يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

تتبع وقياس العمليات التنموية في

8.5K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/53469

⸱

ديسمبر 16, 2015

 ,  ,  ,  , 
1Buchmann Institute for Molecular Life Sciences and Institute of Biochemistry II, School of Medicine, Goethe University

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

هنا يتم توضيح كيفية تتبع وقياس العمليات التنموية في C. ايليجانس. تعتمد الطرق المقدمة على أدوات مفتوحة المصدر يمكن تنفيذها بسهولة. يتم توضيح كيفية إعادة بناء نماذج شكل خلية ثلاثية الأبعاد ، وكيفية تتبع الهياكل الخلوية يدويا ، وكيفية تحليل التدفق المقلص القشري.

الملخص

التقاط كميا العمليات التنموية أمر بالغ الأهمية لاستخلاص النماذج الميكانيكية والمفتاح لتحديد ووصف الظواهر متحولة. هنا يتم عرض بروتوكولات لإعداد الأجنة وC. الكبار ايليجانس الحيوانات لقصيرة وطويلة الأجل الوقت الفاصل بين المجهر وطرق تتبع وتقدير من العمليات التنموية. الأساليب المقدمة تستند فقط على C. سلالات ايليجانس المتاحة من مركز علم الوراثة انواع معينة وعلى البرمجيات مفتوحة المصدر التي يمكن تنفيذها بسهولة في أي مختبر مستقل عن نظام المجهر المستخدمة. A إعادة بناء نموذج 3D خلية الشكل باستخدام IMOD نماذج البرمجيات، وتتبع اليدوي الهياكل التحت خلوية fluorescently المسمى باستخدام متعددة الأغراض برنامج تحليل الصور Endrov، وتحليل تدفق مقلص القشرية باستخدام PIVlab (حل الزمن الرقمي الجسيمات صورة Velocimetry وأظهرت أداة لMATLAB). تم مناقشته كيف يمكن أيضا أن يتم نشر هذه الأساليب رس التقاط كميا العمليات التنموية الأخرى في نماذج مختلفة، على سبيل المثال، تتبع الخلايا والنسب تتبع، تتبع تدفق الحويصلة.

المقدمة

مع التحسن المطرد من البروتينات الفلورية، والهندسة الجينية، المجهر الضوئي، والبرنامج التشغيلى الكمبيوتر والأجهزة، أصبح من الممكن الآن لتسجيل تطوير العديد من الكائنات النموذجية في القرار المكانية والزمانية لم يسبق له مثيل. هذا يسمح للباحثين لطرح الأسئلة التي لا يمكن معالجتها سابقا أو لإعادة النظر في العمليات التنموية المعروفة من أجل البحث عن الجوانب تجاهلها. وأثار هذا التقدم في مجال البيولوجيا التطورية الكمي، الذي يهدف إلى تحويل، ونماذج رسمية النوعية في النماذج الكمية التي كتبها قياسات دقيقة والتحليلات الإحصائية.

جعلت خلايا تتبع والهياكل التحت خلوية من الممكن استخلاص النماذج الكمية من التطور الجنيني، نشاط الجهاز العصبي، أو انقسام الخلايا 12/01. من خلال تتبع بقايا انقسام الخلايا خلال التنمية في وقت مبكر من C. ايليجانس الجنين، يمكن أن تكشف مؤخرا أنها تتبع جهاز ستيريوعوامل كتبته مسار ويشكل الاستقطاب المهم 13،14.

هنا، يتم عرض البروتوكولات التي تجعل النهج البيولوجيا التطورية الكمي للوصول لغير الخبراء. التركيز يكمن في ثلاث على التوالي إلى الأمام، والأدوات المتاحة بحرية التي يمكن أن تنفذها في أي مختبر لديه حق الوصول إلى معيار المجهري متحد البؤر وأجهزة الكمبيوتر. وتشمل هذه بروتوكول لتوليد الأشكال خلية 3D، وبروتوكول لتعقب فلول انقسام الخلايا، وبروتوكول لوصف كميا ديناميات أكتوميوزين القشرية. الديدان الخيطية C. يستخدم ايليجانس كحالة نموذجية، ومع ذلك، فإن أساليب وأدوات مناقشتها هنا هي مناسبة لمجموعة متنوعة من الأسئلة في النماذج البيولوجية الأخرى، على سبيل المثال، الخلايا المستزرعة، إإكسبلنتس الأنسجة، organoids أو الكروية والأجنة الأخرى، الخ

عموما، بعض التحليلات هو موضح هنا يمكن أيضا أن يؤديها مع شعبية مفتوحة المصدر أداة يماغيج (http://imagej.nih.gov/ij/docs/index.أتش تي أم أل. أو في فيجي، "وشملت بطاريات" إصدار يماغيج، http://fiji.sc/Fiji) التي هي العديد من الإضافات للالتحليلات الكمية المختلفة المتاحة. ومع ذلك، فإن برامج مناقشتها هنا مصممة لمعالجة مشاكل محددة.

