكسيلين جيل الثاني (0.4٪) لمدة 5 دقائق.
  3. يغسل وصمة عار الزائدة في المطرد الحنفية H 2 O لمدة 3 دقائق.
  4. تراجع الشريحة 10 مرات في الكحول الحمضية
  5. غسل الشريحة في إدارة الصنبور H 2 O لمدة 3 دقائق.
  6. تراجع الشريحةفي 0.1٪ محلول بيكربونات الصوديوم لمدة 30-60 ثانية لتحويل اللون الأرجواني إلى اللون الأزرق.
  7. غسل الشريحة في إدارة الصنبور H 2 O لمدة 3 دقائق.
  8. شطف الشريحة في 95٪ من الإيثانول مع 10 الانخفاضات.
  9. تراجع الشريحة في أوقات يوزين-Y 2-3 مجموعه 15 ثانية.
  10. يذوى الشريحة من خلال الإيثانول متدرج على النحو التالي: تراجع الشريحة مرتين في 95٪ من الإيثانول، مرتين في الإيثانول بنسبة 100٪، ومرتين في الزيلين (تأكد تظهر الأنسجة واضحة مما يدل على الجفاف شامل).
  11. جبل الشريحة مع غير مائي دائم الصعب تصاعد المتوسطة والغطاء زلة.
  12. السماح بانزلاق الجافة لمدة 30 دقيقة.
  13. الشريحة المسح الضوئي مع أي جهاز ماسح ضوئي الشريحة بأكملها وطباعة كبيرة، صورة عالية الدقة على 8 "× 11" ورقة.
  14. المناطق المخطط الفائدة (يتم عادة من قبل الطبيب الشرعي شهادة البورد) مع علامة. هذه العلامات هي دليل لإجراءات LCM.

3. طولويدين الأزرق تلطيخ الشرائح PEN الإطار

ملاحظة: تويتم في نفس اليوم كما LCM. استخدام depcH 2 O المياه لجميع الحلول. استكمال جميع الخطوات في منطقة خالية من ريبونوكلياز. يجب تنظيف جميع coplins مع حل ريبونوكلياز تطهيرها.

  1. يوم LCM إزالة PEN-إطار الشرائح من -80 ° C الفريزر وهيدرات بسبب الانهيارات جوفاء إلى 90٪ ETOH لمدة 2 دقيقة ثم 75٪ ETOH لمدة 2 دقيقة.
    1. إعداد 0.5٪ طولويدين الأزرق عن طريق إذابة في الماء الصف البيولوجيا الجزيئية ثم تصفية تعقيم خلال 0.2 ميكرون تصفية وتخزينها في RT. قد يكون هذا الحل إعادة استخدامها لمدة تصل إلى 6 أشهر. ملاحظة: ينصح بشدة لإعداد الحل قبل باسم الترشيح يمكن أن يستغرق بضع ساعة.
  2. وصمة عار على أنسجة البروستاتا عن طريق غمس بلطف الشرائح في 0.5٪ طولويدين الأزرق لل30/05 ثانية. يزيل اللون الأنسجة عن طريق غسل الشرائح 2 مرات في depcH 2 O لمدة 15 ثانية تليها 75٪ ETOH لمدة 30 ثانية إلى 3 دقائق. ملاحظة: يمكن تعديل وصمة عار ويزيل اللون الأوقات لضمان تلطيخ جيد. البروستاتا يميل إلى أكثر من وصمة عار.
    3. نقل الشرائح PEN-الإطار إلى الحاوية الجافة حرة RNAase على الجليد.

