يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

جبل كله تشريح والمناعي من الكبار ماوس القوقعة

58.3K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/53561

⸱

يناير 1, 2016

 , 
1Department of Surgery, Division of Otolaryngology, Southern Illinois University, School of Medicine, 2Department of Pharmacology, Southern Illinois University, School of Medicine

في هذه المقالة

ملخص

نقدم طريقة لعزل الجهاز الكبار كورتي كما ثلاث لفات سليمة قوقعة (قمة، والمتوسطة، وقاعدة). علينا أيضا أن يبرهن على وجود إجراءات المناعية مع الأجسام المضادة الموسومة fluorescently. معا هذه التقنيات تتيح دراسة خلايا الشعر والخلايا الداعمة، وأنواع الخلايا الأخرى الموجودة في القوقعة.

الملخص

يحتوي عضو كورتي ، الموجود في قوقعة الأذن الداخلية ، على خلايا شعر حسية ميكانيكية وخلايا داعمة محيطة منظمة في شكل حلزوني ولها تدرج توتوني للكشف عن الصوت. يبلغ طول قوقعة الفأر حوالي 6 مم وغالبا ما تنقسم إلى ثلاث لفات (قمة ووسط وقاعدة) للتحليل. للتحقيق في فقدان الخلايا أو انقسام الخلايا أو التعبير الجيني الفسيفسائي ، يكون التركيب الكامل للقوقعة أو التحضير السطحي مفيدا. تسمح طريقة التشريح هذه بتصور جميع الخلايا داخل عضو كورتي عند دمجها مع التلوين المناعي والفحص المجهري متحد البؤر لتصوير الخلايا على مستويات مختلفة في المحور z. يمكن أيضا الحصول على مقاطع عرضية بصرية متعددة من صور z-stack هذه. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن استخدام طريقة تشريح التثبيت بالكامل لمسح المجهر الإلكتروني ، على الرغم من الحاجة إلى طريقة تثبيت مختلفة. هنا ، نقدم طريقة لعزل عضو كورتي كثلاث منعطفات قوقعة صناعية سليمة (القمة والوسط والقاعدة). يمكن استخدام هذه الطريقة للفئران التي تتراوح من أسبوع واحد من العمر حتى مرحلة البلوغ وتختلف عن التقنية المستخدمة في عينات حديثي الولادة حيث يكون تكلس القوقعة غير مكتمل. يمكن استخدام نسخة معدلة قليلا لتشريح قوقعة الفئران. نعرض أيضا إجراء للتلوين المناعي بالأجسام المضادة الموسومة بالفلورسنت.

المقدمة

القوقعة على شكل حلزوني في الأذن الداخلية، الواردة في العظم الصدغي، ويوجد في جهاز كورتي، والسمعي الجهاز نهاية الحسي في الثدييات. ويتم تنظيم القوقعة tonotopically وتنقسم عادة إلى قمية، والمتوسطة، والقاعدية يتحول الموافق المناطق ترددية مختلفة مع الكشف عن الصوت عالية التردد في قاعدة وانخفاض الكشف عن التردد في قمة 1. خلايا الشعر، خلايا ميكانيكية حسية من جهاز كورتي، تشغيل طول القوقعة، وهو ما يقرب من 6 مم طويل في الفئران 2،3. هذه الخلايا بتحويل الطاقة الميكانيكية من الموجات الصوتية التي تنتقل عن طريق التيه الغشائي مملوءة بسائل، إلى إشارات العصبية التي تتم معالجتها من قبل هياكل السمعية المركزية. تقنية الموضحة هنا يوفر طريقة لتحضير يتصاعد كاملة من جهاز كورتي بعد تكلس القوقعة كاملة (للعينات تتراوح بين أسبوع واحد من العمر إلى سن البلوغ). كما نقدم طريقة لimmunostaining كلها محمولة على الأنسجة القوقعة. يتصاعد كلها قوقعة حاسمة لرؤية جميع خلايا الشعر والخلايا المحيطة دعم في الترتيبات المكانية الطبيعية وتسمح للتحليل في ثلاثة أبعاد باستخدام المجهر متحد البؤر.

