تقوم هذه الطريقة بتقييم غزو الخلايا السرطانية من الكرات إلى مصفوفة ثلاثية الأبعاد محيطة. يتم إنشاء الكرات الكروية عبر طريقة زراعة القطرات المعلقة ثم يتم تضمينها في مصفوفة تتكون من مواد الغشاء القاعدي والكولاجين من النوع الأول. يتم مراقبة الغزو من الكرويات لاحقا.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
خلية السرطان كروي الفحص لتقييم الغزو في إعداد 3D
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
< p class = 'jove_content'>يعتقد أن الطبيعة الغازية لخطوط الخلايا السرطانية ترتبط بإمكاناتها النقيلية. ومع ذلك ، فإن معظم المقايسات التقليدية لا تفحص هذه الميزات الغازية في بيئة ثلاثية الأبعاد وتعاني البيانات الناتجة من انخفاض قابلية التطبيق البيولوجي. هنا يتم تقديم نهج لتصور القدرة الغازية لخطوط الخلايا في بيئة ذات صلة من الناحية الفسيولوجية. يستخدم مقايسة الغزو الكروي للخلايا السرطانية الجاذبية أولا لتوليد كرويات داخل قطرات من الوسائط التي تتدلى من غطاء طبق زراعة الخلايا. بعد ذلك ، يتم تضمين هذه الكرويات في مصفوفة ثلاثية الأبعاد تتكون من مزيج من مواد الغشاء القاعدي والكولاجين من النوع الأول. ثم تتم مراقبة خروج الخلايا السرطانية من الكرويات إلى المصفوفة المحيطة بمرور الوقت. يمكن تعديل الطريقة الموضحة هنا لفحص الغزو بعد الزراعة المشتركة لأنواع مختلفة من الخلايا ، أو إدراج الأدوية / المثبطات ، أو التغيرات في مكونات المصفوفة خارج الخلية (ECM).
المقدمة
ثبت أن الحركة الخلايا السرطانية هي التنبؤية المحتملة المتنقل، بالنظر إلى أن مثل هذا السلوك يسهل الغزو من خلال الغشاء القاعدي والدخول في الدورة الدموية 1. وقد ركزت معظم البحوث على الحركة على كيفية سلوك الخلايا في ثنائي الأبعاد (2D) الإعداد، على الرغم من أنه أصبح من المسلم به على نطاق واسع أن حركة الخلايا في ثلاثية الأبعاد (3D) المصفوفة هي أكثر تمثيلا لكيف يمكن لهذه الخلايا نفسها سوف فعلا تتصرف في الجسم الحي 2. وتستخدم نظم الاستزراع 3D على نحو متزايد لدراسة السلوكيات الخلوية التي تتراوح من مورفولوجيا الخلايا، لحركية النمو وحساسية العقاقير 3. وقد أدى الرغبة في رصد سرطان غزو الخلايا في إطار محيط 3D لتوليف التقنيات المحددة سابقا التي تنطوي على جيل من المجاميع خلية 3D (الكروية) عن طريق أسلوب ثقافة الإفلات شنقا 4، تليها تضمين هذه الأجسام الشبه الكروية إلى خارج الخلية 3D مصفوفة (ECM) تتألف من الكولاجين والغشاء القاعدي المواد 5. ويسعى هذا الأسلوب إلى تحسين هذه التقنيات المحددة سابقا من خلال توفير نهج مبسط التي يمكن استخدامها بسهولة لمقارنة الغزو في إطار مجموعة من الظروف التجريبية.