أولا، IMOD، ومعالجة الصور، والنمذجة وعرض جناح يمكن استخدامها لإعادة بناء 3D من مسلسل أقسام من الإلكترون المجهري أو ضوء 15. كما يحتوي IMOD أدوات للعرض البيانات 3D من أي اتجاه. ثانيا، Endrov، وهو برنامج جافا المصممة لإجراء تحليل الصورة، ومعالجة البيانات، والشرح الشبكات أو المسارات (وغيرهم) على أساس العمارة المساعد طويلة، مع يماغيج المساعد التوافق 16. أنه يحتوي على أكثر من 140 عمليات لمعالجة الصور واجهة المستخدم الموسعة التي يتم فيها عرض النماذج والبيانات الخام على حدة. ويمكن الاطلاع على شفرة المصدر في https://github.com/mahogny/Endrov. ثالثا، PIVlab، وMأداة ATLAB عن الجسيمات الصور الرقمية velocimetry التي تسمح للمستخدم لكميا ونوعيا تحليل حقول تدفق الجسيمات 17. استخدام هذه البرامج يتطلب ترخيص MATLAB الذي يتضمن أدوات معالجة الصور (http://mathworks.com). PIVlab هو برنامج مصمم لوصف تدفق كميا. وتحسب توزيع سرعة وحجم، الدردورية، الاختلاف، أو القص ضمن أزواج صورة أو سلسلة. لهذا، فإنه عبر يرتبط مناطق صغيرة من الصور (وتسمى 'يمر' في قسم البروتوكول) من الزوج الصورة لاشتقاق النزوح الجسيمات الأكثر احتمالا. هذا الارتباط عبر ينتج مصفوفة الارتباط التي يمكن تحليلها في مجال الفضاء أو التردد باستخدام إما مباشرة عبر ارتباط أو تحول فورييه السريع (الاتحاد الفرنسي للتنس)، على التوالي.

المعدات المستخدمة هنا هي مجهر مقلوب مجهزة نيبكو ('الغزل') القرص، وهو EMCCD، 488 و 561 نانومتر solid- القياسيةليزر الدولة، و20x والهواء أو 40X 60X أو خطة / امزيغ أهداف بالنفط أو الغمر بالمياه. ومع ذلك، فمن الممكن أيضا أن أداء الوقت الفاصل بين التصوير مع طرائق التصوير الأخرى، على سبيل المثال، راهنا، line- أو القائم على الليزر المجهر رقة المسح الضوئي، متعدد الفوتون المجهري، وكذلك برنامج التحصين الموسع ومضان المجهر جنبا إلى جنب مع deconvolution أو منظم إضاءة. وميزة استخدام نظام القرص نيبكو هي الحصول على الصور سريع للغاية، وخاصة إذا وضع تدفق (حركة مستمرة والمسح الضوئي للجسم في البعد ض) هو متاح. بالإضافة إلى ذلك، لتحسين القرار، مكبرة الموسع 1.5 أضعاف أمام EMCCD يمكن استخدامها.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1. إعداد C. ايليجانس الأجنة عن الوقت الفاصل بين المجهري باستخدام بلي