د. هانز انجستروم وهارلو عدس وصف في الأصل كله جبل طريقة تشريح قوقعة الأذن في عام 1966. وهي المفصل تقنية لإصلاح سريع وتشريح قوقعة متكلسة المغمورة في السائل من مجموعة متنوعة من الثدييات، والحفاظ على شرائح سليمة قصيرة من جهاز كورتي عن التحليل المجهري 4. كما تم توضيح وتشريح لغير المثبتة، متكلسة القوقعة الفئران في شريط فيديو تعليمي 5. د. قدمت باربرا Bohne وغاري هاردينغ في جامعة واشنطن عدة تعديلات هامة لهذا الأسلوب. في النسخة الخاصة من طريقة جبل كامل القوقعة، وكان العظم الصدغي decalcified، جزءا لا يتجزأ من البلاستيك، وكانت خمس نصف المنعطفات أو عشرة ربع يتحول dissecتيد 6،7. الدكتور تشارلز ليبرمان وزملاؤه في مختبرات بيبودي إيتون، ماساتشوستس العين والأذن المستوصف، تعديل هذه التقنية لذلك لم يكن مطلوبا أن التضمين البلاستيك 8. حدث مزيد من التعديل للتقنية في مختبر الدكتور جيان تسوه في مستشفى سانت جود للاطفال البحوث 12/09 الذي أبلغ طريقة تشريح المقدمة هنا. نحن نستخدم استراتيجية مختلفة للوصول إلى جهاز كورتي من Bohne وليبرمان، والذي يسمح عزل قمي كاملة، والمتوسطة، والمنعطفات القاعدية. وهكذا فإن تشريح الأنسجة أكبر وأقل عرضة للالمفقودة أو التالفة أثناء عمليات تشريح أو المناعية. وبالإضافة إلى ذلك، فإن الطريقة الحالية يسهل قياس المسافة من طرف القمي أو ربط القاعدية لتعريف المنطقة التردد.

على الرغم من أن العديد من المعامل أداء المناعية للأنسجة القوقعة، فمن غير الواضح أين نشأت هذه الطريقة. ونتيجة لذلك هناك وصفات مختلفة لمنع العازلهالتمرير ومخازن الأجسام المضادة الحضانة التي قد تؤثر على أداء الأجسام المضادة الأولية الفردية. هنا، نقدم طريقة واحدة لالمناعية مع الأجسام المضادة الموسومة fluorescently التي تنطبق على الأجسام المضادة الأكثر استخداما في مجال السمعي.

شكل معقد من القوقعة، هيكل الدقيق للجهاز كورتي، وتغطية عظمي توفر تحديا للتحليل النسيجي والبيوكيميائية. وتستخدم مجموعة متنوعة من التقنيات حاليا في مجال السمع للتغلب على هذه الميزات صعبة وتصور الخلايا داخل جهاز كورتي، كل أسلوب مع مزاياه وعيوبه. بروتوكول المعروضة هنا يسمح لكامل تشريح جبل القوقعة الماوس الكبار و، مع تعديل طفيف، يمكن أن يحتمل أن تستخدم لدراسة الهياكل الحيوية داخل قوقعة من مجموعة متنوعة من الكائنات النموذج الأخرى المستخدمة في هذا المجال.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

بيان الأخلاق: إجراءات التي تجرى على الحيوانات قد وافقت عليها رعاية الحيوان واللجنة المؤسسية استخدم في جامعة جنوب إلينوي الطب.

1. استخراج الزمني العظام

  1. تحديد عظام الزمنية في قاعدة الجمجمة الماوس 13 وكشط بعيدا الأعصاب القحفية باستخدام ملقط نمط القياسية.
  2. وضع ملقط نمط القياسية في غيض من الكبسولة أذني ومع الإبهام من المعاكس جهة ضغط لأسفل على الخلفية القناة الهلالية لإزاحة القوقعة مغلفة.
  3. تحرير النصف السفلي من العظم الصدغي من الجمجمة يدويا مع الإبهام والسبابة أو باستخدام 10.5 سم مقص غرامة.

2. بعد إصلاح الزمني العظام

  1. وضع العظام الزمنية إلى 2 مل أنابيب microcentrifuge تحتوي على 250-500 ميكرولتر بارافورمالدهيد 4٪ (PFA) المخفف في الفوسفات 10 ملي المالحة (PBS) ودرجة الحموضة 7.4 وincubيأكلون في RT ل2-20 ساعة.
    ملاحظة: لا حاجة لفتح الغطاء القمي أو حقن PFA الى الدور أو النافذة البيضوية. نوصي باستخدام الميثانول الحرة، فائقة نقية، المجهر الإلكتروني (EM) الصف PFA التي يمكن شراؤها عند تركيز 16٪ في قوارير زجاجية. بمجرد فتح القارورة والمخفف 1: 4 في برنامج تلفزيوني، مما يجعل حل 4٪، ويمكن استخدامها لمدة تصل إلى 2 أسابيع عند تخزينها في 4 درجة مئوية (بعض الأجسام المضادة تتطلب تثبيت القصير وغيرها يمكن أن يتسامح مع O / N (O / N) التثبيت).