الطرق التقليدية أكثر لتقييم حركية الخلية في المختبر هي فحص الجرح الصفر وفحص transwell 6. الفحص السابق يصور حركية الخلية في وضع 2D، وبالتالي فهي مستقلة عن مجموعة متنوعة من الميزات الهامة في الجسم الحي الغزو، مثل نشاط الأنزيم البروتيني 7. مقايسة transwell يمكن غزو الخلايا نموذج أفضل عندما تكون مغلفة يدرج بشكل جيد مع ركائز ECM، ولكن فقط معلمة واحدة، أي ظهور الخلايا على العكس سطح غشاء يقاس، والعديد من الفروق الدقيقة من غزو الخلايا وبالتالي لا يمكن ملاحظتها بسهولة. وعلى النقيض من هذه التقنيات، وفحص الخلايا السرطانية غزو كروي (الشكل 1 </ قوي>) يسمح للرصد في الوقت الحقيقي من غزو الخلايا في إعداد هذا ليس من الناحية الفسيولوجية ذات الصلة فقط، ولكن أيضا يسمح الميزات الهامة خلية خط محدد لأن تصور، مثل هجرة الخلايا الفردية مقابل الجماعية 8. هذا الأسلوب يتيح أيضا مزايا أكثر من فحوصات النمو الثقافة 3D القياسية. توليد المجاميع الخلوية عبر طريقة انخفاض شنقا يحد في البداية حركة الخلية، بحيث يتم تحفيز الخلايا لغزو بعد رفع هذا القيد. وعلاوة على ذلك، حالما يتم رفع هذا القيد، والخروج خلية تسير في اتجاه موحد ويمكن بعد ذلك quantitated مريح.
المواد ECM الأكثر شعبية المستخدمة في الخلايا السرطانية الكروية المقايسات Matrigel والنوع الأول الكولاجين، حيث كل عنصر من هذه العناصر أدوارا هامة ومميزة في التأثير على سلوك النقيلي. Matrigel هو خليط يفرز من البروتينات التي تنتجها الخلايا ساركوما Engelbreth-هولم سرب الماوس، وأثرت في basemeبروتينات الغشاء الإقليم الشمالي مثل laminin، entactin، والنوع الرابع الكولاجين 9. لهذا السبب Matrigel يشار من الآن فصاعدا باسم "المواد الغشاء القاعدي". وتوفر هذه المواد الغشاء القاعدي بروابط الأساسية اللازمة لإنتغرين التصاق خلال السرطان غزو الخلايا 10 بالإضافة إلى العديد من البروتينات الأخرى التي تمارس مجموعة من الآثار على سلوك الخلية 11. في المقابل، النوع الأول الكولاجين، الذي أعد عادة من هضم الحمض الأوتار والهياكل الكولاجينية الكثيفة، 12، هو مادة مصفوفة أبسط من ذلك بكثير التي هي بمثابة العنصر الهيكلي الرئيسي للأنسجة وسدى دعم الأنسجة والأعضاء الضام في الجسم. وقد ثبت أن الخصائص الفيزيائية للالكولاجين يمكن أن تنظم عددا من ملامح الحركة الخلية؛ على سبيل المثال، في محاذاة الألياف الكولاجين في واجهة للورم انسجة تسمح الخلايا السرطانية للهجرة في وقت لاحق على طول تلك الألياف عند غزو في سدى 13. في مقايسة المقدمة هنا، سواء النوع الأول الكولاجين ويتم استخدام المواد الغشاء القاعدي وسيلة لدراسة سرطان 3D خلية سدى التفاعلات.
