Method Article

استخراج متتابعة من القابلة للذوبان وغير القابلة للذوبان ألفا Synuclein من أدمغة الشلل الارتعاشي

DOI:

10.3791/53415

⸱

January 5th, 2016

1Reta Lila Weston Institute of Neurological Studies, UCL Institute of Neurology

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا ، نقدم بروتوكولا لعزل ألفا سينوكلين (α-syn) غير القابل للذوبان / المجمعة بشكل متزايد من أنسجة المخ البشري بعد الوفاة. من خلال استخدام المخازن المؤقتة ذات قوة المنظفات المتزايدة وتقنيات الطرد المركزي الفائق عالية السرعة ، يمكن فحص الخصائص المتغيرة لتجميع α-syn في الأنسجة المريضة وغير المريضة.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ألفا synuclein وأعربت (α-اصطناعي) البروتين بكثرة أساسا داخل الخلايا العصبية، وتوجد في عدة أشكال مختلفة - أحادية، tetramers، oligomers والألياف. أثناء المرض، α-اصطناعي يخضع لتغيرات متعلق بتكوين تشكيل oligomers وارتفاع المجاميع الوزن الجزيئي التي تميل إلى جعل البروتين أكثر غير قابلة للذوبان. بشكل غير طبيعي مجمعة α-اصطناعي هو سمة من سمات عصبية مرضية من مرض باركنسون (PD)، والخرف مع الهيئات ليوي (DLB) وضمور في النظام المتعدد (MSA). توصيف وتحليل غير قابلة للذوبان مخازن-SYN α باستخدام مع زيادة قوة المنظفات وعالية السرعة تنبيذ فائق الكيمياء الحيوية ويوفر أداة قوية لتحديد وتطوير علم الأمراض α-اصطناعي يرتبط تطور المرض. يصف هذا البروتوكول عزلة غير قابلة للذوبان متزايد / مجمعة α-اصطناعي من بعد الوفاة أنسجة المخ الإنسان. هذه المنهجية يمكن تكييفها مع بعض التعديلات لدراسات α العادية وغير العاديةعلم الأحياء -syn في النماذج الحيوانية المعدلة وراثيا إيواء مختلفة الطفرات SYN α وكذلك في الأمراض العصبية الأخرى التي تتميز الودائع ييفي الشاذة من البروتينات المرتبطة بأمراض كل منها.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

واحدة من السمات المرضية رئيسية مشتركة بين عدة أمراض الاعصاب هو تشكيل المجاميع البروتين الشاذة التي تحدث في بروتين / المرض بطريقة محددة 1. وبالتالي، هناك المميزة extraneuronal ويحات أميلويد بيتا والمجمعة ودائع تاو hyperphosphorylated داخل الخلايا العصبية في مرض الزهايمر (AD)؛ ودائع-α SYN المجمعة في الهيئات ليوي (LBS) التي هي شوائب داخل العصبون، وكذلك في عمليات التصنع الخلايا العصبية تسمى neurites التي ليوي (LNS) في PD، PD العته والخرف مع الهيئات ليوي (DLBs) 2-4. وتعتبر الودائع α SYN غير طبيعية أيضا في آفات مميزة لالادراج السيتوبلازمية الدبقية في MSA 5. في مرض هنتنغتون، هناك المميزة الودائع بولي-Q، وغير طبيعي القطران DNA ملزمة تودع البروتين 43 و تنصهر في البروتينات ساركوما (الفتح) في الخرف الجبهي الصدغي. الأهم لPD، تم العثور على الطفرات الجينية α-اصطناعي لالكمنولثحد ذاته جسمية مهيمنة PD 11/06. بالإضافة إلى ذلك، α-اصطناعي triplication الجين 12 و 13 الازدواجية يسبب أيضا PD العائلية التي تربط ما بين زيادة التعبير α-SYN إلى pathomechanisms من PD. والجدير بالذكر أن الحالات PD كلا متفرقة والعائلية تؤوي الودائع غير طبيعية من α-اصطناعي علم الأمراض (14). العلاجات المتاحة حاليا للPD هي مسكن فقط وليس لها أي تأثير على وقف أو تأخير تطور المرض لا يرحم.

α-اصطناعي وأعرب عن بوفرة في الدماغ البشري وتشكل حوالي 1٪ من البروتين في الدماغ الكلي. كان موجودا على نحو أكثر تحديدا في الخلايا العصبية ولكن يمكن أن توجد ولو بكميات أقل داخل الخلايا الدبقية. وهناك نقطة خلافية هي الهيكل الأصلي للα-SYN التي يمكن أن توجد كما مونومر عشوائي 15 أو في شكل tetramer مطوية 16. أثناء المرض، α-اصطناعي يتغير التشكل التي تتيح لها الحصول تتجمع ويعتقد لهذه العملية أن تكون سببا في pathoge المرضnesis. على الرغم من عدة سنوات من التحقيقات في الجوانب المرضية في جسم المريض من α-اصطناعي والمرض، وظلت الاسباب الحقيقية لآليات المرض بعيد المنال 14.