3. يزيل الكلس الزمني العظام

  1. بعد التثبيت، وإزالة PFA باستخدام ماصة واستبدالها مع 120 ملم ثنائي أمين الإيثيلين رباعي حمض الخل (EDTA)، ما يزيد قليلا عن 2 مل. تأكد من ملء كامل 2 مل أنبوب microcentrifuge لمنع فقاعات الهواء عند إغلاق الأنبوب.
    1. إن لم يكن مزيل للكلس على الفور، استبدال PFA مع 10 ملي PBS الرقم الهيدروجيني 7.4 وتخزين العينات عند 4 درجة مئوية.
      ملاحظة: بعد التثبيت، والعظام الزمنية يمكن تخزينها لvariabلو يرقى وقت قبل زوال الكلس اعتمادا على مولدات المضادات يجري بحثها.
  2. مكان الأنابيب في نهاية الإفراط في نهاية المدورة وتناوب على 4 دورة في الدقيقة في RT. تغيير الحل EDTA يوميا باستخدام ماصة. طول زوال الكلس يعتمد على عمر العينة وتفضيل للعالم القيام تشريح.
    1. احتضان العظام الزمنية في EDTA باستخدام المبادئ التوجيهية التالية لمرات الحضانة:
      للحصول على عينات يوم بعد الولادة (P) 8 إلى P15: 2-4 ساعة. للحصول على عينات P15 P21 إلى: O / N؛ للحصول على عينات P21 P30 ل: 2 O / N؛ للحصول على عينات قديمة من P30: 3 أو أكثر O / N.
      ملاحظة: مرات زوال الكلس تخضع لتفضيل المستخدمين ويمكن تمديدها حسب الحاجة. الوقت زوال الكلس يمكن الحد من تغيير الحل EDTA مرتين في اليوم، حوالي 8 ساعة على حدة. بعض المعامل إضافة 1٪ PFA إلى حل EDTA عندما مزيل للكلس لمدة أطول من 3 أيام لمنع التلوث.
  3. لتحديد ما إذا كان decalcified العينة بشكل كاف، ضع العظام الزمنية سالمغلفة المطاط الصناعي غ السيليكون طبق تشريح واضغط بلطف ملقط على القوقعة على شكل الحلزون. إذا كانت الأنسجة spongey، ثم زوال الكلس كاملة.
  4. مرة واحدة زوال الكلس اكتمال إزالة EDTA باستخدام ماصة وإضافة 500 -1000 ميكرولتر من 10 ملي PBS الرقم الهيدروجيني 7.4. مخزن العينات في 4 درجة مئوية حتى جاهزة للتشريح.

4. إنشاء سيليكون المرنة المغلفة طبق تشريح

  1. الجمع بين القاعدة وعلاج وكيل لencapsulant عدة سيليكون المطاط الصناعي وفقا لتعليمات الشركة الصانعة وتخلط جيدا.
  2. إضافة حوالي 2-3 ملاعق من مسحوق الفحم حتى حل والأسود وتخلط جيدا.
    ملاحظة: الحبر السائل أو الفحم السائل لا يختلط مع الحل والتي لا يمكن استخدامها. سيليكون المطاط الصناعي مجموعات encapsulant يمكن شراؤها في الأسود، مما يسمح خطوة 4.2 إلى أن يتم حذف.
  3. صب الحل في 60 ملم الزجاج أو البلاستيك أطباق بتري، وملء ما يكفي لمعطف أسفل. إذا بوbbles موجودة، نفخة مع الهواء على السطح. اسمحوا الوقوف لا يقل عن 24 ساعة على RT لتعيين.
    ملاحظة: أطباق المغلفة المطاط الصناعي سيليكون يمكن استخدامها مرارا وتكرارا لسنوات. ولكن لا تستخدم الإيثانول لتنظيف، وهذا سوف يسبب الاستومر سيليكون للقضاء.

