مقالة منهجية

تطوير المناعي اختبار قطاع تستند الذهب الغروية عن الكشف عن الحيتان الميوجلوبين

DOI:

10.3791/53433

⸱

يوليو 13, 2016

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Veterinary Medicine, National Chiayi University, 2Department of Microbiology and Immunology/Graduate Institute of Biomedical and Biopharmaceutical Sciences, National Chiayi University

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يصف هذا البروتوكول تطوير اثنين من الأجسام المضادة أحادية النسيلة من فئة IgG (mAbs) التي تتفاعل بقوة مع الميوغلوبين من الحيتانيات. يتم تطبيق هذه mAbs على شريط اختبار كروماتوجرافي مناعي ذهبي غروي يعتمد على شكل الساندويتش للتمييز بين ميغابايت الحيتانيات والفقمة الأخرى.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يصف هذا البروتوكول تطوير شريط اختبار كروماتوغرافيا مناعي ذهبي غروي يعتمد على تنسيق الساندويتش الذي يمكن استخدامه للتمييز بين الميوغلوبين (Mb) للحيتانيات عن الفقمات الأخرى. يوفر الشريط فحصا سريعا وفوريا للحوم الحيتانيات ، وبالتالي تقييد تجارتها واستهلاكها غير المشروعين. تم تطوير اثنين من الأجسام المضادة أحادية النسيلة (mAbs) مع تفاعل تجاه ميغابايت من الحيتانيات. تم تحليل تسلسل الأحماض الأمينية للمناطق التفاعلية المستضدية Mb من مختلفة من أجل تصميم ببتيدات اصطناعي (ببتيد عام وببتيد محدد) وبعد ذلك رفع mAbs (الفئة الفرعية IgG1). تم اختيار mAbs من الأورام الهجينة التي تم فحصها بواسطة ELISA غير المباشر ، اللطخة الغربية واللطخة النقطية. كان CGF5H9 خاصا ب Mbs من الأرانب والخنازير والأبقار والماعز والحيتانيات بينما أظهر تقاربا ضعيفا أو معدوما مع Mbs من الدجاج والتونة والفقمات. يمكن CSF1H13 ربط الأختام والحيتانيات بتقارب قوي ولكنها لم تظهر أي تقارب مع الأخرى. تم استخدام عينات الحيتانيات من أربع عائلات (Balaenopteridae و Delphinidae و Phocoenidae و Kogiidae) في هذه الدراسة ، وأشارت النتائج إلى أن هذين الحيتانيين لهما قدرة ارتباط واسعة ل Mbs من الحيتانيات المختلفة. تم تطبيق هذه mAbs على شريط اختبار كروماتوجرافي مناعي من الذهب الغروي من نوع الساندويتش. CGF5H9 ، الذي يتعرف على العديد من الأنواع ، تم تصنيفه على الذهب الغرواني واستخدامه كجسم مضاد للكشف. اكتشف CSF1H13 ، الذي تم تغطيته في منطقة الاختبار ، وجود الحيتانيات والفقمة Mbs. تم اختبار عينات العضلات من التونة والدجاج والفقمة وخمسة أنواع من الثدييات الأرضية و 15 نوعا من الحيتانيات في ثلاث نسخ. أظهرت جميع عينات الحيتانيات نتائج إيجابية وأظهرت جميع العينات الأخرى نتائج سلبية.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تاريخيا ، تم استهلاك لحوم الحيتانيات في أجزاء كثيرة من العالم ويستمر هذا الاستهلاك حتىاليوم 1. نظرا للمستوى الغذائي للحيتانيات ، من المعروف أن المستويات العالية من الزئبق والسموم الأخرى موجودة فيلحومها 2. لذلك ، يمكن أن يؤدي استهلاك لحوم الحيتانيات إلى مشكلة صحية ليس فقط للفئات المعرضة لخطر كبير مثل النساء الحوامل ولكن أيضا لعامةالسكان 3. علاوة على ذلك ، يمكن أن يحدث تلوث لحوم الحيتانيات بمسببات الأمراض الحيوانية المنشأ أو التي يحتمل أن تكون حيوانية المنشأ أثناء معالجتهاوتخزينها 4. يصعب حتى على الوكلاء ذوي الخبرة التعرف على لحوم الحيتانيات من خلال مظهرها وحده. لذلك ، هناك حاجة إلى طريقة علمية موثوقة لتحديد الهوية للتمييز بين لحوم الحيتانيات واللحوم الأخرى. هذا من شأنه أن يساعد في الحد من استهلاك لحوم الحيتانيات.

