يتم عرض بروتوكول فيديو خطوة بخطوة للاستئصال القمي في هذه الدراسة. الاستئصال القمي هو نهج جراحي تم تسليط الضوء عليه مؤخرا في أبحاث تجديد قلب الثدييات. قد تعزز هذه الدراسة تطبيق الاستئصال القمي كمنهجية قياسية في البحث في الآلية الكامنة وراء تجديد القلب.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
قمي استئصال نموذج الفأر لدراسة المبكر الثدييات تجديد القلب
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
أمراض القلب والأوعية الدموية يصيب العالم كله بسبب تغيير نمط الحياة المركزة. تجديد القلب يحمل وعودا كبيرة لإصلاح وترميم العضلية التي فقدت بسبب الاصابة والمرض. وعلى النقيض من تجديد القلب القوي لبعض الفقاريات الدنيا، تظهر قلوب الثدييات الكبار عادة القدرة الحد الأدنى لتجديد القلب والإصلاح. ومع ذلك، فقد أثار الدراسات الحديثة أهمية علمية كبيرة مع النتيجة أنه بين يوم بعد الولادة 1-7 (P1 إلى P7)، يحتفظ قلب الفأر حديثي الولادة إمكانات التجدد كبيرة بعد استئصال القمي (أي بتر جراحية وتعرض اليسرى قمة البطين). واحد جدل كبير على هذا الاستنتاج قد يكون راجعا إلى الإجراءات المتعلقة جراحة المتنوعة المستخدمة في الجهود الرامية إلى تكرار أو توسيع بناء على هذه النتائج الهامة. هذه التعليمات يعرض حيوي المواد ومنهجية لاستئصال القمي في نموذج الفأر. الخطوات البارزة لهذه القوارض بقاؤهعملية جراحية ل تنطوي التخدير انخفاض حرارة الجسم، بضع الصدر، البتر الجراحي للبطين القلب قمة، وخياطة والانتعاش من الفئران. النهج الموصوف يمكن توسيع تطبيق استئصال نموذج الفأر القمي للأبحاث القلب والأوعية الدموية.
المقدمة
يؤدي عمر الإنسان الطويل إلى العديد من الأمراض المرتبطة بالشيخوخة ونمط الحياة ، بما في ذلك قصور القلب ، وهو سبب رئيسي للوفيات. ومع ذلك ، بدون استبدال خلايا عضلة القلب المفقودة أو المختلة وظيفيا ، يمكن للعلاجات الحالية فقط تحسين وظائف القلب بشكل عابر1 ، 2. وبالتالي ، من الضروري اكتشاف وتطوير استراتيجيات مبتكرة لتجديد القلب وإصلاحه. قلب الثدييات البالغة لديه إمكانات تجديدية محدودة. قدمت الدراسات التي أجريت على الفقاريات السفلية ، مثل البرمائيات urodele وأسماك teleost ، رؤى غير مسبوقة حول الآليات الجزيئية والخلوية الكامنة وراء تجديد القلب3 ، 4. في الآونة الأخيرة ، ظهر نموذج فأر حديثي الولادة لتجديد القلب قد يمكن من تحديد وتوصيف الأحداث الفيزيولوجية المرضية المحفوظة تطوريا والمطلوبة لتجديد قلب الإنسان5.
