التنميط التعبير الجيني اصابة الميكروبات باستخدام منصة رقمية من الترميز

Wenjie Xu; Norma V. Solis; Scott G. Filler; Aaron P. Mitchell

doi:10.3791/53460

Method Article

التنميط التعبير الجيني اصابة الميكروبات باستخدام منصة رقمية من الترميز

DOI:

10.3791/53460

⸱

January 13th, 2016

Wenjie Xu¹ , Norma V. Solis² , Scott G. Filler² , Aaron P. Mitchell¹

¹Department of Biological Sciences, Carnegie Mellon University, ²Infectious Diseases, Harbor-UCLA Medical Center

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لقد طورنا بروتوكولا سريعا وحساسا وقابلا للتكرار لتنميط التعبير الجيني لمسببات الأمراض أثناء الإصابة.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

بالنسبة لمعظم مسببات الأمراض الثدييات والتعبير الجيني التنميط الدراسات كانت محدودة بسبب الصعوبات التقنية لتحديد بدقة النصوص الممرض الجينات من الأنسجة المصابة. يشكل الممرض RNA جزء صغير جدا من الحمض النووي الريبي مجموع معزولة عن عينات الأنسجة المصابة. كلا ميكروأري والتكنولوجيات RNAseq صعوبات في توليد موثوقة يقرأ عن الجينات الممرض أعرب ضعيفة. سلالات الممرض متحولة مع انخفاض في انتشار فيفو تشكل تحديا أكبر. نحن هنا وصف في الجسم الحي التعبير الجيني بروتوكول التنميط هذا هو سريع جدا وحساسة للغاية وتكرار للغاية. وضعنا هذا البروتوكول خلال تحقيقنا للالفطرية البيض الممرض المبيضات في نموذج الفئران من داء المبيضات نشر hematogenously. استخدام هذا البروتوكول، ونحن قد وثقت الدورات وقت ينظم حيوي C. البيض التعبير الجيني خلال عدوى في الكلى، وميزات غير متوقعة اكتشف منردود التعبير الجيني للفطريات العلاج من تعاطي المخدرات في الجسم الحي.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ديناميات التعبير الجيني يحمل معلومات حيوية عن كيفية استجابة الخلايا للتغيرات البيئية. في حالة وجود ميكروب إصابة، يمكن للبيانات التعبير الجيني تقديم رؤى ذات الصلة سريريا على كيف يتكيف الممرض للبيئة عدوى ويسبب ضررا لالمضيف. في العقدين الماضيين، وقد ولدت دراسات التعبير الجيني على حد سواء في التجارب المختبرية والحية كمية كبيرة من البيانات وضعت أساسا لفهم العدوى البيولوجيا ^1-3. ومع ذلك، والتكنولوجيات التنميط الحالية بما في ذلك ميكروأري وRNAseq، ليست هي الأمثل لالتنميط التعبير الجيني الممرض خلال العدوى. استضافة يشكل RNA وهو جزء الساحقة (عادة> 99٪) من الحمض النووي الريبي مجموع معزولة عن عينات الأنسجة المصابة. يساهم RNA المضيف إلى خلفية عالية على المجهرية، ويهيمن تسلسل يقرأ من RNAseq. عزل الخلايا الممرض من الأنسجة المصابة، من الناحية النظرية، يمكن أن تساعد على إثراء لالممرض RNA، ولكنه يطرح بالإضافةمشاكل سورة: أنه يتطلب كميات كبيرة من الأنسجة المصابة. هذا الإجراء يمكن أن تكون مملة. والأهم من ذلك، فإنه من الصعب للحفاظ على الدولة الأم أو سلامة RNA خلال عملية طويلة. من أجل توليد المزيد من البيانات شاملة ودقيقة عن العوامل المسببة للأمراض التعبير الجيني خلال العدوى الحقيقية، شرعنا في وضع بروتوكول يسمح الكمي موثوقة وفعالة من حيث التكلفة لأنواع RNA أقلية في عدد السكان RNA مختلطة.