دراسات باستخدام التحليل بعد الوفاة من أدمغة الشلل الارتعاشي وفرت حتى الآن ادلة هامة بشأن البيولوجيا العادية وغير العادية لل-α SYN سواء في PD متفرقة وأيضا PD المرتبطة الطفرات في الجين LRRK2 17-22. هنا، وقد وصفت بروتوكول استخراج الكيمياء الحيوية (انظر المخطط الوارد في الشكل 1) للودائع-α SYN غير قابلة للذوبان متزايد من بعد الوفاة الأنسجة PD الدماغ التي تأوي المجاميع α-SYN بدرجات متفاوتة. ويمكن أيضا أن هذا الأسلوب يمكن تكييفها مع بعض التعديلات في التراكيب عازلة لدراسة البروتينات الكلية من الأمراض العصبية الأخرى 23،24 وأيضا من الحيوانات المعدلة وراثيا أنسجة المخ 25-27. والاعتبار الرئيسي للتكييفات هي الاختلافات في solubiعنه lity والمبالغ الإجمالية للبروتينات منها بعض منها هي أساسا النووي، وربما تحتاج مخازن عالية من الملح لاستخراج الأمثل كما هو مبين على الفتح 28.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد تبرعت أنسجة المخ بعد الوفاة إلى الملكة ساحة البنك الدماغ لعلاج الاضطرابات العصبية، جامعة كلية لندن، معهد علم الأعصاب باستخدام بروتوكولات المعتمدة أخلاقيا وتخزينها للبحوث، بموجب رخصة صادرة من قبل السلطة الأنسجة البشرية (HTA) المملكة المتحدة (رقم 12198). انظر قائمة الحالات المستخدمة لهذا البروتوكول (الجدول 1).

1. إعداد المخازن

  1. إعداد 1X TBS (المالحة تريس مخزنة) المخزن المؤقت:
    1. إعداد 10X TBS كحل الأسهم مع 500 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك 7.4 درجة الحموضة و 1،500 ملي كلوريد الصوديوم.
      1. تزن 60.5 غرام من تريس، الكلور ودرجة الحموضة 7.6 و 87.6 غرام من كلوريد الصوديوم في 800 مل من الماء عالية النقاء. ضبط درجة الحموضة مع 1 M حمض الهيدروكلوريك وجعل حجم المخزون النهائي إلى 1 L.
    2. إعداد تركيز النهائي من 1X TBS عن طريق تمييع الأسهم 10 مرات في الماء المقطر.
    3. إضافة مثبطات الأنزيم البروتيني (PI)، (1 قرص لكل 50 مل العازلة) وفوس وقفة وأقراص الفوسفاتيز المانع (1 قرص لكل 10 مل من العازلة) لإلغاء الآثار المترتبة على الإجراءات الأنزيمية غير محددة البروتياز والفسفاتازات.
      ملاحظة: وهنا استخدمنا مثبط الإنزيم أقراص من شركة روش لكن الأخرى على قدم المساواة مثبطات المتاحة تجاريا يمكن استخدامها وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
  2. إعداد العازلة TBS-SDS بإضافة 5٪ ث / ت كبريتات الصوديوم دوديسيل (SDS) ل1X TBS (الرقم الهيدروجيني 7.4) العازلة. الحرارة الحل إلى 60 درجة مئوية مع التحريك المستمر باستخدام محرك مغناطيسي لإذابة SDS.
  3. إعداد العازلة TBS-SDS-اليوريا عن طريق إضافة اليوريا إلى تركيز النهائي من 8 M ث / ت لالعازلة 1X TBS-SDS (7.4 درجة الحموضة). الحرارة الحل إلى 60 درجة مئوية مع التحريك المستمر على محرك مغناطيسي لإذابة اليوريا.

2. التجانس عينة والتفاضلية تنبيذ فائق

ملاحظة: الجزء التالي من عمل ينطوي على التعامل مع أنسجة المخ الإنسان وفقا لقواعد HTA المملكة المتحدة. يتم اتباع إجراءات التشغيل القياسية المحلية في كل منظمة الشفافية الدوليةMES. يتم تشريح عينات الدماغ من كتل الدماغ المجمدة والمواد النسيج المتجانس في microcabinet الحفاظ على الضغط السلبي. يتم ارتداء القفازات العباءات يمكن التخلص منها، أقنعة الوجه، والإفراط في حذاء حماة ونظارات السلامة في جميع أنحاء الداخلي. يتم تجاهل النفايات الأنسجة البشرية بعد التعقيم في 121 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة للتخلص الآمن. يتم التخلص من الأدوات الحادة (شفرات المشرط) في حاوية الأدوات الحادة المناسبة لاحتواء والتخلص الآمن.