5. الجامع جبل تشريح القوقعة (لP7 وعينات أقدم)

  1. فصل بدوره القاعدية من المنعطفات المتوسطة / قمي
    1. مكان واحد العظم الصدغي decalcified في طبق تشريح المغلفة المطاط الصناعي سيليكون شغل ثلثي كامل مع 10 ملم PBS الرقم الهيدروجيني 7.4 واستخدام المجهر تشريح ستيريو للخطوات التالية.
    2. عقد العظم الصدغي في المنطقة الدهليزي مع # 4 أو 5 # ملقط صائغ التوالي وباستخدام 5 ملم مقص الربيع Vannas-توبنجن، وقطع بعيدا الزائدة الأنسجة كبسولة أذني على طول الجانبين وفوق قمة.
    3. باستخدام 2.5 ملم مقص الربيع Vannas، إدراج شفرة واحدة في إطار بيضاوي وجعل العديد من الجروح الصغيرة على طول دوامة الرباط / جانبيجدار بدوره القاعدية.
    4. استخدام 5 مم Vannas-توبنجن مقص الربيع، إدراج شفرة واحدة في المنطقة مجرد قطع ووضع شفرة أخرى على خارج العظم الصدغي، وسطي إلى إطار بيضاوي. هذا الخفض يفصل بدوره القاعدية من المنعطفات المتوسطة وقمي.
  2. تشريح كامل للبدوره القاعدية.
    1. باستخدام 2.5 ملم مقص الربيع Vannas، وقطع الألياف العصبية دوامة العقدة التي تتصل عماد القوقعة للافراج عن التوتر في المقابل القاعدية وقطع تحت بدوره القاعدية لفصل من أجهزة الدهليزي.
    2. باستخدام 2.5 ملم مقص الربيع Vannas، وجعل سلسلة من الجروح الصغيرة لإزالة دوامة الرباط / الجدار الجانبي من كل من فوق وتحت جهاز كورتي. استخدام رقم 4 أو 5 # ملقط صائغ التوالي لتوجيه الأنسجة. دبوس الألياف العصبية دوامة العقدة للسيليكون المغلفة المطاط الصناعي طبق تشريح، ولكن لا نحتفظ في هذه المنطقة مثل الأنسجة والمسيل للدموع.
    3. خلال الخطوات السابقة، بعض MEMBRAN رايسنروغالبا ما يتم إزالتها ه. إن وجدت لا يزال، فهم غشاء رايسنر مع ملقط # 4 أو 5 # الجواهري على التوالي، وسحب بعيدا عن جهاز كورتي.
      ملاحظة: الغشاء السقفي نادرا ما المرئي ويطفو عادة بعيدا دون الحاجة إلى خطوة محددة لإزالة.
    4. وأخيرا إجراء عدة تخفيضات للحد من سمك المحاور دوامة العقدة، لجعل بدوره شقة قدر الإمكان واستخدام رقم 4 أو # 5 ملقط صائغ التوالي لنقل بدوره القاعدية تشريح، من خلال استيعاب المحاور المتبقية من العقدة الحلزونية، ل لوحة 48-جيدا (أو غرفة الشرائح) التي تحتوي على ~ 500 ميكرولتر من 10 ملي PBS الرقم الهيدروجيني 7.4.
  3. وسط منفصل والمنعطفات قمي
    1. وضع ما تبقى من ثلثي القوقعة، الجانب قمي أسفل.
    2. باستخدام 2.5 ملم مقص الربيع Vannas، إدراج شفرة واحدة في وسائل الإعلام سكالا حيث منعطف الأوسط تستخدم ليكون متصلا بدوره القاعدية، وجعل العديد من الجروح الصغيرة على طول دوامة الرباط / الجدار الجانبي من الالبريد بدوره الأوسط.
    3. استخدام 5 مم Vannas-توبنجن مقص الربيع، إدراج شفرة واحدة في المنطقة مجرد قطع مع مطلع المتوسطة وضعت على رأس النصل، ووضع شفرة أخرى في الخارج المتاهة عظمي، في 90 س زاوية من طرف القمي. هذا يفصل بدوره المتوسطة من مطلع القمي.
  4. تشريح كامل للبدوره المتوسطة بطريقة مشابهة للبدوره القاعدية (انظر الخطوات 5.2.2 إلى 5.2.4).
  5. تشريح كامل للبدوره القمي.
    1. باستخدام 2.5 ملم مقص الربيع Vannas، فتح الغطاء الذي يغطي بدوره القمي. تشريح كامل بطريقة مشابهة للبدوره القاعدية (انظر الخطوات 5.2.2 إلى 5.2.4).
      ويمكن تخزين تشريح يتحول القوقعة في 10 ملي PBS الرقم الهيدروجيني 7.4 في لوحة 48-جيدا (أو غرفة الشرائح) في 4 درجة مئوية لعدة أسابيع قبل المناعية: ملاحظة. ومع ذلك PBS سوف تتبخر ويحتاج إلى تجديد دوري وتخزين أطول من 2-3 أسابيع يمكن أن يؤدي إلى نمو البكتيريا أو الفطريات علىالأنسجة التي يمكن أن تقلل من جودة الصورة. نوصي التخزين على المدى الطويل من العينات وundissected العظام الزمنية.