  1. نقل الديدان البالغة حامل باستخدام معول دودة (سلك البلاتين) إلى قطرة من العازلة M9 وتنظيف قبالة البكتيريا عن طريق أولا تهييج بقوة ومن ثم نقل كل الدودة إلى انخفاض المجاور M9 باستخدام السوط العين التي شنت على اختيار الأسنان / ماصة أو استخدام الزجاج الشعرية أشار.
  2. تمييع تشتت تحتوي على 20 ميكرومتر الخرز قطر البوليسترين 10 أضعاف في M9 العازلة (يحتوي على 1 L M9 عازلة 3 ز KH 2 PO 4 و 6 ز نا 2 هبو 4، 5 غرام كلوريد الصوديوم، وبعد التعقيم (20 دقيقة، 120 ° C)، إضافة 1 مل إضافية من 1 M MgSO 4 الحل).
  3. جعل ماصة الفم من أي نوع من أنواع رقيقة الزجاج الشعرية (على سبيل المثال، وذوبان نقطة أو الشعيرات الدموية الشعيرات الدموية تستخدم لسحب إبر الحقن)، وقطعة تقريبا 0.5 مترا من المطاط، سيليكون أو مواد مماثلة أنابيب (شفاف المثالية)، 200 ميكرولترغيض ماصة، وغطاء من 200 ميكرولتر PCR أنبوب، مرشح مسعور والمحاقن الصغيرة (على سبيل المثال، وهو ،2-،45 ميكرون حجم المسام و15-50 مم نايلون، PTFE أو تصفية المواد مماثلة)، وماصة 1000 ميكرولتر طرف . هذا النوع من الفم ماصة يضمن أن أي مادة بيولوجية يمكن الحصول على اتصال مع المجرب.
  4. تجميع ماصة عن طريق إدخال 200 ميكرولتر ماصة مع طرف لأول مرة في الأنابيب وتوصيله مع غطاء أنبوب PCR التي لديها ثقب المركزي الذي يطابق قطر الشعرية المستخدمة. وأشار جدا إبرة المخرز أو إعداد يمكن استخدامها لتوليد ثقب.
  5. رسم الشعرية رقيقة وأدخله في ثقب. إدراج مرشح في الطرف الآخر من الأنبوب وإدراج ماصة 1000 ميكرولتر كقطعة الفم (الشكل 1).
  6. تشريح البالغين حامل عن طريق قطع الديدان بشكل مستعرض في الفرج بشفرة حلاقة نظيفة أو مشرط.
    ملاحظة: عادة، فإن العديد من الأجنة يكون هxpulsed بعد القطع. ومع ذلك، إذا كانت هناك حاجة الأجنة في وقت مبكر، في بعض الأحيان أن يتم الافراج عن الذبيحة باستخدام السوط العين أو إبرة مدببة.
  7. ماصة قطرة واحدة من المخفف البوليسترين حبة التشتت (~ 4 ميكرولتر) في الصعود إلى 24x60 مم الغطاء الزجاجي ونقل الأجنة إلى هذا الانخفاض باستخدام ماصة الفم.
  8. وضع بعناية صغيرة (على سبيل المثال، 18x18 أو 20X20 مم) تغطية الزجاج على رأس قطرة والتأكد من انخفاض انتشر بشكل كامل.
    ملاحظة: يجب أيضا أن يكون قطرة صغيرة بما يكفي كي لا تلمس حواف غطاء زجاجي صغير.
  9. ختم جبل مع الفازلين المسال. إضافة قطرة من زيت الغمر على 24x60 مم الغطاء الجانبي زلة، والشروع في قسم "الوقت الفاصل بين الميكروسكوب.

2. إعداد الكبار C. ايليجانس الحيوانات في الوقت الفاصل بين المجهري تستخدم Nanobeads

ملاحظة: بشكل عام، وبروتوكول لتركيب الحيوانات الكبار هو التكيف للبروتوكول من المرجع. 18.مع هذا البروتوكول، فمن الممكن أن تؤدي على المدى الطويل المجهري الوقت الفاصل بين متحد البؤر من الحيوانات البالغة.

  1. إعداد 1.5٪ (ث / ت) حل الاغاروز في المخزن M9، يغلي (1 دقيقة، و 100 درجة مئوية في حمام مائي أو الميكروويف). لا ينصح استخدام تركيزات أعلى من الاغاروز لأن هذا يمكن أن يؤدي إلى قذف من الأمعاء و / أو أجزاء من الغدد التناسلية.
  2. عصا أسفل 2-3 طبقات من الشريط على شريحتين المجهر لكل منهما. ضع شريحة من دون الشريط بين الشرائح اثنين مع الشريط.
  3. استخدام غيض ماصة ووضع قطرة واحدة من الحل الاغاروز الساخن في وسط الشريحة المتوسطة. المكان بسرعة شريحة أخرى على تراجع بحيث كانت مدعومة من قبل الطبقات الشريط على كل جانب. هذا سيخلق جولة وسادة أجار شقة حوالي 10 مم.
  4. وضعت قطرة من 100 حل حبة نانومتر (غير مخفف، وهو 2.6٪ (ث / ت)) على لوحة. نقل 1-10 الديدان البالغة تنظيفها في الانخفاض مع اختيار دودة. ختم مع 18x18 مم الغطاء الزجاجي والفازلين كما هو موضح في بروتocol 1.