NanoString nCounter هو منصة وضعت مؤخرا أن يجعل قياس المضاعفة المباشر في التعبير الجيني باستخدام الرقمية أزواج التحقيق شريط مشفر ^{4، 5.} هذه المنصة لديها مستوى حساسية مماثلة لتلك التي من QRT-PCR ولكن لا تتطلب التضخيم الأنزيمية. التكنولوجيا ليست واسعة الجينوم، لأنها تتيح الكشف عن ما يصل الى 800 جينات مختلفة في كل فحص. لذا، فمن الأهمية بمكان لتحديد الجينات بالمعلومات كما تحقيقات لتحديد ملامح. هنا نستخدم التعبير الجيني التنميط دراسة همهمة الرئيسيةالممرض، المبيضات البيض، أثناء وجود عدوى الغازية على سبيل المثال، لإثبات: 1) التفاصيل الفنية للإجراءات التجريبية (بروتوكول)، 2) الحساسية، واستنساخ والنطاق الديناميكي لهذه الطريقة (نتائج ممثل)، و 3) هام اعتبارات لتصميم وإجراء التجارب على أساس هذا البروتوكول (مناقشة). هذا البروتوكول يمكن تكييفها بسهولة لمختلف مسببات الأمراض وطبقت بنجاح في عدد من نماذج العدوى ^6-9.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد وافق جميع الإجراءات الحيوانية من لجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسي في معهد البحوث الطبية الحيوية لوس انجليس (بروتوكول 011،000) ونفذت وفقا لالمعاهد الوطنية للصحة (NIH) مبادئ توجيهية من أجل المعاملة الأخلاقية للحيوانات. تم قفص الفئران في منشأة AAALAC المعتمدة تقع في حرم هاربور UCLA معهد البحوث والتعليم. طبيب بيطري متفرغ متخصص في الطب الحيوانات المختبرية أشرف رعايتهم. وقدمت الحبس وتربية فقا للمبادئ التوجيهية في خدمة الصحة العامة الأميركية نشر "دليل لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية". تم بذل كل محاولة لعلاج الفئران إنسانية. تم رصد بقاء وصحة الفئران ثلاث مرات يوميا. ومن الواضح أن تم فصل المريضة والفئران السبات العميق من مجموعة والموت الرحيم للحد من المعاناة. الموت الرحيم كانت الفئران التي كتبها جرعة زائدة بنتوباربيتال (210 ملغ / كلغ)، على النحو الموصى به من قبل الفريق المعني Euthanasالجيش العراقي للجمعية الأمريكية للطب البيطري.

1. إعداد الأنسجة، الكواشف والصكوك

استخدام الذكور BALB / ج الفئران الترجيح 20-22 غرام لجميع الدراسات. تطعيم ثلاثة الفئران في المجموعة التجريبية عن طريق الوريد مع 1 × 10 ⁶ الخميرة المرحلة C. الخلايا البيض. تضحية الحيوانات والكلى الحصاد عند نقاط زمنية محددة بعد الإصابة. وضع كل الكلى في أنبوب سقف المسمار، والمفاجئة التجميد في النيتروجين السائل، وتخزينها في -80 درجة مئوية لمدة RNA لاحق استخراج ^6.
ملاحظة: وقد تم إجراء التجارب على الحيوانات خارج كما هو موضح بالتفصيل في زو وزملاؤه ^6.
تحضير الكواشف والصكوك التالية قبل إزالة الكلى من -80 ° C الفريزر:
1. فتح الإجمالية عدة استخراج الحمض النووي الريبي. إضافة 2 المركابتويثانول (1٪ V / V) لالعازلة RLT وتخلط جيدا (إعداد 2 مل لكل عينة).
2. إعداد الفينول: الكلوروفورم: كحول أيزو أميلي 25: 24: 1 (تحتاج 600 ميكرولتر لكل عينة).
3. تسمية M-نوع أنابيب التجانس (M-أنبوب) والبرد على الجليد.
4. التسمية 2 مل المسمار الأنابيب كأب، وإضافة ما يقرب من 300 حبات الزركونيا ميكرولتر إلى كل أنبوب.
5. هي الاختيار الأدوات المتاحة: dissociator الأنسجة، beadbeater، منضدية أجهزة الطرد المركزي مع محولات ل50 مل أنابيب و 96 لوحات جيدة، مضواء.