تشمل الطرق الحالية لتحديد الأنواع التقنيات الجزيئية والطرق المناعية. يمكن استخدام التقنيات الجزيئية ، مثل تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) وتسلسل الحمض النووي ، لتحديد العينات ليس فقط من اللحوم النيئة5 والعينات المتحللة6 ولكن أيضا من الأطعمة المصنعة مثل النقانق المطبوخة والأعلاف7،8. يتم تطبيق الطرق المناعية ، مثل مقايسة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA) ، بشكل شائع في إنتاج الغذاء للكشف عن محتوى اللحوم ، على سبيل المثال ، لحم الخنزير9 ولحم البقر10 وسمك السلور11. يتوفر تحليل الحمض النووي القائم على تفاعل البوليميراز المتسلسل لتحديد لحوم الحيتانيات12 ، وقد ساعد في منع التجارة الدولية غير المشروعة للحوم الحيتانيات في اليابان وكوريا الجنوبية والفلبين وتايوان وهونغ كونغ وروسيا والنرويج والولايات المتحدة1. هذه الطرق فعالة وموثوقة ، لكنها قد تستغرق ساعات أو أياما لإكمالها وتنطوي على خطوات شاقة. عادة ما يعتمد تحديد لحوم الحيتانيات على التقنيات الجزيئية ولا توجد حاليا طريقة مناعية متاحة. بالنسبة للوكالات التنظيمية ، من المستحسن للغاية تطوير تقنية موثوقة وسريعة يمكن استخدامها في هذا المجال لتحديد لحوم الحيتانيات.

تستخدم شرائط الكروماتوغرافيا المناعية < p class = 'jove_content'> كأدوات كشف مع ميزة إنتاج نتيجة سريعة عبر بروتوكول بسيط مناسب للاستخدام في هذا المجال. مبادئ الشريط الكروماتوجرافي المناعي و ELISA متشابهة جدا ، وتشمل الأجسام المضادة والمستضدات والملصقات. تم استخدام العديد من الملصقات المختلفة مثل الذهب الغروي والكربون واللاتكس في تطوير شرائط كروماتوغرافيا مناعية. في الوقت الحاضر ، تستخدم هذه الطريقة بشكل شائع للكشف عن المضادات الحيوية والسموم والبكتيريا والفيروسات13 ، ولكنها نادرا ما تستخدم لتحديد البروتينات في اللحوم14،15. نقترح هنا مقايسة مناعية للإنزيم الكروماتوغرافي للتدفق الجانبي للكشف السريع عن ميوغلوبين الحيتانيات (Mb).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أخلاقيات الإعلان: تم إجراء هذه الدراسة وفقا للمبادئ التوجيهية الدولية التي وافقت عليها لجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسي (IACUC) من الجامعة الوطنية تشيايي، ID موافقة: 99022. ويسمح باستخدام عينة الحوتيات بواسطة مجلس الزراعة في تايوان (تصريح بحوث 100M-02.1-C-99).

إعداد نموذج 1. العضلات وSDS-PAGE

ملاحظة: عينات العضلات من 23 نوعا منها 16 نوعا من الثدييات البحرية، 5 أنواع من الثدييات الأرضية، واستخدمت التونة والدجاج في هذه الدراسة (الجدول 1). تم الحصول على عينات من العضلات الحيتان من الأفراد الذين تقطعت بهم السبل، الصيد العرضي السمكية، والمصادرة. تم الحصول على الأرانب، والفئران، والكلب، والأنسجة العضلية الدجاج من مركز التشخيص الأمراض الحيوانية من الجامعة الوطنية جايبور. تم شراء عينات من لحم البقر والخنزير والضأن، وسمك التونة من المتاجر المحلية. عينة العضلات لميناء ختم (PHOCA vitulina ) تم توفيره من قبل فارغلوري حديقة المحيط. وقد استخدم دوديسيل كبريتات الصوديوم هلام بولي أكريلاميد الكهربائي (SDS-PAGE) لفصل بروتينات قابلة للذوبان مع أوزان جزيئية مختلفة في عينات العضلات.

  1. تخزين جميع العينات في -20 درجة مئوية حتى الاستخدام.
  2. هاون قبل بارد عند درجة حرارة -20 درجة مئوية. ثم وضع 3 غرام من عينة العضلات المجمدة في ذلك.
  3. تجانس العينة مع 10 مل من بارد الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) باستخدام الخالط الأنسجة.
  4. أجهزة الطرد المركزي لعينة متجانسة في 10000 x ج لمدة 10 دقيقة على 4 درجات مئوية. جمع supernatants وتخزينه عند درجة حرارة -20 درجة مئوية حتى الاستخدام.
  5. إعداد 5 مل من 5٪ التراص هلام (3.07 مل من الماء المقطر، 1.25 مل من العازلة هلام العلوي 4x والرقم الهيدروجيني 6.8، 625 ميكرولتر من 40٪ مادة الأكريلاميد، 50 ميكرولتر من 10٪ فوق كبريتات الأمونيوم (APS)، و 5 ميكرولتر من tetramethylethylenediamine ( TEMED)) و 10 مل من 15٪ يفصل هلام (3.65 مل من الماء المقطر، 2.5 مل من 4X أقل عازلة هلام الرقم الهيدروجيني 8.8، 3.75 مل من 40٪ مادة الأكريلاميد، 100 ميكرولتر من 10٪ وكالة الأنباء الجزائرية،و4 ميكرولتر من TEMED).
    1. في الخلية الكهربائي، صب جل التراص (5٪ الأكريلاميد) على أعلى من هلام فصل (15٪ الأكريلاميد) بعد أن وطدت هذه الأخيرة. إدراج مشط هلام في هلام التراص.
  6. أداء PAGE وفقا للشروط التالية: حالة المدى الأولية: 100 فولت، 20 دقيقة، وحالة النهائية: 120 فولت و 40 دقيقة.
  7. وصمة عار الجل مع Coomassie الأزرق اللامع في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة حتى الجل الأزرق بشكل موحد في اللون.
    ملاحظة: تلطيخ اكتمال عندما هلام لم يعد مرئيا في محلول الصبغة.
  8. يزيل اللون مع حل حامض الخليك (10٪) في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة. وسوف يبدأ البولنجر على ما يبدو. تواصل destaining في 4 درجات مئوية خلال الليل حتى خلفية واضحة.

