Method Article

سريع المعالجة الأنزيمية من البروتينات للكشف عن مرض التصلب العصبي المتعدد مع Microreactor التدفق من خلال

DOI:

10.3791/53564

⸱

April 6th, 2016

 ,  , 
1Biological Sciences, Virginia Tech

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتم تقديم بروتوكول سريع للهضم المحلل للبروتين مع مفاعل دقيق مدمج للتدفق الداخلي مقترن بمطياف كتلة تأين الرش الكهربائي (ESI). يتم وصف تصنيع المفاعل الصغير والإعداد التجريبي وعملية الحصول على البيانات.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الغالبية العظمى من قياس الطيف الكتلي (MS) القائم على أساليب تحليل البروتين وتشمل خطوة الهضم الأنزيمي قبل الكشف، وعادة مع التربسين. هذه الخطوة ضرورية لتوليد صغيرة الببتيدات الوزن الجزيئي، عموما مع MW <3،000-4،000 دا، التي تقع ضمن نطاق المسح الفعال للأجهزة قياس الطيف الكتلي. وتتضمن البروتوكولات التقليدية O / N الهضم الأنزيمي في 37 درجة مئوية. وقد أدت التطورات الحديثة في تطوير مجموعة متنوعة من الاستراتيجيات، وعادة ما تنطوي على استخدام microreactor مع الانزيمات يجمد أو مجموعة من العمليات الفيزيائية التكميلية التي تقلل من الوقت اللازم لهضم بروتين لبضع دقائق (على سبيل المثال، الميكروويف أو عالية الضغط). في هذا العمل، ونحن تصف مقاربة بسيطة وفعالة من حيث التكلفة التي يمكن تنفيذها في أي مختبر لتحقيق الهضم الأنزيمي سريع للبروتين. وكثف البروتين (أو خليط من البروتين) على المستعبدين C18-عكس المرحلة الأداء الإقتصادي الأداء العاليormance السائل اللوني (HPLC) جسيمات السيليكا مسبقة في العمود الشعري، وغرست التربسين في المخزن مائي على جزيئات لفترة قصيرة من الزمن. لتمكين على خط للكشف عن مرض التصلب العصبي المتعدد، ومزال الببتيدات زيتية مع نظام المذيبات مع زيادة المحتوى العضوي مباشرة في مصدر MS أيون. هذا النهج يتجنب استخدام جزيئات الإنزيم يجمد مرتفعة الثمن ولا تتطلب أي مساعدات لإتمام العملية. هضم البروتين وتحليل عينة الكامل يمكن تحقيقه في أقل من 3 دقائق ~ و ~ 30 دقيقة، على التوالي.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وكثيرا ما حقق تحديد وتوصيف تنقية البروتينات باستخدام تقنيات MS. يتم هضم البروتين مع انزيم ويتم تحليل الببتيدات إلى أبعد من مرض التصلب العصبي المتعدد باستخدام ضخ الإعداد التجريبية بسيط. الهضم بروتين ضروري لتوليد شظايا الببتيد الصغيرة التي تقع في نطاق كتلة مفيد لمعظم تحليل MS، والتي يمكن أن تكون مجزأة بسهولة من خلال الطاقة المنخفضة تصادم التفكك المستحث لتوليد الأحماض الأمينية تسلسل المعلومات. للبروتينات معزولة أو خليط من البروتين بسيطة، ليست هناك حاجة أخرى لفصل الكروماتوغرافي من الببتيدات قبل الكشف عن مرض التصلب العصبي المتعدد. مزيج من 25-50 الببتيدات يمكن تحليلها بسهولة عن طريق غرس العينة مع ضخ حقنة مباشرة في مصدر MS أيون.