6. المناعية مع الموسومة fluorescently الأجسام المضادة

  1. بعد التشريح، وتخزين كل بدوره القوقعة في بئر مستقل في لوحة 48-جيدا (أو غرفة الشريحة)، غارقة في ~ 500 ميكرولتر من 10 ملي PBS الرقم الهيدروجيني 7.4. لكل من الخطوات التالية يجب أن يغطس في المقابل القوقعة في السائل، لا تطفو على أعلى أو تمسك إلى جانب البئر.
    ملاحظة: عند إزالة السائل من كل جانب، فمن السهل أن تفقد يتحول قوقعة أو تمتص منه في الطرف ماصة. سوف تغير حلول مع ماصة 200 ميكرولتر باستخدام نطاق تشريح تساعد على منع ذلك.
  2. باستخدام ماصة، وإزالة PBS من كل بئر واستبدالها مع ~ 200-300 ميكرولتر لكل بئر من عرقلة / حل permeabilization (1٪ تريتون X-100، 1٪ ألبومين المصل البقري (BSA)، و 10٪ مصل الماعز العادي (خ ع) مخففة في 10 ملي PBS صH 7.4). احتضان 1 ساعة عند RT على محور دوار 3D.
    ملاحظة: إذا تم إجراء أي الأجسام المضادة الأولية المستخدمة في مجموعة الماعز، وبعد ذلك سوف تكون هناك حاجة إلى الأجسام المضادة لمكافحة الماعز الثانوي وNGS يجب أن لا تستخدم لأي من الخطوات. طبيعي مصل الحصان يمكن استخدامها كبديل للNGS.
  3. إزالة حجب / حل permeabilization باستخدام ماصة واستبدالها مع ~ 100 ميكرولتر لكل بئر من حل الأجسام المضادة الأولية (0.1٪ تريتون X-100، 1٪ BSA، و 5٪ NGS مخففة في 10 ملي PBS درجة الحموضة 7.4). عامل تخفيف لكل الأجسام المضادة الأولية يختلف. احتضان O / N (الحد الأدنى 14 ساعة) عند 4 درجة مئوية على محور دوار 3D.
    ملاحظة: إذا تم استخدام الأجسام المضادة الأولية أكثر من واحد، كل يمكن دمجها في نفس الحل للحضانة، فقط للتأكد من أن كل الأجسام المضادة الأولية لديها مجموعة مختلفة.
  4. إزالة حل الأجسام المضادة الأولية باستخدام ماصة وتنفيذ 3 يغسل من 10 ملي PBS الرقم الهيدروجيني 7.4 في ~ 500 ميكرولتر لكل بئر. كل غسل الحضن لا تقل عن 5 دقائق على RT على محور دوار 3D.
  5. إزالة P مشاركةBS غسل باستخدام ماصة واستبدالها مع ~ 100 ميكرولتر لكل بئر من حل الضد الثانوية (0.1٪ تريتون X-100، 1٪ BSA، و 5٪ NGS مخففة في 10 ملي PBS درجة الحموضة 7.4). عامل تخفيف لكل الموسومة fluorescently الضد الثانوية عادة 1: 500 أو 1: 1000. وضع لوحة 48-جيدا في مربع أسود لحماية الموسومة fluorescently الأجسام المضادة الثانوية من الضوء. احتضان 2-3 ساعة على RT على محور دوار 3D.
    ملاحظة: إذا كانت هناك حاجة الأجسام المضادة الثانوية أكثر من واحد، فإنها يمكن أن تكون مجتمعة في نفس الحل للحضانة. تأكد من عدم وجود إمكانية عبر وضع العلامات (على سبيل المثال، وذلك باستخدام الماعز المضادة للأرنب والدجاج مكافحة الماعز الأجسام المضادة الثانوية)
  6. إزالة حل الأجسام المضادة الثانوية باستخدام ماصة وتنفيذ 3 يغسل من 10 ملي PBS الرقم الهيدروجيني 7.4 في ~ 500 ميكرولتر لكل بئر. احتضان كل غسل مدة لا تقل عن 5 دقائق على RT على محور دوار 3D. إبقاء لوحة 48-جيدا في الصندوق الأسود للحماية من الضوء.
  7. إزالة الماضي غسل PBS باستخدام ماصة واستبدالها مع ~ 100 ميكرولتر لكل بئر من HoecHST 33342 (المخفف 1: 2000 في 10 ملي PBS درجة الحموضة 7.4) لتسمية النوى. احتضان 15-20 دقيقة في RT على محور دوار 3D. إبقاء لوحة 48-جيدا في الصندوق الأسود للحماية من الضوء. لا NOT احتضان أطول من 20 دقيقة.
  8. إزالة حل هويشت باستخدام ماصة وتنفيذ 3 يغسل من 10 ملي PBS الرقم الهيدروجيني 7.4 في ~ 500 ميكرولتر لكل بئر. احتضان كل غسل مدة لا تقل عن 5 دقائق على RT على محور دوار 3D. إبقاء لوحة 48-جيدا في الصندوق الأسود للحماية من الضوء.
  9. جميع الخطوات التي يمكن مدها إلا هويشت الحضانة، لعدة ساعات إذا لزم الأمر. لإيقاف التفاعل في أي مرحلة، فقط غمر العينات في ~ 500 من المجاهدين 10MM PBS pH7.4 وتخزين لوحة 48 -well (أو الشرائح غرفة) في 4 درجة مئوية لتصبح جاهزة لاستئناف ساعات بروتوكول أو 1-2 أيام في وقت لاحق .