تأثير تثبيط أو تنشيط مسارات التي تتحكم يمكن رصدها الغزو بعد أن تم جزءا لا يتجزأ من الخلايا في مصفوفة 3D. يمكن سابقة التجهيز الخلايا أثناء النمو في قطرات شنقا أو عند نقله الى ثقافة 3D، اعتمادا على ما إذا كان سوف تكون هناك حاجة إلى علاج طويل لتعديل الغزو. لعلاج أقصر، فمن المستحسن أن العقار أن تكون مختلطة مع تعليق كروي بعد جمع، وكذلك وسائل الإعلام التي ستحيط الثقافات 3D، لتسهيل التعرض الكافي للخلايا المخدرات. المقبل، خلايا انسجة طبيعية أو المرتبطة الورم يمكن ممزوجة مع مواد مصفوفة لتقييم دورها في تحوير غزو الخلايا السرطانية، أو لتحديد كيفية يشير التأثيرات سلوك الخلية نظير الصماوي وautocrine. وقد أظهرت هذه الفكرة في الدراسة حيث coculture من العقيدعلى السرطانية والخلايا البطانية في قطرات شنقا أدى إلى شبكة الأوعية الدموية داخل الكروية 14. وأخيرا، يمكن أيضا مكونات ECM يمكن تغييرها، كما يتأثر غزو الخلايا السرطانية عن طريق ركائز مختلفة 15. وبالتالي فإن الطريقة المعروضة أدناه إطارا لتقييم غزو الخلايا السرطانية في إطار مجموعة من الشروط. بشكل عام تبين أن ليس جميع خطوط الخلايا خلق الكروية في قطرات شنقا وخطوط الخلايا الظهارية المظهر عادة تشكل مجالات العادية.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1. توليد الأجسام الشبه الكروية
- إعداد وحيدة الخلية تعليق لتعليق الثقافات قطرة فصل الثقافات الخلايا السرطانية ملتصقة من ~ 70٪ التقاء باستخدام PBS غسل تليها التعرض إلى 0.05٪ التربسين-EDTA الحل.
- تحييد الحل التربسين مع وسائل الإعلام ثقافة الخلية وعدد الخلايا باستخدام قسامة لتعليق الخلية. ملاحظة: وسائل الإعلام ثقافة الخلية معينا سوف تعتمد على خط الخلية التي يجري اختبارها. اتبع توصيات سائل الإعلام ATCC، حيث وسائل الإعلام ثقافة الخلية عادة DMEM + 10٪ FBS. ويمكن الاطلاع على مزيد من المعلومات في جدول المواد.
- إجراء تخفيف للسماح لزرع البذور من 500-1،000 الخلايا في 20 قطرة ميكرولتر من وسائل الإعلام ثقافة الخلية.
- الحصول على صحن 10 سم وإضافة 5 مل من برنامج تلفزيوني العقيمة إلى أسفل. ملاحظة: هذه الخطوة تحمي قطرات شنقا من التبخر. من حيث التكلفة أقل "الصف البكتريولوجية" أطباق يمكن استخدامها في مكان من الأطباق الصف زراعة الخلايا، وكذلك الخلايا لا تابعالتصرف سطح الثقافة.
- استخدام الماصة متعدد القنوات لنقل 20 قطرات ميكرولتر من تعليق خلية المخفف إلى السطح الداخلي للغطاء.
- الماصة 40 قطرات (5 صفوف من 8 قطرات) على غطاء صحن 10 سم.
- عكس الغطاء ومكان على طبق الثقافة. احتضان الثقافات قطرة شنقا في 37 درجة مئوية لمدة 72 ساعة لتوليد الأجسام الشبه الكروية.
- الوجه الغطاء في اثقة، الطريقة التي تسيطر عليها حتى الان. ملاحظة: للقلب غطاء سريعة جدا أو بطيئة جدا قد يسبب قطرات للتحول. بعض خطوط الخلايا قد شكل الكروية في 48 ساعة أو أقل، في حين أن البعض الآخر قد يتطلب أكثر من 72 ساعة لإنتاج الركام المدمجة.
2. تضمين من الأجسام الشبه الكروية في مصفوفة 3D
- ذوبان الجليد قسامة من النمو انخفاض عامل الطابق السفلي المواد غشاء عند 4 درجات مئوية خلال الليل قبل تضمين الكروية.
- اختياري: آبار طبقة مع ECM مقدما لمنع التفاعل كروي محتمل مع cultu الأنسجةإعادة السطح.
- الماصة 200 ميكرولتر من ECM لكل بئر في لوحة 24-جيدا.