2. استخراج الحمض النووي الريبي من الأنسجة المصابة

إزالة الأنابيب التي تحتوي على الكلى من -80 ° C الثلاجة ووضعها على الجليد. إضافة 1.2 مل العازلة RLT مع 2-المركابتويثانول لكل الكلى. صب الكلى مع العازلة إلى M-نوع أنابيب التجانس.
التجانس الكلى باستخدام dissociator الأنسجة على محمل مسبقا الإعداد RNA_02.01.
أجهزة الطرد المركزي في 1000 x ج لمدة 1 دقيقة في جهاز للطرد المركزي الطاولة في RT.
نقل 600 ميكرولتر جناسة لأنبوب سقف المسمار تحتوي على حبات الزركونيا. حفظ جناسة المتبقية على الجليد.
إضافة 600 الفينول ميكرولتر: الكلوروفورم: كحول أيزو أميلي 25: 24: 1 لالأنابيب من الخطوة السابقة.
إغلاق الأغطية بإحكام ودوامة على beadbeater لمدة 3 دقائق في غرفة باردة 4 ° C.
أنابيب الطرد المركزي في 15000 x ج لمدة 5 دقائق في غرفة باردة 4 ° C.
نقل بعناية المرحلة المائية إلى 1.5 مل microfuge أنبوب جديد، وتخلط جيدا مع حجم مساو من الايثانول 70٪، ثم تحميل على عمود الدوران (الحمل مرتين).
غسل عمود الدوران مرة واحدة مع 700 ميكرولتر RW عازلة، تليها مرتين مع 500 ميكرولتر العازلة RPE. واحدة الطرد المركزي دقيقة اضافية في أنبوب جمع جافة لإزالة السائل المتبقي في عمود الدوران. تنفيذ كافة الخطوات الطرد المركزي في 8000 ز س.
أزل RNA مع 50 ميكرولتر H ₂ O. قياس تركيز الحمض النووي الريبي في OD ₂₆₀ باستخدام مقياس الطيف الضوئي.

3. التنميط التعبير الجيني باستخدام الرقمية من الترميز

ذوبان الجليد codeset مراسل (الأخضر أنبوب كاب) والقبض على codeset (الرمادي أنبوب الغطاء) على الجليد.
إضافة 130 ميكرولتر العازلة التهجين إلى إعادةحمال codeset، عكس لخلط وتدور باستمرار.
إضافة 20 ميكرولتر من مزيج لكل من أنابيب رد فعل 12.
إضافة 10 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي مجموع الأنسجة (في حجم 5 ميكرولتر) إلى كل أنبوب. مزيج من قبل pipetting.
إضافة 5 ميكرولتر القبض codeset إلى كل أنبوب. مزيج من قبل التقليب أنبوب تليها دوران سريع أسفل.
احتضان ردود الفعل عند 65 درجة مئوية في cycler الحرارية مع غطاء ساخنة O / N (~ 18 ساعة).
إزالة أحد خرطوشة عينة من -20 ° C والسماح لها دافئ لRT.
إزالة اثنين من لوحات الكاشف من 4 درجات مئوية، وأجهزة الطرد المركزي في 670 x ج لمدة 2 دقيقة في جهاز للطرد المركزي الطاولة.
انشاء محطة الإعدادية التالية خطوة بخطوة تعليمات على الشاشة، حدد الخيار حساسية عالية.
إزالة ردود الفعل من cycler الحرارية وتحميل مباشرة على محطة الإعدادية. حدد لتشغيل البرنامج حساسية عالية (3 ساعات).
عندما برنامج محطة الإعدادية كاملة، إزالة خرطوشة وختم الممرات مع شريط واضح. ا ف برقائق الزيوت المعدنية في الجزء السفلي من خرطوشة (لجيل واحد nCounter فقط، في وقت لاحق أجيال لا تتطلب هذه الخطوة)، ثم تحميل خرطوشة على محلل الرقمي.
إعداد محلل الرقمية التالية خطوة بخطوة تعليمات على الشاشة، حدد خيار المسح عالية الدقة.
حدد الخيار (600 الحقول) ارتفاع القرار، قم بتشغيل برنامج المسح الضوئي (~ 4.5 ساعة).
عندما برنامج المسح كاملة، تحميل النتائج (أو اختيار لتلقي النتائج عن طريق البريد الإلكتروني)، واستيراد البيانات الخام إلى برنامج الشركة المصنعة. يقوم البرنامج تلقائيا الاختيار نوعية البيانات ورفع الأعلام إذا كانت نوعية البيانات تقع خارج نطاق العادي. أداء التعديل الفني باستخدام المدمج في وظيفة (اختياري، اتبع التعليمات في البرنامج)، ثم تصدير البيانات كملف اكسل.
تطبيع البيانات باستخدام إحدى الطرق التالية: العدد الكلى من جميع الجينات في codeset. واحد أو عدد قليل من الجينات الرقابة الداخلية. هندسيجينات أعرب غاية (انظر المناقشة).
حساب القيم التعبير يعني لكل الجين (إذا تم إجراء التجربة في مكررات أو يثلث)، ثم حساب نسبة مستويات التعبير بين المجموعات التجريبية المختلفة.
(اختياري) تحليل وتصور نتائج التنميط التي كتبها المدمج في وظائف في البرمجيات nSolver أو برنامج التجميع مثل MultiExperiment عارض ^10.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