2. الببتيد التجميعي وحيدة النسيلة جسم إنتاج

  1. استرداد تسلسل الأحماض الأمينية ميغابايت من بنك الجينات بما في ذلك سمك التونة والدجاج والنعام والثدييات المحلية، وختم 18 نوعاالثدييات البحرية (الجدول 2).
  2. محاذاة تسلسل باستخدام البرامج المناسبة 16:
    1. إطلاق مستكشف محاذاة طريق تحديد محاذاة: تعديل / بناء التوافق على شريط الإطلاق؛ حدد إنشاء محاذاة جديد ثم انقر فوق موافق. سيظهر مربع حوار يسأل "هل بناء الحمض النووي أو البروتين تسلسل المحاذاة؟"
    2. انقر فوق الزر المسمى "البروتين". تحديد البيانات: فتح: استرداد سلاسل من الملفات وحدد ملف تسلسل. حدد تعديل: حدد جميع الأوامر القائمة لتحديد جميع المواقع لكل تسلسل في مجموعة البيانات لإنشاء محاذاة تسلسل متعددة.
    3. اختر محاذاة: محاذاة بواسطة ClustalW من القائمة الرئيسية لمحاذاة البيانات تسلسل المحدد باستخدام خوارزمية ClustalW. حدد "BLOSUM"، كما البروتين الوزن مصفوفة ثم انقر فوق الزر موافق.
  3. تحليل تسلسل المحاذاة:
    1. التركيز على 5 سي التفاعلي الأنتيجينقسم التدريب والامتحانات 17: الموقع 1 (AKVEADVA، 15-22)، موقع 2 (KASEDLK، 56-62)، الموقع 3 (ATKHKI، 94-99)، الموقع 4 (HVLHSRH، 113-119)، والموقع (5 KYKELGY، 145- 151) والعثور على جزء المحفوظة بين الثدييات البحرية. * (علامة النجمة، رمز إجماع في محاذاة (بروتوكول 2.2.3)) إلى المواقف التي لديها واحدة، وبقايا الحفظ تماما. تم العثور على شظايا الحفظ التالية في الحيتان: تسلسل KASEDLKKHG (والذي يتضمن الموقع 2)، وتسلسل HVLHSRHP (والذي يتضمن الموقع 4).
  4. توليف مرشح تسلسل شظايا وفقا لتحليل تسلسل، والمترافقة مع بروتين ألبومين البيض (OVA) كما البروتين الناقل باستخدام الخدمات التجارية.
    1. إضافة الأحماض الأمينية مسعور (على سبيل المثال، ميثيونين) إلى N-محطة من موقع رد الفعل الأنتيجين لمنع الببتيد من التحلل (على سبيل المثال، M-KASEDLKKHG).
    2. إطالة C-محطة من موقع رد الفعل الأنتيجين لفضح الموقع الأنتيجين الأساسية لخلية مناعية. وعلاوة على ذلك، conjuبوابة الببتيد مع OVA بإضافة السيستين (السيستئين، C) إلى C-محطة (على سبيل المثال، M-KASEDLKKHG-NTVL-C).
  5. يستحلب مساعد الكامل فرويند لمستمنع 1 أو مساعد ناقصة فرويند لمستمنع 2 مع حجم مساو من كل الببتيد الاصطناعية في برنامج تلفزيوني (3 مل، نهائي تركيز 30-50 ميكروغرام / 100 ميكرولتر).
  6. تطعيم مستمنع 1 (0.1 ملغ) تحت الجلد في كل من 5 إناث الفئران BALB / ج.
  7. أداء حقن منشطة تحت الجلد خمس مرات باستخدام مستمنع 2 على فترات لمدة أسبوعين، وجمع الأمصال الاختبار عن طريق أخذ العينات ذيل مقطع من الفئران قبل كل معززة.
  8. تحديد عيار الأمصال للفحص الأول.
    1. حل 100 ميكروغرام من الببتيد مجانا في 25 مل من رد فعل العازلة وقسامة 50 ميكرولتر من الحل في كل بئر من لوحة 96-جيدا. إضافة 10 ميكرولتر حل اقتران الكاشف في كل بئر وتخلط لوحة. احتضان لوحة لمدة 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
    2. إزالة محتويات البئر،غسل كل بئر 3 مرات بالماء المقطر، ومنع لوحة بإضافة 200 ميكرولتر من عرقلة الحل. احتضان لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة. إزالة محتويات وغسل كل بئر 3 مرات بالماء المقطر.