4. الليزر التقاط الجزئي تشريح (LCM)

  1. مباشرة قبل LCM، شريحة الجافة على شريحة دفئا في 42 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. الجافة فقط الشريحة التي سيتم تجهيزها وتخزينها الباقي على الجليد حتى جاهزة بالنسبة لهم.
  2. تشغيل LCM والكمبيوتر في هذا النظام، والسلطة المجهر، والمفتاح ليزر، والتحول ليزر ثم الكمبيوتر. إطلاق برنامج ليزر تسليخ مجهري.
  3. استخدام برنامج للسيطرة على المجهر لتحميل الشرائح وأنابيب جمع. انقر على "صاحب العينة تفريغ"، تحميل الشريحة مع المقاطع على حامل شريحة المجهر مع الأنسجة أسفل وإدراج حامل الشرائح في الفتحة المناسبة في المجهر، ثم انقر فوق "متابعة".
    1. انقر على "أنابيب جمع تفريغ"، والتسمية وتحميل 0.5 مل أنابيب على حامل الأنبوب وأدخله في الفتحة المناسبة في الصك. ذات مرةيتم تأمينها والقبعات، وإضافة 35 ميكرولتر من تحلل العازلة للقبعات جمع ومحاولة لتجنب الفقاعات. ثم انقر فوق "موافق".
      ملاحظة: إذا تبخر هو المشكلة، تمييع عازلة على النحو التالي: 25 ميكرولتر تحلل العازلة مع 10 ميكرولتر depcH2O.
  4. في البرنامج، حدد الموضع حيث تم وضع الشرائح في حامل الشرائح. تحديد الحد الأقصى للجمع لجمع العينة LCM.
  5. تصور والتركيز على الشريحة من خلال الكمبيوتر في 10X. استخدام البرنامج لمعايرة الليزر عن طريق اختيار "الليزر" ثم "معايرة". ضبط السلطة، وفتحة العدسة وسرعة ليزر، واختيار "ليزر" ثم "السيطرة" على السماح لشعاع الليزر لقطع المساحة المحددة تماما وكفاءة. تكرار التعديلات حتى التخفيضات الليزر تماما من خلال الأنسجة.
  6. باستخدام 8 "× 11" الطبيب الشرعي علامة المتابعة كدليل، واستخدام "رسم شكل" أداة لتطويق المناطق المطلوب من epithelium في طريقة العرض وتجنب جمع أي سدى.
    ملاحظة: يمكن تحديد مجالات متعددة ضمن عرض واحد، ولكن لا تنتقل إلى رأي آخر بدون تقطيع الأول عن طريق النقر على "قطع شكل" أداة.
    1. إذا كان المجال لا يحصل معزولة تماما بواسطة الليزر استخدام "التحرك وقطع" أداة ليذهب أكثر من ذلك يدويا. مواصلة التحرك الهدف إلى وجهات جديدة وتكرار القطع بالليزر حتى يتم تشريح شريحة تماما أو تم جمع المبلغ المطلوب من الأنسجة (عادة 100 الغدد حميدة تسفر 150-500 نانوغرام من RNA). (انظر المثال في الشكل 1A).
  7. إزالة بعناية أنابيب من صاحب جمع وإغلاق القبعات، واضعة في اعتبارها من تحلل العازلة والأنسجة في مباراة دولية. أجهزة الطرد المركزي لفترة وجيزة لمدة 30 ثانية لجمع السائل والأنسجة في الجزء السفلي من الأنبوب. احتضان العينات عند 42 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة وتخزينها في -80 درجة مئوية لتصبح جاهزة لعزل الحمض النووي الريبي.