3. الوقت الفاصل بين المجهري

  1. وضع قطرة من زيت الغمر على شريحة المجهر أو شطيرة غطاء زجاجي. استخدام brightfield في التكبير المنخفض (5X 10X أو العدسات) لتحديد العينة.
    ملاحظة: الحد من التعرض للضوء الأزرق قدر الإمكان (ولا سيما بالنسبة للC. ايليجانس الأجنة)، على سبيل المثال، لا تستخدم برنامج التحصين الموسع ومضان المجهري للعثور / تركيز العينة ولكن استخدام brightfield بدلا من ذلك.
  2. تغيير إلى أعلى التكبير (40X 60X أو أهداف)، وجلب العينة إلى التركيز (أي طائرة المركزية أو أعلى / أسفل طائرات من العينة، وهذا يتوقف على اقتناء البرمجيات).
  3. تعيين فترات أخذ العينات إلى 30 طائرة في 1 ميكرون تباعد سجلت كل 1min. في حالة ومرحلة XYZ الآلي xy- أو متاحة، يمكن تسجيل النقاط متعددة في دورة واحدة. التحول إلى التصوير مضان والتحقق من التركيز مرة أخرى.
    ملاحظة: في محاولة لتجنب استخدام الصلاحيات ليزر عالية، وليس استخدام مرات التعرض أطول قليلافي كثافات منخفضة جدا. تدبير الحصول على الصور على الفور، إما في البرنامج الحصول على الصور أو في يماغيج لتجنب التشبع، المحاصيل التي تتراوح ديناميات ويعني أيضا التعرض للإشعاع الزائد.
  4. بدء تسجيل سلسلة مرور الزمن.
    ملاحظة: لاستبعاد تحليل الأعمال الفنية، تبدأ طويلة فترات (3-10 دقيقة) الوقت بين المسح عينة وتزيد تدريجيا أخذ العينات الزمنية لفترات المطلوب. توقيت التنموي وكذلك نقطة نهاية في كلتا الحالتين يجب أن تكون مماثلة عند إجراء التحليل الإحصائي. وعلاوة على ذلك، فإنه غالبا ما يكون ضروريا لتقييم معدلات الضيائية والبقاء على قيد الحياة. لذلك، واستعادة عينة من الجبل بعد على المدى الطويل الوقت الفاصل بين المجهر وتحقق ما إذا كانت مواصلة تطوير / على الهواء مباشرة.

4. إعادة بناء نموذج 3D خلية الشكل مع IMOD

ملاحظة: البرنامج IMOD متاح من صفحة الويب IMOD: http://bio3d.colorado.edu/imod/. تثبيت البرنامج هو وصفد هناك. عند استخدام نظام التشغيل ويندوز، مجموعة أدوات يونكس لديها ليتم تثبيتها، والتي يمكن أيضا أن تكون موجودة كحزمة واحدة على صفحة ويب IMOD. وعلاوة على ذلك، هناك مقدمة 3dmod جمعت ممتاز متوفرة على صفحة ويب IMOD (http://bio3d.colorado.edu/imod/doc/3dmodguide.html).