  1. خذ قطعة من المجمدة الأنسجة البشرية (حوالي 0.5 غرام في الوزن من منطقة العقد القاعدية) واللحم المفروم بسرعة إلى أجزاء صغيرة (حوالي 1 ملم 2) على الجليد باستخدام صغير بتري طبق وشفرة مشرط معقم. استخدام منفصل بتري طبق وشفرة مشرط لكل عينة. جمع الأنسجة المفروم في أنبوب 15 مل وإضافة 10 مجلدات من العازلة 1XTBS الجليد الباردة إلى الأنبوب.
  2. تجانس العينات باستخدام الخالط الميكانيكية في 20000 دورة في الدقيقة لمدة 10 ثانية. تبرد على الجليد لمدة 2 دقيقة. كرر هذه المرة الخطوة الثالثةالصورة.
    ملاحظة: يتم ذلك بحيث لا يتم تسخين العينات حتى أثناء المجانسة.
  3. توضيح بواسطة الطرد المركزي في 1000 x ج لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. تجاهل بيليه من مواد غير متجانسة.
  4. اتخاذ طاف (جناسة الخام)، إضافة إلى البولي أنابيب الطرد المركزي (حجم أنبوب يعتمد على حجم الدوار) والتوازن بعناية. أجهزة الطرد المركزي في 100000 XG لمدة 1 ساعة على 4 درجات مئوية.
  5. الاحتفاظ طاف لأن هذا هو جزء TBS للذوبان.
  6. غسل بيليه مرتين في خمسة مجلدات من 1X TBS العازلة وأجهزة الطرد المركزي في كل مرة في 100،000 x ج لمدة 15 دقيقة على 4 درجات مئوية. تجاهل supernatants.
    1. resuspend الكرية النهائي sonicating بيليه لمدة 10 ثانية في 20 كيلوهرتز في حوالي 5 مجلدات من 1X TBS-SDS في RT.
      ملاحظة: قبل أن يجب أن يقدموا إضافة SDS تحتوي على عينات عازلة في 10 ° C لتجنب SDS هطول الأمطار.
    2. نابذة فائقة السرعة في 100،000 x ج لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة 25 درجة مئوية.
  7. الاحتفاظ طاف لأن هذا هو الالبريد SDS جزء القابلة للذوبان.
    1. غسل بيليه مرتين في 5 مجلدات من العازلة 1X TBS-SDS في RT. أجهزة الطرد المركزي في كل مرة في 100،000 x ج لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة 25 درجة مئوية.
    2. إذابة بيليه النهائي في 50 ميكرولتر من 1X العازلة TBS-SDS-اليوريا باستخدام sonicator وضعت في 20 كيلوهرتز لمدة 10 ثانية للوصول إلى ذوبان كامل؛ هذا يسمى الكسر للذوبان اليوريا.
  8. فحص كل جزء لمحتوى البروتين الكلي باستخدام طقم فحص البروتين التجارية وفقا لبروتوكول الشركة الصانعة. تمييع عينات TBS-SDS-اليوريا 1: 1 مع العازلة 1X TBS للسماح التوافق مع الكواشف فحص البروتين. عينات تجميد قسامات صغيرة (20 ميكرولتر) في -80 ° C للحد من تجميد أذاب دورات.
    ملاحظة: إضافة 10٪ الجلسرين لعينات من المستحسن للتخزين طويل الأجل في -80 ° C.

3. Immunoblotting العينات وتحليل النتائج

  1. عينات من تشغيل TBS، TBS-SDS ومقتطفات TBS-SDS-اليوريا في 10-جيدا 4-12٪ هلام مكرر تريس بولي أكريلاميدمع MOPS كما يعمل عازلة باستخدام التقنيات القياسية. رؤية غالاغر وChakravarti (2008) 29 للبروتوكول وصمة عار الغربي تفصيلا.
  2. تحميل 10 ميكروغرام من البروتين من كل عينة على كل حارة جنبا إلى جنب مع علامة الوزن الجزيئي للTBS وSDS والكسور اليوريا.
  3. تشغيل هلام في 200 V لمدة 1 ساعة أو حتى وصلت صبغة زرقاء من العازلة تحميل الجزء السفلي من هلام.
  4. نقل البروتينات من المواد الهلامية electrophoretically على أغشية النايلون 28، المبللة مسبقا لأول مرة في الميثانول بنسبة 100٪ ومن ثم إلى نقل العازلة التي تحتوي على 20٪ الميثانول. توفر علامة تحديد على لطخة لتحديد الجانب البروتين والتوجه للعلامات حجم الوزن الجزيئي.
    1. ساندويتش هلام مع غشاء جنبا إلى جنب مع ورق الترشيح الرطب. موضع الصحيح من الغشاء أمر حاسم مع الغشاء بين جل والأنود. إجراء نقل لمدة 2 ساعة على 40 V.
    2. تشكل 1X PBS-توين (1X PBS-T) العازلة: ذوب 1 قرص من برنامج تلفزيوني في 200 ملالماء لانتاج 0.01 M العازلة الفوسفات، 0.0027 M كلوريد البوتاسيوم وكلوريد 0.137 M الصوديوم، ودرجة الحموضة 7.4.
    3. منع الغشاء في 5٪ محلول BSA في برنامج تلفزيوني 1X-T لمدة 30 دقيقة مع اهتزاز في 70 دورة في الدقيقة. هذا يمنع ملزم من الأجسام المضادة الأولية لغشاء غير محددة.
  5. تحقيق في وصمة عار البروتين مع 6 مل من α SYN الأجسام المضادة الأولية SYN-1 (BD العلوم البيولوجية؛ الماوس وحيدة النسيلة الأجسام المضادة) في 1: 750 التخفيف (O / N عند 4 درجات مئوية) تليها سلسلة من يغسل مع 1X PBS-T ( 3 × 5 دقائق في كل مرة) 28.
  6. احتضان وصمة عار مع HRP المناسب مترافق الضد الثانوية في 1: 2000 تخفيف لمدة 30 دقيقة. تنفيذ سلسلة من يغسل (3 × 5 دقائق في كل مرة) مع 1X PBS-T.
    1. تزج البقع في تعزيز حل معان كيميائي لمدة 15 ثانية في غرفة مظلمة. البقع غطاء مع التشبث الفيلم ومكان أفلام تصوير الإشعاع الذاتي ضد وصمة عار مع البروتين حتى الجانب في شريط عازلة للضوء لالتقاط الإشارات المناسبة (العصابات حجم المناسبة).
    2. تطوير أفلام تصوير الإشعاع الذاتي في مطور الآلي.
      ملاحظة: يمكن أيضا تطوير البقع يدويا باستخدام المطور والمثبت من مصدر تجاري في حالة جهاز مطور الآلية غير متوفرة.
  7. احتضان طخة غربية مع 6 مل من لطخة غربية تجريد عازلة لمدة 10 دقيقة مع اهتزاز ثابت لتجريد صمة-α SYN إشارة الضد. اتبع الخطوات 3.43 حتى 3.6.2 باستخدام بيتا أكتين الأجسام المضادة الأولية (الماوس وحيدة النسيلة) في 1: 8000 التخفيف.
  8. مسح وتحويل الصورة النهائية في المشاجرة الصورة وقياس كثافة استخدام NIH يماغيج لأغراض الكميات (أ تنزيل البرمجيات الحرة).
    ملاحظة: البرنامج يتيح قراءة الكثافة من منطقة قريبة من الفائدة (الفرق حجم المناسبة) ويمكن التعبير عن البيانات إما على شكل نسبة α-اصطناعي الكثافة / β-الأكتين (جين لحفظ البيت) وحدات التعسفي أو على تلقاء نفسها عندما الجين حفظ البيت غير صالح (كما في حالة العينات اليوريا القابلة للذوبان).