5. مجموع العزلة RNA مع الفيلكيت القائم ثالثا وتحليل الجودة

  1. ذوبان الجليد من الأنابيب على الجليد وتبرزي حجم من الحل إلى 100 ميكرولتر.
  2. قبل الرطب مرشح الصغير من العزلة عدة RNA عن طريق تطبيق 30 ميكرولتر ofLysis الحل إلى مركز للتصفية والسماح لها لامتصاص whileperforming الخطوتين التاليتين (5 دقائق على الأقل).
  3. إضافة 3 ميكرولتر من LCM مضافة الحل (المنصوص عليها في عدة) إلى المحللة ومزيج من قبل vortexing لمدة 5 ثانية. أجهزة الطرد المركزي لمدة 30 ثانية لجمع السائل في الجزء السفلي من الأنبوب.
  4. الطرد المركزي فلتر مبلل قبل ل~ 30 ثانية في سرعة قصوى لإزالة السائل.
  5. إضافة 1.25 مجلدات (في هذه الحالة 129 ميكرولتر) من الإيثانول بنسبة 100٪ إلى خليط المحللة، بلطف دوامة أو ماصة صعودا وهبوطا. ** هذه الطريقة سوف يتعافى كلا النوعين RNA الكبيرة والصغيرة.
  6. تحميل العينة على مرشح الصغيرة المبللة مسبقا، وأجهزة الطرد المركزي في 10000 x ج لمدة 1 دقيقة لربط RNA إلى التصفية. ثم يغسل فلتر الجزئي مع 180 ميكرولتر من "غسل الحل 1، R21؛ أجهزة الطرد المركزي في 10000 x ج لمدة 1 دقيقة.
    ملاحظة: من ينبغي أن يتم هذه النقطة على كل centrifugations في 13000 x ج، أو الحد الأقصى للسرعة.
  7. غسل تصفية مرتين مع 180 ميكرولتر من "الحلول غسل 2 و 3"، على التوالي وفقا لتوجيهات بروتوكول عدة. أجهزة الطرد المركزي لمدة 30 ثانية، ثم تجاهل التدفق من خلال وتدور مرشح لمدة 1 دقيقة لإزالة السوائل المتبقية وتجفيف التصفية.
  8. نقل فلتر لأنبوب المجموعة الجديدة.
  9. حل الدافئ شطف إلى -95 ° C (المقدمة مع عدة).
  10. تطبيق 10 ميكرولتر من محلول شطف محمى على مركز للتصفية، أغلق الغطاء وتخزينها لمدة 5 دقائق على RT. ثم الطرد المركزي لمدة 1 دقيقة إلى أزل الحمض النووي الريبي، وكرر هذه الخطوة لمرة واحدة أن تسفر ~ 20 ميكرولتر من الحمض النووي الريبي.
  11. إجراء العلاج الدناز I لمدة 15 دقيقة عند 37 ° C.
  12. تحديد الحمض النووي الريبي التي كتبها الطيف مع الامتصاصية في 260 نانومتر. يتم استخدام نسبة الكثافة البصرية في موجات من 260 نانومتر و 280 نانومتر لتقييم نقاءالحمض النووي الريبي (انظر الجدول 1) 15.

6. جين تحليل التعبير

ملاحظة: التعبير الجيني للأنواع RNA طويلة (مثل من mRNAs وlncRNAs) هو مبين في الخطوة 6.1 والأنواع RNA قصيرة (مثل microRNAs) يظهر في الخطوة 6.2. هي مجموعات المختلفة المتاحة لRT-QPCR وكمية من الحمض النووي الريبي المطلوبة تختلف حسب عدة (أقل من 10 نانوغرام). يوصف تحليل الحمض النووي الريبي التسلسل في 6.3.