7. جبل القوقعة يضيء الشرائح

  1. التسمية الشرائح مع المعلومات ذات الصلة حول العينة والأجسام المضادة المستخدمة.
  2. ماصة ~ 50 ميكرولتر من وسائل الاعلام المتزايدة على كل شريحة وتوخي الحذرلمنع الفقاعات. أجهزة الطرد المركزي الأنبوب الذي يحتوي على وسائل الاعلام متزايدة لإزالة أي فقاعات.
  3. باستخدام # 4 أو ملقط # 5 الجواهري على التوالي، وفهم محاور من العقدة الحلزونية لنقل بلطف بدوره قوقعة واحدة من لوحة 48-جيدا إلى الشريحة ومكان في وسائل الإعلام في تصاعد مستمر. جبل احد بدوره قوقعة لكل شريحة لمنع التعرض للضوء وphotobleaching من خلال عملية التصوير.
  4. استخدام مجهر تشريح ستيريو لضمان بدوره قوقعة لا مطوية، الملتوية، أو بالقرب من فقاعة الهواء. إذا كان أي من هذه الشروط تحدث، ملقط استخدام رقم 4 أو 5 # صائغ الثابت لإعادة وضع بدوره القوقعة.
  5. وضع واحدة من نهاية ساترة على الشريحة وإطلاق سراح بلطف لتسقطوا ساترة.
  6. استخدام مجهر تشريح ستيريو لضمان بدوره قوقعة لا مطوية، الملتوية، أو بالقرب من فقاعة الهواء. إذا كان أي من هذه الشروط تحدث، تحرك بلطف ساترة ذهابا وإيابا لإعادة بدوره القوقعة.
  7. مكان الشرائحفي مجلد الشريحة بحيث وضع مسطح. السماح تصاعد علاج وسائل الإعلام O / N في RT (نضع في الظلام)
  8. ختم coverslips مع طلاء الأظافر واضح وتخزينها في RT أو -20 س C حتى تصوير. ويمكن تخزين الشرائح في مجلد الشريحة أو الشرائح مربع.
    ملاحظة: يمكن تخزين الشرائح على المدى الطويل عند -20 درجة مئوية أو -80 س C ومضان أن يستمر لعدة أشهر.
  9. شرائح الصور باستخدام المجهر متحد البؤر مع الطول الموجي المناسب استنادا إلى الأجسام المضادة الثانوية استخدامها أثناء إجراء المناعية. لا يمكن أن يؤديها السطوع والتباين التعديلات باستخدام برامج التصوير التي تقدمها بائع متحد البؤر.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