< p class = 'jove_content'> يشير الاستئصال القمي إلى الاستئصال الجراحي لقمة البطين الأيسر. يقتصر هذا الإجراء على الفئران التي يبلغ عمرها من 1 إلى 7 أيام (P1 إلى P7) نظرا لقدرتها على الفتك العالية في الفئرانالأكبر سنا 6. من المتوقع أن تكون عملية تجديد القلب في الفئران حديثي الولادة بعد الاستئصال القمي على النحو التالي: (I) التكوين السريع والفعال للورم الدموي لإغلاق القمة ومنع الاستئصال القمي. (II) تجديد خلايا عضلة القلب واستعادة الوظيفة الانقباضية5 ، 7. أثار العمل الأخير الجدل حول أهمية وكفاءة هذا النموذج8-11. وبالتالي ، من المهم تقديم الاستئصال القمي بوضوح وتفصيل. تحقيقا لهذه الغاية ، يصف هذا البروتوكول بوضوح وتحديد مقطع فيديو لكيفية قيامي بالاستئصال القمي بناء على بروتوكول سابق6.يعد فهم الآليات الجزيئية الكامنة وراء تجديد القلب أمرا مهما لعلاج أمراض القلب التي تتميز بفقدان و / أو إصابة خلايا عضلة القلب ، مثل قصور القلب1 ، 2. بالنظر إلى التقدم الحالي والواعد لاستئصال القمي في أبحاث تجديد القلب ، يمكن لهذه الدراسة أن تعزز استخدام هذه التقنية واستخداماتها في أبحاث تجديد القلب.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
تمت الموافقة على جميع التجارب الماوس عن طريق رعاية الحيوان واستخدام البرنامج في المعاهد الوطنية للصحة (NIH) مع عدد بروتوكول H0083R3. وافق NHLBI IACUC البروتوكول دون مسكنات.
1. انخفاض حرارة الجسم التخدير في الفئران حديثي الولادة
- تطهير اسفنجات والمعدات الجراحية في الأوتوكلاف قبل الجراحة. إعداد جميع المواد الجراحية والتبديل على الساخن حبة تعقيم 15-20 دقيقة مقدما لتصل إلى 240 درجة مئوية إلى 270 درجة مئوية.
- نقل جميع C57BL / 6 الجراء (P1 العمر) من الأم المرضعة لقفص الماوس نظيفة مع الفراش الطازجة والمواد التعشيش. مرة واحدة يتم اتخاذ الجراء إلى غرفة الجراحة، إجراء الجراحة قمي على وجه السرعة للحد من وقتهم أمضى فصل من الأم ويقلل من خطر التفكيك الأمهات.
- وضع الاسفنج على السرير الجليد ومن ثم وضع الجرو واحد على الاسفنجة الخاصة ب ~ 3 دقائق لتحقيق التخدير انخفاض حرارة الجسم. تأكيد التخدير عن طريق مراقبة ا ف بوكالة الطاقة النووية وتعذر الحركة ومعسر القدم الخلفية. التحقق من حالة حديثي الولادة في كثير من الأحيان لأن القليل جدا من الوقت لا تجعل تعذر الحركة الجرو وانقطاع التنفس، ومدة زائدة من التخدير يمكن أن تقلل من معدل البقاء على قيد الحياة 12.
2. بضع الصدر
- نقل الجرو من السرير الجليد إلى منطقة الفوق الجراحية واستخدام الشريط لشل في الذراعين والساقين، والذيل في موقف ضعيف.
- تطهير الصدر باستخدام betadine وتنظيفه باستخدام 70٪ وسادة الإعدادية الكحول بلطف.
- جعل شق الجلد عرضية على طول المنطقة بين الضلوع عليها من تجويف الصدر باستخدام Vannas الربيع مقص، ثم فظة تشريح العضلات الوربية عليها لتسهيل الوصول إلى القلب.
ملاحظة: معدلات البقاء تتحسن عندما يتم تصغير فقدان الدم أثناء عملية جراحية.
3. البتر الجراحي للقلب بطيني أبيكس
- من جهة، وتطبيق الضغط بلطف على البطن إلى الداخل للظاهر للقمة القلب. امتصاص الدم في جميع أنحاء منطقة العمليات الجراحية مع تطبيقها ذات الرؤوس القطن المعقم لتصور واضح. لحديثي الولادة السيطرة الشام التي تديرها، الانتقال مباشرة إلى الخطوة 4 (خياطة واسترداد الفئران).