  1. فتح قذيفة يونكس واكتب في "IMOD". سيتم فتح نافذة IMOD. حدد الملف مع البيانات الخام (مثالي لمعرض طرابلس مكدسة أو ما شابه ذلك) يمكن من خلالها توليد نموذج 3D.
  2. تحديد الجزء السفلي والعلوي من الكائنات في إطار انطلق باستخدام إطار المعلومات (ارتفاعا وانخفاضا التمرير أداة).
  3. بدء تتبع الخطوط العريضة الخلية. الأهم من ذلك، تأكد من أن كل خلية كائن واحد. تبدأ الطائرة العليا من كل خلية وخلق كفاف الأول هناك باستخدام إطار المعلومات. انتقل لأسفل في Z، وخلق محيط جديد لكل ض الطائرة.
  4. نفعل نفس الشيء بالنسبة العديد من الخلايا حسب الحاجة إلى نموذج في 3D. لا تنسى أن إنشاء كائن جديد عند بدء مع خلية جديدة.
    NOTE: هناك العديد من الطرق المختلفة للبحث عن المفقودين كفاف والعديد من الإضافات المفيدة. يرجى زيارة صفحة ويب IMOD والبرامج التعليمية عبر الإنترنت للحصول على التفاصيل. في حالة المعروضة هنا، وقد استخدم الإعداد الافتراضي.
  5. فتح "نموذج عرض" نافذة لتفقد الأشياء وملامح بها.
  6. في "نموذج عرض" شريط الأدوات اختر "تحرير" - "الأجسام". سيتم فتح نافذة التحرير المعنيين.
  7. لنموذج الخلايا كما الأجسام الممتلئة والمغلقة، اختر "شبكة" ك "رسم نوع البيانات" و "تعبئة" بأنه "نمط رسم". انقر على "تشبك" في اختيار تمرير في الجهة اليسرى السفلي من الإطار. حدد الخيار "كاب" في الاختيار في أسفل اليمين. تحقق العديد من الأشياء عند الضرورة وانقر على زر "مش الكل". سيقوم البرنامج توليد الأجسام الصلبة من أكوام من معالم. وعامل أخذ العينات ض يمكن تعديلها عن طريق تغيير "Z-مقياس" في "عرض" النافذة.
  8. نقل / تدوير objec 3Dر ("تحرير" - "عرض") وحفظ لقطات أو الأفلام ("ملف" - "التقط المشاجرة باسم ..." أو "فيلم / مونتاج").

5. تتبع Fluorescently الهياكل إعتبر مع Endrov

ملاحظة: من أجل تعقب فلول انقسام الخلايا، واستخدام الضغط مع علامة غشاء النووية أو البلازما لتحديد الخلية (على سبيل المثال، H2B، PH-PLC-D1)، وانقسام الخلايا علامة المتبقية (على سبيل المثال، NMY-2، ZEN-4 ). علامة غشاء النووية أو البلازما هي مهمة لتحديد الخلية التي يرث بقية انقسام الخلايا.

  1. لتحميل سريع وسهولة الاستخدام، البيانات الخام لابد من تحويلها إلى ملف شجار (على سبيل المثال، في يماغيج). بعد ذلك، فتح Endrov وتحميل الملف ليتم تحليلها عن طريق اختيار "ملف تحميل" خيار من القائمة ملف. انقر على "المشاهد 2D" أيقونة على شريط الأدوات.
  2. ضبط الرسم البياني عن طريق النقر على أيقونة "مجموعة صالح" (رمز الأزرق في أسفل الزاوية اليمنىمن الشاشة Endrov). تعيين XYZ دقة عن طريق الذهاب إلى "بيانات" - "اسم الملف" - "Imageset" - "قناة" - "تعيين XYZ-القرار". اكتب في قيم X، Y، Z و، على سبيل المثال، 5، 5، 1 إذا كان X و Y القرار هو 0.2 ميكرون وتذوق كل 1 ميكرون في Z.
  3. ليحشي نوى، والانتقال إلى الطائرة من الفائدة وانقر على "المشاهد 2D". حدد "النسب" من القائمة المنسدلة واختيار "النسب جديد".
  4. بالنقر والسحب على النواة، فإنه يمكن أن تكون علامة. على سبيل المثال النواة، انقر بزر الماوس الأيمن واختر "إعادة تسمية الجسيمات" من القائمة المنسدلة. لزيادة أو إنقاص قطر الدائرة، اسحب رمز السهم الذي يظهر على يسار دائرة ملحوظة. بمناسبة الطائرة المركزية للنواة، انقر على أيقونة الصحيح. عند استخدام علامة غشاء البلازما، يمكن استخلاص كرة كبيرة من شأنها أن تغطي معظم الخلية.
  5. المضي قدما في الوقت المناسب والطائرة، واختيار "الإطار" و "Z"الخيارات في شريط الأدوات السفلي. بعد الذهاب إلى نقطة زمنية المقبلة، وضبط الموقف أو حجم الدائرة الذي يمثل نواة وفقا لذلك. كرر هذا حتى تنقسم فيها الخلية تتبعها.
  6. عندما يكون هناك انقسام الخلايا، بمناسبة نوى ابنة والتحول إلى "المشاهد النسب". هذا يمكن اختيارها من قبل النقر على أيقونة "ويندوز" على شريط الأدوات العلوي. علامة كل نواة ثلاثة في وقت واحد، انتقل إلى "النسب" خيار في شريط الأدوات العلوي وحدد "الأم مشارك".
  7. عندما يتم الانتهاء من تتبع الخلية، والتحول إلى القناة بمناسبة بقايا انقسام الخلايا لتتبع. للتبديل القنوات، انقر على اسم الملف على الركن الأيسر السفلي من شريط الأدوات. يمكن تتبع بقية انقسام الخلايا (أو أي بنية أخرى) كما هو موضح أعلاه لنواة.
  8. عند عودته إلى البرنامج بعد إغلاق، فمن الضروري أن تذهب إلى "2D عارض" - "النسب" - "تحرير" والنقر على رقم النسب التي سيتم تحريرها.