- إمالة لوحة للتأكد من أن ECM يغطي السطح جيدا بأكمله.
- إزالة بعناية ECM الزائد مع الماصة.
- احتضان لوحة حتى آبار جافة: 3 ساعة في درجة حرارة الغرفة أو بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
- اختياري: آبار طبقة مع ECM مقدما لمنع التفاعل كروي محتمل مع cultu الأنسجةإعادة السطح.
- جمع الكروية عن طريق إمالة غطاء صحن زراعة الأنسجة وتجمع وسائل الإعلام. نقل وسائل الإعلام مع الكروية في أنبوب microcentrifuge 1.5 مل.
- سماح 10 دقيقة للالكروية ليستقر على الجزء السفلي من أنبوب microcentrifuge. وينبغي أن يكون الكروية مرئية بالعين.
- مزيج 100 ميكرولتر من المواد الغشاء القاعدي مع 100 ميكرولتر من البرد (4 ° C) النوع الأول من الكولاجين في أنبوب قبل المبردة منفصل. نضع الخليط في 4 درجات مئوية لمنع أي هلام من ترسيخ قبل الأوان.
- استخدام نصائح الماصة قبل المبردة إذا نقل كميات صغيرة.
- تقديم الرعاية عندماخلط المواد الغشاء القاعدي والكولاجين النوع الأول لمنع تشكيل فقاعة الهواء. ملاحظة: فقاعات الهواء قد تعيق التصوير في وقت لاحق في البروتوكول إذا أصبحت جزءا لا يتجزأ من هلام.
- نضح الكروية من 40 ميكرولتر الجزء السفلي من أنبوب microcentrifuge، ويتحد مع المواد الغشاء القاعدي / النوع الأول الكولاجين الخليط. كن حذرا لمنع تشكيل فقاعة الهواء عند خلط. ملاحظة: محلول يحتوي على 100 ميكرولتر المواد الغشاء القاعدي، 100 نوع ميكرولتر أنا الكولاجين، و 40 ميكرولتر من الكروية سيخلق ما يكفي من المواد لمدة 4 الثقافات 3D مستقلة. يمكن زيادتها هذا أعلى أو لأسفل.
- الماصة 40 قطرات ميكرولتر من مزيج لزج في مراكز الآبار على طبق من ذهب 24-جيدا. يحافظ على لوحة لمنع خليط من الوقوع في جانب البئر. ملاحظة: A عمود واحد على لوحة 24-جيدا - يوصى لكل حالة لفحصها - 4 آبار.
- وضع لوحة الباحثالزراعة العضوية 37 ° C الحاضنة وترك دون عائق لمدة 30 دقيقة. إن ثقافة 3D تتبلمر خلال هذه الفترة.
- يغرق ببطء الثقافات 3D في 1 مل من وسائل الإعلام ثقافة الخلية.
- تأكد من أن وسائل الإعلام دافئة عند إضافته إلى الآبار لزيادة تعزيز هلام البلمرة.
- خطوة حاسمة: إضافة بلطف وسائل الإعلام على ثقافات 3D. يمكن pipetting لوسائل الإعلام بسرعة كبيرة جدا في الآبار يؤدي إلى مفرزة من الثقافات 3D من سطح زراعة الأنسجة.
3. رصد وتحليل كروي الغزو
- غزو صورة من الكروية في مصفوفة 3D المحيطة في نقطة زمنية قررت من قبل المحقق. الحصول على الصور باستخدام مجهر مقلوب مع عدسة الهدف 20X. ملاحظة: تختلف مثالية نقاط الوقت اعتمادا على خط الخلية التي يجري اختبارها. وسوف تبدأ خطوط الخلايا أكثر الغازية الخروج بهم من الكروية بعد وقت قصير من الطلاء، وبالتالي تأخذ صورة أوليةالصورة في غضون بضع ساعات بعد الطلاء. عموما، يتم أخذ الصور في 0 ساعة (بعد الطلاء)، 24 ساعة، و 48 ساعة. الغزو يخلص عادة 24 إلى 48 ساعة بعد الطلاء.