- تحت مصباح المكبرة واستخدام قطع القزحية مقص، نفذ بلطف استئصال تدريجي من البطين الأيسر (LV) حتى يتم كشفها غرفة LV. كن حذرا للحد من أجزاء مقطوعة من LV. ما يقرب من 15٪ استئصال ضروري لتحقيق التعرض الأمثل للغرفة LV.
- تأكد من أن القلب يعود إلى تجويف الصدر مرة واحدة يتعرض غرفة LV.
4. خياطة والاسترداد من الفئران
- خياطة الأضلاع والعضلات معا لختم تجويف الصدر باستخدام العقيمة الغرز البرولين 6-0، ثم قم بإغلاق بعناية باستخدام الغراء الجلد موقع شق الجلد.
- تدفئة الوليد تحت مصباح الحرارة ل~ 3 دقائق للانتعاش، ومن ثم تنظيف آثار الدماء والغراء باستخدام 70٪ وسادة الإعدادية الكحول befoإعادة إعادة تقديم لتتزاحم فيها. في محاولة لاستكمال العملية الجراحية كله في غضون 10 دقيقة لتقليل الوقت الذي يقضيه فصلها عن الأم يحسن البقاء على قيد الحياة الجرو بعد استئصال القمي.
- بعد كل جراحة، وضع الأدوات الجراحية في اتصال مع حبات من حبة تعقيم الساخن لمدة حوالي 20 ثانية لتعقيم كامل. السماح للأدوات الجراحية لتبريد لRT قبل كل عملية جراحية.
- بعد الانتهاء من العمليات الجراحية لجميع الجراء في القمامة، مزيج من الجراء مع أغطية فراش الأم والبراز قبل إعادتهم إلى عش الأم.
ملاحظة: عموما، ICR / CD-1 الفئران هي أفضل الحاضنة الأمهات من C57BL / 6، ولكن حتى بين النساء المرضعات من نفس الخلفية الوراثية، وتختلف الغرائز تعزيز. إذا تغير الأم المرضعة من الضروري خفض معدل وفيات الأمهات عن طريق الإبدال، وإزالة الجراء P0 إلى الأم المرضعة ثم قم بإجراء استئصال القمي في P1. القيام بأي عملية صورية أو ص القمي فقطesection في لتر واحد من الجراء، لأن خلط الشام والجراء الجراحية يمكن أن تقلل من معدلات البقاء على قيد الحياة من المجموعة الجراحية من الجراء 6.
5. تحليل ما بعد الجراحة
- بعد يوم واحد من عملية جراحية، ومراقبة الجراء، تأكد من أنه لا يوجد فرق بين الشام والمجموعات الجراحية، والاعتماد على عدد من الجراء لقياس معدل البقاء على قيد الحياة. إذا تم إجراء العمليات الجراحية بشكل صحيح، يجب أن تكون معدلات البقاء على قيد الحياة مماثل، وأكثر من 60٪ في كل من الشام والمجموعات الجراحية.
- عزلة القلب والتثبيت.
- الموت ببطء الجراء في أيام 1 و 2 بعد الجراحة عن طريق قطع الرأس واليوم 21 بعد الجراحة التي كتبها CO2 مع ضمان الموت خلع عنق الرحم، ثم تنظيف الصدر باستخدام 70٪ الإعدادية الكحول.
- شق الجلد خط الوسط وعضلات الصدر ثم فتح الصدر.
- استئصال قلوب كامل من التجويف الصدري وإصلاح القلب كامل من كل عينة في 5 مل من 4٪ لامتصاص العرق O / N في RT.
- في اليوم التالي، ونقل العينات إلى 70٪ من الإيثانول. ويمكن تخزين العينات لمدة أسبوع قبل البارافين التضمين.
- شريحة أقسام البارافين 5 ميكرون سميكة من خلال البطين كامل وأداء الهيماتوكسيلين القياسية ويوزين (H & E) وماسون ثلاثي الألوان تلطيخ لدراسة استجابة التجدد 5 و 7. وعلى وجه التحديد، يتم استخدام H & E صمة عار لدراسة استبدال العضلات ويستخدم ماسون ثلاثي الألوان وصمة عار لدراسة ردود تليفي 5.