مطياف الكتلة يمكن أن تؤدي في التحليل والتأكد من تسلسل البروتين داخل زمنية قصيرة. مع وسائل الحصول على البيانات الحديثة، وهذه العملية يمكن أن يتحقق ثithin بضع دقائق أو حتى ثواني. العامل المحدد في استكمال العملية برمتها على المدى الزمني القصير هو الخطوة الهضم بروتين. عادة، وهذا يتم تنفيذه خلال بضع ساعات (أو O / N)، في الحل، في 37 درجة مئوية، وذلك باستخدام الركيزة: نسب انزيم (50-100): 1. لتقليل الوقت الهضم الأنزيمي لدقائق أو ثواني، microreactors انزيم يجمد، في شكل مفاعلات الموائع الدقيقة أو خراطيش المتاحة تجاريا، وقد وصفت 1-6 عادة، يتم يجمد الانزيم من قبل التساهمية، غير التساهمية / الامتزاز الفيزيائي، مجمع تشكيل أو التغليف، 3،6 في تعزيز الكفاءة العملية الأنزيمية التي مكنت من كبير أرض- حجم ونسب انزيم إلى الركيزة. وتشمل مزايا إضافية من المفاعلات يجمد تخفيض انحلال ذاتي والتدخل من الانزيم في تحليل MS، وتحسين الاستقرار انزيم وإعادة استخدام. وقد وصفت مجموعة متنوعة من النهج واستخدام الزجاج أو أجهزة microfabricated البوليمرية،باستخدام الإنزيمات ثبتوا على حبات مغناطيسية بواسطة تفاعلات الضد مستضد، 7،8 شرك في شبكات جسيمات متناهية الصغر من الذهب، 9 مغلفة في تيتانيا الألومينا سول المواد الهلامية 10 و nanozeolites، 11 أو من خلال القبض على ني NTA أو صاحب الوسم تشكيل تعقيدا. 6 بدلا من ذلك ، وقد وضعت الشعيرات الدموية مفتوح أنبوبي مع الإنزيمات ثبتوا، وكذلك 12 وعلاوة على ذلك، وقد تجلى تعزيز الانقسام بروتين باستخدام تسيطر الميكروويف إشعاع 13 أو بمساعدة ضغط أو الضغط تكنولوجيا الدراجات (PCT) للحد من أوقات رد الفعل إلى 30-120 دقيقة 14

على الرغم من المزايا المتعددة للمفاعلات انزيم يجمد، تكاليف خراطيش التجارية عالية، وتوافر الأجهزة ميكروفلويديك للاستخدام الروتيني محدودة، واستخدام نتائج تقنيات الميكروويف أو معاهدة التعاون بشأن البراءات في الحاجة إلى أجهزة إضافية. وكان الهدف من هذا العمل هو تطوير طريقة التي circumveNTS هذه العيوب، والتي يمكن تنفيذها بسهولة في كل مختبر لتمكين الباحثين مع نهج بسيط وفعال لأداء الانقسام الأنزيمية للبروتينات في التحضير لتحليل MS في غضون دقائق. يعتمد المنهج على استخدام مسعور، C18 الجسيمات التي هي محملة مسبقا في الشعيرات الدموية أو الجهاز ميكروفلويديك، وامتصاص البروتين (ق) من الفائدة على هذه الجسيمات تليها الهضم الأنزيمي خلال ضخ الانزيم على عمود معبأ والبروتين القبض على (ق). في هذا النهج، وثبتوا الركيزة من خلال التفاعلات غير التساهمية، وغرست الانزيم على البروتين وظائفها. وزيادة كفاءة بروتين الهضم من خلال المناطق سطح الجسيمات الكبيرة التي تعرض البروتين لمعالجة الأنزيمية، وخفض المسافات والأوقات نشر من وإلى السطح من الجزيئات، وتحسين نقل الجماعي، أي مرفق التساهمية التي قد تؤثر على نشاط الإنزيم، والقدرة بسرعة evaluatتركيبات (ه) من الإنزيمات المختلفة، disposability، ومضاعفة إذا تم تنفيذ هذه العملية في شكل ميكروفلويديك. ويتجلى هذا النهج مع استخدام خليط من البروتينات القياسية والتربسين- الأكثر شيوعا انزيم لبروتين الهضم قبل الكشف ESI-MS. كان مطياف الكتلة المستخدمة للكشف في هذه الدراسة فخ رباعي (LTQ) أداة الخطية.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. إعداد شعري Microreactor