- Quantitate القدرة الغازية باستخدام برمجيات تحليل الصور مثل صورة J.
- تحليل الغزو والمسافة خلية من على حافة كروي.
- استخدام أداة رسم مستقيم بمناسبة دائرة نصف قطرها و / أو المسافة الغازية القصوى.
- انقر على زر "تحليل" في القائمة العلوية، ثم انقر فوق "القياس" لعرض قياس الطول.
- تحليل الغزو كما إجمالي المساحة الغازية خارج كروي.
- استخدام أداة رسم حر لتتبع حدود كروي و / أو المساحة الإجمالية الغازية.
- انقر على زر "تحليل" في القائمة العلوية، ثم انقر فوق "القياس" لعرض قياس المنطقة.
- استخدام البرنامج المساعد مثل أدوات إدارة ROI لخلق قياسات كومة من الصور.
- تحليل الغزو والمسافة خلية من على حافة كروي.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
تم اختبار باستخدام مقايسة غزو كروي (الشكل 1)، فريق من خطوط الخلايا السرطانية لقدرتها على تشكيل الأجسام الشبه الكروية، فضلا عن كمية من الخروج خلية عرضت بعد زرع في مصفوفة 3D تتكون من مواد الغشاء القاعدي والنوع الأول الكولاجين (الجدول 1). هذه النتائج تثبت أنه ما كل خط الخلايا السرطانية خلق الكروية بشكل جيد، حيث خطوط الخلايا الظهارية حيازة التشكل في المختبر تميل إلى إنتاج المجاميع العادية وعلى نحو سلس. وكانت قدرة خطوط مختلفة من الخلايا لغزو ف...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
قيمت هذه الدراسة أداء لجنة من خطوط الخلايا السرطانية في مقايسة غزو كروي (الجدول 1). عموما، نجد أن تتعزز تشكيل كروي في المزيد من خطوط الخلايا الظهارية المظهر، حيث وجود تقاطعات خلية خلية يشجع على تشكيل بنية تشبه كروي. خطوط الخلايا المعروفة التي خضعت لالانتقالية الظهارية الوسيطة، مثل MDA-MB-231 الخلايا لا تشكل الأجسام الشبه الكروية في الثقافة انخفاض شنقا على الأرجح بسبب من انخفاض E-، N-، وP-كادهيرين التعبير 16.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
يعلن المؤلفون أنه ليس لديهم مصالح مالية متنافسة.
شكر وتقدير
بدعم من المعاهد الوطنية للصحة منح P30 CA051008 وT32 CA009686 (ATR).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| عامل نمو Matrigel Reduced | Corning | CB-40234 | |
| Collagen Type I ، ذيل الفئران ، 100 مجم | Millipore | 08-115 | |
| DMEM | Life Technologies | 11995-065 | |
| RPMI 1640 Medium & nbsp ؛ | Life Technologies | 11875-093 | |
| PBS | Life Technologies | 10010-023 | |
| 0.05٪ Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25300-054 | |
| مصل الأبقار الجنيني ، | أوميغا Scientific | FB-12 | |
| 100 مم أطباق معالجة TC | Corning | 430167 | |
| 24 بئرا من الألواح المعالجة TC | NEST علم التكنولوجيا الحيوية | 702001 | |
| أوليمبوس IX-71 | |||
| في DMEM + 10٪ FBS ، مع توقع خلايا BT-474 و LNCaP ، والتي تم الاحتفاظ بها في RPMI + 10٪ FBS. |
المراجع
- Chambers, A. F., Groom, A. C., MacDonald, I. C. Metastasis: Dissemination and growth of cancer cells in metastatic sites. Nat Rev. Cancer. 2 (8), (2002).