واحد يتمثل التحدي الرئيسي للتعبير عن العوامل المسببة للأمراض الجينية التنميط في الجسم الحي هو الحصول على ما يكفي من يقرأ الممرض RNA. ونظرا لانخفاض نسبة النصوص الممرض في الحمض النووي الريبي مجموع، كمية كبيرة من الحمض النووي الريبي مجموع (> 10 ميكروغرام) لديها لاستخدامها في كل رد فعل. منصة لديها ميزة فريدة من نوعها في هذا المنظور: فهو يستخدم كل مسبار القبض والتحقيق تقرير لزيادة الخصوصية، بحيث الكم الهائل من الحمض النووي الريبي المضيف لا يسبب قدرا كبيرا من الضوضاء. كما هو مبين في الشكل 1 (مقتبس من المرجع 6)، وكانت التهم الخام خلفية من عينة الأنسجة غير المصابة (النقاط الحمراء) عن أقل من 10، في حين كانت التهم الخام من عينتين الأنسجة المصابة (النقاط الزرقاء) عن أعلى 10. البيانات التعبير المتولدة باستخدام هذا البروتوكول هي تكرار للغاية. كما هو مبين في الشكل 1 (مقتبس من المرجع 6)، التهم الخام من اثنين مكررات البيولوجية (النقاط الزرقاء، وعينات الكلى بعد العدوى 48 ساعة) كان غو جداد الارتباط، مع قيمة-R مربع يساوي 0.945. يوفر منصة أيضا مجموعة ديناميكية كافية لتشمل مستويات التعبير البيولوجية الطبيعية (الشكل 1، وتراوحت التهم الخام بين 10 و 10 ¹ ^6).

باستخدام مجموعة التحقيق تحديد 248 جينات الاستجابة البيئية، كنا قادرين على تمييز مرحلتين التعبير الممرض الجين (الشكل 2، مقتبس من المرجع 6): تتكون في وقت مبكر الجينات استجابة التعبير الجينات مع مستويات RNA مختلفة إلى حد كبير بين اللقاح و 12 ساعة عينات بعد الإصابة (P <0.05 و> تغير 2 أضعاف في التعبير)، واستجابة التعبير أواخر الجينات تتكون الجينات مع مستويات RNA التي تختلف بشكل كبير بين نقطة زمنية 12 ساعة على 48 ساعة عينات بعد العدوى (P <0.05 و> تغير في التعبير 2 أضعاف). هذه النتائج تشير إلى أن C. وينظم البيض التعبير الجيني ديناميكيا اثناء infectio الغازيةن من مجموعة الثدييات.