نقدم طريقة لعزل جهاز كورتي كما ثلاث لفات سليمة قوقعة (قمة، والمتوسطة، وقاعدة) من الأنسجة القوقعة التي هي متكلسة، مع خطوات تشريح الرئيسية الواردة في الشكل 1. وخلال أول أسبوع بعد الولادة للتنمية، تكلس الماوس القوقعة غير مكتملة وطريقة تشريح أكثر بساطة يمكن استخدام 13. باستخدام جبل بأكمله طريقة تشريح حديثي الولادة مع القوقعة من P7 والنتائج الفئران الأكبر سنا في البكاء والتمزيق من جهاز كورتي. والآن يعلق دوامة...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

هناك العديد من الخطوات الهامة لنجاح كامل تشريح جبل والمناعية. ولكن قبل أن يتم إجراء أي من هذه الطرق، هناك حاجة إلى تثبيت السليم للأنسجة القوقعة. نوصي باستخدام الميثانول الحرة، نقي للغاية، EM الصف PFA. PFA مصنوعة من مسحوق يمكن أن يكون لها آثار الميثانول ودرجة الحموضة غير مستقرة مما يقلل من جودة المناعي. وقد أظهرت المجموعات الأخرى أيضا أن تشريح مماثلة ممكنة باستخدام المثبتات التي لا تحتوي على الفورمالديهايد 14-16. طول التثبيت هو أيضا مهم وغير محددة الأجسام المضادة. ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

تم دعم هذا العمل جزئيا بمنحة من مكتب البحوث البحرية (N000141310569). تم دعم معدات مرفق التصوير البحثي بكلية الطب بجامعة جنوب إلينوي من قبل المركز الوطني لموارد البحوث والصحة (S10RR027716).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
يمكن شراء ملقط نمطأدوات العلومالدقيقة 11000-12من بائعين آخرين
مقص ناعم 10.5 سميمكن شراء أدوات العلومالدقيقة 14060-11من بائعين آخرين يمكن
أنابيب الطرد المركزي الدقيقة 2 ملMidSciAVSS2000من بائعين آخرين
16٪ فورمالديهايد ، خالي من الميثانول ، نقي للغاية ، من الدرجةالأولى Polysciences18814سام - ارتد قفازات ولا يمكن التخلص منها في الحوض. يمكن شراؤها من بائعين آخرين. 
PBS الرقم الهيدروجيني 7.4 شراء SigmaP3813-10PAKمن بائعين آخرين يمكن
شراء EDTAFisherBP118-500من بائعين آخرين يمكن
دوار الأنبوب النهائيفيشر05-450-127من بائعين آخرين يمكن
طبق بتري 60 مميمكن شراء طبق بتري فيشر50-202-037من بائعين آخرين
مجموعة مغلفات سيليكون Dow Corning Sylgard 184Ellsworth المواد اللاصقة184 SIL ELAST KIT 0.5 كجم
الفحم المنشطشراء AC134372500فيشرمن بائعين آخرين يمكن
مجهر تشريح ستيريوZeissStemi 2000من بائعين آخرين
Dumont # 4 ملقط المجوهراتأدوات العلوم الدقيقة11241-30
Dumont # 5 ملقط صائغأدوات العلوم الدقيقة11251-20
2.5 مم مقص زنبركي Vannasأدوات العلوم الدقيقة15001-08منحني & nbsp ؛
مقص زنبركي 5 مم Vannas-Tubingenأدوات العلوم الدقيقة15003-08ألواح
مستقيمة 48 بئرايمكن شراء Fisher08-772-52من بائعين آخرين شرائح
غرفة 8 آباريمكن شراء 1256518 فيشرمن بائعين آخرين يمكن
شراء Triton X-100SigmaX100-500من بائعين آخرين
BSA ، الكسر الخامسBP1605من بائعين آخرين يمكن
مختبرات NGSVectorS-1000من بائعين آخرين يمكن
مختبراتNHSS-2000من بائعين آخرين يمكن
3D RotatorMidsciR3D-710من بائعين آخرين صندوق
حضانة اللطخة الغربية XLLicor929-97401
يمكن شراء Hoechst 33342Life TechnologiesH3570من بائعين آخرين
إطالة وسائل الإعلام المضادة للبهتان الذهبيةيمكن شراء Life TechnologiesP36930من بائعين آخرين ، لكن وسائط التركيب تختلف في قدرتها على الحماية من التبييض الضوئي
يمكن شراء Superfrost PlusSlides Fisher12-550-15البائعين الآخرين
22 × 22 × 1فيشر12-548-Bيمكن شراؤها من بائعين آخرين طلاء
أظافر شفافالأدوية المحليمن بائعين آخرين مجلد
شرائح من الورق المقوىيمكن شراءفيشر 12-587-10من بائعين آخرين
صندوق شرائح بلاستيكييمكن شراء فيشر03-448-10من بائعين آخرين
قياسي شراء يمكن شراء شراء يمكن شراء يمكن شراء Fisher شراء شراء Vector شراء من أغطية يمكن شراء متجر