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم تشغيل TBS، SDS واليوريا ذوبان البروتينات المستخرجة من العقد القاعدية بعد بروتوكول هو مبين في الشكل رقم 1 على المواد الهلامية وimmunoblotted مع الماوس وحيدة النسيلة SYN-1-α اصطناعي الأجسام المضادة الأولية. الكسور القابلة للذوبان TBS عرض وجود أحادى α-SYN (~ 14 كيلو دالتون الأنواع) في الحالات PD والسيطرة فحص (الشكل 2A). كما أظهرت الكسور القابلة للذوبان SDS فيرة أحادى α-اصطناعي في جميع أنواع فرعية ثلاثة من الحالات التي تمت دراستها كما هو معروض في انخفاض التعرض صمة عار (الشكل 2C). أظهر الحالات PD أيضا الوزن الجزيئي (MW) الأنواع SYN α أعلى كما هو ظاهر على لطخة التعرض العالية، والتي من المحتمل أن تكون oligomers (الشكل 2C). وأظهرت الكسور اليوريا القابلة للذوبان من الحالات PD كميات مرتفعة من أحادية-α اصطناعي، oligomers والأنواع المجمعة مقارنة للسيطرة على الحالات. الحالات مجهولة السبب PD القشرة المخية الحديثة تظهر كميات أكبر من aggreg ATED الأنواع α SYN، في حين أن الحالات الحوفي تظهر مستويات متوسطة من غير القابلة للذوبان α-اصطناعي. كل من SDS واليوريا الكسور من الحالات مجهولة السبب PD تظهر مستويات مختلفة من المنتجات α SYN اقتطاع في 12 كيلو دالتون و 6 كيلو دالتون كما هو موضح 20. في المقابل، لم الحالات التحكم لا تظهر أي غير قابلة للذوبان أو تجميعها α-SYN (الشكل 2E). تعكس التدابير كثافة شبه الكمية كمية من حمولة LB كما categoriesd باستخدام α-اصطناعي المناعية مما يدل على الطبيعة غير القابلة للذوبان من تجميعي α-SYN (الشكل 2B، 2D، 2F) في الحالات PD القشرة المخية الحديثة والحوفي.

figure-results-1
الشكل 1. رسم تخطيطي للα غير قابلة للذوبان إجراءات استخراج -syn.r يمكنك الحصول = "_ فارغة"> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-2
الشكل 2. immunoblots الممثل مستويات -syn ألفا من PD والسيطرة على الأنسجة البشرية. TBS، SDS واليوريا كسور قابلة للذوبان من العقد القاعدية (وهي المنطقة التي تؤوي ألفا-اصطناعي علم الأمراض في الحالات PD) من الحالات مجهولة السبب PD وطبيعية عصبيا (مراقبة) حللت العقول عن وجود α-SYN باستخدام طخة مناعية الغربي. تم تحميل 10 ميكروغرام من البروتين على كل حارة. في TBS الكسور (A)، أساسا أحادية ألفا-اصطناعي موجودة في جميع الحالات. في SDS الكسور (C)، وشهدت بعض oligomers من α-اصطناعي جنبا إلى جنب مع مونومرات بشكل رئيسي في الأنسجة PD. في الكسور اليوريا (C)، أحادية، oligomers ومجمعة α-اصطناعي يتم التعبير عنها بنسب مختلفة في الحالات PD reflectinز تحميل LB كل منهما. تظهر العينات الضابطة عصبيا وجود كميات صغيرة فقط من أحادى α-اصطناعي. يرجى ملاحظة نواتج تحلل الممكنة لα-اصطناعي ينظر إليها في بعض الحالات مع ارتفاع الحمولة LB. يمثل رأس السهم الصلبة على شكل أحادى α-اصطناعي. و* ربما يمثل شكلا-C عضال اقتطاع من α-اصطناعي كما هو موضح سابقا 20،26. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