    3. أداء إليسا غير المباشر (بروتوكول 5،1-5،7) لتحديد الأمصال عيار لفحص الأول. اختيار الماوس وفقا لأعلى عيار (أعلى كثافة ضوئية) لجمع الطحال.
  9. قبل ثلاثة أيام لجمع الطحال، تطعيم 0.1 ملغ من مستمنع 1 تحت الجلد في الماوس تقديم أعلى عيار.
  10. جمع خلايا الطحال من الفئران تحصين المختارة والصمامات مع خلايا المايلوما الفئران F0 (SP2 / 0-Ag14) للحصول على خلايا هجين لتوليد ماب 18.
  11. بعد 14 يوما الانصهار، حدد استنساخ إيجابية عن طريق فحص والتفاعل من supernatants هجين نحو الببتيد الاصطناعية مجانا باستخدام الاليزا غير المباشر (بروتوكول 5،1-5،7).
  12. تمييع الخلايا لعدد مناسب لكل بئر لmaximizجي نسبة الآبار التي تحتوي على نسخة واحدة واحدة فقط (تخفيف الاستنساخ).
    1. إضافة 100 ميكرولتر من مستنبت الخلية لجميع الآبار في لوحة 96-جيدا إلا A1 الآبار التي تبقى فارغة.
    2. إضافة 200 ميكرولتر من خلية إلى تعليق A1 جيدا. ثم سرعان ما نقل 100 ميكرولتر من A1 إلى B1 ومزيج من قبل pipetting بلطف. كرر هذه 1: 2 التخفيفات أسفل العمود بأكمله، ثم تنقلب 100 ميكرولتر من H1 بحيث ينتهي مع نفس الحجم مثل الآبار فوقه.
    3. إضافة 100 ميكرولتر إضافية من المتوسطة إلى العمود 1 مع micropipette 8 قنوات. ثم سرعان ما نقل 100 ميكرولتر من كل من الآبار في العمود 1 لتلك الموجودة في العمود 2 باستخدام نفس ماصة، ومزيج من قبل pipetting بلطف.
    4. باستخدام نفس النصائح، كرر هذه 1: 2 التخفيفات عبر لوحة كاملة. تجاهل 100 ميكرولتر من كل من الآبار في العمود الأخير.
    5. جلب الحجم النهائي من جميع الآبار إلى 200 ميكرولتر بإضافة 100 ميكرولتر المتوسطة إلى كل بئر. احتضان جيش التحرير الشعبى الصينىدون عائق الشركة المصرية للاتصالات عند 37 درجة مئوية في ترطيب CO 2 الحاضنة.
    6. التحقق من كل جانب وعلامة جميع الآبار التي تحتوي على مجرد مستعمرة واحدة. تنفيذ اثنين أو أكثر من clonings حتى> 90٪ من الآبار التي تحتوي على الحيوانات المستنسخة واحدة إيجابية لإنتاج الأجسام المضادة.
  13. فحص الحيوانات المستنسخة لطخة الغربية وصمة عار نقطة (بروتوكول 3،1-4،6). ثم المستعمرات ثقافة فرعية من الآبار إلى السفن الكبيرة إلى توسيع الخلايا للحصول على ماب. وعادة ما يتم نقل كل استنساخ في بئر واحدة في لوحة 12- أو 24-جيدا.
  14. قياس تقارب بين MABS ومقتطفات العضلات من البقر والماعز والخنازير والكلاب والأرانب والتونة والدجاج، وختم، وأربعة أنواع الحيتان تمثيلية لطخة الغربية وصمة عار نقطة (بروتوكول 3،1-4،6).
  15. تطعيم الخلايا هجين مختارة (ما يصل الى 3 × 10 6) البريتونى في الفئران للحث على استسقاء. انتفاخ البطن عادة ما يبدو في غضون 7-10 آخر أيام حقن هجين. جمع السائل باستخدام إبرة تحت الجلد(أقل من قياس 20).
  16. أجهزة الطرد المركزي سائل الاستسقاء (10000 x ج لمدة 10 دقيقة) لإزالة الخلايا والحطام. تصفية من خلال مرشح 0.45 ميكرون. إضافة 1-20 مل من العينة، 15 مل العازلة ملزمة، و3-5 مل من شطف العازلة في البروتين العمود G سيفاروز. جمع الكسر شطف تحتوي على الأجسام المضادة تنقيته من السوائل استسقاء الفئران.
  17. تحديد نمط إسوي الأجسام المضادة من قبل الأجسام المضادة عدة isotyping باستخدام تعليمات الشركة الصانعة.