  1. قطع قطرها الداخلي 100 ميكرون (ID) × 360 ميكرون القطر الخارجي (OD) الشعرية لمدة 7-8 سم، و 20 ميكرون معرف × 90 ميكرون OD الشعرية إلى 3-5 سم مع الساطور الزجاج الشعرية. تحقق تحت المجهر أن طرفي الشعرية لها نظيفة، وقطع على التوالي، دون أي نتوءات بارزة.
  2. إدراج 20 ميكرون معرف × 90 ميكرون OD الشعرية إلى واحدة من نهاية 100 ميكرون معرف × 360 ميكرون OD الشعرية، على طول ~ 6 مم؛ في حالة الضرورة، ومراقبة هذه العملية تحت المجهر.
  3. تطبيق قطرة صغيرة من الغراء حول E6000 تقاطع 90 ميكرون OD / 100 الشعيرات الدموية معرف ميكرون مع نهاية * نصيحة، والسماح للالغراء علاج O / N في RT.
  4. قطع إدراج 20 ميكرون معرف × 90 ميكرون OD الشعرية على طول ~ 10-15 ملم. وسيكون هذا التأين باعث electrospray.
  5. قبل قطع 1/32 "OD نظرة خاطفة، 1/16" نظرة خاطفة OD و1/16 حوض PTFE OD "جي في قطعة من 4-5 سم في الطول. وستكون هذه الأكمام المستخدمة في النقابات الشعرية لتوفير اتصال خالية من تسرب.
  6. قم بتوصيل الطرف الآخر من 100 ميكرون معرف × 360 ميكرون OD الشعرية لاتحاد نظرة خاطفة. استخدام كم 1/32 "نظرة خاطفة لتوفير اتصال خالية من تسرب.
  7. إدراج / تشديد قطعة من ~ 5 سم 1/16 "أنابيب PTFE في الطرف الآخر من الاتحاد.
  8. تزن ~ 4 ملغ من C18 (5 ميكرون) الجسيمات في مرحلة ما قبل تنظيفها / المجففة 2 مل قارورة زجاجية. إضافة 0.5 مل الأيزوبروبانول، أغلق القارورة وتفريق الطين في الحمام ultrasonicator.
  9. سحب مع حقنة 250 ميكرولتر ما يقرب من 200 الطين ميكرولتر، تضاف إبرة الحقنة في "أنابيب PTFE 16/01 للاتحاد نظرة خاطفة، والاستغناء ببطء الطين إلى 100 ميكرون معرف × 360 ميكرون OD الشعرية، مراقبة تحت المجهر باسم شعري يملأ مع جزيئات حتى يبلغ طوله 2-3 ملم التعبئة ويتحقق، وهذا سوف يكون microreactor (الشكل 1) وμ 20.الشعرية م معرف يحتفظ الجزيئات في microreactor من خلال تأثير كيستون. 15
  10. شطف microreactor مع ~ الحل 50 ميكرولتر من H 2 O / CH 3 CN 50:50 ت / ت، وبعد ذلك مع ~ الحل 50 ميكرولتر من H 2 O / CH 3 CN 98: 2 ت / ت.

2. إعداد حلول عينة

ملاحظة: العمليات التي تنطوي على التعامل مع المذيبات والأحماض العضوية وإعداد الحل هي التي يتعين القيام بها في غطاء الدخان. ارتداء النظارات والقفازات والملابس الواقية.

  1. شطف مع CH 3 OH ويجف بضع قوارير زجاجية (4 مل)، وأنابيب البولي بروبلين (15 مل).
  2. إعداد 10 مل من محلول H 2 O / CH 3 CN (98: 2 ت / ت) في أنبوب 15 مل البولي بروبلين عن طريق خلط 9.8 مل H 2 O مع 200 ميكرولتر CH 3 CN. مزيج من قبل صوتنة.
  3. إعداد 10 مل من محلول H 2 O / CH 3 CN (50:50 ت / ت) في أنبوب 15 مل البولي بروبلين من خلال خلط 5 مل H 2 </ دون> O مع 5 مل CH 3 CN. مزيج من قبل صوتنة.
  4. إعداد 4 مل من محلول مائي المحمض (TFA 0.01٪ ت / ت) وذلك بإضافة 4 ميكرولتر TFA (10٪) إلى 4 مل H 2 O / CH 3 CN (98: 2 ت / ت) في قارورة زجاجية 4 مل. مزيج من قبل صوتنة.
  5. إعداد 4 مل من محلول عضوي المحمض (TFA 0.01٪ ت / ت) وذلك بإضافة 4 ميكرولتر TFA (10٪) إلى 4 مل H 2 O / CH 3 CN (50:50 ت / ت) في كوب قارورة 4 مل. مزيج من قبل صوتنة.
  6. تزن 16 ملغ NH 4 HCO 3 مع توازن دقيق التحليلي في قارورة زجاجية 4 مل. إضافة 4 مل من H 2 O / CH 3 CN (98: 2 ت / ت) حل وتفريق صوتنة. وهذا يؤدي إلى حل 50 ملم من NH 4 HCO 3 (الرقم الهيدروجيني ~ 7.8) في المخزن المائي.
  7. تزن 5 ملغ من البروتين القياسية (على سبيل المثال، زلال المصل البقري، الهيموجلوبين α / β، السيتوكروم C، الأنهيدراز الكربونيك، α-2-HS-بروتين سكري، الخ) مع توازن دقيق التحليلي في قارورة زجاجية 4 مل. إضافة 4 مل DI توفير المياهص وتفريق صوتنة. هذا ينتج عادة في محلول بتركيز عال على مستوى ميكرومتر.
  8. إعداد 1 مل من محلول البروتين (1-2 ميكرومتر) عن طريق تمييع الحل تركيز عالية المستوى ميكرومتر مع حجم مناسب من NH 4 HCO 3 (50 ملم) عازلة مائي. مزيج من قبل صوتنة.
  9. إعداد الحل التربسين (5 ميكرومتر) عن طريق إذابة 20 ميكروغرام التسلسل الصف التربسين في 170 ميكرولتر NH 4 HCO 3 (50 ملم) عازلة مائي. تفريق صوتنة.