حالة جنس العمر عند الوفاة سنوات تأخير بعد الوفاة (ساعة) درجة حموضة الأنسجة
القشرة المخية الحديثة 1 م 82 40 63
القشرة المخية الحديثة 2 F 75 35.3 6.4
الحوفي 1 م 81 28.5 6.2
الحوفي 2 F 79 36.5 6.2
التحكم 1 م 80 38 6.1
السيطرة 2 F 83 32.5 63

الجدول 1. التركيبة السكانية محدودة من الحالات المستخدمة

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

توضح هذه المقالة بروتوكول الكيمياء الحيوية لاستخراج وفحص الخصائص التفاضلية ذوبان مركب بسيط، بلازميدة قليلة القسيمات وتجميع α-اصطناعي من العقول المريضة باستخدام تغيير طبيعة الظروف هلام التوالي. هذا هو أسلوب راسخة لدراسة مجمعة α-اصطناعي 17، 18، 20، 21 بروتينا عادة قابل للذوبان في شكله الأصلي لكن كسب amyloidogenic أو زيادة خصائص التجميع مع تطور المرض أو مع الطفرات الجينية. ومع ذلك، استخدمت بعض الجماعات اختلافات طفيفة في تركيزات SDS في المخازن الخاصة بهم (8٪ أو 10٪ بدلا من 5٪) 21،22، 30، وSDS هو المنظفات أنيوني وsolubilises α-SYN oligomers التي يمكن أن تشمل غشاء ملزمة أشكال α-اصطناعي، في حين اليوريا، وكاشف chaotropic يبدل طبيعة الأشكال المجمعة وييفي أو amyloidogenic غير قابلة للذوبان من α-اصطناعي 20. وفي هذا الصدد تناولت دراسة منهجية Paleologou وآخرون 31 استقرارمن oligomers-SYN α والألياف مع تركيزات مختلفة من اليوريا (6،5-8 M) أو SDS (،25-2٪) وذكرت أن oligomers مستقرة في تركيزات SDS لكن ليس مع تركيزات عالية من اليوريا. من فيلا-1 الأضداد ومحددة لoligomers-SYN α والألياف الكشف عن تركيزات أعلى من الألياف بنسبة 6.5 M تركيزات اليوريا في ظل ظروف غير تغيير طبيعة. تركيزات العازلة المستخدمة في هذا البروتوكول يعكس عن كثب ما تم وصفه في Culvenor وآخرون. (1999) 32.

مناطق الدماغ التشريحية لاستخراج البيوكيميائية غير قابلة للذوبان α-اصطناعي يجب اختيارها بعناية وهذا ينبغي أن تعكس LB وLN تحميل ألفا-SYN اعتمادا على تطور المرض 33،34. الحالات المستخدمة هنا هي عينات العقد القاعدية من الأنواع الفرعية القشرة المخية الحديثة والحوفي من PD تعكس المراحل المتأخرة والمتوسطة من التقدم PD وفقا لMcKeith ctriteria 34. في الضفة ساحة الملكة الدماغ، نصف الدماغالثابتة بشكل روتيني في الفورمالين لتحليلها النسيجية وتشريح النصف الآخر بعناية في المناطق التشريحية المختلفة وفلاش تجميد وتخزينها في -80 س C المجمدات لمزيد من الكيمياء الحيوية والحمض النووي دراسات تحليل / RNA. بعد التثبيت الفورمالين من العقول وتشريح من قبل neuropathologists، المناعية تتم باستخدام الأجسام المضادة α-اصطناعي والنتائج المؤرشفة. أيضا كإجراء روتيني، يتم قياس درجة الحموضة في نسيج المخ لدى وصوله كمقياس للدولة احتضارية من أنسجة المخ. وهذا يشكل أساسا متينا لنوعية الحفاظ على الأنسجة لتحليل الكيمياء الحيوية.

لدينا البيانات هنا تبين أن هناك المزيد من SDS ذوبان مونومر α-اصطناعي في حالات PD مقارنة مع الضوابط. ولا سيما الحالات PD القشرة المخية الحديثة لديها أعلى حمولة α-اصطناعي مقارنة متنوعة PD الحوفي. حالات القشرة المخية الحديثة تمثل تطور أكبر من PD-α اصطناعي علم الأمراض في مناطق القشرة المخية الحديثة مثل الجبهي والجداري كوراملمارسات 33،34. الحالات PD الحوفي لديها أعلى الدرجات LB في مناطق الدماغ الأمامي / المناطق الحوفي القاعدية مثل اللوزة، transentorhinal والمناطق الحزامية. للبيانات ذات مغزى والتحليل الإحصائي، لا بد من تشغيل 4 حالات على الأقل من كل فوج. وبالمثل نحن لم يحاولوا التحليل الإحصائي للبيانات وصمة عار المقدمة هنا.