3. ويسترن وصمة عار

  1. إعداد العازلة تحميل 2X تحتوي على بيتا المركابتويثانول (BME) عن طريق خلط 950 ميكرولتر من عينة العازلة 2X Laemmli مع 50 ميكرولتر من أساسيات إدارة الأعمال. تمييع supernatants العضلات (بروتوكول 1،1-1،4) في العازلة تحميل مع نسبة ملائمة من أجل الحصول على إشارات جيدة: 01:50 (الحيتان والفقمة) و 1: 5 (الحيوانات الأليفة وأسماك التونة) عند استخدام الأجسام المضادة ميغابايت الأرنب بولكلونل مكافحة الإنسان، و 1: 1 (الخنازير والأرانب والدجاج والتونة)، 1: 5 (البقر والماعز والكلاب)، و01:25 (الحيتان والفقمة) عندماntibody هو من طاف هجين.
  2. عينة الحرارة على 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. نماذج تحميل في الآبار من هلام SDS-PAGE (4٪ الأكريلاميد التراص و 12٪ الأكريلاميد فصل) جنبا إلى جنب مع علامات الوزن الجزيئي. تشغيل هلام لمدة 5 دقائق في 50 V ثم زيادة الجهد إلى 150 فولت لإنهاء التشغيل في حوالي 1 ساعة.
  3. وضع الجل في المخزن نقل 1X لمدة 15 دقيقة. نقل البروتين فصلها لالنيتروسليلوز (NC) الأغشية بعد أن يتم فصل في الصفحة. ويمكن أن يتم نقل 100 V ل60-90 دقيقة.
  4. يعد حل حجب ما يلي: 1X PBS تحتوي على 0.1٪ توين 20 مع 5٪ الحليب الجاف الخالي. منع غشاء NC في 25 مل من عرقلة الحل في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة. يغسل ثلاث مرات لمدة 5 دقائق لكل منهما مع 15 مل الفوسفات مخزنة المالحة مع توين 20 (PBST).
  5. احتضان الغشاء والأجسام المضادة الأولية (استسقاء السائل أو طاف هجين) في 10 مل العازلة تخفيف الأجسام المضادة المخفف مع 5٪ عرقلة الحل في 4 درجات مئوية خلال الليل.
  6. غسل MEMBRANالبريد ثلاث مرات مرة أخرى مع PBST لتنظيف قبالة الأجسام المضادة المفرط.
  7. احتضان الغشاء مع القلوية الفوسفاتيز مترافق الماعز المضادة للماوس مفتش في 1: 1250 في محلول مانع مع الإثارة لطيف لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
  8. يغسل الغشاء مرة أخرى واحتضان ذلك في 5 برومو-4-كلورو-3-indolyl كلوريد الفوسفات / ف تترازوليوم نتروبلو (BCIP / NBT) الفوسفاتيز الركيزة الخليط لمدة 10 إلى 20 دقيقة حتى وضع اللون.
  9. وقف رد فعل عن طريق غسل الغشاء في العديد من التغييرات من الماء المقطر.

4. نقطة وصمة عار

  1. تمييع supernatants العضلات (بروتوكول 1،1-1،4) في 5٪ الزلال المصل البقري (BSA) في PBST مع نسبة ملائمة من أجل الحصول على إشارات جيدة: 1: 5 للحيوانات المحلية والتونة، و01:25 لالحيتان والفقمة. بقعة 5 ميكرولتر من العينات على الغشاء. تقليل المنطقة أن الحل تخترق (عادة قطرها ملم 3-4) عن طريق تطبيق ببطء.
  2. يجف الغشاء في درجة حرارة الغرفة (على سبيل المثال، </ م> في تدفق الصفحي لمدة 30-60 دقيقة)، منعه مع عرقلة الحل في طبق بتري لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة، ويغسل مع PBST.
  3. احتضان الغشاء مع الأجسام المضادة الأولية (ماب من طاف هجين في 1: 10000 أو السائل الاستسقاء في 1: 100،000 المخفف في 5٪ عرقلة الحل) لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
  4. استخدام PBST لغسل غشاء ثلاث مرات لمدة 5 دقائق كل لإزالة الأجسام المضادة الزائد، ثم احتضان مع الأجسام المضادة الثانوية (القلوية الماعز الفوسفاتيز مترافق المضادة للماوس مفتش في 1: 1250 في 5٪ عرقلة الحل) لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة .
  5. يغسل الغشاء مرة أخرى واحتضان ذلك في BCIP / NBT خليط الفوسفاتيز الركيزة في غضون 10 إلى 20 دقيقة حتى وضع اللون.
  6. وقف رد فعل عن طريق غسل الغشاء في العديد من التغييرات من الماء المقطر.

5. غير المباشر ELISA

  1. إعداد غسل العازلة (0.002 M ايميدازول مخزنة المالحة مع 0.02٪ توين 20). غسل لوحة 3 مرات مع الغسيلالعازلة بين كل خطوة التالية (بروتوكول 5،2-5،5).
  2. إعداد 1:25 التخفيف من supernatants العضلات (بروتوكول 1،1-1،4) في المخزن الطلاء. معطف 96-جيدا لوحة ELISA مع 100 ميكرولتر supernatants المخففة عند 4 درجات مئوية خلال الليل ومنعه مع عازلة تمنع (1٪ في جيش صرب البوسنة PBS) لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
  3. إعداد 1: 2000 تخفيف من ماب النقي مع عازلة المخفف وإضافة 100 ميكرولتر من ماب المخفف إلى كل بئر. احتضان لوحة لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
  4. إضافة الماعز المضادة للمفتش الماوس مترافق مع البيروكسيديز الفجل (1: 200 التخفيف في المخزن المخفف) لمزيد من الحضانة.
  5. إضافة البيروكسيديز الركيزة على كل جانب (100 ميكرولتر / جيد)، واحتضان لمدة 10-15 دقيقة.
  6. وقف رد فعل الانزيم من قبل وقف الحل البيروكسيداز (100 ميكرولتر / جيد) عندما لوحظ اللون التنمية.
  7. قراءة الكثافة البصرية في 450 نانومتر باستخدام مطياف صفيحة.