3. إعداد التجريبية

ملاحظة: تم تجهيز نظام LTQ-MS مع مصدر ESI تعديل يتضمن XYZ المرحلة محلي الصنع والتي تمكن تفاعل من مطياف الكتلة لمختلف النهج إدخال العينة.

  1. فصل microreactor الشعرية من النقابة نظرة خاطفة والاتصال إلى نظرة خاطفة المحملة.
  2. إدراج سلك حزب العمال ل~ 2 سم في الجانب ذراع من نظرة خاطفة المحملة. استخدام 1/32 "كم نظرة خاطفة لتوفيراتصال ولعزل السلك حزب العمال خالية من تسرب.
  3. توصيل 50 ميكرون معرف × 360 ميكرون OD (~ 0.5 مترا) نقل عينة الشعرية إلى الطرف الآخر من نظرة خاطفة المحملة. استخدام كم 1/32 "نظرة خاطفة لتوفير اتصال خالية من تسرب.
  4. تأمين المحملة نظرة خاطفة على XYZ المرحلة ووضع ESI باعث ~ 2 ملم بعيدا عن الإعلام الشعرية مطياف مدخل.
  5. قم بتوصيل سلك حزب العمال إلى مصدر التيار الكهربائي ESI من مطياف الكتلة.
  6. قم بتوصيل الطرف الآخر من شعري نقل العينة إلى الاتحاد الفولاذ المقاوم للصدأ. استخدام كم 1/16 "نظرة خاطفة لتوفير اتصال خالية من تسرب.
  7. توصيل 4-5 سم 1/16 "أنابيب PTFE إلى الطرف الآخر من اتحاد الفولاذ المقاوم للصدأ وإدراج إبرة حقنة 250 ميكرولتر في أنابيب PTFE؛ بدوره على مضخة وتحديد معدل التدفق في القيمة المطلوبة (على سبيل المثال، 2 ميكرولتر / دقيقة).
  8. مدخلات جنبا إلى جنب المعلمات الحصول على البيانات MS في مجموعة من البرامج التي تسيطر على أداة لمرض التصلب العصبي المتعددد حفظ كملف طريقة لتجهيز الإعداد لإجراء التحليل؛ لنظام LTQ-MS، استخدم المعلمات تحليل تعتمد البيانات التالية: استبعاد الديناميكي تمكين 180 ثانية مع عرض استبعاد كتلة ± 1.5 م / ض. واحد MS تفحص تليها التكبير واحد وMS 2 يمسح على رأس 5 القمم على أشده، وتكبير العرض الضوئي ± 5 م / ض. تصادم التفكك المستحث (CID) المعايير المحددة في عرض العزلة 3 م / ض، تطبيع الاصطدام الطاقة 35٪، وتفعيل س 0.25، ووقت التنشيط 30 ميللي ثانية.