figure-results-1
الشكل 1. التهم الخام من أنسجة الكلى المصابة وغير المصابة (مقتبس من المرجع 6). مسبار يهم لمدة المصاب (48 ساعة بعد الإصابة، ونقاط البيانات الزرقاء) واحد (نقاط البيانات الحمراء) غير المصابة يتم عرض عينات الكلى كما مبعثر المؤامرة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-2
الشكل 2. التعبير عن C. البيض الجينات التي تستجيب للبيئة خلال العدوى الغازية (مقتبس من المرجع 6). التغيرات في مستويات التعبير أثناء الغزو الكلى الماوس ل248 C. يتم عرض الجينات البيض في الحرارة ومتنسيق ا ف ب. يتم عرض القيم المتوسطة من يثلث البيولوجية ليصل التنظيم (الصفراء) وأسفل تنظيم (الأزرق) من الجينات في 12 و 24 و 48 ساعة بعد العدوى بالنسبة لتعني مستويات اللقاح (0 ساعة). يمثل تشبع اللون ومدى التغير التعبير، مع التشبع الكامل في 10 أضعاف حتى- أو لأسفل التنظيم. يتم توسيع أجزاء من حرارة خريطة لتوضيح ممثل في وقت مبكر يصل ينظم الجينات (أعلى) والجينات في وقت متأخر (وسط)، والجينات في وقت مبكر ينظم أسفل (أسفل). في هذه الأجزاء، يتم عرض عينات فردية على حدة لتوضيح التكاثر. نحدد التغييرات التعبير في وقت مبكر كما فروق ذات دلالة إحصائية بين اللقاح و 12 عينات ساعة. نحدد التغييرات التعبير في وقت متأخر كما فروق ذات دلالة إحصائية بين عينات ساعة 12 و 48. يشير أهمية للتغيرات في> 2 أضعاف وف قيمة <0.05. تم تطبيع البيانات لكل عينة إلى مستويات الحمض النووي الريبي من TDH3 التحكم الجيني قبل احتساب متوسط القيم. معايير مهمة تسمح لنا بعض dynamicaالجينات تنظيم LLY الوقوع في كل من فئات التعبير المبكرة والمتأخرة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم تطوير هذا البروتوكول لتحسين النسخي اصابة الميكروبات باستخدام منصة nanoString nCounter. الإجراء بأكمله، من جمع الأنسجة لبيانات التعبير، يتطلب أقل من 48 ساعة. التدريب العملي على الساعة حوالي 4 ساعات لمدة 12 عينات. واحد متغير رئيسي في هذا البروتوكول هو مقدار عازلة RLT تضاف إلى الأنسجة في الخطوة الأولى. والكثير من عازلة تمييع جناسة ويؤدي إلى خفض تركيز الحمض النووي الريبي، بينما عازلة القليل جدا قد يؤدي إلى تشكيل المواد الهلامية اللزجة بعد خطوة الاستخراج الفينول الكلوروفورم وترك أي المرحلة المائية لتحقيق الانتعاش RNA. وحدات التخزين المثلى تحدد تجريبيا من RLT العازلة للأنسجة الماوس (على افتراض أحجام نموذجية) هي: الكلى (1.2 مل)، واللسان (1.0 مل) والرئة (2.0 مل). بالنسبة لمسببات الأمراض الجرثومية، وخصوصا هذه التي تزرع في شكل الخيطية، وخطوة بفوزه على حبة يساعد على كسر فتح جدار الخلية سميكة لاطلاق سراح تماما محتويات الخلوية. في خطوة شطف، من أجل زيادة RNA النهائيالتركيز، أول شطافة مستديرة ويمكن أن يضاف إلى العمود، وأزل مرة ثانية. حوالي 100 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي مجموع الأنسجة يمكن استردادها من واحد العمود RNeasy تدور (~ 2 ميكروغرام / ميكرولتر × 50 ميكرولتر). إذا كانت هناك حاجة أكبر كمية من الحمض النووي الريبي، والإعدادية الثاني يمكن أن تكون مصنوعة من جناسة الأنسجة المتبقية. لا تتخلص من جناسة المتبقية حتى تم قياس تركيز الحمض النووي الريبي، فقط في حالة.