- حدد مجال الاهتمام وانشاء ثلاثة على الأقل بؤر لكل عينة يدويا باستخدام ماسح ضوئي الشريحة. صورة وتحليل الشرائح تلطيخ في 40 × التكبير وفقا لتعليمات الشركة الصانعة مع المعلمات الافتراضية.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
الموت الرحيم كانت الجراء الماوس 1 و 2 و 21 يوما استئصال ما بعد القمي، وجمعت قلوبهم لH & E وماسون ثلاثي الألوان وصمة عار. اللون الأزرق في ماسون ثلاثي الألوان وصمة عار يشير إلى ترسب النخابية المصفوفة خارج الخلية 5. مع نجاح استئصال القمي، تتشكل جلطة الدم بشكل فعال لختم LV يوم واحد استئصال ما بعد القمي، كما هو مبين في الشكل 1A. ويلاحظ وجود ارتشاف التدريجي لتجلط الدم وتليف القلب في وقت مبكر، والاستعاضة عنها أنسجة عضلة القلب يحدث حتى تجدي...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
يظهر تجديد القلب إمكانية علاج قصور القلب والوقاية منه1 ، 2. لا غنى عن النماذج الحيوانية وتلعب دورا مهما في فهم كيفية حدوث تجديد القلب3-6. تقوم العديد من البرمائيات والأسماك بتجديد أنسجة القلب استجابة للإصابة ، مما يوفر نظرة ثاقبة لفهمنا لأمراض القلب والأوعية الدموية البشرية13 ، 14. ومع ذلك ، من حيث التطور ، يجب الحفاظ على الفيزيولوجيا المرضية بشكل أكبر بين نموذج الفأر والبشر. يعد تجديد القلب في نماذج الثدييات مجالا بحثيا جديدا نسبيا ولكنه مزدهر لعلاجات قصور القلب3-6.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
رعيت رسوم النشر لهذه المادة عن طريق هدية من أدوات العلوم الجميلة الدكتور جيان هوى.
شكر وتقدير
الكتاب أشكر الدكاترة. جيمس هوكينز، زو شي يو وشوان تشو من الوطني للقلب والرئة والدم المعهد (NHLBI) لمساعدتها مع جراحة الماوس وإعداد وتلطيخ أقسام البارافين. المؤلفون ممتنون لهيئة التحرير NIH الزملاء للمساعدة التحريرية.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| حاملات إبرة أولسن هيغار مع مقص ، أدوات | العلوم الدقيقة | 1.5 مم 12002-12 | |
| مقص زنبركي Vannas - 2 مم | أدوات العلوم الدقيقة | 15000-03 | مقص قزحية القزحية |
| معقم الخرز الساخن | أدوات العلوم الدقيقة | 18000-45 | |
| ملقط القزحية ، أدوات العلوم الدقيقة المستقيمة والمسننة | 11064-07 | ||
| ملقط القزحيةأدوات العلوم الدقيقة المنحنية والمسننة | 11065-07 | ||
| مقص الشيا - أدوات العلوم الدقيقة المنحنية / حادة / 12 سم | 14105-12 | ||
| ملقط ربط خياطة دائرية ، | أدوات العلوم الدقيقة | المستقيمة 18025-12 | |
| مقص زنبركي دائري مقص | العلوم الدقيقة | 15400-12 | |
| Fine Hemostat | 13007-12 | ||
| مصباح مكبر | Luxolamp Corp | IM120 | |
| مصباح التدفئة | Brandt Equipment LLC | 51152/3 | |
| 6-0 خيوط Prolene | Ethicon | 8889H | |
| لاصق الأنسجة اللاصق للجلد | 3M | 1469 | |
| أدوات تطبيق قطنية معقمة | Dynarex | 4305 | |
| WEBCOL وسادة تحضير الكحول | Covidien | 6818 | متوسطة 2 رقائق ، 200 / صندوق ، مشبعة ب 70٪ كحول الأيزوبروبيل |
| Curity الإسفنج لجميع الأغراض | Covidien | 9024 | غير المنسوجة 4 طبقات ، 4 "× 4" (10.2 سم & مرات ؛ 10.2 سم) |
| لوح واقي علوي من مقاعد البدلاء | KIMTECH SCIENCE | 7546 | 18 بوصة × 19.5 بوصة (45.72 سم × 49.53 سم) × 50 |