6. تحليل القشرية أكتوميوزين تدفق مع PIVlab

ملاحظة: PIVlab هو البرمجيات المتاحة بحرية من: http://pivlab.blogspot.de/. يمكن استدعاؤها من داخل ماتلاب بيئة سطر الأوامر بكتابة PIVlab_GUI. عند العمل مع PIVlab، فمن المستحسن لانقاذ سلسلة صورة في مجلد منفصل.

  1. بدء دورة جديدة من "القائمة ملف". تحميل ملفات الصور من خلال النقر على "تحميل الصور" الزر.
  2. حدد نمط التسلسل 1-2، 2-3، ... وانتقل إلى الدليل الذي يحتوي على سلسلة من الصور المطلوبة. حدد الصور وانقر على زر "إضافة" والاستيراد.
  3. انتقل إلى "إعدادات تحليلات" وحدد "الاستثناءات (ROI، قناع)". بدلا من ذلك، اضغط على "السيطرة + E". استخدم زر "رسم قناع ل الإطار الحالي" لتعطيل الجزء غير مرغوب فيه من الصورة / الصورة (أي منطقة خارج الجنين).
  4. حدد "إعدادات التعريف الشخصي" الابOM قائمة "إعدادات تحليلات". بدلا من ذلك، اضغط على "السيطرة + S". اختيار "الاتحاد الفرنسي للتنس نافذة تشوه" كما الخوارزمية التعريف الشخصي المطلوب.
    ملاحظة: وجبات سريعة التحول فورييه (الاتحاد الفرنسي للتنس) يقلل من تكلفة الحسابية ولكن ينصح فقط إشارة فوق ضجيج بشكل جيد وإذا تشريد الجزيئات درس لا يتجاوز نصف مساحة تمريرة تحليلها (انظر 6.5).
  5. أدخل القيم التالية للممرات الثلاثة، التي هي مجال التحقيق لكثافة عبر الارتباط بين الصور التالية: تمرير 1: الاستجواب مساحة 64 بكسل مع خطوة 32. ممر 2: الاستجواب مساحة 32 بكسل مع خطوة من 16 اختر "خطية" من تشوه نافذة القائمة المنسدلة. اختيار طريقة جاوس 2 * 3 نقاط لالفرعي بكسل تقدير النزوح.
  6. حدد "تحليل"! من القائمة تحليل واستخدام زر "تحليل جميع الأطر" لبدء تحليل.
  7. لمرحلة ما بعد المعالجة حدد "التحقق من صحة ناقلات" من "؛ مرحلة ما بعد المعالجة "القائمة وتعيين عتبة تصفية الانحراف المعياري (STDEV) إلى 7 وتنطبق على جميع الأطر.
  8. اختيار "اشتقاق المعلمات / تعديل البيانات" من القائمة "مؤامرة". حدد "ناقلات [بكسل / الإطار]" من القائمة المنسدلة. ضبط نعومة النواقل وارتفاع تمرير مرشح وتنطبق على جميع الأطر.
  9. لحساب ناقلات يعني من جميع الأطر، تعيين "إطارات مستعملة" ل1: نهاية وانقر على زر "احسب ناقلات متوسط".

