توليد كريسبر / Cas9 ساطة Monoallelic الحذف لدراسة وظيفة محسن في الخلايا الجذعية الجنينية الماوس

ملخص

من الأفضل التعامل مع التحقق التجريبي لنشاط المحسن من خلال تحليل فقدان الوظيفة. يتم تقديم بروتوكول فعال يستخدم الحذف بوساطة CRISPR / Cas9 لدراسة التنظيم الخاص بالأليل لنسخ الجينات في خلايا F1 ES التي تحتوي على جينوم هجين (Mus musculus¹²⁹ x Mus castaneus).

الملخص

تتحكم المعززات

في هوية الخلية من خلال تنظيم التعبير الجيني الخاص بالأنسجة بطريقة مستقلة عن الموضع والتوجيه. غالبا ما توجد هذه المعززات بعيدا عن الجين المنظم في المناطق بين الجينات أو حتى داخل جسم جين آخر. تجعل الطبيعة المستقلة للموضع لنشاط المحسن من الصعب مطابقة المعززات مع الجينات التي تنظمها. يوفر حذف منطقة المحسن دليلا مباشرا على نشاط المحسن وهو المعيار الذهبي للكشف عن دور المحسن في نسخ الجينات الداخلية. تم تجاوز طرق الحذف التقليدية القائمة على إعادة التركيب المتماثل من خلال التطورات الحديثة في تقنية تحرير الجينوم التي تتيح تغييرات سريعة ومحددة بدقة في جينومات العديد من الكائنات الحية النموذجية. يمكن استخدام تحرير الجينوم بوساطة CRISPR / Cas9 لمعالجة الجينوم في العديد من أنواع الخلايا والكائنات الحية بسرعة وفعالية من حيث التكلفة ، نظرا للسهولة التي يمكن بها استهداف Cas9 للجينوم بواسطة دليل الحمض النووي الريبي من بلازميد التعبير المخصص. قد يؤدي الحذف المتماثل اللواقح للعناصر التنظيمية الجينية الأساسية إلى الفتك أو تغيير النمط الظاهري الخلوي بينما يسمح الحذف أحادي الأليلات لمعززات النسخ بدراسة تنظيم رابطة الدول المستقلة للتعبير الجيني دون هذه المشكلة المربكة. يتم تقديم بروتوكول للحذف بوساطة CRISPR / Cas9 في الخلايا الجذعية الجنينية للفأر F1 (Mus musculus¹²⁹ x mus castaneus). يتم تسهيل الحذف والفحص وتحليل التعبير أحادي الأليلات من خلال تعدد أشكال النوكليوتيدات المفردة (SNP) بين الأليلين اللذين يحدثان في المتوسط كل 125 نقطة أساس في هذه الخلايا.

المقدمة

العناصر التنظيمية النسخي حاسمة لضبط المكانية والزمانية في التعبير الجيني خلال تنمية ⁽¹⁾ وتعديل هذه العناصر يمكن أن يؤدي إلى المرض بسبب التعبير الجيني الشاذة ^2. العديد من المناطق الأمراض المرتبطة حددها الجينوم الدراسات جمعية واسعة هي في مناطق غير الترميز ولها ميزات معززات النسخي ^3-4. تحديد القدرة ومضاهاتها مع الجينات التي تنظم معقدة لأنها غالبا ما تقع عدة kilobases بعيدا عن الجينات التي تنظم ويمكن تفعيلها بطريقة الأنسجة محددة ^5-6. وتستند توقعات محسن عادة على علامات هيستون تعديل، مجمعات للوسيط cohesin وملزمة من نوع معين الخلية عوامل النسخ ^7-10. وغالبا ما يتم التحقق من القدرة ....

البروتوكول

1. تصميم وبناء وgRNA

1. لحذف المناطق محسن النسخي استخدام اثنين gRNAs، واحد 5 "واحدة 3" في المنطقة من الفائدة. استخدام الماوس UCSC متصفح الجينوم المسار الناتجة عن المختبر تشانغ لتحديد تسلسل gRNA فريدة (http://www.genome-engineering.org ^15). التالي التحقق من هذه gRNAs وحزب الأصالة والمعاصرة المجاورة من أجل تعدد الأشكال وindels باستخدام أدوات الإنترنت التي تقدمها معهد سانجر (www.sanger.ac.uk/sanger/Mouse_SnpViewer/rel-1211) ^27-28. لاستهداف كل من الأليلات مع كفاءة متساوية، وتجنب gRNA متواليات / حزب الأصالة والمعاصرة التي تح....