4. إعداد ميكروفلويديك

  1. إعداد جهاز ميكروفلويديك من الزجاج أو ركائز البوليمرية، 16-18 وتقدم تخطيط للجهاز في الشكل 2A، ويتكون من microreactor (1) (0.13 ملم طول عرض × 2 مم × 50 ميكرون العميق) متصلة مدخل (2 )، منفذ (3) ومنفذ الجانب (4)؛ قنوات ربط للتلاعب الموائعية هي ~110 ميكرون واسع و~ 50 ميكرون عميقة. بنية متعددة القنوات (5)، تتكون من ~ 1.5-2 ميكرون عميق × 10 ميكرون يوسع x 100 ميكرون microchannels طويلة وضعت 25 ميكرون وبصرف النظر، سيكون بمثابة مرشح للإبقاء على الجزيئات في microreactor.
  2. تمكين الاتصالات السائل التسليم إلى الرقاقة عن طريق الإلتصاق الموصلات المتخصصة إلى الموانئ مدخل، أو عن طريق ابتكار موقف البوليمر الذي يتسع التجهيزات للتسليم السائل (الشكل 2B). 16
  3. إعداد الطين الجسيمات C18 (5 ميكرون) كما هو موضح في الخطوة 1.8. تقديم الطين إلى microreactor مع حقنة باستخدام 1/16 "أنابيب PTFE موصولة إلى منفذ الجانب رقاقة (4)؛ ختم الميناء بعد تحميل الجسيمات مع الغراء الايبوكسي وعلاج لمدة 1 ساعة في الفرن على 90 درجة مئوية (16).
  4. إدراج الشعرية (20 ميكرون معرف × 90 ميكرون طول OD × 10 ملم) في ميناء منفذ، وختم مع الغراء E6000، والسماح علاج O / N؛ هذا وسوف تصبح باعث ESI ( 6).
  5. توصيل 50 ميكرون معرف × 360 ميكرون OD (~ 0.5 مترا) نقل عينة الشعرية إلى ميناء رقاقة مدخل (2)؛ ربط الطرف الآخر من الشعيرات الدموية إلى حقنة ميكرولتر 250 و ضخ حقنة، كما هو موضح في 3،6-3،7.
  6. وضع خفيفة الوزن نظرة خاطفة المحملة الموصل على خط نقل عينة فقط قبل مدخل الميناء (2) وادخال سلك حزب العمال على الجانب ذراع المحملة، كما هو موضح في 3.2. وسيكون هذا القطب ESI.
  7. تأمين جهاز ميكروفلويديك على مرحلة XYZ مع باعث ESI وضع ~ 2 ملم بعيدا عن الشعرية مطياف الكتلة مدخل. إعداد MS للتحليل كما هو موضح في 3.8.

5. تحميل عينة، متعلق ب التحلل البروتيني الهضم وشطف لتحليل MS

ملاحظة: يتم تنفيذ كافة الخطوات نقل الحل / عينة مع المعونة من ضخ حقنة وينبغي أن يسمح لبضع دقائق إضافية لاستكمال، لتعويض القتلى نظام القبولوفاق المرتبطة خطوط نقل من وإلى microreactor. الوقت اللازم سوف تعتمد على معدلات تدفق المعنية.

  1. شطف microreactor وإعدادها للتحليل عن طريق غرس محلول مائي من NH 4 HCO 3 (50 ملم) في H 2 O / CH 3 CN (98: 2 ت / ت) في 2 ميكرولتر / دقيقة لمدة 5 دقائق. استخدام حقنة 250 ميكرولتر.
  2. تحميل عينة بروتين (1 ميكرومتر) على microreactor عن طريق غرس محلول العينة في 2 ميكرولتر / دقيقة لمدة 5 دقائق. استخدام حقنة 250 ميكرولتر.
  3. يبث في حل التربسين (5 ميكرومتر) على البروتين كثف على microreactor في 2 ميكرولتر / دقيقة لمدة 1-3 دقيقة.
  4. إخماد عملية الهضم بروتين وذلك بدهن microreactor مع محلول مائي المحمض من TFA (0.01٪ ت / ت) في H 2 O / CH 3 CN (98: 2 ت / ت) في 2 ميكرولتر / دقيقة لمدة 5 دقائق. استخدام حقنة 250 ميكرولتر.
  5. بدء يبلغ حجمه البروتين هضم من microreactor عن طريق غرس حل العضوية المحمض من TFA (0.01٪ت / ت) في H 2 O / CH 3 CN (50:50 ت / ت) في 300 نيكولا لانغ / دقيقة.
  6. بدوره على عملية الحصول على البيانات MS والجهد ESI (~ 2000 V)؛ الحصول على البيانات MS باستخدام المعلمات الحصول على البيانات المنصوص عليها في خطوة 3.8. مراقبة شطف من الببتيدات زيتية.