اعتمادا على نموذج العدوى، وحجم قيحة وسلالة الممرض، نسبة الممرض RNA في الحمض النووي الريبي مجموع الأنسجة يختلف من 0٪ -2٪، وعادة ما يندرج ضمن 0.05٪ -0.5٪ النطاق. على سبيل المثال، 10 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي مجموع الأنسجة من C. إصابة البيض الكلى يمكن أن تولد التهم الخام مساوية ل10 نانوغرام من الذهب الخالص C. البيض RNA من ثقافة في المختبر (10 نانوغرام / 10 ميكروغرام = 0.1٪). لأن نسبة الممرض RNA في الحمض النووي الريبي مجموع الأنسجة تختلف في نطاق واسع، فإنه من الصعب أن نعرف كمية pathogeن RNA في كمية معينة من مجموع RNA. لتجنب هدر codeset (250 جينات X 192 ردود الفعل، والتكلفة لكل رد فعل حوالي 200 $) على عينات الحمض النووي الريبي مع الممرض دون مستوى الكشف، قد يتم تنفيذ خطوة لمراقبة الجودة RNA لتحديد مستوى الممرض RNA داخل كل عينة. ويمكن القيام بذلك عن طريق إما Q-RTPCR أو codeset صغيرة تحتوي على عدد قليل من الجينات التدبير المنزلي.

التطبيع باستخدام الجينات الممرض هو خطوة حاسمة قبل ملامح التعبير يمكن مقارنة بين عينات مختلفة. هناك ثلاث طرق شائعة الاستخدام للتطبيع. 1. استخدام العد الكلي من جميع الجينات في codeset. 2. استخدام واحد أو عدد قليل من الجينات "التدبير المنزلي". 3. استخدام الوسط الهندسي (N ^عشر الجذرية للمنتج من الأرقام N) من الجينات التي أعرب عنها إلى حد كبير. لcodeset كبيرة (> 100 الجينات) التي تحتوي على تحقيقات تم اختيارها عشوائيا، وذلك باستخدام العدد الكلى للتطبيع يمكن أن يكون خيارا جيدا، لأن العد الكلي لعدد كبير من الجينات لا علاقة لها قد الإيمانيعكس تماما كمية المدخلات RNA. لcodeset صغيرة (<100 الجينات) التي تحتوي تركز على عملية معينة المسابير (مثل نمو خوطي، بالنظر إلى أن جينات النمو خوطي تميل إلى أن يشترك تنظيم)، واختيار واحد أو عدد قليل من الجينات التدبير المنزلي عن السيطرة لتطبيع أمر ضروري. TDH3، جين الأيض أعرب بقوة، وقد خدم كذلك التحكم في العديد من التجارب. الطريقة الثالثة هو مزيج من أسلوب 1 و 2، مع التركيز على مساهمة متساوية من الجينات التي أعرب عنها إلى حد كبير.

على الرغم من أن منصة nCounter لا الجينوم، فإنه يسمح الكمي لمستوى التعبير لمدة تصل إلى 800 الجينات في فحص واحد. لذلك، واختيار الجينات أكبر قدر من المعلومات لتحليل هو أمر حاسم لنجاح التنميط. وقد استخدمت نهجين لتحديد للتحقيقات. النهج الأول هو "قائم على المعرفة". يتم تصنيف المعلومات من التعبير المنشورة والبيانات الوظيفية للكشف عن الجينات التي تنطوي على أهمية محتملة للتياردراسة مثل جينات الاستجابة البيئية ^6-9. هذا النهج يتيح المقارنة سهلة لفي الجسم الحي التنميط البيانات إلى العديد من قواعد البيانات الموجودة، وبالتالي توفير إطار لتفسير البيانات. النهج الثاني هو "استكشاف أساس". ويتم اختيار فئة من الجينات في الجينوم ميكروب، مثل كل الجينات تحديد عوامل النسخ، تحركات أو البروتينات جدار الخلية للتحقيقات. هذا النهج يتيح تحديد عوامل الفوعة جديدة واكتشاف علاقات تنظيمية جديدة على أساس المجراة التنميط البيانات ^6.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم تطوير هذا البروتوكول في مختبر الدكتور آرون ب. ميتشل في جامعة كارنيجي ميلون. نشر هذه المخطوطة برعاية NanoString Technologies.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وأيد هذا العمل في جزء من المنح NIH R21 DE023311 (APM)، R56 AI111836 (APM وSGF)، R01 AI054928 (SGF)، وR01 DE017088 (SGF).