المراجع

  1. Robles, L., Ruggero, M. A. Mechanics of the mammalian cochlea. Physiol Rev. 81 (3), 1305-1352 (2001).
  2. Ehret, G., Frankenreiter, M. Quantitattive analysis of cochlear structures in the house mouse in relation to mechanisms of acoustical information processing. J Comp Physiol. 122, 65-85 (1977).
  3. Ou, H. C., Bohne, B. A., Harding, G. W. Noise damage in the C57BL/CBA mouse cochlea. Hear Res. 145 (1-2), 111-122 (2000).
  4. Engstrom, H., Ades, H. W., Andersson, A. Structural pattern of the organ of Corti. A systematic mapping of sensory cells and neural elements. , Almqvist and Wiksell. (1966).
  5. Grant, L., Yi, E., Goutman, J. D., Glowatzki, E. Postsynaptic Recordings at Afferent Dendrites Contacting Cochlear Inner Hair Cells: Monitoring Multivesicular Release at a Ribbon Synapse. J Vis Exp. (48), e2442(2011).
  6. Bohne, B. A., Harding, G. W. Processing and analyzing the mouse temporal bone to identify gross, cellular and subcellular pathology. Hear Res. 109 (1-2), 34-45 (1997).
  7. Bohne, B. A., Harding, G. W., Ou, H. C. Handbook of Mouse Auditory Research. Willott, J. , CRC Press. 171-187 (2001).
  8. Eaton-Peabody Laboratories. Video Tutorial for Cochlear Dissection. , Massachusetts Eye and Ear. Available from: http://www.masseyeandear.org/research/otolaryngology/investigators/laboratories/eaton-peabody-laboratories/epl-histology-resources/video-tutorial-for-cochlear-dissection/ (2015).
  9. Weber, T., et al. Rapid cell-cycle reentry and cell death after acute inactivation of the retinoblastoma gene product in postnatal cochlear hair cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (2), 781-785 (2008).
  10. Yu, Y., et al. In vivo proliferation of postmitotic cochlear supporting cells by acute ablation of the retinoblastoma protein in neonatal mice. J Neurosci. 30 (17), 5927-5936 (2010).
  11. Steigelman, K. A., et al. Polycystin-1 Is Required for Stereocilia Structure But Not for Mechanotransduction in Inner Ear Hair Cells. J Neurosci. 31 (34), 12241-12250 (2011).
  12. Liu, Z., et al. Age-dependent in vivo conversion of mouse cochlear pillar and Deiters' cells to immature hair cells by Atoh1 ectopic expression. J Neurosci. 32 (19), 6600-6610 (2012).
  13. Parker, M., Brugeaud, A., Edge, A. S. Primary culture and plasmid electroporation of the murine organ of Corti. J Vis Exp. (36), e1685(2010).
  14. Burns, J. C., On, D., Baker, W., Collado, M. S., Corwin, J. T. Over half the hair cells in the mouse utricle first appear after birth, with significant numbers originating from early postnatal mitotic production in peripheral and striolar growth zones. J Assoc Res Otolaryngol. 13 (5), 609-627 (2012).
  15. Collado, M. S., et al. The postnatal accumulation of junctional E-cadherin is inversely correlated with the capacity for supporting cells to convert directly into sensory hair cells in mammalian balance organs. J Neurosci. 31 (33), 11855-11866 (2011).
  16. Meyers, J. R., Corwin, J. T. Shape change controls supporting cell proliferation in lesioned mammalian balance epithelium. J Neurosci. 27 (16), 4313-4325 (2007).
  17. Gratton, M. A., Rao, V. H., Meehan, D. T., Askew, C., Cosgrove, D. Matrix metalloproteinase dysregulation in the stria vascularis of mice with Alport syndrome: implications for capillary basement membrane pathology. Am J Pathol. 166 (5), 1465-1474 (2005).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

Z
جبل كله تشريح والمناعي من الكبار ماوس القوقعة
اتصل بنا
أوصِ بها للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

2026 © حقوق الطبع والنشر MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.