Method Article

في وقت واحد ثنائي الفوتون في فيفو تصوير متشابك المدخلات والأهداف بعد المشبكي في اللحاء ماوس خلف الطحال

DOI:

10.3791/53528

⸱

March 13th, 2016

 ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular and Cellular Neuroscience, Nencki Institute of Experimental Biology, 2Department of Biochemistry, Nencki Institute of Experimental Biology, 3Neurobiology Centre, Nencki Institute of Experimental Biology

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يظهر هذا الفيديو إجراء بضع القحف الذي يسمح بالتصوير المزمن للخلايا العصبية في قشرة خلف الطحال للفأر باستخدام الفحص المجهري للفوتون في الجسم الحي في الخط المعدل وراثيا Thy1-GFP. يتم الجمع بين هذا النهج مع حقن الفيروس المرتبط بالغدة المعبر عن mCherry في الحصين الظهري. تسمح هذه التقنيات بمراقبة طويلة الأمد للدونة الهيكلية المعتمدة على الخبرة في RSC.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يظهر هذا الفيديو إجراء حج القحف الذي يسمح بالتصوير المزمن للخلايا العصبية في قشرة خلف الطحال للفأر (RSC) باستخدام الفحص المجهري ثنائي الفوتون في الجسم الحي في خط الفأر المعدل وراثيا Thy1-GFP. يخلق هذا النهج إمكانية للتحقيق في ارتباط التلاعب السلوكي بالتغيرات في مورفولوجيا الخلايا العصبية في الجسم الحي.

اعتبر إجراء زرع النافذة القحفية يقتصر فقط على مناطق القشرة التي يسهل الوصول إليها مثل حقل البرميل. يسمح نهجنا بتصور الخلايا العصبية في RSC شديد الأوعية الدموية. RSC هو عنصر مهم في دائرة الدماغ المسؤولة عن الذاكرة المكانية ، والذي كان يعتبر سابقا مشكلة في التصوير ثنائي الفوتون في الجسم الحي.

يتم دمج زرع النافذة القحفية فوق RSC مع حقن الفيروس المؤتلف المرتبط بالغدة (rAAVmCherry) في الحصين الظهري. ينتشر mCherry المعبر عنه إلى الإسقاطات المحورية من الحصين إلى RSC ، مما يتيح تصور التغييرات في كل من العروات المحورية قبل المشبكية والعمود الفقري التغصني بعد المشبكي في القشرة.

تسمح هذه التقنية بمراقبة طويلة الأمد للدونة الهيكلية المعتمدة على الخبرة في RSC.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ثورة ثنائي الفوتون المجهري مراقبة نشاط الدماغ في العيش والتصرف الحيوانات. منذ إطلاقها في عام 1990 وسرعان ما اكتسب شعبية ويتم تنفيذه الآن واحدة من الطرق الأكثر إثارة للاهتمام ومبتكرة من أجل النظر في جوانب عديدة من نشاط الدماغ في الجسم الحي 1،2. وتشمل هذه التطبيقات قياس تدفق الدم، وتنشيط الخلايا العصبية (على سبيل المثال، وذلك باستخدام مؤشرات مستوى الكالسيوم أو الجينات في وقت مبكر فورية التعبير) ومورفولوجيا الخلايا العصبية. عدد متزايد من المختبرات استخدام المجهر ثنائي الفوتون، وتنفيذ تقنية في جميع أنحاء العالم العلمي كمعيار جديد للتصوير في الجسم الحي الدماغ.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد وافق جميع الإجراءات التجريبية المبينة أدناه من قبل لجنة الأخلاقية المحلية في معهد نينكي البيولوجيا التجريبية، أكاديمية العلوم البولندية.

ملاحظة: يتم تسارع بعض المشاهد في الفيديو المرتبطة. يشار عامل السرعة في هذه المشاهد.

1. جراحة التحضير

  1. تعقيم جميع الأدوات والعبوات الزجاجية للسوائل ومسحات القطن في الأوتوكلاف. استخدام قفازات يمكن الاستغناء عنها. تنظيف طاولة الجراحة، والإطار التجسيمي وجميع المناطق الم....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