كما يجب الإشارة إلى أن الأجسام المضادة المختلفة قد يتعرف أشكال مختلفة / تكوين العالي أجل α-SYN oligomers ومنها قد يكون له حساسيته النسبية الخاصة وتفضيل. وهذا واضح من نتائج تونغ وآخرون. 29 حيث تبين أن 4 الأجسام المضادة α SYN مختلفة (SYN-1، SS، الأدوية السرطانية وLB509) تعطي نتائج قابلة للتغيير على الأقل ل-α SYN oligomers / الركام. وقد اعترفت أحادية α-اصطناعي بدرجات مماثلة من قبل جميع الأجسام المضادة 4 على الرغم من أن هذه يمكن أن يكون اختلاف اعتمادا على ما إذا حاتمة الضد-α SYN يقع إما في N-محطة أو C-terminal 29. وبالمثل، والأجسام المضادة المحددة لالفوسفات ألفا تحديد synuclein متميزة الوزن عالية الجزيئية α-synuclein الأنواع 20،21. في بروتوكول الموصوفة هنا، والأجسام المضادة تتميز غاية SYN-1 وقد استخدم 19-21.

ومع ذلك، فمن المهم النظر في التحقق من صحة أي الأجسام المضادة جديد على البقع الغربية من خلال الأجسام المضادة التجارب preabsorption وأيضا overexpression وضربة قاضية من البروتين في الخلايا.

من المهم أن تنظر الاختلافات الأخرى التي تم تطبيقها من قبل الباحثين لتحديد أجزاء أصغر من أشكال α SYN وأو رباعي القسيمات غير مستقرة α-SYN. ويمكن أن يشمل معتدل التثبيت من الأغشية مع 0.4٪ PFA في برنامج تلفزيوني للاحتفاظ أشكال اقتطاع من α-اصطناعي 35 أو علاج الخليط عينة مع linkers عبر لتحقيق الاستقرار tetramers 36.

تقييم البيوكيميائية دقيق من البروتينات باستخدام ما بعد الوفاة منظمة الشفافية الدوليةيتطلب ssue التقليل من تدهور البروتين الأنزيمي والتعديل. ولذلك فمن المستحسن استخدام الأنسجة مع أقصر تأخير بعد الوفاة و / أو اختيار عينات مطابقة ضمن الأفواج القضية. المناعية باستخدام أجسام مضادة القياسية لα-اصطناعي المناعية يجب أن يتم تنفيذ قبل البدء في بروتوكول العزلة. مدى α-اصطناعي أمراض متغير بدرجة كبيرة ويمكن أن تختلف وفقا لمناطق مختارة. فإنه من المستحسن لتحديد المناطق يعانون من أمراض وفيرة كوسيلة لمراقبة إيجابية للالعائد الأمثل مع كل تشغيل. استخدام مثبطات الأنزيم البروتيني، وإذا مثبطات إنزيم الفوسفاتيز ضروري لمنع تدهور الأنزيمية غير مرغوب فيه بعد الافراج عن البروتياز داخل الخلايا أو الفسفاتازات التي تحدث أثناء تحلل الخلايا والحفاظ على العينات عند 4 ° C أمر حاسم.

ومن المهم أن جميع العينات ضمن مجموعة من التجارب يتم التعامل معها بالتساوي وباستمرار لتجنب الاختلافات داخل المستخدم؛ الصحائف متعددةوينبغي تجنب دورات إز ذوبان الجليد لأن هذا قد يحتمل التراجع عن التعديلات بعد متعدية مثل الفسفرة. وهناك نقطة حاسمة لنأخذ في الاعتبار عند النظر في عدد كبير من العينات غير أن البيانات من immunoblots يجب أن تكون طبيعية لعينة واحدة، والتي يجب أن تعمل بالتوازي لجميع العينات الأخرى على المواد الهلامية، وجميع البيانات المشار إليها إلى أن العينة. ويتم ذلك لضمان تطبيع البيانات طخة مناعية بين عدة البقع. هذا هو الأسلوب المعتمد في دراستنا الأخيرة (22).

وتجدر الإشارة إلى أنه من أجل الحفاظ على ECL خلفية منخفضة، لا ينبغي أن يسمح البقع لتجف في أي وقت خلال بروتوكول صمة عار الغربي. بالإضافة إلى ذلك، ينبغي تجنب التعرض لفترة طويلة جدا (> 10 دقيقة) على أفلام تصوير الإشعاع الذاتي لأن ذلك سوف يؤدي إلى تشبع إشارة ECL وسيؤدي إلى الكميات غير دقيقة.