6. إعداد ماب المسمى الذهب الغروية

ملاحظة: لون حل الذهب الغروية والخليط يجب أن تكون دائما حمراء. ضبط درجة الحموضة، وتركيز ماب، سرعة أجهزة الطرد المركزي عندما يلاحظ راسب أسود. الخطوات 6.1 و 6.2 خطوات الأمثل.

  1. إضافة تنقيته كشف ماب (50 ميكروغرام / مل، و 3 ميكرولتر) إلى 100 ميكرولتر من محلول الذهب الغروية مع قيم الرقم الهيدروجيني متفاوتة 5-9. ويعتبر الحد الأدنى من درجة الحموضة التي تحافظ على اللون الأحمر لمدة ساعتين كما أن درجة الحموضة المثلى. ملاحظة: في هذه الدراسة، تم استخدام 0.1 M كربونات البوتاسيوم لضبط الذهب الغروي (40 نانومتر) حل لدرجة الحموضة 8.0 (درجة الحموضة المثلى).
  2. إضافة كمية مختلفة من تنقية كشف ماب (500 ميكروغرام / مل، 1-20 ميكرولتر) إلى 100 ميكرولتر من محلول الذهب الغروية في درجة الحموضة 8.0. ملاحظة: إن تركيز الأمثل في هذه الدراسة هو 6 ميكروغرام / مل (أي راسب أسود).
  3. وفقا لنتائج المذكورة أعلاه، إضافة 60 ميكروغرام من تنقية كشف ماب قطرة من الحكمة إلى 10 مل من محلول الذهب الغروي. استحلب الخليط بلطف على درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقيقة. ميلاديد 2 مل من محلول 5٪ BSA في برنامج تلفزيوني (الرقم الهيدروجيني 7.4) إلى الخليط ويستحلب بلطف في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة للحد من التدخل في الخلفية.
  4. أجهزة الطرد المركزي الخليط في 10000 x ج لمدة 30 دقيقة على 4 درجات مئوية.
  5. إزالة طاف مع الأجسام المضادة اللامقترن بعناية وتعليق الكريات الناتجة في 4 مل PBST تحتوي على 1٪ BSA و 0.1٪ توين 20، وكرر الطرد المركزي وتعليق عدة مرات.
  6. تعليق رواسب النهائية في 1 مل PBST وتخزينها في 4 درجات مئوية حتى استخدامها.

7. بناء قطاع المناعي

ملاحظة: يبين الشكل 1 تصميم الشريط المناعي. إعداد وتجميع الشرائط في الرطوبة منخفضة الظروف البيئية مختبر (<20٪ الرطوبة النسبية) للحياة تخزين لفترات طويلة (> 1 سنة). أبعاد منصات وغشاء هي: المكورات وحة 300 مم × 10 مم، وسادة ماصة 300 مم × 24 مم، وسادة العينة 300 مم × 24 مم، NC غشاء 300 مم × 25 مم، كرتون 300مم × 80 مم.

  1. إضافة الغروي حل المسمى الذهب ماب من الخطوة 6.6 مع micropipette لتشبع لوحة المترافقة ثم جففه في 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة قبل تجميع.
  2. توزيع محددة ماب (500 ميكروغرام / مل) على منطقة الاختبار التقاط مستضد، وأرنب لمكافحة فأر مفتش (500 ميكروغرام / مل) على المنطقة المراقبة للكشف عن ماب على الغشاء NC باستخدام طابعة ماصة أو immunostrip. الحفاظ على مسافة (> 5 ملم) بين المنطقتين لتفادي أي تشويش.
  3. لصق لوحة مترافق، وسادة ماصة والأغشية NC على الكرتون مع الشريط على الوجهين.
    ملاحظة: تداخل منصات على كل جانب من الغشاء NC بنحو 2 مم. وبناء قطاع غير لائق يؤدي إلى اختبار غير مكتملة.
  4. وضع لوحة العينة على لوحة المترافقة (2 ملم) ولصقها على ورق مقوى.
  5. إنشاء شرائح واسعة 6 ملم مع ورقة القاطع. حزمة شرائح في كيس رقائق الألومنيوم مع المجففة، وتخزينها في 4 درجات مئوية حتى استخدامها.