6. معالجة البيانات

  1. معالجة البيانات جنبا إلى جنب MS مع محرك بحث متوافقة مع تنسيق البيانات MS الخام.
    1. معالجة الملفات الخام LTQ-MS باستخدام كائن قاعدة بيانات محددة بروتين زائدة الحد الأدنى. تحميل البيانات الخام في محرك البحث، تعيين الأم والأيونات جزء التحمل كتلة إلى 2 و 1 دا، على التوالي، واستخدام أجزاء فقط زيتية تماما مع ما يصل الى اثنين غاب الانشقاقات للبحث. لا تسمح التعديلات posttranslational. تعيين العالية والمتوسطة الثقة الزائفة معدلات اكتشاف (فرانكلين روزفلت) إلى 1٪ و 3٪ على التوالي، وعدم السماح للتعديلات posttranslational.
  2. تصفية البيانات لتحديد الوحيدة الموثوقةالببتيد مباريات للبروتينات في قاعدة البيانات؛ تقييم البروتين ومستوى الببتيد النتائج.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ونتيجة تمثيلية لعملية الهضم بروتين أداء في وقت واحد على مزيج من البروتينات، مع microreactors المذكورة أعلاه (الشكلان 1 أو 2)، وتقدم في الجدول 1. ويتألف جدول تسلسل الببتيد الفريدة التي تحدد بروتين معين، والصليب درجة الارتباط (Xcorr) (أي النقاط التي تميز نوعية مباراة تجريبية لالنظرية للجنبا إلى جنب الطيف الكتلي المقابلة)، وعدد الانشقاقات لم يرد عليها، ولاية تهمة الببتيد (ض)، وكتلة / تهمة ( م / ض) من الببتيدا...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وmicroreactor وصفها في هذا العمل يوفر سهلة لتنفيذ الإعداد التجريبية لأداء الهضم الأنزيمي من البروتينات لتمكين تحليل التصلب العصبي المتعدد وتحديد الهوية في أقل من 30 دقيقة. مزايا واضحة لهذا النظام، بالمقارنة مع الأساليب التقليدية، وتشمل البساطة والسرعة، وانخفاض استهلاك كاشف وتكاليف منخفضة. على وجه الخصوص، ليست هناك حاجة لتكلفة الخرز التربسين يجمد والخراطيش. إعداد microreactor الشعرية واضح وصريح (الشكل 1A)، ويمكن تحقيق ذلك في غضون دقائق من الإمدادات القياسية، توجد ع...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعلن المؤلفون عدم وجود مصالح مالية متنافسة.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم هذا العمل من خلال منحة NSF/DBI-1255991 إلى IML.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
مصيدة الأيونات ESI-MSThermo ElectronLTQيتم استخدام مطياف الكتلة LTQ للحصول على بيانات MS الترادفية
مرحلة XYZنيوبورتأجزاء متعددةتستخدم مرحلة XYZ المصنوعة منزليا لتكييف مصدر LTQ nano-ESI التجاري لتلقي المدخلات من أنظمة توصيل العينات
المختلفة مجهر ستيريوبصريات إدموندG81-278المجهر لمراقبة عملية تعبئة المفاعل الدقيق
الميزان التحليلي / MetlerVWR46600-204يستخدم الميزان لوزن عينات البروتين
حمام بالموجات فوق الصوتية / برانسونVWR33995-540الحمام الصوتي لخلط / تجانس العينات وتشتيت مضخة حقنة الملاط الجسيمي C18
22Harvard Apparatus552222يتم استخدام المضخة الدقيقة لتحميل وشطف وشطف العينة والإنزيم على وإلى المفاعل الشعري المعبأ
نظام المياه عالي النقاء Milli-QEMD MilliporeZD5311595  ؛نظام المياه MilliQ لتحضير مياه DI النقية
Pipettor/Eppendorf (1,000  ومايكرو. ل)VWR53513-410يتم استخدام الماصة لقياس كميات صغيرة من حلول العينات
Pipettor / Eppendorf (100 & nbsp ؛ ومايكرو. ل)VWR53513-406يستخدم الماصة لقياس كميات صغيرة من حلول العينات
Pipettor / Eppendorf (10   ؛ ومايكرو. ل)VWR53513-402يتم استخدام الماصة لقياس كميات صغيرة من حلول العينات الشعرية
السيليكا المنصهرة (100 وميكرو ؛ م معرف × 360 & ميكرو; م OD)تقنيات PolymicroTSP100375يستخدم هذا الشعيرات الدموية لتصنيع المفاعل الصغير
الشعرية المنصهرة من السيليكا (20 & nbsp; ومايكرو. م معرف × 100 وميكرو ؛ م OD)تقنيات PolymicroTSP020090تستخدم هذه الشعيرات الدموية لتصنيع باعث ESI
الشعرية السيليكا المنصهرة (50 & nbsp; ومايكرو. م معرف × 360 & ميكرو; م OD)تقنيات PolymicroTSP050375يتم استخدام هذه الشعيرات الدموية لنقل العينات والمواد من مضخة الحقنة إلى المفاعل الشعري الصغير