هذا البروتوكول أعلاه هي تقنية بسيطة نسبيا باستخدام الكواشف المخبرية المشتركة وفيstruments ويمكن أن يكون أداة قيمة للتحقيق في الفيزيولوجيا المرضية من البروتين α-اصطناعي في مجال البحوث PD. لا يمكن تمديد هذه المنهجية فقط مع تعديلات مناسبة لدراسة البيولوجيا α-اصطناعي في الحيوانات المعدلة وراثيا α SYN ولكن أيضا لأمراض الاعصاب أخرى تتميز الودائع غير طبيعية من البروتينات المجمعة مثل AD، MSA، DLB، HD وfrontotemporaldementias. إلا أن البيانات طخة غربية الموصوفة هنا يمكن أيضا أن يتم التحقق من صحة باستخدام المقايسات المناعي المرتبط بالإنزيم باستخدام الأجسام المضادة لأشكال محددة من α-اصطناعي 31.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المؤلف ليس لديه ما يكشف.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أشكر الدكتور Adamantios Mamais على استخراج α-synuclein من الأنسجة البشرية وتشغيل البقع. تم دعم هذا العمل جزئيا من خلال منحة MRC (MR / L010933 / 1) وجزئيا من قبل جائزة Wellcome Trust / MRC Joint Call in Neurodeformation (WT089698) لاتحاد مرض باركنسون في المملكة المتحدة (UKPDC) الذي ينتمي أعضاؤه إلى معهد UCL لطب الأعصاب وجامعة شيفيلد ووحدة فسفرة البروتين MRC في جامعة دندي. تلقى RB تمويلا من مؤسسة MJFox لهذا العمل ويتم تمويله أيضا من قبل Reta Lila Weston Trust.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Tris-HCLSigmaT5912
كلوريد الصوديومVWR27800.291
SDSFluka71727
UreaSigmaU5378
أقراص مثبطات البروتياز  روش04 693 116001
أقراص مثبطات الفوسفاتيز Roche 04 906 837001
أقراص ملحية مخزنة بالفوسفات سيجما P4417
Tween-20 SigmaP9416
NuPAGE MOPS SDS تشغيل المخزن المؤقتInvitrogenNP0001
NuPAGE نقل المخزنالمؤقت InvitrogenNP0006-1
Hybond-P غشاء  GE HealthcareRPN303F
Whatman 3MM ورق ترشيحSigmaWHA30306185
Bis-tris gels 4-12٪  Invitrogen NP0322BOX
Supersignal West Pico الركيزة الكيميائيةPierce34080
Bio-RAD DC مجموعة فحص البروتين   ؛Bio-Rad500-0112
Thickwall Beckman أنابيب البولي كربوناتBeckman355630
Western blot stripping bufferThermo scientific46430
Syn-1 الجسم المضاد الأساسي (فأر أحادي النسيلة )BD Biosciences610786
الجسم المضاد الأولي بيتا أكتين (أحادي النسيلة للفأر  سيجماA5441
HRP الماعز المقترن الجسم المضاد الثانوي المضاد للفأرسانتا كروزsc-2031
ألبومين مصل الأبقارSigmaA7030
InstrumentCompanyRotor / نموذج رقم   ؛
طرد مركزي فائق الطاولة Optima MaxBeckmanMLA-80
SonicatorHeat SystemsXL20-20
HomogeniserJenke and KunkelTP18 / 10
جهاز