- Schmeichel, K. L., Bissell, M. J. Modeling tissue-specific signaling and organ function in three dimensions. J Cell Sci. 116 (12), 2377-2388 (2003).
- Yamada, K. M., Cukierman, E. Modeling tissue morphogenesis and cancer in 3D. Cell. 130 (4), (2007).
- Foty, R. A simple hanging drop cell culture protocol for generation of 3D spheroids. J Vis Exp. 51, (2011).
- Del Duca,, Werbowetski, D., T,, Del Maestro,, F, R. Spheroid preparation from hanging drops: characterization of a model of brain tumor invasion. J Neuro-Oncol. 67 (3), (2004).
- Justus, C. R., Leffler, N., Ruiz-Echevarria, M., Yang, L. V. In vitro cell migration and invasion assays. J Vis Exp. 88, (2014).
- Ramos-DeSimone, N., Hahn-Dantona, E., Sipley, J., Nagase, H., French, D. L., Quigley, J. P. Activation of matrix metalloproteinase-9 (MMP-9) via a converging plasmin/stromelysin-1 cascade enhances tumor cell invasion. J Bio Chem. 274 (19), Forthcoming.
- Friedl, P., Wolf, K. Tumour-cell invasion and migration: diversity and escape mechanisms. Nature Rev. Cancer. 3 (5), 362-374 (2003).
- Kleinman, H. K., Martin, G. R. Matrigel: Basement membrane matrix with biological activity. Semin Cancer Biol. 15 (5), 378-386 (2005).
- Shaw, L. M., Chao, C., Wewer, U. M., Mercurio, A. M. Function of the integrin α6β1 in metastatic breast carcinoma cells assessed by expression of a dominant-negative receptor. Cancer Res. 56 (5), 959-963 (1996).
- Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. A. Matrigel: a complex protein mixture required for optimal growth of cell culture. Proteomics. 10 (9), (2010).
- Rajan, N., Habermehl, J., Coté, M. -F., Doillon, C. J., Mantovani, D. Preparation of ready-to-use, storable and reconstituted type I collagen from rat tail tendon for tissue engineering applications. Nat Protoc. 1 (6), (2006).
- Provenzano, P. P., Eliceiri, K. W., Campbell, J. M. Collagen reorganization at the tumor-stromal interface facilitates local invasion. BMC Med. 4 (1), (2006).
- Timmins, N. E., Nielsen, L. K. Generation of multicellular tumor spheroids by the hanging-drop method. Methods Mol Med. 140, 141-151 (2007).
- Brenner, W., Groß, S., Steinbach, F., Horn, S., Hohenfellner, R., Thüroff, J. W. Differential inhibition of renal cancer cell invasion mediated by fibronectin, collagen IV and laminin. Cancer Lett. 155, 199-205 (2000).
- Nieman, M. T., Prudoff, R. S., Johnson, K. R., Wheelock, M. J. N-cadherin promotes motility in human breast cancer cells regardless of their E-cadherin expression. J Cell Biol. 147 (3), Forthcoming.
- Cheung, K. J., Gabrielson, E., Werb, Z., Ewald, A. J. Collective invasion in breast cancer requires a conserved basal epithelial program. Cell. 155 (7), (2013).
- Sodek, K. L., Brown, T. J., Ringuette, M. J. Collagen I but not Matrigel matrices provide an MMP-dependent barrier to ovarian cancer cell penetration. BMC Cancer. 8 (1), 223-2210 (2008).
- Nguyen-Ngoc, K. V., Ewald, A. J. Mammary ductal elongation and myoepithelial migration are regulated by the composition of the extracellular matrix. J Microsc. 251 (3), 212-223 (2013).
- Glinskii, A. B., Smith, B. A., Jiang, P., Li, X., Yang, M., Hoffman, R. M., Glinsky, G. V. Viable circulating metastatic cells produced in orthotopic but not ectopic prostate cancer models. Cancer Res. 63 (14), 4239-4243 (2003).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