الساطور الشعري الزجاجيSupelco23740-Uهذه أداة لقطع الشعيرات الدموية المدمجة من السيليكا بالطول المطلوب
منتجات الغراءالانتقائيةE6000 Craftيستخدم هذا الغراء لتأمين باعث ESI في المفاعل الشعري أو رقاقة الموائع
الدقيقة غراء الايبوكسيEpo-Tek353NDTيستخدم هذا الغراء لإغلاق فتحة مدخل الموائع الدقيقة التي يتم من خلالها تحميل جزيئات C18
جزيئات المرحلة العكسية C18 (5   ومايكرو. م)Agilent TechnologiesZorbax 300SB-C18هذه هي جسيمات C18 التي يتم امتصاص البروتينات عليها ؛ تم استخراج الجسيمات من 4 & nbsp ؛ مم × 20 سم عمود C18 LC من حقنة / زجاج Agilent
(250 & micro; ل)هاميلتون81130-1725RNتستخدم المحاقن الزجاجية لتحميل ملاط الجسيمات C18 في المفاعل الدقيق الشعري وتسليم العينة والمزيدات إلى المفاعل الدقيق
الداخلي لتقليل اتحاد PEEK (1/16 "إلى 1/32")ValcoZRU1.5FPKيستخدم هذا الاتحاد لتوصيل 250 & micro ؛ ل حقنة إلى المفاعل الصغير لتحميل 5 & مايكرو ؛ م الملاط الجسيمات
اتحاد الفولاذ المقاوم للصدأ (1/16 بوصة)ValcoZU1XCيتم استخدام اتحاد الفولاذ المقاوم للصدأ لتوصيل إبرة الحقنة الزجاجية
بموصل Microvolume PEEK Tee الشعري للتسريب (1/32 بوصة)ValcoMT.5XCPKيتم استخدام نقطة الإنطلاق Peek لتوصيل الشعيرات الدموية لنقل العينة بالمفاعل الصغير الشعري ؛ على ذراعها الجانبي ، فإنه يتيح إدخال
موصل نقطة الإنطلاق السلكية Pt (خفيف الوزن)ValcoC-NTXFPKيستخدم موصل نقطة الإنطلاق هذا لتطبيق جهد ESI على رقاقة الموائع الدقيقة من خلال خط نقل العينة
سلك Pt (0.404 مم)VWR66260-126يوفر سلك Pt اتصالا كهربائيا لتوليد ESI ويتم توصيله بأنبوب PTFE لإمداد الطاقة ESI
(1/16 " OD)ValcoTTF115-10FTيتم استخدام أنابيب التفلون لتمكين اتصال محكم الهواء بين إبرة المحقنة واتحاد الفولاذ المقاوم للصدأ & nbsp ؛
أنابيب نظرة خاطفة (0.015 بوصة معرف × 1/16 بوصة OD)Upchurch Scientific1565يتم استخدام أنبوب Peek كغلاف لتمكين اتصال محكم الغلق بين اتحاد الفولاذ المقاوم للصدأ و 50 & nbsp ؛ ومايكرو. m ID نقل أنابيب نظرة خاطفة الشعرية
(0.015 " معرف × 1/32 بوصة OD)ValcoTPK.515-25يتم استخدام أنبوب Peek كغلاف لتمكين اتصال خال من التسرب بين الشعيرات الدموية المصنوعة من السيليكا المنصهرة وقاطع أنابيب البوليمر Peek Tee
Clean-cutValcoJR-797هذا القاطع لقطع 1/16 بوصة و 1/32 بوصة مسبقا أنابيب بوليمر نظرة خاطفة تستخدم كغلاف للوصلات الخالية من التسرب في قطع ~ 4-5 سم في الطول
قارورة العنبر (2 مل) Agilent& nbsp ؛HP-5183-2069تستخدم القوارير لإعداد حلول العينات وملاط الجسيمات C18   ؛
قارورة العنبر (4 مل)VWR66011-948تستخدم القوارير لتحضير حلول العينات
أنبوب البولي بروبلين (15 & nbsp ؛ مل)فيشر12-565-286Dتستخدم القوارير لتحضير المحاليل العازلة
اسطوانة (100 مل)VWR24710-463الأسطوانة لقياس أحجام أسطوانة المذيبات
(10 مل)VWR24710-441الأسطوانة لقياس أحجام
أطراف ماصة المذيبات (1,000 & micro; ل)VWR83007-386تستخدم أطراف الماصة لقياس كميات صغيرة من حلول العينات
أطراف الماصات (100 ومايكرو؛ ل)VWR53503-781تستخدم أطراف الماصة لقياس كميات صغيرة من حلول العينات
أطراف الماصات (10 & micro; ل)VWR53511-681تستخدم أطراف الماصة لقياس كميات صغيرة من حلول العينات
ركائز زجاجيةتاج أبيض نانوفيلمB270 ، 3 × 3 بوصةهذه ركائز زجاجية لتصنيع الرقائق الدقيقة
تركيب الجوز الذكور (1/16 بوصة)UpchurchP203Xيستخدم هذا التركيب لتوصيل الشعيرات الدموية للنقل بشريحة الموائع الدقيقة
مجموعة NanoportUpchurchN-122Hهذا التركيب لتوصيل الشعيرات الدموية بشريحة الموائع الدقيقة
معايير البروتينSigmaMultiple #
Acetonitrile ، درجة HPLCFisherA955
Methanol ، درجةHPLCفيشرA452
الأيزوبروبانول ، HPLC الصفسيجما650447
حمض ثلاثي فلورو أسيتيكسيجما302031
بيكربونات الأمونيومAldrichA6141
Trypsin ، درجة التسلسلPromegaV5111
يستخدم يستخدم يستخدم يستخدم تستخدم تستخدم يستخدم