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

باستخدام بروتوكولات 2، 3، و 4، والتصوير الوقت الفاصل بين الغدد التناسلية في البرية من نوع C. ايليجانس يتم تنفيذ البالغين (سلالة OD58 (UNC-119 (ED3) الثالث؛ ltIs38 [pAA1؛ فطيرة-1 :: :: GFP PH (PLC1delta1) + UNC-119 (+)])، معربا عن علامة الغشاء من المروج سلالة الجرثومية ). التركيز على منعطف من الغدد التناسلية، يتم إنشاء نموذج 3D من الخلايا الجرثومية من البيانات المجهري (الشكل 2). هذا النموذج يسمح لتحليل التغيرات في حجم الخلية في حين عبور خلايا تشكل البعيدة ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

من خلال تتبع الكائن في التنمية ولا سيما تتبع النووي، كان، فإنه من الممكن توضيح الآليات الزخرفة المركزية للC. ايليجانس مرحلة التطور الجنيني 1،23،24. توسيع هذه الاستراتيجية إلى ارتفاع الإنتاجية، فقد كان من الممكن مؤخرا للكشف عن قواعد الزخرفة إضافية واقتراح الأسلوب كيفية استخلاص قواعد الزخرفة دي نوفو 10. بالنسبة لكثير من المسوخ، ومع ذلك، فإن العيوب الزخرفة الدقيقة لا تزال غير معروفة. الأساليب المذكورة هنا هي الأدوات التي يمكن أن تكون مفيدة في ت...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

يتم تمويل البحث في مختبر الإنتاج الأنظف من قبل Deutsche Forschungsgemeinschaft (EXC 115; FOR 1756) ومجموعة أبحاث LOEWE شبكات Ubiquitin. ويحظى البرنامج الأنظف بدعم إضافي من البرنامج الإطاري 7 للاتحاد الأوروبي (مشروع أعمال ماري كوري 326632).

شكر وتقدير

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
مجهر ستيريوMotic / VWROT4005Sمجهر ستيريو لتشريح وتركيب
Polybead Polystyrene المجهرية ،   ؛علوم متعددة18329تركيب الأجنة
20 & م
كريات البوليسترين المجهرية ،   ؛Polysciences876تصاعد البالغة
0.1 & micro; m
شرائح المجهرVWR 631-0902تركيب البالغة
غطاء زجاجي 18x18 ممVWR631-1331تركيب الأجنة / البالغين
غطاء زجاجي 24x60 ممVWR631-1339تركيب الأجنة
مشرطVWR233-5455تشريح الأجنة
أنابيب سيليكونVWR228-1501أنابيب لماصة الفم
30 مم مرشح غشاء PTFENeoLabJul-01مرشح لماصة الفم
أنابيب الشعيرات الدمويةVWR621-0003طرف ماصة الفم
الفازلينروثE746.1تركيب الجنين / البالغين
أجارروث5210.5تصاعد البالغة
البوتاسيوم ثنائي هيدروجينفوسفات روثP018.2M9 عازلة
ثنائي الصوديوم - فوسفات الهيدروجينروثP030.2M9 عازلة
كلوريد الصوديومروث3957.1M9 عازلة
VisiScope الغزل قرص نظام متحد البؤرأنظمة VisitronN / Aالفحص المجهري متحد البؤر