Materials

List of materials used in this article
Name	Company	Catalog Number
gentleMACS Dissociator	Miltenyl Biotec	130-093-235
gentelMACS M أنبوب	Miltenyl Biotec	130-093-236
RNeasy Mini Kit	QIAGEN	74104
2-mercaptoethanol	Sigma	M-3148
الفينول: CHCl_{3< / sub>: IAA}	Sigma	P-2069
حبات الزركونيا	منتجات Biospec	11079110zx
Mini-Beadbeater-16	Biospec Products	607
nCounter نظام تحليل	nanoString تقنيات
nCounter مجموعات الرموز للتعبير الجيني	nanoString تقنيات

nanoString

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

The host-infecting fungal transcriptome. FEMS Microbiol Lett. 307 (1), 1-11 (2010).">Cairns, T., Minuzzi, F., Bignell, E. The host-infecting fungal transcriptome. FEMS Microbiol Lett. 307 (1), 1-11 (2010).
Dual RNA-seq of pathogen and host. Nat Rev Microbiol. 10 (9), 618-630 (2012).">Westermann, A. J., Gorski, S. A., Vogel, J. Dual RNA-seq of pathogen and host. Nat Rev Microbiol. 10 (9), 618-630 (2012).
Quantitative bacterial transcriptomics with RNA-seq. Curr Opin Microbiol. 23C, 133-140 (2015).">Creecy, J. P., Conway, T. Quantitative bacterial transcriptomics with RNA-seq. Curr Opin Microbiol. 23C, 133-140 (2015).
Direct multiplexed measurement of gene expression with color-coded probe pairs. Nat Biotechnol. 26 (3), 317-325 (2008).">Geiss, G. K., et al. Direct multiplexed measurement of gene expression with color-coded probe pairs. Nat Biotechnol. 26 (3), 317-325 (2008).
Multiplexed measurements of gene signatures in different analytes using the Nanostring nCounter Assay System. BMC Res Notes. 2, 80(2009).">Malkov, V. A., et al. Multiplexed measurements of gene signatures in different analytes using the Nanostring nCounter Assay System. BMC Res Notes. 2, 80(2009).
Activation and Alliance of Regulatory Pathways in C. albicans during Mammalian Infection. PLoS Biology. 13, e1002076(2015).">Xu, W., et al. Activation and Alliance of Regulatory Pathways in C. albicans during Mammalian Infection. PLoS Biology. 13, e1002076(2015).
The Cryptococcus neoformans Rim101 Transcription Factor Directly Regulates Genes Required for Adaptation to the Host. Mol Cell Biol. 34 (4), 673-684 (2014).">O'Meara, T. R., et al. The Cryptococcus neoformans Rim101 Transcription Factor Directly Regulates Genes Required for Adaptation to the Host. Mol Cell Biol. 34 (4), 673-684 (2014).
Profiling of Candida albicans Gene Expression During Intra-Abdominal Candidiasis Identifies Biologic Processes Involved in Pathogenesis. J Infect Dis. 208 (9), 1529-1537 (2013).">Cheng, S., et al. Profiling of Candida albicans Gene Expression During Intra-Abdominal Candidiasis Identifies Biologic Processes Involved in Pathogenesis. J Infect Dis. 208 (9), 1529-1537 (2013).
Divergent Targets of Candida albicans Biofilm Regulator Bcr1 in Vitro and In Vivo. Eukaryot Cell. 11 (7), 896-904 (2012).">Fanning, S., et al. Divergent Targets of Candida albicans Biofilm Regulator Bcr1 in Vitro and In Vivo. Eukaryot Cell. 11 (7), 896-904 (2012).
TM4: a free, open-source system for microarray data management and analysis. Biotechniques. 34 (2), 374-378 (2003).">Saeed, A. I., et al. TM4: a free, open-source system for microarray data management and analysis. Biotechniques. 34 (2), 374-378 (2003).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

التنميط التعبير الجيني اصابة الميكروبات باستخدام منصة رقمية من الترميز

In This Article

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgements

Materials

References

Reprints and Permissions

Tags

Related Articles