| 0.9٪ كلوريد الصوديوم ، 250 مل | Hospira Inc. | NDC 0409-6138-22 | |
| محلول البيتادين Swabsticks | منتجات بوردو LP | NDC 67618-153-03 | |
| الأوتوكلاف | تومي علم الأحياء الرقمي | SX-700 | معقم بالبخار عالي الضغط |
| ماسح ضوئي للشرائح | HAMAMATSU | NanoZoomer 2.0-RS |
المراجع
- Lin, Z., Pu, W. T. Strategies for cardiac regeneration and repair. Sci Transl Med. 6, 231-239 (2014).
- Xin, M., Olson, E. N., Bassel-Duby, R. Mending broken hearts: cardiac development as a basis for adult heart regeneration and repair. Nat Rev Mol Cell Biol. 14, 529-541 (2013).
- Mahmoud, A. I., Porrello, E. R. Turning back the cardiac regenerative clock: lessons from the neonate. Trends Cardiovasc Med. 22, 128-133 (2012).
- Porrello, E. R., Olson, E. N. A neonatal blueprint for cardiac regeneration. Stem Cell Res. 13, 556-570 (2014).
- Porrello, E. R., et al. Transient regenerative potential of the neonatal mouse heart. Science. 331, 1078-1080 (2011).
- Mahmoud, A. I., Porrello, E. R., Kimura, W., Olson, E. N., Sadek, H. A. Surgical models for cardiac regeneration in neonatal mice. Nat Protoc. 9, 305-311 (2014).
- Allen, T. C. Armed Forces Institute of Pathology. Hematoxylin and eosin. Laboratory methods in Histotechnology. Prophet, E. B., Mills, B., Arrington, J. B., Sobin, L. H. , American Registry of Pathology. Washington DC. 53-58 (1992).
- Andersen, D. C., Ganesalingam, S., Jensen, C. H., Sheikh, S. P. Do neonatal mouse hearts regenerate following heart apex resection? Stem cell reports. 2, 406-413 (2014).
- Kotlikoff, M. I., Hesse, M., Fleischmann, B. K. Comment on 'Do neonatal mouse hearts regenerate following heart apex resection?'. Stem cell reports. 3, 2(2014).
- Sadek, H. A., et al. Multi-investigator letter on reproducibility of neonatal heart regeneration following apical resection. Stem cell reports. 3, 1(2014).
- Andersen, D. C., Jensen, C. H., Sheikh, S. P., et al. Response to Sadek et al. and Kotlikoff et al. Stem cell reports. 3, 3-4 (2014).
- Phifer, C. B., Terry, L. M. Use of hypothermia for general anesthesia in preweanling rodents. Physiol Behav. 38, 887-890 (1986).
- Laflamme, M. A., Murry, C. E. Regenerating the heart. Nat Biotechnol. 23, 845-856 (2005).
- Laflamme, M. A., Murry, C. E. Heart regeneration. Nature. , 326-335 (2011).
- Jesty, S. A., et al. c-kit+ precursors support postinfarction myogenesis in the neonatal, but not adult, heart. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 13380-13385 (2012).
- Gonzalez-Rosa, J. M., Martin, V., Peralta, M., Torres, M., Mercader, N. Extensive scar formation and regression during heart regeneration after cryoinjury in zebrafish. Development. 138, 1663-1674 (2011).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
الوسوم