المراجع

  1. Sulston, J. E., Schierenberg, E., White, J. G., Thomson, J. N. The embryonic cell lineage of the nematode Caenorhabditis elegans. Dev. Biol. 100 (1), 64-119 (1983).
  2. Kimmel, C. B., Warga, R. M. Tissue-specific cell lineages originate in the gastrula of the zebrafish. Science. 231 (4736), 365-368 (1986).
  3. Nishida, H. Cell lineage analysis in ascidian embryos by intracellular injection of a tracer enzyme. III. Up to the tissue restricted stage. Dev. Biol. 121 (2), 526-541 (1987).
  4. Lee, T., Luo, L. Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis. Neuron. 22 (3), 451-461 (1999).
  5. Livet, J., Weissman, T. A., Kang, H., Draft, R. W., Lu, J., Bennis, R. A., Sanes, J. R., Lichtman, J. W. Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system. Nature. 450 (7166), 56-62 (2007).
  6. Fernandez, R., Das, P., Mirabet, V., Moscardi, E., Traas, J., Verdeil, J. L., Malandain, G., Godin, C. Imaging plant growth in 4D: robust tissue reconstruction and lineaging at cell resolution. Nat. Methods. 7 (7), 547-553 (2010).
  7. Olivier, N., et al. Cell lineage reconstruction of early zebrafish embryos using label-free nonlinear microscopy. Science. 329 (5994), 967-971 (2010).
  8. Kitajima, T. S., Ohsugi, M., Ellenberg, J. Complete kinetochore tracking reveals error-prone homologous chromosome biorientation in mammalian oocytes. Cell. 146 (4), 568-581 (2011).
  9. Schrödel, T., Prevedel, R., Aumayr, K., Zimmer, M., Vaziri, A. Brain-wide 3D imaging of neuronal activity in Caenorhabditis elegans with sculpted light. Nat. Methods. 10 (10), 1013-1020 (2013).
  10. Du, Z., Santella, A., He, F., Tiongson, M., Bao, Z. De novo inference of systems-level mechanistic models of development from live-imaging-based phenotype analysis. Cell. 156 (1-2), 359-372 (2014).
  11. Amat, F., et al. Fast, accurate reconstruction of cell lineages from large-scale fluorescence microscopy data. Nat. Methods. 11 (9), 951-958 (2014).
  12. He, B., Doubrovinski, K., Polyakov, O., Wieschaus, E. Apical constriction drives tissue-scale hydrodynamic flow to mediate cell elongation. Nature. 508 (7496), 392-396 (2014).
  13. Singh, D., Pohl, C. Coupling of rotational cortical flow, asymmetric midbody positioning, and spindle rotation mediates dorsoventral axis formation in C. elegans. Dev. Cell. 28 (3), 253-267 (2014).
  14. Singh, D., Pohl, C. A function for the midbody remnant in embryonic patterning. Commun. Integr. Biol. 7, e28533(2014).
  15. Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD. J. Struct. Biol. 116 (1), 71-76 (1996).
  16. Henriksson, J., Hench, J., Tong, Y. G., Johansson, A., Johansson, D., Bürglin, T. R. Endrov: an integrated platform for image analysis. Nat. Methods. 10 (6), 454-456 (2013).
  17. Thielicke, W., Stamhuis, E. J. PIVlab - Towards User-friendly, Affordable and Accurate Digital Particle Image Velocimetry in MATLAB. Journal of Open Research Software. 2 (1), e30(2014).
  18. Kim, E., Sun, L., Gabel, C. V., Fang-Yen, C. Long-term imaging of Caenorhabditis elegans using nanoparticle-mediated immobilization. PLoS One. 8 (1), e53419(2013).
  19. Dickinson, D. J., Ward, J. D., Reiner, D. J., Goldstein, B. Engineering the Caenorhabditis elegans genome using Cas9-triggered homologous recombination. Nat. Methods. 10 (10), 1028-1034 (2013).
  20. Schonegg, S., Constantinescu, A. T., Hoege, C., Hyman, A. A. The Rho GTPase-activating proteins RGA-3 and RGA-4 are required to set the initial size of PAR domains in Caenorhabditis elegans one-cell embryos. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104 (38), 14976-14981 (2007).
  21. Schmutz, C., Stevens, J., Spang, A. Functions of the novel RhoGAP proteins RGA-3 and RGA-4 in the germ line and in the early embryo of C. elegans. Development. 134 (19), 3495-3505 (2007).
  22. Naganathan, S. R., Fürthauer, S., Nishikawa, M., Jülicher, F., Grill, S. W. Active torque generation by the actomyosin cell cortex drives left-right symmetry breaking. Elife. 3, e04165(2014).
  23. Kaletta, T., Schnabel, H., Schnabel, R. Binary specification of the embryonic lineage in Caenorhabditis elegans. Nature. 390 (6657), 294-298 (1997).
  24. Schnabel, R., et al. Global cell sorting in the C. elegans embryo defines a new mechanism for pattern formation. Dev. Biol. 294 (2), 418-431 (2006).
  25. Murray, J. I., Bao, Z., Boyle, T. J., Waterston, R. H. The lineaging of fluorescently-labeled Caenorhabditis elegans embryos with StarryNite and AceTree. Nat. Protoc. 1 (3), 1468-1476 (2006).
  26. Giurumescu, C. A., et al. Quantitative semi-automated analysis of morphogenesis with single-cell resolution in complex embryos. Development. 139 (22), 4271-4279 (2012).
  27. Dejima, K., Kang, S., Mitani, S., Cosman, P. C., Chisholm, A. D. Syndecan defines precise spindle orientation by modulating Wnt signaling in C. elegans. Development. 141 (22), 4354-4365 (2014).
  28. Schnabel, R., Hutter, H., Moerman, D., Schnabel, H. Assessing normal embryogenesis in Caenorhabditis elegans using a 4D microscope: variability of development and regional specification. Dev Biol. 184 (2), 234-265 (1997).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

C elegans
تتبع وقياس العمليات التنموية في
اتصل بنا
أوصِ بها للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

2026 © حقوق الطبع والنشر MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.