التعبير عن GFP في مجموعة فرعية من الخلايا العصبية في مراسل الماوس Thy1-GFP يسمح في التصوير المجراة من التشعبات القشرية والتوقعات محور عصبي المحلية في RSC. ويبين الشكل 1A أقصى الإسقاط من كومة من الصور مع العديد من التشعبات GFP إيجابية واضحة. تحجب خلايا الجسم عن طريق الشريان. ويبين الشكل 1B صورة أسرع طائرة واحدة (تقريب رقمي 3X) من فرع شجيري مبين في 1A. تفاصيل التشكل شجيري (العمود الفقري، أرجل كاذبة .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في هذه الورقة نقدم بروتوكول لفي وقت واحد ثنائي الفوتون في التصوير المجراة من مدخلات متشابك والأهداف بعد المشبكي في RSC من خلال نافذة في الجمجمة. تتكون إجراء زرع عدة خطوات رئيسية. أولا، هذا الحيوان هو تخدير عميق وثابت في إطار المجسم، ومن ثم ضعفت الجمجمة على RSC مع حفر على طول خطوط دائرية ملحوظ وإزالة العظام دائري. بعد توقف النزيف، يتم حقن rAAV2 / 1 mCherry في الحصين، ويتم إصلاح الغطاء الزجاجي في الجمجمة على منطقة حفر. وأخيرا يتم تأمين شريط التثبيت على ا.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب (KL، MR، KR) لديها حقوق لبراءات الاختراع في انتظار (PL410001) لإطار حامل المستخدمة في هذه المادة.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

فإن الكتاب أود أن أشكر السيد Steczkowski لتسجيلات صوتية، M. Borczyk للرسومات، A. Trąbczyńska لإنتاج الفيروس، M. Ziókowska عن التنميط الجيني وA. Mirgos للحصول على المساعدة مع التصوير. KR يعترف هدية النوع من الفيروس المؤتلف الغدة المرتبطة (rAAV) التعبير عن بروتين فلوري mCherry تحت سيطرة المروج CaMK من K. Deisseroth. تم تنفيذ هذا المشروع في المرافق الأساسية من مختبر النماذج الحيوانية ومختبر بنية الأنسجة وظيفة، مركز علم الأعصاب، معهد نينكي علم الأحياء التجريبي، مع استخدام البنية التحتية CEPT بتمويل من الاتحاد الأوروبي - صندوق التنمية الإقليمية الأوروبي في البرنامج التشغيلي "المبتكرة الاقتصاد" للفترة 2007-2013. وأيد هذا العمل من الم....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
<قوي>دواء< قوي>
إيزوفلورانباكسترAErrane 8DG96235-2٪ قبل الجراحة
IsofluraneBaxterAErrane 8DG96231.5-2٪ أثناء الجراحة
ديكساميتازونفحص الطبيب البيطريديكساسون 2 مجم / مل0.2 مجم / كجم في العضل
BaytrilBayer2.50٪5 مجم / كجم تحت الجلد
تولفيدينفيتوكينول4٪4 مجم / كجم تحت الجلد
بوتوميدورريختر فارما10 مجم / مل2 مجم / كجم تحت الجلد
كاربروفينKRKA-PolskaRycarfa 50 مجم / مل10 مجم / كجم تحت الجلد
ليدوكائينJelfaLignocainumموضعيا
ليدوكائينجلفا20 مجم / جمموضعيا
<قوي>الجراحة< / قوي>
GelfoamEthiconSpongostan الأسنان ؛ REF MS0005
مرهم العينDedraLubrithalموضعيا
CA الغراءPelikan Daniel20G Huste
أكريليك الأسنانSpofaDentalDuracryl Plus
إطار مجسمStoelting51500D
< قوي > أداة < / قوي >
غطاءهارفارد جهازHSE-64-07203 مم
مثقاب الأسنانSigmedKeystone KVet
شريط تثبيتمصنوعة حسب الطلب N / AM2 أو M3 يمكن استخدام
الملقطRenexPN-7B-SA
مقص صغيرFalconBM.183.180
تشريح مجهرKOZOXTL6445T
إطار <قوي > تصوير < / قوي >
حاملمخصص مجهرثنائي
الفوتونZeissتستقيم Axio Examiner Z1وحدة الليزر: حرباء متماسكة 690-1040 نانومتر مع مذبذب بصري بارامتري 1050-1300 نانومتر. الأهداف: EC-PLAN-NEUFLUAR 10x / 0.1 و LD Plan-APOCHROMAT 20x / 1.0. الكشف: مرشحات ممر النطاق الترددي Zeiss BP 500-550 (GFP) و BP 570-610 (mCherry) مفصولة بفاصل شعاع عند 560 نانومتر ومقترنة بكاشفين ضوئيين GaAsP.
<قوي > كاشف < / قوي >
هدية من K. Deisserothالفيروس المؤتلف المرتبط بالغدة (rAAV) الذي يعبر عن البروتين الفلوري mCherry تحت سيطرة محفز CaMK
قطر يمكن استخدام صواميل لولبية

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Grutzendler, J., Gan, W. B. Two-photon imaging of synaptic plasticity and pathology in the living mouse brain. NeuroRx. 3, 489-496 (2006).
  2. Svoboda, K., Yasuda, R. Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience. Neuron

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Two photon ImagingRetrosplenial CortexCranial Window ImplantationAAV InjectionThy1 GFP MicemCherry ExpressionHippocampal ProjectionsDendritic Spine ImagingSynaptic Plasticity MonitoringIn Vivo Microscopy

Related Articles