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Forman, M. S., Trojanowski, J. Q., Lee, V. M. Neurodegenerative disease a decade od discoveries paves the way for therapeutic breakthroughs. Nat Med. 10, 1055-1063 (2004).
  2. Spillantini, M. G., Schmidt, M. L., Lee, V. M., Trojanowski, J. Q., Jakes, R., Goedert, M. A-synuclein in Lewy bodies. Nature. 388, 839-840 (1997).
  3. Spillantini, M. G., Crowther, R. A., Jakes, R., Hasegawa, M., Goedert, M. Alpha-synuclein in filamentous inclusions of Lewy bodies from Parkinson's disease and dementia with Lewy bodies. Proc Natl Acad Sci. 95, 6469-6473 (1998).
  4. Baba, M., et al. Aggregation of alpha-synuclein in Lewy bodies of sporadic Parkinson's disease and dementia with Lewy bodies. Am J Pathol. 152, 879-884 (1998).
  5. Ahmed, Z., et al. The neuropathology, pathophysiology and genetics of multiple system atrophy. Neuroptahol Appl Neurobiol. 38 (1), 4-24 (2012).
  6. Ploymeropoulos, M. H., et al. Mutation in the alpha-synuclein gene identified in families with Parkinson's disease. Science. 276, 2045-2047 (1997).
  7. Kruger, R., et al. Ala30Pro mutation in the gene encoding alpha-synuclein in Parkinson's disease. Nat Genet. 18, 106-108 (1998).
  8. Zarranz, J. J., et al. The new mutation, E46K, of alpha-synuclein causes Parkinson and Lewy Body dementia. Ann. Neurol. 55, 164-173 (2004).
  9. Proukakis, C., et al. A novel alpha-synuclein missense mutation in Parkinson disease. Neurology. 80 (11), 1062-1064 (2013).
  10. Kiely, A., et al. Synucleinopathy associated with G51D SNCA mutation: a link between Parkinson's disease and Multiple System atrophy? Acta Neuropathol. 125 (5), 753-769 (2013).
  11. Lesage, S., et al. G51D alpha-synuclein mutation causes a novel Parkinson-pyramidal syndrome. Ann Neurol. 73 (4), 459-471 (2013).
  12. Singleton, A. B., et al. Alpha-synuclein locus triplication causes Parkinson's disease. Science. 302, 841(2003).
  13. Chartier-Harlin, M. C., et al. Alpha-synuclein locus duplication as a cause of familial Parkinson's disease. Lancet. 364, 1167-1169 (2004).
  14. Cookson, M. R., Hardy, J., Lewis, P. A. Genetic neuropathology of PD. Int J Clin Exp Pathol. 1 (3), 217-231 (2008).
  15. Fauvet, B., et al. α-synuclein in central nervous system and from erythrocytes, mammalian cells, and. Escherichia coli exists predominantly as disordered monomer. J Biol Chem. 287, 15345-15364 (2012).
  16. Bartels, T., et al. α-synuclein occurs physiologically as a helically folded tetramer that resists aggregation. Nature. 477, 107-110 (2011).
  17. Campbell, B. C., et al. Accumulation of insoluble alpha-synuclein in dementia with Lewy bodies. Neurobiol of Dis. 7 (3), 192-200 (2000).
  18. Campbell, B. C., et al. The solubility of alpha-synuclein in multiple system atrophy differs from that of dementia with Lewy bodies and Parkinson's disease. J Neurochem. 76, 87-96 (2001).
  19. Miller, D. W., et al. Alpha-synuclein in blood and brain from familial Parkinson's disease with SNCA locus triplication. Neurology. 62, 1835-1838 (2004).
  20. Anderson, J. P., et al. Phosphorylation of Ser-129 is the dominant pathological modification of alpha-synuclein in familial and sporadic Lewy body disease. J Biol Chem. 281, 29739-29752 (2006).
  21. Zhou, J., et al. Changes in the solubility and phosphorylation of alpha-synuclein over the course of Parkinson's disease. Acta Neuropathol. 121, 695-704 (2013).
  22. Mamais, A., et al. Divergent solubility and aggregation properties in G2019S LRRK2 Parkinson's disease brains with Lewy Body pathology compared to idiopathic cases. Neurobiol of Dis. 58, 183-190 (2013).
  23. Lashley, T., et al. A comparative clinical, pathological, biochemical and genetic study of fused in sarcoma proteinopathies. Brain. 134 (pt9), 2548-2564 (2011).
  24. Brelstaff, J., et al. Transportin-1: a marker of FTLD-FUS. Acta Neuropathol. 122 (5), 591-600 (2011).
  25. Kahle, P. J., et al. Hyperphosphorylation and insolubility of alpha-synuclein in transgenic mouse oligodendrocytes. EMBO reports. 3 (6), 583-588 (2002).
  26. Nuber, S., et al. A progressive dopaminergic phenotype associated with neurotoxic conversion of α-synuclein in BAC-transgenic rats. Brain. 136, 412-432 (2013).
  27. Tofaris, G. K., et al. Pathological changes in dopaminergic nerve cells odf the substantia nigra and olfactory bulb in mice transgenic for truncated human a-synuclein (1-120): implications for Lewy Body disorders. J Neurosci. 26 (15), 3942-3950 (2006).
  28. Neumann, M., et al. FET proteins TAF15 and EWS are selective markers that distinguish FTLD with FUS pathology from amyotrophic lateral sclerosis with FUS mutations. Brain. 134 (9), 2595-2609 (2011).
  29. Gallagher, S., Chakravarti, D. Immunoblot analysis . J Vis. Exp. (16), e759(2008).
  30. Tong, J., et al. Brain alpha-synuclein accumulation in multiple system atrophy, Parkinson's disease and progressive supranuclear palsy: a comparative investigation. Brain. 133, 172-188 (2010).
  31. Paleologou, K. E., et al. Detection of elevated levels of soluble α-synuclein oligomers in post-mortem brain extracts from patients with dementia with Lewy bodies. Brain. 132, 1093-1101 (2009).
  32. Culvenor, J. G., et al. Non-Aβ component of Alzheimer s disease Amyloid (NAC) revisited. American Journal of Pathology. 155 (4), 1173-1181 (1999).
  33. Braak, H., et al. Staging of brain pathology related to sporadic Parkinson's disease. Neurobiol Aging. 24, 197-211 (2003).
  34. McKeith, I. G., et al. Diagnosis and management of dementia with Lewy bodies: third report of the DLB consortium. Neurology. 65, 1863-1872 (2005).
  35. Lee, B. R., Kamitani, T. Improved immunodetection of endogenous α-synuclein. PLoS ONE. 6, e23939(2011).
  36. Newman, A. J., et al. A new method for quantitative immunoblotting of endogenous α-synuclein. PLoS ONE. 8 (11), e81314(2013).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Alpha Synuclein ExtractionSoluble Insoluble FractionUltracentrifugation ProtocolTBS SDS Urea BuffersWestern Blot AnalysisPost Mortem Brain TissueProtein Isolation MethodNeurodegenerative Disease ResearchParkinson Disease BiomarkersSequential Protein Extraction

Related Articles