  1. نسخ العكسي (RT) الحمض النووي الريبي إلى [كدنا خلط 5 ميكرولتر من 20 نانوغرام / ميكرولتر عينة الحمض النووي الريبي مع 5 ميكرولتر من مزيج الرئيسي RT (RT العازلة، وdNTP، الاشعال عشوائية، RT انزيم، ريبونوكلياز المانع). احتضان رد فعل لمدة 25 دقيقة في درجة حرارة 25 مئوية، ثم 120 دقيقة عند 37 درجة مئوية و 5 دقائق عند 85 ° C.
  2. تمييع رد فعل RT 01:10 مع ريبونوكلياز المياه مجانا واستخدام 2.5 ميكرولتر في 10 ميكرولتر QPCR رد فعل مع الاشعال أو مجموعات التمهيدي / مسبار للجينات الفائدة.
    ملاحظة: لتسهيل تحليل RNA المتدهورة جزئيا ومن المستحسن استخدام بادئات FOص amplicons أقصر (أقل من 100 سنة مضت) 16 (الجدول 2B)
    1. لتحليل التعبير الرنا الميكروي تشغيل رد فعل RT عن طريق خلط 5 ميكرولتر من 2-10 نانوغرام / ميكرولتر عينة الحمض النووي الريبي مع 5 ميكرولتر من مزيج الرئيسي RT.
      ملاحظة: تتطلب مقرها PCR-كل تكنولوجيا الكشف الرنا الميكروي المتاحة تجاريا استخدام الملكية ومحددة الاشعال RT.
  3. بدلا من أو بالإضافة إلى RT-PCR، استخدم الجيل القادم التسلسل (RNA وما يليها أو الصغيرة RNA وما يليها) لتحديد أنواع مختلفة من الرنا. عادة، استخدم 500 نانوغرام من الحمض النووي الريبي لهذا الإجراء (الجدول 3) وتنفيذ طريقة كما هو مبين في الصك الشركة المصنعة والكشف.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في دراسة سابقة أثبتنا استخدام LCM لجمع الأنسجة الظهارية واللحمية لمقارنة التنميط التعبير بواسطة RT-QPCR مرنا وmicroRNAs من أنسجة البروستات المجمدة وFFPE من نفس المريض (4). LCM هو مضيعة للوقت، خاصة إذا كمية كبيرة من RNA التي يتعين جمعها لتحليل تسلسل الجيل القادم. لذا، فمن الأهمية بمكان للحفاظ على مساحة العمل والأدوات ريبونوكلياز الحرة. فمن المستحسن لفحص الجودة وخلايا خصوصية التحكم في الحمض النووي الريبي التي تم جمعها (مناقشتها بمزيد من التفصيل في الفقرة التالية).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

التنميط الجيني التعبير من العينات البشرية يمكن أن يكون تحديا، ليس فقط بالنسبة للنوعية أو كمية من النسيج المتاحة، ولكن أيضا لمختلف الكيانات النسيجية الموجودة في عينة نسيج معين. هذا هو تحديا من نوع خاص في البروستاتا الذي أنسجة حميدة إلى حد كبير الأنسجة اللحمية ومجالات السرطان هي خالية من سدى. LCM يسهل الفصل المادي بين سدى البروستاتا وظهارة RNA للتوقيع أكثر دقة من اثنين من أنواع مختلفة من الخلايا (الشكل 1A). بالمقارنة مع macrodissection أو معالجة الأنسجة كله، يمكن LC...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نشكر الدكتورة فيكي ماسياس وأنجلين جيانغريكو وأفاني فايشناف للمساعدة في تحسين هذه المنهجية على مر السنين ويانغ تشانغ والدكتور جيان ما في جامعة إلينوي في أوربانا شامبين لتحليل تسلسل الحمض النووي الريبي. تم دعم هذا العمل من قبل NIH / NCI R01 CA166588-01 (Nonn) ، الباحث البحثي في جمعية السرطان الأمريكية 124264-RSG-13-012-01-CNE (Nonn) ، NIH / NCI R03 CA172827-01 (Nonn) ، DOD-CDMPR PRCP جائزة فكرة التفاوتات الصحية PRCP PC121923 (Nonn) ومنحة مؤسسة الوقاية من السرطان (Zhou).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
RNase-AWAY MBP7005-11
PEN-membrane 4.0 مم الشرائح  زجاجلايكا 11600289
، Superfrost PlusFisherBrand12-550-15
ديكون مقاومة للإيثانول 200.2701
DEPC (بيروكربونات ثنائي إيثيل)SigmaD-5758
CryostatLeicaCM3050
Coplins (جرة تلطيخ)IHCWORLDM900-12
Coplins (رف تلطيخ)IHCWORLDM905-12
Aperio ScanScopeAperio (Leica)ScanScope® ؛ CS
Toluidine BlueFluka89640-5G
نظام التشريح الدقيق بالليزرLeicaLMD7000
0.5 مل أنابيب رقيقة الجدران ل LCMThermo ScientificAB-0350
RNAqueous® ؛ - طقم عزل الحمض النووي الريبي الكلي الصغيرAmbionAM1931Thermo Fisher Scientific العلامة التجارية
NanoDropThermo ScientificND-1000
كيوبت 2.0 تقنيات حياة الفلورQ32866Thermo Fisher Scientific العلامة التجارية
عالية السعة cDNA النسخ العكسي كيتالنظم الحيوية التطبيقية4368814Thermo Fisher Scientific العلامة التجارية
العالمي (cDNA) مجموعة التوليف II ، 8-64 rxnsExiqon203301
TaqMan microRNA RTمجموعة الأنظمة الحيوية التطبيقية4366597Thermo Fisher Scientific العلامة التجارية
هيماتوكسيلين صبغة  شركة ريكا للكيماويات3536-16
Eosin-Y,ريتشارد آلان العلمي 7111
شرائح مختبرات