النتائج

بروتوكول الموصوفة هنا يستخدم خلايا F1 ES لدراسة -regulation رابطة الدول المستقلة في التعبير الجيني في الخلايا محسن حذف monoallelic تم إنشاؤها باستخدام كريسبر / Cas9 تحرير الجينوم (الشكل 1). وgRNA وأليل معين التصميم التمهيدي لالتنميط الجيني والتعبير الجيني هي العوامل الرئيسية في هذا النهج. يجب التحقق من صحة كل مجموعة التمهيدي أليل معين عن طريق QPCR لتأكيد أليل خصوصية. الاشعال-أليل معين أن تضخيم فقط منها الهدف الحمض النووي ا.......

المناقشة

تقدم كريسبر / Cas9 تكنولوجيا التحرير الجينوم بوساطة طريقة واضحة وسريعة وغير مكلفة لتعديل الجينوم. طريقة مفصلة هنا لتوليد وتحليل حذف محسن monoallelic لتوصيف وظيفي محسن يستفيد من تعدد الأشكال في الخلايا F1 الماوس. من مزايا هذا النوع من النهج هي: 1) الحذف محسن monoallelic لا تنتج آثار الخلط الذي يحدث عند حذف محسن حاسم من كل من الأليلات، أي خفض كبير في مستويات البروتين من الجين المنظم يؤدي إلى الخلية الفتك أو تغييرها النمط الظاهري. 2) إذا كان تردد من حذف monoallelic منخفض الح.......

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
بوليميراز الحمض النووي عالي الدقة من Phusion	NEB	M0530S	عالي الدقة DNA polymerase المستخدم في تجميع gRNA
Gibson Assembly Master Mix	NEB	E2611L
gRNA_Cloning Vector	Addgene	41824	يتم استنساخ تسلسل مستهدف في هذا المتجه لإنشاء بلازميد gRNA
pCas9_GFP	Addgene	44719	SpCas9 و EGFP المحسن للكودون البلازميد
التعبير AflII	NEB	R0520S
EcoRI	NEB	R3101S
نظام نقل النيون 100 & مايكرو ؛ L Kit	Life Technologies	MPK10096	تقنية التعداء Microporator
prepGEM	ZyGEM	PT10500	كاشف استخراج الحمض النووي الجيني
Nucleo Spin Gel & PCR Clean-up	Macherey-Nagel	740609.5
طقم بلازميد صغير عالي	Geneaid	PD300
Maxi Plasmid Kit بدون سموم داخلية خالية من السموم الداخلية	أدوات التركيب التوليفية من Geneaid	PME25
SYBR ل CFX	Life Technologies	4472942	كاشف qPCR
iScript cDNA	Bio-rad	170-8891	كاشف النسخ العكسي
0.25٪ التربسين مع EDTA	Life Technologies	25200072
PBS بدون Ca / Mg 2 + < / sup>	Sigma	D8537
0.5 M EDTA	Bioshop	EDT111.500
HBSS	Life Technologies	14175095
1 M HEPES	Life Technologies	13630080
BSA fraction V (7.5٪)	Life Technologies	15260037
أقصى كفاءة DH5 & ألفا الخلايا المختصة	Invitrogen	18258012
FBS	ES المؤهلة		تخضع FBS لاختبار مسبق في خلايا ES للفأر لتعدد القدرات
DMSO	Sigma	D2650
Glutamax	Invitrogen	35050
DMEM	Life Technologies	11960069
Pencillin / Streptomycin	Invitrogen	15140
Sodium Pyruvate	Invitrogen	11360
غير ضروري أمينوحميد	Invitrogen	11140
& beta ؛ -mercaptoethanol	Sigma	M7522
96 بئر لوحة	Sarstedt	83.3924
شريط الختم	Sarstedt	95.1994
CoolCell LX	Biocision	BCS-405	حاوية تجميد الخلايا الخالية من الكحول
CHIR99021	Biovision	1748-5	مثبط لزراعة الخلايا F1 ES
PD0325901	Invivogen	inh-pd32	لثقافة الخلايا F1 ES
LIF		Chemicon ESG1107	لزراعة الخلايا F1 ES

المشترك السرعة مجموعة التركيبية مثبط مثبط