8. عبر التفاعل الاختبار

  1. التجانس 0.03 غرام من عينة العضلات الخام مع 1 مل PBS (التي تحتوي على 0.1٪ BSA) في أنبوب الطرد المركزي 1.5 مل باستخدام عصا الخيزران أو طحن قضيب.
  2. عقد قطاع كتبها العكس حد للمناطق اختبار وتراجع الجزء وحة العينة إلى العينة لمدة 5-10 دقيقة ومراقبة نتيجة مباشرة.
    1. اختياري: جمع 500 ميكرولتر طاف وتحويلها إلى أنبوب الطرد المركزي الجديدة.
      ملاحظة: اقترح هذه الخطوة إذا كانت إشارة ليست واضحة عندما يتم استيعابه الشريط مباشرة في طاف.
  3. اختبار عينات العضلات المختلفة في ثلاث نسخ.
    ملاحظة: نحن هنا اختبار التونة، الدجاج، ختم، 15 نوعا من الثدييات و 5 أنواع من الثدييات الأرضية.
  4. لدينا خمسة مفتشين مستقلين يكرر 8.3 لخمس مرات، أي استخدام 575 شرائط في المجموع.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

خصائص الأجسام المضادة وحيدة النسيلة

وضعنا اثنين مفتش 1 MABS (CGF5H9 وCSF1H13) الاعتراف اثنين من الببتيدات الاصطناعية (MKASEDLKKHGNTVLC وAIIHVLHSRHPAEFGC)، على التوالي، من الحوتيات ميغابايت، وكانت تستخدم هذه لبناء شطيرة من نوع الذهب الغروية شريط الاختبار المناعي للكشف السريع ميغابايت الحيتان. ويبين الشكل 2 أن CGF5H9 بالكشف عن الحيتان والثدييات الأخرى والفرقة الملون واحد...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

باستخدام الببتيد الاصطناعية مترافق إلى البروتين الناقل هو ملحوظ أكثر فعالية مقارنة مع البروتين وما شابه ذلك. لمعدات القائم على شطيرة، لأنه يتم تطوير ماب باستخدام الحواتم مع المواقع النسبية المعروفة، وMABS اثنين في هذه الدراسة من غير المحتمل أن تتداخل مع تفاعل كل منهما مع حاتمة المستضد الهدف. وعلاوة على ذلك، فإن التفاعل بين البروتين الأصلي والأجسام المضادة من الفئران تحصين مع الاصطناعية الببتيد المترافقة قد تكون أقوى من التفاعل بين البروتين الأصلي والأجسام المضادة التي تنتج من البر...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعلن المؤلفون أنه ليس لديهم مصالح مالية متنافسة.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نحن نقدر الزملاء في جمعية الحيتانيات التايوانية ، ومركز أبحاث البيولوجيا البحرية والحيتانيات التابع لجامعة تشنغ كونغ الوطنية ، وحديقة فارجلوري أوشن بارك ، ومركز تشخيص الأمراض الحيوانية التابع لجامعة تشياي الوطنية لجمع العينات. تم تمويل هذا المشروع بمنحة إلى WCY من مجلس الزراعة في تايوان (100AS-02.1-FB99).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
محلول ملحي مخزن بالفوسفاتAMRESCOJ373
Protein G HP SpinTrap جنرال إلكتريك  عمود الدوران للرعاية الصحية28-9031-34الذي يحتوي على بروتين G Sepharose
IsoStrip Mouse أحادي النسيلة طقم الأنماط المضادة للأجسام المضادة أحادية النسيلةشرائط الأنماط المتناسبة من Roche11493027001، مغلفة مسبقا بالأجسام المضادة المضادة للماوس Ig الخاصة بالفئة الفرعية والسلسلة الخفيفة
Mini Trans-BlotBio-Rad170-3935
غشاء النيتروسليلوزWhatmanZ613630
الأجسام المضادة حل المانع LTK BioLaboratoriesلتقليل تفاعلات الربط غير المحددة ل IgG غير المحددة في عينات
ركيزة الفوسفاتيز BCI / NBT   ؛KPL50-81-00
كاشف البروتين HRP Microwell Kit ، مضاد للفأرKPL54-62-18
Nunc Immunoplate MaxiSorp ELISA PlateThermo   ؛ فيشر ساينتفيكEW-01928-08
Multiskan  قارئ EX ELISA Thermo  Electron  شركة51118170
حل الذهب الغرواني (40 نانومتر)  REGA للتكنولوجيا الحيوية40-50 نانومتر مناسب للشريط المناعي
ألبومين مصل الأبقارGibco15561-020
اختبار سريع طابعة شريط immnoREGA biotechnology Inc.AGISMART RP-1000 مناسب فقط لإنتاج الشرائط المناعية على نطاق صغير لأغراض البحث والتطوير
مكونات الشريط (أغشية NC ، وسادات العينة (# 33 الزجاج ، S & amp S) ، وسادات مترافقة (#16S ، S & S) والوسادات الماصة (CF6 ، Whatman)) REGAbiotechnology Inc.
فرويند s مساعد وغير مكتمل Freund' s adjuvant Sigma-AldrichF5881 ، F5506تستخدم لإنتاج مستحلبات الماء في الزيت من الجينات المناعية
أكريلاميد ، المخزن المؤقت للهلام ، بيرسلفات الأمونيوم (APS) ، رباعي ميثيل إيثيلين ديامين (TEMED)   ؛جل Protechل SDS-PAGE
Coomassie الأزرق اللامع R-250Bio-Rad1610436تلطيخ البروتين في المواد الهلامية SDS-PAGE عينة
Laemmli و & beta ؛ mercaptoethanolBio-Rad1610737 ، 1610710تمييع عينات البروتين قبل التحميل على المواد الهلامية SDS-PAGE
شركة تحضير

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Robards, M. D., Reeves, R. R. The global extent and character of marine mammal consumption by humans: 1970-2009. Biol. Conserv. 144, 2770-2786 (2011).
  2. Booth, S., Zeller, D. Mercury, food webs, and marine mammals: implications of diet and climate change for human health. Environ. Health Perspect. 113, 521-526 (2005).
  3. Endo, T., et al. Total mercury, methyl mercury, and selenium levels in the red meat of small cetaceans sold for human consumption in Japan. Environ. Sci. Technol. 39, 5703-5708 (2005).
  4. Tryland, M., et al. Human pathogens in marine mammal meat. Norwegian Scientific Committee for Food Safety (VKM). , (2011).
  5. Matsunaga, T., et al. A quick and simple method for the identification of meat species and meat products by PCR assay. Meat Sci. 51, 143-148 (1999).
  6. Dalebout, M. L., Helden, A. V., van Waerebeek, K., Baker, C. S. Molecular genetic identification of southern hemisphere beaked whales (Cetacea: Ziphiidae). Mol. Ecol. 7, 687-694 (1998).
  7. Dalmasso, A., et al. A multiplex PCR assay for the identification of animal species in feedstuffs. Mol. Cell. Probes. 18, 81-87 (2004).
  8. Kesmen, Z., Sahin, F., Yetim, H. PCR assay for the identification of animal species in cooked sausages. Meat Sci. 77, 649-653 (2007).
  9. Liu, L., Chen, F. -C., Dorsey, J. L., Hsieh, Y. -H. P. Sensitive Monoclonal Antibody-based Sandwich ELISA for the Detection of Porcine Skeletal Muscle in Meat and Feed Products. J. Food Sci. 71, 1-6 (2006).
  10. Kotoura, S., et al. A Sandwich ELISA for the Determination of Beef Meat Content in Processed Foods. Food Sci. Techno. Res. 15, 613-618 (2009).
  11. Hsieh, Y. H., Chen, Y. T., Gajewski, K. Monoclonal antibody-based sandwich ELISA for reliable identification of imported Pangasius catfish. J. Food Sci. 74, 602-607 (2009).
  12. Ross, H. A., et al. DNA surveillance: web-based molecular identification of whales, dolphins, and porpoises. J.Hered. 94, 111-114 (2003).
  13. Ngom, B., Guo, Y., Wang, X., Bi, D. Development and application of lateral flow test strip technology for detection of infectious agents and chemical contaminants: a review. Anal. Bioanal. Chem. 397, 1113-1135 (2010).
  14. Muldoon, M. T., Onisk, D. V., Brown, M. C., Stave, J. W. Targets and methods for the detection of processed animal proteins in animal feedstuffs. Int. J. Food Sci. Technol. 39, 851-861 (2004).
  15. Rao, Q., Hsieh, Y. H. Evaluation of a commercial lateral flow feed test for rapid detection of beef and sheep content in raw and cooked meats. Meat Sci. 76, 489-494 (2007).
  16. Tamura, K., et al. MEGA5: molecular evolutionary genetics analysis using maximum likelihood, evolutionary distance, and maximum parsimony methods. Mol. Biol. Evol. 28, 2731-2739 (2011).
  17. Atassi, M. Z. Antigenic structure of myoglobin: the complete immunochemical anatomy of a protein and conclusions relating to antigenic structures of proteins. Immunochemistry. 12, 423-438 (1975).
  18. Zhang, C. Hybridoma technology for the generation of monoclonal antibodies. Methods Mol. Biol. 901, 117-135 (2012).
  19. Kao, D. J., Hodges, R. S. Advantages of a synthetic peptide immunogen over a protein immunogen in the development of an anti-pilus vaccine for Pseudomonas aeruginosa. Chem. Biol. Drug Des. 74, 33-42 (2009).
  20. Dolar, M. L., Suarez, P., Ponganis, P. J., Kooyman, G. L. Myoglobin in pelagic small cetaceans. J. Exp. Biol. 202, 227-236 (1999).
  21. Lo, C., et al. Rapid immune colloidal gold strip for cetacean meat restraining illegal trade and consumption: implications for conservation and public health. PLoS ONE. 8, e60704(2013).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Colloidal Gold Immunochromatographic Test StripCetacean Myoglobin DetectionMonoclonal Antibody DevelopmentPeptide Sequence AnalysisWestern Blot AnalysisDot Blot AnalysisIndirect ELISA ScreeningMuscle Sample HomogenizationNitrocellulose Membrane AssemblyRapid Field Detection

مقالات ذات صلة