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Schauer, I. G., Rowley, D. R. The functional role of reactive stroma in benign prostatic hyperplasia. Differentiation. 82, 200-210 (2011).
  2. Peehl, D. M. Primary cell cultures as models of prostate cancer development. Endocrine-related cancer. 12, 19-47 (2005).
  3. McNeal, J. E., Haillot, O. Patterns of spread of adenocarcinoma in the prostate as related to cancer volume. The Prostate. 49, 48-57 (2001).
  4. Nonn, L., Vaishnav, A., Gallagher, L., Gann, P. H. mRNA and micro-RNA expression analysis in laser-capture microdissected prostate biopsies: valuable tool for risk assessment and prevention trials. Experimental and molecular pathology. 88, 45-51 (2010).
  5. Long, Q., et al. Global transcriptome analysis of formalin-fixed prostate cancer specimens identifies biomarkers of disease recurrence. Cancer research. 74, 3228-3237 (2014).
  6. Long, Q., et al. Protein-coding and microRNA biomarkers of recurrence of prostate cancer following radical prostatectomy. The American journal of pathology. 179, 46-54 (2011).
  7. Giangreco, A. A., et al. Differential expression and regulation of vitamin D hydroxylases and inflammatory genes in prostate stroma and epithelium by 1,25-dihydroxyvitamin D in men with prostate cancer and an in vitro. model. The Journal of steroid biochemistry and molecular biology. , (2014).
  8. Giangreco, A. A., et al. Tumor suppressor microRNAs, miR-100 and -125b, are regulated by 1,25-dihydroxyvitamin D in primary prostate cells and in patient tissue. Cancer prevention research. 6, 483-494 (2013).
  9. Mihelich, B. L., et al. miR-183-96-182 cluster is overexpressed in prostate tissue and regulates zinc homeostasis in prostate cells. The Journal of biological chemistry. 286, 44503-44511 (2011).
  10. Bevilacqua, C., Makhzami, S., Helbling, J. C., Defrenaix, P., Martin, P. Maintaining RNA integrity in a homogeneous population of mammary epithelial cells isolated by Laser Capture Microdissection. BMC cell biology. 11, 95(2010).
  11. Gregg, J. L., Brown, K. E., Mintz, E. M., Piontkivska, H., Fraizer, G. C. Analysis of gene expression in prostate cancer epithelial and interstitial stromal cells using laser capture microdissection. BMC cancer. 10, 165(2010).
  12. Hart, M., et al. Comparative microRNA profiling of prostate carcinomas with increasing tumor stage by deep sequencing. Molecular cancer research : MCR. 12, 250-263 (2014).
  13. Smalheiser, N. R., Lugli, G., Thimmapuram, J., Cook, E. H., Larson, J. Endogenous siRNAs and noncoding RNA-derived small RNAs are expressed in adult mouse hippocampus and are up-regulated in olfactory discrimination training. Rna. 17, 166-181 (2011).
  14. Song, C., et al. Expression profile analysis of microRNAs in prostate cancer by next-generation sequencing. The Prostate. 75, 500-516 (2015).
  15. Deng, M. Y., Wang, H., Ward, G. B., Beckham, T. R., McKenna, T. S. Comparison of six RNA extraction methods for the detection of classical swine fever virus by real-time and conventional reverse transcription-PCR. Journal of veterinary diagnostic investigation : official publication of the American Association of Veterinary Laboratory Diagnosticians, Inc. 17, 574-578 (2005).
  16. Kong, H., et al. Quantitative assessment of short amplicons in FFPE-derived long-chain RNA. Scientific reports. 4, 7246(2014).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة