التصوير الهياكل التحت خلوية في الأجنة الحية اسماك الزرد

ملخص

يمكن أن يلقي تصوير السلوك الديناميكي للعضيات والهياكل الخلوية الأخرى في الجسم الحي الضوء على وظيفتها في الظروف الفسيولوجية والمرضية. هنا ، نقدم طرقا لوضع علامات وراثية على عضيتين ، الجسيمات المركزية والميتوكوندريا ، وتصوير ديناميكياتها في أجنة الزرد الحية باستخدام الفحص المجهري واسع المجال ومتحد البؤر.

الملخص

يوفر التصوير في الجسم الحي وصولا غير مسبوق إلى السلوك الديناميكي للهياكل الخلوية وتحت الخلوية في سياقها الطبيعي. يتطلب إجراء تجارب التصوير هذه في الفقاريات العليا مثل الثدييات عموما الوصول الجراحي إلى النظام قيد الدراسة. تسمح إمكانية الوصول البصري لأسماك الزرد الجنينية واليرقاتية بالتحايل على مثل هذه الإجراءات الغازية وتسمح بالتصوير في الكائن الحي السليم. في الواقع ، أصبح سمك الزرد الآن نموذجا راسخا لتصور السلوكيات الخلوية الديناميكية باستخدام الفحص المجهري في الجسم الحي في مجموعة واسعة من السياقات التنموية من الانتشار إلى الهجرة والتمايز. من التطورات الحديثة الاستخدام المتزايد لأسماك الزرد لدراسة الأحداث تحت الخلوية بما في ذلك الاتجار بالميتوكوندريا وديناميكيات الجسيم المركزي. إن السهولة النسبية التي يمكن بها تصنيف هذه الهياكل الخلوية وراثيا بواسطة بروتينات الفلورسنت واستخدام تقنيات الفحص المجهري الضوئي لتصويرها تحول سمكة الزرد إلى نموذج في الجسم الحي لبيولوجيا الخلية. نصف هنا طرق توليد التركيبات الجينية التي تصنف العضيات بشكل فلوري ، مع تسليط الضوء على الميتوكوندريا والجسيمات المركزية كأمثلة محددة. نستخدم نظام Gal4-UAS ثنائي الأجزاء في تكوينات متعددة لتقييد التعبير على أنواع خلايا معينة وتوفير بروتوكولات لتوليد أسماك معدلة وراثيا مستقرة بشكل عابر. أخيرا ، نقدم إرشادات لاختيار طرق الفحص المجهري الضوئي الأكثر ملاءمة لتصوير الديناميكيات تحت الخلوية.

المقدمة

في مجال التصوير فيفو يوفر رؤية مباشرة من السلوكيات الخلوية في سياق أكثر الفسيولوجية. الشفافية في الأجنة الزرد وتطورها السريع والخارجية ومجموعة غنية من الأدوات الوراثية التي تسمح وضع العلامات الفلورية التي ساهمت في تزايد استخدام في الجسم الحي المجهري لتوضيح ديناميات الأحداث التنموية الرئيسية. دراسات التصوير تطوير النظام العصبي في الزرد لها على سبيل المثال توسع كبير معرفتنا سلوك الخلايا الاولية العصبية ومصير أولادهم بما في ذلك على الهجرة لاحقة، والتمايز والتكامل الدائرة ^1-8.

يتم الآن تعيين المرحلة للتحقيق في ديناميات التحت خلوية الكامنة وراء هذه السلوكيات الخلوية. في الواقع، يجري بالفعل استغلال الزرد كأدوات للفي الجسم الحي بيولوجيا الخلية. أصبح من الممكن الآن لتصور الميتوكوندريا ^11/09، جسيم مركزي ^{2،8،12-14،} جولجي ¹⁵وأنيبيب ⁴ و الأكتين ¹⁶ الهيكل الخلوي، الإندوسومات ¹⁷ ومكونات غشاء قمي مجمع ^1،18، بين الهياكل التحت خلوية أخرى في الأجنة الزرد في الجسم الحي. وحتى الآن، معظم ما هو معروف عن وظيفة هذه العضيات يأتي من دراسة سلوكهم في الخلايا المستزرعة. بينما في المختبر اعطت الدراسات البصيرة هائلة في بيولوجيا الخلايا، والخلايا في الثقافة لا تمثل تماما تعقيد الوضع في الجسم الحي، وبالتالي لا تعبر بالضرورة عن وظيفة وديناميات العضيات التحت خلوية في الجسم الحي. الأجنة الزرد تقدم قابلة للحياة في بديل الجسم الحي لدراسة ديناميات التحت خلوية.

كما الفقاريات، الزرد تمتلك العديد من أجهزة الجسم (على سبيل المثال، الشبكية العصبية) التي هي مثلي لتلك الموجودة في أنواع الثدييات. بالإضافة إلى ذلك، يتزايد استخدام الأجنة الزرد لنموذج الأمراض التي تصيب الإنسان ^19،20 ، بما في ذلك تلك التي تتعلق وظيفة centrosomal (على سبيل المثال، صغر الرأس ²¹ والخلقية بعمى جزئي ²² ليبر) وظيفة الميتوكوندريا (على سبيل المثال، مرض باركنسون ^23، tauopathies ^10،24 ومتلازمة بارث ^25). وفي الجسم الحي التصوير على المستوى الخلوي والتحت خلوية في هذه الحالات سوف تسمح لفهم أفضل للبيولوجيا الخلايا الكامنة وراء هذه الحالات المرضية.

ويتمثل الهدف العام من الأساليب المذكورة هنا هو توفير دليل شامل للتحقيق في العضيات والهياكل التحت خلوية أخرى في الأجنة الزرد استخدام في ضوء الجسم الحي المجهري. يتم وصف كامل تدفق العمل المشاركة في تصور وتتبع الهياكل التحت خلوية في الجسم الحي - من نهج وضع العلامات الوراثية، لتوليد عابر التعبير والأسماك المعدلة وراثيا مستقرة، وأخيرا إلى التصوير باستخدام واسعة المجال والفحص المجهري متحد البؤر. في حين أن كل من هذه بروكيستخدم edures من قبل العديد من المختبرات الزرد، والأمثل البروتوكولات المذكورة ومبسطة للتحقيق في ديناميات الهياكل التحت خلوية. اثنان جوانب محددة من العمل الموصوف هنا تستدعي ذكر: أولا، استخدام نظام التعبير GAL4-UAS في تشكيلات متعددة لوراثيا العضيات التسمية في الخلية أنواع معينة. ثانيا، مقارنة مباشرة من الميدان واسعة والفحص المجهري متحد البؤر الهياكل التحت خلوية الصورة في الجسم الحي.

الاستراتيجيات الحالية لوراثيا العضيات التسمية والهياكل التحت خلوية أخرى في الزرد إما الاستفادة من توج مرنا ^1،4،8 أو يبني الحمض النووي إلى حيث العناصر المروج تدفع مباشرة للتعبير عن البروتينات الانصهار ^9،14،15. كتب في المختبر توج نتائج الحمض النووي الريبي في السريع والتعبير واسع، وهذا ليس أنسجة محددة ولكن. بالإضافة إلى ذلك، مستويات التعبير يقلل بمرور الوقت يتم تخفيف الحمض النووي الريبي توج أو تدهور. وبالتالي استخدام الحمض النووي الريبي مقرهايبني لدراسة ديناميات عضية في مراحل لاحقة في التنمية محدودة (عادة ما يصل إلى 3 أيام بعد الإخصاب).

هذه القيود يمكن التغلب عليها باستخدام البنى الحمض النووي، حيث يتم تحديد السيطرة المكانية والزمانية التعبير من قبل عناصر المروج محددة. عندما تستخدم يبني الحمض النووي مقرها في سياق التحسينات نظام GAL4-UAS كبيرة في مستويات التعبير التحوير لوحظ ^26،27. في هذا النظام التعبير الثنائي، من نوع الخلية عناصر المروج محددة بالسيارة التعبير عن منشط GAL4 النسخي، في حين يتم استنساخ الجينات مراسل المصب من تسلسل تفعيل المنبع ملزم GAL4 (UAS). من خلال الجمع بين UAS صحفيين مع السائقين GAL4 المناسبة والتعبير يمكن أن يقتصر على خلية أنواع معينة، التحايل على الحاجة إلى استنساخ الجينات مراسل وراء المروجين مختلفة في كل مرة هو المطلوب نمط التعبير محددة. وعلاوة على ذلك، والتعبير عن الجينات مراسل UAS متعددة يمكن أن يكونمدفوعا منشط GAL4 واحد. وبالتالي يوفر نظام GAL4-UAS نهجا وراثية متعددة ومرنة لوضع العلامات التحت خلوية.

واسع المجال، والمجاهر مبائر هي حقوله المنتجة من معظم المختبرات. أنظمة واسعة المجال وعادة ما تستخدم مصباح قوس كمصدر الضوء وكشف عن الضوء المنبعث مع كاميرا الحساسة التي يتم وضعها في نهاية مسار الضوء. ويقتصر هذا طريقة التصوير عادة لعينات رقيقة مثل الخروج من ضوء التركيز يحجب المعلومات في التركيز في عينات سمكا. المجهر متحد البؤر تختلف عن أنظمة واسعة المجال في أن يتم بناؤها لصالح الإشارات التي تنشأ من طائرة الوصل على تلك التي تنشأ من التركيز (أي، "باجتزاء البصري") ^28. لتحقيق باجتزاء البصرية يتم وضع الثقب في مسار الانبعاثات في موقف المترافقة إلى مصدر الضوء نقطة. وتستخدم أشعة الليزر ومصادر الضوء ويتم اكتشاف الإشارات مع أنابيب مضخم (هذه الفرق). عمليا، ليزروتمريرها شعاع على عينة تم الكشف من قبل PMT نقطة بنقطة وانبعاث مضان في كل بقعة (بكسل).

نحن هنا صورة نفس الهياكل التحت خلوية في العيش الأجنة الزرد باستخدام كل واسعة المجال والفحص المجهري متحد البؤر لتوفير المقارنة المباشرة الطريقتين المجهر. والهدف الأساسي من تقديم مثل هذه المقارنات هو تقديم المبادئ التوجيهية لاختيار تقنية المجهر الأنسب للسؤال محدد في متناول اليد.

باستخدام النهج الموصوفة هنا علينا أن نبرهن GAL4-UAS وضع العلامات الوراثية على أساس من الميتوكوندريا وجسيم مركزي. يتم تصوير هذه العضيات في مختلف خلية أنواع من الجهاز العصبي وخلايا العضلات باستخدام واسعة المجال، والفحص المجهري متحد البؤر لإثبات مدى ملاءمة كل طريقة التصوير. يمكن بسهولة الأساليب المذكورة هنا يمكن تكييفها للتحقيق في العضيات الأخرى والهياكل التحت خلوية في الجنين الزرد الحية.

البروتوكول

وأجريت التجارب على الحيوانات فقط وفقا للوائح المحلية للحكومة بافاريا العليا (ميونيخ، ألمانيا).

1. التعريف العضيات والهياكل التحت خلوية أخرى

ملاحظة: هنا يبني مراسل الوراثية التي وصفها fluorescently العلامة جسيم مركزي، الميتوكوندريا وأغشية الخلية.

1. استخدام أساليب الاستنساخ التقليدية ²⁹ لتوليد البروتينات الانصهار أن تسمية fluorescently جسيم مركزي والميتوكوندريا. استنساخ تسلسل ترميز centrin4 الزرد (cetn4) في الإطار مع بروتين فلوري ² (FP) مثل البروتين الفلوري الأصفر لتوليد cetn4-YFP. استنساخ تسلسل استهداف الميتوكوندريا من فرعية الثامن من السيتوكروم أوكسيديز في الإطار مع FP مثل البروتين الفلوري سماوي لتوليد mitoCFP ^9-11.
2. لتقييد حرية التعبير من البروتينات الانصهار (cetn4-YFP أو mitoCFP) إلى خلايا معينة من zebrafالعش الجنين (مثل الخلايا العصبية أو خلايا العضلات) استخدام ثنائي GAL4-UAS نظام التعبير ^26،27. أولا إنشاء مراسل بناء UAS. استخدام الطرق التقليدية لاستنساخ البروتين الانصهار في ناقلات التعبير UAS، المصب من كاسيت UAS ملزم GAL4 (تتراوح المتغيرات من 1x إلى 14X UAS، انظر مناقشة) ^26،27،30 والمروج الحد الأدنى (E1B المروج القاعدية من الكارب βactin الجينات)، وتوليد UAS: cetn4-YFP وUAS: mitoCFP.
   ملاحظة: لإعداد مراسل UAS يبني لمستقر الجيل خط المعدلة وراثيا تحتاج إلى استنساخ عناصر إضافية (انظر 3 أدناه)
3. لتصور سياق الخلوي الذي جسيم مركزي أو وصفت الميتوكوندريا، توليد مراسل UAS يبني التي وصفت أغشية الخلايا من قبل ضباط الإتصال. استنساخ أول الأحماض الأمينية العشرين من الزرد Gap43 (التي تحتوي على مواقع palmitoylation) في الإطار مع FP لاستهداف هذا FP إلى غشاء الخلية (memFP) ^31،32.
4. Obtaiن يبني سائق أو خطوط المعدلة وراثيا في أي خلية من نوع العناصر المروج محددة بالسيارة التعبير عن المنشط النسخي GAL4-VP16 ^27، Gal4FF ³³ أو KalTA4 ^30.
5. الجمع بين مراسل UAS يبني مع بناء التشغيل المناسب لتقييد حرية التعبير على المطلوب خلية نوع من الفائدة (على سبيل المثال، في العصبونات أو الخلايا العضلية). للقيام بذلك شارك في حقن السائق GAL4 ومراسل UAS يبني في مرحلة خلية واحدة من البويضات المخصبة (للحصول على تعليمات مفصلة الاطلاع على 2 أدناه) لتوليد عابر معربا عن الأسماك. بدلا من ذلك، تولد مراسل UAS خط المعدلة وراثيا مستقر (للحصول على تعليمات مفصلة الاطلاع على 3 أدناه) والعبور إلى سائق GAL4 خط المعدلة وراثيا مستقر لتوليد ذرية تحمل كل من الجينات المحورة.
   ملاحظة: من الممكن أيضا لحقن UAS مراسل بناء / ث إلى البويضات المخصبة من سائق GAL4 خط المعدلة وراثيا مستقر أو السائق GAL4 بناء في الاسمدةالبيض إد من مراسل UAS خط المعدلة وراثيا مستقر.
6. للمشاركة في التعبير عن عدة بروتينات اندماج متميزة باستخدام نظام GAL4-UAS، استخدام برنامج تشغيل GAL4 وUAS مراسل / ثانية في واحد من التكوينات التالية: أ متعددة، منفصلة يبني مراسل UAS (على سبيل المثال، UAS: mitoCFP وUAS: memYFP التعاون -injected مع سائق بناء GAL4) ^10، B. أشرطة UAS متعددة على مراسل واحد (على سبيل المثال، UAS: cetn4-YFP، UAS: memCerulean) ¹² C. ثنائية الاتجاه مراسل UAS (على سبيل المثال UAS: memYFP، mitoCFP) ^2،10،24 (الشكل 1).

الشكل 1. استراتيجيات للمشاركة في التعبير عن البروتينات الانصهار باستخدام نظام GAL4-UAS.
شارك في التعبير عن البروتينات الانصهار متعددة يمكن تحقيقه باستخدام UAS أشرطة مراسل في تشكيلات مختلفة: (أ) متعددة، منفصل CONST يحركها UASructs، (ب) عدة أشرطة UAS على بناء واحد أو (C) في UAS كاسيت ثنائي الاتجاه على بناء واحد. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

2. توليد عابر التعبير عن السمك

ملاحظة: فيما يلي التكيف من البروتوكولات التي تم نشرها مسبقا ^34،35. وينبغي أن تشمل الإعداد حقن الأساسي لمجهر تشريحي مع التكبير مداه يصل إلى 12X، وmicromanipulator مع حامل micropipette ومصدرا للضغط الهواء. إعداد قبل 2.1-2.5 من الزمن:

1. لإعداد غرف حقن مكروي البيض، وإعداد محلول 1.5٪ (ث / ت) الاغاروز في الماء. إضافة مسحوق الاغاروز في الماء والميكروويف حتى يذوب تماما agarose. ملء طبق بتري (100 × 15 ملم) مع هذا الحل.
   1. تسمح الحل الاغاروز لتبريد لapproximately 45 ^درجة مئوية قبل وضع قالب حقن مكروي البلاستيك (40 ملم × 66 ملم، مع 6X 50 ملم التلال الطويلة التي هي 1.5 ملم واسعة، 1 مم عميقة ومتباعدة 3 ملم بعيدا) على سطح الاغاروز المصهور، مع الحرص على عدم إدخال فقاعات في واجهة.
   2. بعد غروب الاغاروز، مخزن في 4 ^درجة CO / N. بعناية إزالة العفن باستخدام ملعقة. إعداد غرف حقن مكروي متعددة في وقت واحد، مخزن في 4 ^درجة مئوية واستخدامها مرارا وتكرارا على مدى عدة أسابيع.
2. استخدام مجتذب micropipette لتوليد الشعيرات الدموية حقن الزجاج مع عرقوب طويل ^36.
   ملاحظة: إعدادات محددة تستخدم لتوليد الشعيرات الدموية حقن ينبغي أن تحدد تجريبيا. يمكن سحب الشعيرات الدموية حقن في وقت مبكر وتخزينها قبل استخدامها.
3. قياس تركيز الحمض النووي البلازميد (سائق GAL4 وUAS يبني مراسل) ل microinjection باستخدام مقياس الطيف الضوئي وفقا لدليل الشركة المصنعة. قياس60، ونسبة الامتصاصية في 260 نانومتر و 280 نانومتر (A260 / 280). تمييع DNA إلى تركيز النهائي من 100 نانوغرام / ميكرولتر في nuclease خالية من المياه.
   ملاحظة: A260 280 / نسبة من ~ 1.8 يدل على الحمض النووي محض. النظر في استخدام عدة التجارية (على أساس مصفوفة السيليكا المستندة ملزمة) لتنقية DNA البلازميد لاستخدامها في الحقن. يجب أن يكون DNA البلازميد ذات جودة عالية لمنع التسمم.
4. إعداد 10 ميكرولتر حقن مزيج من خلال الجمع بين الحمض النووي (0.5 إلى 2.5 ميكرولتر من 100 نانوغرام / الأسهم ميكرولتر لتركيز النهائي من 5 إلى 20 نانوغرام / ميكرولتر)، حل Danieau ل(0.33 ميكرولتر من 30X الأسهم)، الفينول الأحمر (0.25 ميكرولتر، اختياري) وnuclease خالية من المياه لاجمالى حجم 10 ميكرولتر.
   ملاحظة: تحديد تجريبيا تركيز الحمض النووي يمكن أن ينتج التعبير مناسبة. GAL4 السائق وUAS البلازميدات مراسل بحاجة إلى أن يشترك حقنه. لن التعبير تترتب على ذلك عندما يتم حقن سوى السائق GAL4 أو UAS مراسل البلازميد إلى البرية من نوع البويضات المخصبة. ولكن إذا رانه المخصبة البيض من خط السائق GAL4 ثم حقن واحد أو عدة البلازميدات مراسل UAS يكفي. على العكس من ذلك، إذا microinjecting إلى خط مراسل UAS، إلا أن سائق البلازميد GAL4 يحتاج ليتم حقنه. وأخيرا، في حين يمكن الفينول الأحمر يساعد كثيرا في تصور الحقن، وإنما هو أيضا مركب الفلورسنت نفسها. لذلك، يمكن أن الفينول الأحمر طمس ضباط الإتصال تصور إذا تم التخطيط التصوير قبل 24 ساعة آخر الإخصاب (HPF) كما لا يجوز تخفيفه بما فيه الكفاية قبل هذا الوقت.
5. ومن المقرر المساء قبل الحقن، وإنشاء عدة أزواج (عادة 5-10) من الذكور والإناث الزرد لتربية. استخدام الدبابات تربية مع إدراج تحتوي على قاع الشبكية ومقسم القابلة للإزالة لفصل الاناث والذكور.
   ملاحظة: الذكور والإناث الزرد عموما يمكن تمييزها عن طريق شكل الجسم. الذكور تميل إلى أن تكون نحيلة بينما تميل الإناث لعرض البطن جاحظ من الناحية البطنية. الذكور تميل بالإضافة إلى أن يكون لها عمود مصفر الحمراءأورينج في منطقة البطن بطني بهم.
6. مباشرة قبل حقن الحمض النووي، وإزالة فواصل للسماح للذكور والإناث للتزاوج. ما يقرب من 15 إلى 30 دقيقة بعد إزالة المفرق، تحقق من وجود البيض في قاع الخزان. نقل الأسماك البالغة باستخدام صيد الأسماك في الشباك لأحواض التفريخ الجديد.
7. صب الماء، التي تحتوي على البيض المخصب وضعت حديثا، من أحواض التفريخ إلى غربال (على سبيل المثال، وهو البلاستيكية الشاي مصفاة). غسل البيض في غربال باستخدام زجاجة رذاذ يحتوي على حل Danieau ل. عكس غربال على طبق بتري واستخدام زجاجة رذاذ مع حل Danieau لاستعادة كل البيض (عادة 50 إلى 200 بيضة في تربية زوج من الأسماك البالغة).
8. باستخدام ماصة microloader، والعودة ملء الشعرية حقن سحبت مع الحمض النووي حقن المزيج. جبل الشعرية الحقن في حامل micromanipulator وتقليم الطرف، تحت المراقبة البصرية لمجهر تشريحي، وذلك باستخدام ملقط لإنشاء micropipette التي يمكن المؤسسة العامةnetrate المشيماء والسيتوبلازم الخلية في حين أن تكون قادرة على تقديم حجم مناسب من الحمض النووي.
   ملاحظة: إلى أي مدى يتم قطع غيض من الشعرية حقن ينبغي أن تحدد تجريبيا ويمكن أن يكون أفضل الحكم عند حقن البيض.
9. لتحديد حجم الحمض النووي للحقن، وتفريغ قطرة من محلول الحقن في الزيوت المعدنية. قياس نصف قطر (ص) من الهبوط باستخدام ميكرومتر المعايرة وحساب حجمه (4/3 π ص ^3). تعدل حجم عن طريق ضبط ضغط الحقن و / أو مدة كل نبضة الحقن.
10. باستخدام ماصة بلاستيكية، ونقل كل البيض جمعها (عادة 50-200، من 2.7 أعلاه) في خنادق غرفة حقن مكروي. تحت المراقبة البصرية لمجهر تشريحي، استخدام ملقط لتوجيه البيض بحيث السيتوبلازم الخلية (شفافة) وصفار (كثيفة وغير شفاف) ويمكن تحديد بسهولة.
11. تحت المراقبة البصرية لجهاز ستيريوالمجهر، حقن الحمض النووي في سيتوبلازم الخلية البويضة المخصبة، مع الحرص على التأكد من أن حجم حقن (1-2 NL) يتوافق مع ما يقرب من 10٪ من حجم الخلية.
    ملاحظة: الفينول الأحمر في المساعدات محلول الحمض النووي في تصور حجم حقن.
12. بعد الحقن، وتخفيف البيض من خنادق القالب حقن عن طريق تنظيف لهم زجاجة رذاذ يحتوي على حل Danieau ل. وفي وقت لاحق نقل البيض في طبق بتري جديدة باستخدام ماصة نقل البلاستيكية والحفاظ في 28.5 ^درجة مئوية الحاضنة.
13. الحفاظ على البيض حقن الامم المتحدة والضوابط لتحديد ما إذا كان حقن تسهم في ارتفاع معدلات الوفيات، إما نتيجة للأضرار مادية لحقت به خلال اختراق micropipette أو مزيج الحمض النووي.
    يمكن أن تكون معدلات وفيات عالية عقب الحقن بسبب العديد من العوامل، بما في ذلك الاعتقال أو حقن كميات عالية بشكل مفرط الحمض النووي و / أو البلازميدات مع contamina ملاحظة:اليلة. لمنع التسمم من محضرات الحمض النووي جودة منخفضة، ومجموعات تجارية (على أساس مصفوفة السيليكا المستندة ملزمة) يمكن استخدامها.
14. على فترات منتظمة بعد الحقن، واستخدام مجهر تشريحي للكشف عن بويضة غير مخصبة والأجنة الميتة أو التالفة والتخلص منها.
    ملاحظة: ترى البيض التي تبدو وكأنها في مرحلة خلية واحدة عدة ساعات بعد الإخصاب، وغير مخصبة. تحديد الأجنة المشوهة عن عيوب تشريحية الجسيمة مثل يتورط في محاور الجسم الأمامي الخلفي. المواد غير متبلور داخل المشيمه تشير إلى أن الجنين لم ينفذ من خلال مراحل النمو ومات. للتأكد مما إذا الأجنة التي تم microinjected الخضوع لالاعتيادي للتنمية استشارة الأطالس التشريحية ^37.
15. نقل الأجنة باستخدام ماصة نقل البلاستيك إلى حل Danieau التي تحتوي على 1X 1-فينيل 2-ثيوريا (1xPTU) ما بين 10 و 24 HPF لمنع تشكيل الصباغ. الحفاظ على الأجنة في حل تابع Danieau لaining PTU لمدة التجربة.
    ملاحظة: بالإضافة إلى melanophores، يمكن iridophores على سطح الجلد يكون إشكاليا للتصوير. في حين PTU لا تمنع تشكيل iridophore، خطوط متحولة مع تناقص أعداد iridophores مثل روي أربيسن (روي) موجودة، ويمكن استخدامها ^38.
16. بعد فتحة الأجنة (عادة في اليوم الثاني أو الثالث بعد الإخصاب، 2 أو 3 DPF)، تجاهل chorions وتبادل الحل Danieau التي تحتوي على PTU.
    ملاحظة: هذه الخطوات مهمة لضمان جودة متوسطة الجنين وسلامة الأجنة السليمة.

3. إنشاء خطوط المعدلة وراثيا مستقرة

ملاحظة: مستقرة خطوط المعدلة وراثيا يمكن أن تتولد بكفاءة استخدام نظام ينقول Tol2. وناقلات ينقول Tol2 تحتوي على التحوير من الفائدة شارك حقن جنبا إلى جنب مع مرنا ترميز الانزيم ترانسبوزاز إلى إخصابالبيض د في مرحلة خلية واحدة. البروتين ترانسبوزاز المستمدة من مرنا حقن يحفز استئصال الكاسيت التحوير من ناقلات ينقول واندماجها في جينوم ^39.

1. استنساخ التحوير مراسل كاسيت (على سبيل المثال، UAS: mitoCFP) بين Tol2 مقلوب تكرار محطة في واحدة من ناقلات Tol2 المستخدمة حاليا في المجتمع الزرد كما هو موضح ^40.
   ملاحظة: ناقلات Tol2 تحتوي على شريط كاسيت للاختيار فيها عناصر المروج بالسيارة التعبير FP في أجهزة الجسم لا علاقة لها مجال الاهتمام (على سبيل المثال، القلب ⁴¹ أو عدسة ⁴²⁾ مفيدة لفحص خطوط المعدلة وراثيا مراسل UAS في غياب GAL4 transactivation.
2. استخدام عدة التجارية (على أساس مصفوفة السيليكا المستندة ملزمة)، وتنقية DNA البلازميد لاستخدامها في الحقن. تأكد من أن البلازميد هو من نوعية عالية لمنع التسمم.
3. نسخ Tol2 مرنا ترميز ترانسبوزاز باستخدامناقلات النسخ المناسبة مثل PCS-TP ^43. لفترة وجيزة، خطي PCS-TP واستخدام مجموعة تجارية لتوليد توج مرنا واتبع بروتوكول الشركة المصنعة. الحرص على تجنب تلوث مع RNases (على سبيل المثال، استخدام ريبونوكلياز خالية من نصائح ماصة وأنابيب). قسامة الحمض النووي الريبي، في تركيز 100 نانوغرام / ميكرولتر، لاستخدام واحد ومخزن في -80 ^{درجة مئوية.}
4. في صباح يوم من الحقن، وذوبان الجليد قسامة من مرنا ترانسبوزاز على الجليد. مزيج من ناقلات ينقول الحمض النووي (2 ميكرولتر من 100 نانوغرام / ميكرولتر) وترانسبوزاز مرنا (2 ميكرولتر من 100 نانوغرام / ميكرولتر) في نسبة 1: 1، وإضافة 6 ميكرولتر من ريبونوكلياز خالية من المياه لتبرزي حجم الكلي ل10μl.
   ملاحظة: هناك تركيز من 20 نانوغرام / ميكرولتر يوصى لكل لكن ينبغي تحديد تركيز الأمثل تجريبيا. استخدام مياه خالية من ريبونوكلياز للتخفيف. استخدام قفازات عند التعامل مع مزيج حقن الحمض النووي RNA وابقائه على الجليد لكامل الفترة من الحقن لمنع تدهور مالحمض النووي الريبي.
5. باستخدام الإرشادات التفصيلية في القسم 2 أعلاه، وضخ مزيج حقن الحمض النووي RNA إلى البويضات المخصبة في مرحلة خلية واحدة. تحت المراقبة البصرية لمجهر تشريحي استهداف السيتوبلازم الخلية في مرحلة خلية واحدة لأعلى معدلات الكفاءة transgenesis. الحفاظ على الأجنة المحقونة في 28.5 ^درجة مئوية حتى على استعداد للكشف عن التعبير التحوير.
   ملاحظة: PCR يمكن القيام به للتحقق من كفاءة ترانسبوزاز Tol2 كما هو موضح سابقا ^44.
6. الأجنة الشاشة في طبق بتري لtransgenesis باستخدام oculars المجهر مضان تشريح.
   ملاحظة: استخدام مجموعات مرشح المناسبة للمجهر لتصور FP تعبير عن كاسيت اختيار (أي مضان في القلب أو العدسة) في 2 أو 3 DPF. تحديد الأجنة وراثيا المحتملة التي كتبها التعبير (في القلب أو العدسة) ورفع هذه الأجنة إلى مرحلة البلوغ (F ₀ جيل) باستخدام معيارالبروتوكولات ^45. بدلا من ذلك، وتحديد الأجنة وراثيا محتملة من قبل PCR كما هو موضح في ^46.
7. مرة واحدة مراسل F UAS ₀ الأسماك 2،5-3 أشهر من العمر، عبر لهم (انظر 2.5 لمزيد من التفاصيل) إلى غير المعدلة وراثيا من نوع البرية الأسماك للحصول على البيض لإنشاء جيل F _1. بدلا من ذلك، عبر مراسل UAS F ₀ الأسماك إلى خط السائق GAL4 لإنشاء جيل F _1. في الحالة الأخيرة، والتحوير يحركها UAS يمكن رصدها مباشرة في الأجنة التي تم الحصول عليها من الصليب.
8. استخدام مضان تشريح المجهر للكشف F ₁ الأجنة للتعبير عن التحوير أو كاسيت اختيار.
   ملاحظة: عندما يتم تأكيد التعبير ثم التحوير يمكن القول أن سلالة الجرثومية إرسالها. Transgenesis هو غير مندلية في مرحلة F _0. قد تختلف عدد الأجنة معربا عن التحوير من عدد صغير للغالبية العظمى في clutche الفرديةالصورة. التكامل ينقول في مختلف F ₀ الأسماك قد تختلف إلى حد كبير، مما أدى إلى أنماط التعبير المختلفة. وبالتالي الحفاظ على F ₁ الأسماك من مختلف F ₀ مؤسسي كخطوط فرعية منفصلة. التكامل ينقول في F ₁ الأسماك مستقرة ومرت على الأجيال اللاحقة بطريقة مندلية.
9. الحفاظ على كل F ₀ الأسماك في خزانات منفصلة لإعادة تحديد حاملات التحوير.

4. إعداد الأجنة للتصوير على مجهر تستقيم

ملاحظة: الإجراءات الموضحة هنا وقد تم تحسين للتصوير على المجاهر تستقيم مع أهداف مسافة المياه غمس مخروط العمل الطويلة.

1. استخدام مضان تشريح المجهر لفحص الأجنة للتعبير عن التحوير.
   ملاحظة: سوف التعبير مراسل التحوير UAS تعتمد على خط السائق GAL4 المحددة المستخدمة. حدد الأجنة لتجارب التصوير على أساس عملي المطلوبنمط ression.
2. نقل الأجنة المحدد باستخدام ماصة بلاستيكية لطبق بتري منفصلة تحتوي عازلة Danieau مع 1X PTU و1X تريكين.
   ملاحظة: عند وضع العلامات متناثر (سوى عدد قليل من الخلايا في نظام الجهاز) جبل الأجنة في الاغاروز (انظر 4،3-4،7 أدناه)، وشاشة للتعبير عن التحوير باستخدام المجهر واسعة المجال مع أهداف التكبير عالية (انظر 5.1 أدناه). تريكين يخدر الأسماك وينبغي أن تكون فعالة في غضون ثوان. إذا لم يتم يجمد الأسماك فمن المرجح أن تريكين قد تدهورت. وتشمل الأسباب المحتملة لهذا التدهور سوء التخزين من تريكين، وهي حساسة للضوء ^47.
3. إعداد الاغاروز لتضمين الأسماك عن طريق إذابة مسحوق الاغاروز ذوبان منخفضة في المخزن Danieau لتركيز النهائي من 0.7٪. قسامة (1 مل)، ونضع في حرارة كتلة عند 40 درجة مئوية لتصبح جاهزة للاستخدام.
   ملاحظة: ويركز العاليأيونات الاغاروز (حتى 1.5٪) ويمكن أن تستخدم أيضا لتضمين الأسماك.
4. إضافة 50 ميكرولتر من الأسهم 20x ومن تريكين و 20 ميكرولتر من محلول 50X الأسهم من PTU إلى قسامة 1 مل من الاسعار المنخفضة ذوبان الاغاروز وتخلط جيدا من خلال الاستفادة من الجانب من الأنبوب. إعادة أنبوب للحرارة كتلة. باستخدام ماصة نقل البلاستيكية، ماصة بلطف عدد قليل من (1-10) الأجنة تخدير في الاغاروز، ونقل السائل أقل قدر ممكن لتجنب تمييع الاغاروز.
5. باستخدام ماصة نقل البلاستيك جميع الأجنة مع كمية صغيرة من الاغاروز إلى الزجاج طبق بتري السفلي.
6. العمل بسرعة نسبيا، واستخدام الملقط لوضع الأجنة في الاتجاه المطلوب، اعتمادا على هيكل للتصوير.
   ملاحظة: الأجنة المشرق إلى جانبهم إذا كان ينبغي تصوير شبكية العين أو روهون اللحية (RB) الخلايا العصبية الحسية.
7. السماح للالاغاروز ليصلب لمدة 15 دقيقة على الأقل. إضافة العازلة Danieau التي تحتوي على 1xPTU و1xTricaine لتغطية الأجنة جزءا لا يتجزأ من agaroحد ذاتها. ضع صحن يحتوي الأجنة agarose جزءا لا يتجزأ في حاضنة عند 28.5 ^درجة مئوية حتى جاهزة للصورة.

5. التصوير الخلوية والتحت خلوية الهياكل باستخدام اسعة حقل أو متحد البؤر المجهري

ملاحظة: عريض الحقل المجهري ونقاط المسح المجهري متحد البؤر هي الأكثر استخداما على نطاق واسع طرائق صورة الأجنة الزرد fluorescently المسمى ويلخص الجدول 1 المزايا الرئيسية وعيوب كلا النظامين. لكل أشكال المجهر، هي التي شنت الأجنة في الاغاروز كما هو موضح في 4 أعلاه، وحافظت على 28.5 ^درجة مئوية في جميع أنحاء تجربة التصوير باستخدام غرفة التدفئة على مسرح المجهر. الأهم من ذلك، يسمح الطبق مع الأجنة agarose جزءا لا يتجزأ لكي تتوازن إلى 28.5 ^درجة مئوية، قبل أن يبدأ التصوير كما تسبب التقلبات في درجات الحرارة الانجراف في Z-البعد. عند إجراء تجارب التصوير على المدى الطويل (أكثر من سيفيراساعات ل)، ووضع غطاء زجاجي على طبق بتري للحد من تبخر المخزن المؤقت.

	واسع المجال	نقطة مسح متحد البؤر
كلفة	رخيص نسبيا	غالية (تقريبا. 5X أكثر)
الصورة تبيض	منخفض	عالي. تتعرض العينة للضوء ليزر فوق وتحت البؤري.
صور سمية	منخفض	عالية (انظر الصورة تبيض أعلاه)
سرعة اكتساب	بسرعة	بطيء
قرار في س ص	القانون آبه	(يمكن تحسين القانون آبي من خلال التطبيق 40٪ باستخدام الثقب صغير جدا، و. ومع ذلك، فيمعظم إعدادات هذا له التطبيق العملي قليلا)
باجتزاء البصري	فقير	نعم (يمكن تعديلها حسب حجم الثقب)
اختراق الأنسجة	تقتصر على هياكل سطحية (على سبيل المثال، روهون اللحية الخلايا أو الألياف العضلية)	تقتصر على <100 مم من سطح الجنين

الجدول 1. مقارنة العامة للواسعة المجال ونقاط المسح المجهري متحد البؤر

1. المجهر واسعة المجال
   وتقدم إليك بعض الإرشادات لتصوير الأجنة الزرد باستخدام تستقيم المجهر واسعة المجال مع أهداف مسافة المياه غمس مخروط العمل الطويلة: ملاحظة. وقد تم تجهيز المجهر مع كاميرا CCD المبردة، وشنت مجموعات مرشح لتصور fluorophores مختلفة على عجلة تصفية الآلي لاقتناء السريع للقنوات متعددة.يتم التحكم الحصول على الصور من قبل μManager، حزمة البرمجيات مفتوحة المصدر المجهري ^48. ويرد مثال محدد لتصوير الميتوكوندريا في الخلايا العصبية الحسية الميزانيه العاديه. وصفت الخلايا الميزانيه العاديه وراثيا باستخدام غشاء المستهدفة YFP والميتوكوندريا هم CFP الموسومة (انظر 1.1 أعلاه).
   1. جبل الأجنة إلى جانبهم في انخفاض ذوبان الاغاروز كما هو موضح في 4 أعلاه.
   2. السماح الطبق مع السمك شنت لكي تتوازن إلى 28.5 ^درجة مئوية في غرفة التدفئة على مسرح المجهر قبل بدء التصوير.
   3. استخدام الهدف المياه غمس مخروط منخفضة التكبير وننظر من خلال oculars المجهر لاختيار منطقة على سطح الجنين إلى صورة.
      ملاحظة: إذا كان مستقرا المعدلة وراثيا خط مراسل MitoFish، تيراغرام (UAS-E1B: mYFP، mitoCFP) ^mde6، ويستخدم جنبا إلى جنب مع خط سائق مثل HUC: GAL4 ثم وصفت الخلايا العصبية أكثر RB، وتبدو وكأنها زارة التربية والعلم كثيفةح-العمل العرش محوار على سطح الجنين. إذا تم استخدام Microinjection من الحمض النووي يبني لتحقيق وضع العلامات متفرق (على سبيل المثال، الحسي: GAL4-VP16 مع UAS: mitoCFP وUAS: MA-YFP) والأجنة الشاشة لتحديد الخلايا المسمى المزدوج.
   4. فتح البرنامج المجهر (μManager 1.4) وانقر على "الإضاءة" "تحت عنوان" ضبط التهيئة "لتحديد مجموعات مرشح الصحيحة للالطول الموجي للاهتمام (YFP أو CFP للمثال الحالي) وتحت" إعدادات الكاميرا "دخول وقت التعرض مطلوب للحصول على صورة مناسبة.
      ملاحظة: "إعدادات الإضاءة" هي من قبل المستخدم عند تثبيت البرنامج قبل مجموعة ويتم تحميل عند فتح μManager. إذا لم يتم تكوين برنامج للتحكم في عجلة تصفية يدويا تحريك عجلة تصفية في البرج إلى الموقف المناسب.
   5. التغيير إلى الهدف المياه غمس مخروط المسافة العمل منذ فترة طويلة تتراوح بين 40-100x التكبير. اختارالهدف الذي يحتوي على أعلى الفتحة العددية (NA) ويتم تصحيح لونيا (امزيغ).
   6. انقر على "لايف" لاختيار مجال الرؤية: في حالة الخلايا العصبية RB، صورة النقل الميتوكوندريا في محور عصبي الجذعية، المنبثقة عن جسم الخلية، أو في الشجرة الطرفية.
      ملاحظة: العرش الطرفية للخلايا العصبية الميزانيه العاديه في حظيرة الزعنفة الذيلية للجنين توفر فرصة مثالية للصورة حقل كبير من الرأي القائل بأن شقة، وبالتالي يمكن الحصول عليها في إطار واحد مع المجهر واسعة المجال. ولذلك فمن المهم لتحميل الجنين كما رفضا قاطعا ممكن على جانبها، بحيث أضعاف الزعنفة الذيلية موازية للأسفل طبق بتري.
   7. بعد اختيار مجال الرؤية، انقر على زر "اختيار مستطيلة" في القائمة يماغيج، وتحديد المنطقة ذات الاهتمام (ROI) وانقر على "العائد على الاستثمار" في إطار μManager. بعد تحديد العائد على الاستثمار للتصوير، انقر فوق "إيقاف" و "حفظ" لتاكه صورة للقناة YFP لتسجيل مورفولوجيا المحلي للمحوار / ثانية.
   8. إلى صورة النقل الميتوكوندريا انقر على "متعدد الأبعاد ACQ." زر. مراقبة نافذة إضافية ( "متعدد الأبعاد اقتناء") وحدد عدد مرات نقاط وكذلك الفترة الزمنية الفاصلة بين الوقت نقطة في هذا الإطار. استخدام معدلات الإطار من 0،3-1 هرتز. تنفيذ تسجيلات لمدة 10 دقيقة على الأقل لجمع أكبر عدد ممكن البيانات نقاط ممكن.
   9. في إطار "متعدد الأبعاد اقتناء"، انقر على "قنوات"، إضافة وتحديد الطول الموجي للتصوير (CFP للالميتوكوندريا في هذا المثال) ووقت التعرض. الحفاظ مرات التعرض إلى أقل من 400 ميللي ثانية لتصوير النقل الميتوكوندريا.
   10. انقر على خيار "حفظ الصور" في إطار "المتعددة الأبعاد اقتناء"، لحفظ الملفات تلقائيا في مجلد معين الواردة في "دليل الجذر". انقر على "اكتساب" في الزاوية اليمنى العليا لبدء تيمتصوير الفاصل بين ه.
   11. إعادة ضبط يدويا التركيز أثناء تسجيل مرور الزمن لتعويض أي انحراف في البعد ض.
       ملاحظة: استخدام هذه المعلمات النقل الميتوكوندريا في الخلايا العصبية RB يمكن تصوير لطالما 4 ساعة.
2. المجهر متحد البؤر
   وتقدم هنا المبادئ التوجيهية للتصوير مع أوليمبوس FV1000 المجهر متحد البؤر تستقيم والأهداف المياه غمس مخروط مسافة طويلة في العمل: ملاحظة. وقد تم تجهيز المجهر مع خطوط متعددة الليزر والعديد من أجهزة الكشف عن (هذه الفرق التقليدية وأكثر حساسية للكشف عن زرنيخيد فوسفيد) التي تسمح للتصوير الأقنية. يشار محددة لبرنامج أوليمبوس Fluoview. ومع ذلك، يجب أن تكون المعلمات التصوير وصفها هنا للتحويل بسهولة إلى أنظمة متحد البؤر الأخرى.
   1. جبل الأجنة في انخفاض ذوبان الاغاروز في التوجه المناسب للجهاز / هيكل إلى أن تصوير، كما هو موضح في 4 أعلاه.
   2. السماح الطبق مع السمك شنت لكي تتوازن إلى 28.5 ^درجة مئوية في غرفة التدفئة على مسرح المجهر قبل بدء التصوير.
   3. استخدام مسافة الأهداف المياه غمس مخروط العمل الطويلة لالمجاهر مبائر في تكوين تستقيم. اختيار الأهداف مع أعلى مستوى ممكن NA لتحقيق أقصى قدر من إشارات الفلورسنت التي يمكن جمعها والحصول على أفضل حل السلطة. عندما جمع الصور من قنوات متعددة اختيار الأهداف تصحيح لونيا (امزيغ).
   4. فتح البرنامج المجهر وانقر على "ترانس مصباح" أو "برنامج التحصين الموسع مصباح" لاستخدام إما المرسلة أو مضان ضوء على التوالي لتحديد المنطقة ذات الاهتمام عبر oculars المجهر.
   5. استخدام البرنامج لإعداد المعلمات المسح التالية للحصول على مداخن صورة:
      1. في إطار "إعداد اقتناء" تحقق الهدف الذي تم اختياره لتصوير يطابق الهدف الذي يظهر على انخفاض مؤشر داو جونزالقائمة ن الأهداف المتاحة.
         ملاحظة: هذا هو التأكد من أن أية معلمات محسوبة مسبقا لهدف معين (على سبيل المثال، الأفقي وقرار محوري، حجم الفتحة متحد البؤر الخ) يكون صحيحا، ويمكن استخدامها بشكل موثوق.
      2. حدد خط ليزر / ثانية، والإثارة ومزدوج اللون الانبعاثات مرشحات مناسبة لصورة ببروتين معين (ق). القيام بذلك عن طريق النقر على زر "قائمة صبغ" في إطار "صورة تحكم اقتناء" واختيار fluorophore المناسب / ثانية. بدلا من ذلك، انقر على زر "مسار الضوء والأصباغ" لتعيين هذه المعلمات يدويا.
         ملاحظة: عندما يتم اختيار الخيار زر "قائمة صبغ"، البرنامج تلقائيا بتحديد خطوط الليزر، والإثارة وانبعاث مرشحات مزدوج اللون المناسبة وضبط حجم الفتحة مبائر بشكل مناسب.
      3. في إطار "اكتساب إعداد"، وضبط "تكبير" عامل و "الحجم آسيا والمحيط الهادئنسبة إلخ "(أي، 512x512، 1024x1024 الخ) من الصورة الممسوحة ضوئيا إلى الحصول على حجم بكسل من الضروري حل أفضل الهياكل التي يجري تصويرها. اضبط حجم بكسل أن يكون حوالي نصف القرار النظري لهذا الهدف، وبالتالي المعايير التالية أخذ العينات نيكويست . لتحديد حجم بكسل من الصورة نقرة حصلت على الزر الذي يحمل رمز للعلم ( "أنا") في إطار "صورة تحكم اقتناء".
      4. ضبط سرعة المسح الضوئي لأسرع ممكن (2 ميكرو ثانية / بكسل) في إطار "إعداد اقتناء".
      5. في "صورة تحكم اكتساب" نافذة انقر على كالمان خط المتوسط ​​للحد من عامل noise.A من 2-3 يكفي عادة.
      6. اختر وضع المسح المتتابع عند تصوير fluorophores مع تداخل الأطياف. للقيام بذلك، انقر على "متسلسل" و "لاين" في إطار "صورة تحكم اقتناء".
      7. ضبط انتاج الطاقة من خط ليزر / الصورة ذات الصلة (عادةأقل من 5٪). تحتاج إلى أن تحدد تجريبيا قيم معينة.
      8. انقر على زر "XY كرر" أو "X2 التركيز" أو "التركيز X4" لمسح مستمر المنطقة المحددة أثناء ضبط إعدادات كاشف لكل قناة. ضبط "HV"، "الربح" و "الأوفست" لكل قناة للحصول على الصور التي لديها أعلى النطاق الديناميكي القيم الرمادية.
         ملاحظة: القيم المحددة لهذه الإعدادات تحتاج إلى أن تحدد تجريبيا. "HV" يضبط الجهد على كاشف لتغيير حساسيتها، "الأوفست" ضبط إشارة خرج الكاشف و "كسب" يضاعف إشارة خرج للكشف من قبل عاملا ثابتا.
      9. اضغط Ctrl + H لتصور الصور المكتسبة من خلال نظرة متابعة الجدول (حلو) أن يحدد تحت المشبعة (تظهر باللون الأزرق) ومشبعة أكثر بكسل (تظهر باللون الأحمر)، وكلاهما يجب عموما تجنبها. إعادة تقييم انتاج الطاقة من الليزر ذات الصلة لينه / ق وإعدادات كاشف.
         ملاحظة: استخدام القوة ليزر عالية ومستويات عالية من "HV" للكشف سيؤدي إلى المزيد من الإشارات. ولكن سوف قوة الليزر العالي يؤدي إلى زيادة التبييض والصور سمية. وزيادة "HV" يؤدي إلى زيادة الضوضاء. ولذلك، يحتاج حلا وسطا التي يمكن العثور عليها عند وضع قوة الليزر و"HV" للحصول على الصور مع مستويات مقبولة من الضوضاء في حين منع الصور الضرر (انظر أيضا الجدول 1).
      10. جمع الصور من حجم محدد من خلال التركيز على الحدود العليا والدنيا للمنطقة من الفائدة. في "إعداد اقتناء" نافذة انقر على أزرار "وضع حد للمجموعة" و "البداية مجموعة" مجموعة من النافذة ض المكدس في الحدود العليا والدنيا من حجم للتصوير. حدد حجم الخطوة التي هي نصف للقرار ض لهدف معين (على سبيل المثال، إذا ض القرار هو 2 ميكرون اختر 1 ميكرون). لتحديد الدقة ض من الاهدافه انقر على زر مع رمز للعلم ( "أنا") في إطار "صورة تحكم اقتناء".
      11. إعداد سلسلة زمنية لجمع مداخن ض في التواتر الزمني الذي يتناسب مع ديناميات هيكل التحت خلوية يجري تصويره. في "TimeScan" نافذة فرعية إدخال التردد الذي ينبغي الحصول عليها ض مداخن ( "الفاصل الزمني" ') وعدد المرات التي ينبغي الحصول عليها من صور ( "ارقام").
      12. انقر على "عمق" وأزرار "تايم" في إطار "صورة تحكم اقتناء" للتأكد من أن ض المكدس والسلاسل الزمنية سيتم الحصول عليها. وأخيرا انقر على زر "XYZT" لبدء الحصول على الصور مرور الزمن.
      13. بعد الانتهاء من الحصول على الصور، ومراقبة "سلسلة تم" على واجهة البرنامج. اضغط عليها وحفظ الصور في شكل "بنك عمان الدولي" لتسجيل الصور والبيانات الوصفية المرتبطة بها.
          ملاحظة: الصور التي تم الحصول عليها علىالمجهر واسعة المجال والمجهر متحد البؤر يمكن تصور وتحليلها باستخدام برامج مثل فيجي، ضمن الملكية العامة، برنامج معالجة الصور مجانا.

النتائج

هنا تتم مقارنة مباشرة استخدام واسعة المجال والفحص المجهري متحد البؤر الميتوكوندريا صورة وجسيم مركزي في العيش الأجنة الزرد ويتناقض. اعتمادا على مكان وجود الخلايا التي ديناميات عضية وستبحث وتردد الملازمة للأحداث التحت خلوية محددة، عادة إما واسعة حقل أو متحد البؤر المجهري هو الخيار الأفضل. نحن تصوير العضيات في الخلايا العصبية الميزانيه العاديه تقع على سطح الجنين وفي خلايا الشبكية تقع أعمق. موقع سطحية من الخلايا العصبية RB جنبا إلى جنب مع هندسة الأبعاد...

المناقشة

هنا، علينا أن نظهر براعة النظام التعبير GAL4-UAS إلى الميتوكوندريا العلامة fluorescently، جسيم مركزي والأغشية الخلوية من خلية أنواع محددة في الجسم الحي في الأجنة الزرد. العديد من البروتينات الانصهار فلوري أن تسمية العضيات الأخرى أو الهياكل التحت خلوية يمكن العثور عليها في الأدبيات المنشورة ويمكن الحصول عليها من معمل منها، مصادر تجارية أو مستودعات البلازميد غير تجارية (على سبيل المثال، Addgene). لتصميم انصهار بروتين فلوري جديد، تحتاج إلى النظر فيها، بما في ذلك الت...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
Agarose (2-hydroxyethylagarose)	Sigma-Aldrich	A4018-10G	درجة حرارة منخفضة التبلور من النوع السابع
سخان بلوك	Eppendorf		Thermomixer مدمج
Ca (NO3< / sub>) 2< / sub> هيدرات نترات الكالسيوم ، 99.996٪ & nbsp ؛	Aldrich	202967-50g	لتحضير كاميرا CCD 30x Danieau
	Qimaging	Retiga Exi Fast 1394
Dumont # 5 Fulps	Dumont - أدوات العلوم الدقيقة	11252-50	# 5 ملقط
مجهر المسح بالليزر متحد البؤر	Olympus	FV1000 Fluoview
Culture سخان أطباق	Warner Instrument	Corporation DH-35	حلقة تسخين
ملح إيثيل 3-أمينوبنزوات ميثان سولفات	فارما كيو	تريكايين فارما Q-25g	تريكايين (مخدر)
مجهر تشريح مضان	Leica	M205 FA
GeneClean kit	MP Biomedicals	111001200
أطباق ثقافة القاع الزجاجي	MatTek Corporation	P35G-0-14-C	طبق بتري 35 مم ، ميكروويل 14 مم ، غطاء زجاجي رقم 0
الإبر الزجاجية	World Precision Instruments Inc.	TW100F-4	للحقن المجهري
HEPES	Sigma	H3375-250g	لتحضير 30x شحم Danieau
عالي	الفراغ Dow Corning & nbsp ؛	DCC000001242 150 جرام	شحم ثاني أكسيد السيليكون
KCl 99٪	سيجما-ألدريتش	S7643-5 كجم	لتحضير 30x Danieau's
MgSO4< / sub>.7H2O     كبريتات المغنيسيوم سباعي هيدرات 98 +٪ كاشف ACS	سيجما ألدريتش	230291-500 جم	لتحضير 30x حاقن
دانيو الدقيق	Eppendorf		FemtoJet
Microloader	Eppendorf	930001007	0.5-20 ul
Micromanipulator	Maerzhaeuser Wetzlar	MM33 Rechts / 00-42-101-0000 / M3301R
حامل ماصة دقيقة	Intracel	P / N 50-00XX-130-1
mMESSAGE mMACHINE SP6 طقم النسخ	Ambion	AM1340	لنسخ PCS-Transposase
كلوريد الصوديوم BioXtra >99.5٪	سيجما ألدريتش	P9541-1kg	لتحضير مقياس
ضوئي			لقياس تركيز الحمض النووي الريبي
مجتذب إبرة	أداة Sutter	P-1000	ملتهب / بني
NIR Apo 40x / 0.80W   ؛	نيكون		الماء غمس المخروط الهدف
N-Phenylthiourea الصف الأول ، حوالي 98٪	Sigma	P7629-10G	PTU (يمنع التصبغ)
أطباق Petri	Sarstedt AG & nbsp ؛	821472	92 × 16 مم
قوالب بلاستيكية	أدوات العلوم التكيفية	TU-1	للحقن المجهري
غطاء زجاجي مع ثقب			يجب أن يكون الثقب الموجود في غطاء زجاج شبكي أكبر بمقدار 3 مم من قطر الهدف المخروطي بالغمس بالماء
مصفاة الشاي (البلاستيك)			لجمع بيض سمك الزرد
وحدة التحكم في درجة الحرارة	شركة Warner Instrument Corporation	TC-344B	درجة الحرارة الأوتوماتيكية المزدوجة ماصات نقل وحدة
	التحكم Sarstedt AG & nbsp ؛	86.1171	ماصات نقل البلاستيك 3.5 مل
UMPlanFI 100x / 1.00W	Olympus		هدف مخروط غمس الماء
UMPlanFLN 20x / 0.50W   ؛	أوليمبوس		مغمس الماء المخروط
الهدف مجهر واسع	المجال أوليمبوس	BX51WI
PTU (مخزون 50x)			بإذابة 76 مجم PTU في 50 مل من الماء المقطر يقلب بقوة في درجة حرارة الغرفة   ؛ يحفظ في -20 o< / sup>C في 1 مل aliquots استخدم في 1x محلول عمل
Tricaine (20x مخزون)			بإذابة 200 ملغ من Tricaine في 48 مل من الماء المقطر أضف 2 مل 1M Tris base (pH9) ضبط الرقم الهيدروجيني 7 & nbsp ؛ تخزين في -20 o< / sup>C في 1 مل aliquots استخدم في حل عمل
1x Danieau's Solution (30x مخزون)			1،740 mM & nbsp ؛ كلوريد الصوديوم   21 mM           KCl  12 mM           MgSO4.7H2O  18 mM           Ca (NO3)2 150 mM      عازلة HEPES  الماء المقطر حتى 1 لتر & nbsp ؛ Store at 4 oC  استخدم في حل عمل 0.3x