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Petersen, D. H. Microfluidic Bioreactors. Encyclopedia of Microfluidics and Nanofluidics. , Springer Science+Business Media. New York. (2014).
  2. Matosevic, S., Szita, N., Baganz, F. Fundamentals and applications of immobilized microfluidic enzymatic reactors. J. Chem. Technol. Biotechnol. 86 (3), 325-334 (2011).
  3. Liu, Y., Liu, B., Yang, P., Girault, H. H. Microfluidic enzymatic reactors for proteome research. Anal. Bioanal. Chem. 390 (1), 227-229 (2008).
  4. Wu, H., Zhai, J., Tian, Y., Lu, H., Wang, X., Jia, W., Liu, B., Yang, P., Xu, Y., Wang, H. Microfluidic enzymatic-reactors for peptide mapping: strategy, characterization, and performance. LabChip. 4 (6), 588-597 (2004).
  5. Jin, L. J., Ferrance, J., Sanders, J. C., Landers, J. P. A microchip-based proteolytic digestion system driven by electroosmotic pumping. LabChip. 3 (1), 11-18 (2003).
  6. Asanomi, Y., Yamaguchi, H., Miyazaki, M., Maeda, H. Enzyme-immobilized microfluidic process reactors. Molecules. 7 (16), 6041-6059 (2011).
  7. Aravamudhan, S., Joseph, P. J., Kuklenyik, Z., Boyer, A. E., Barr, J. R. Integrated microfluidic enzyme reactor mass spectrometry platform for detection of anthrax lethal factor. 31.st. Annual International Conference of the IEEE EMBS, , 1071-1074 (2009).
  8. Liu, X., Lo, R. C., Gomez, F. A. Fabrication of a microfluidic enzyme reactor utilizing magnetic beads. Electrophoresis. 30 (12), 2129-2133 (2009).
  9. Liu, Y., Xue, Y., Ji, J., Chen, X., Kong, J., Yang, P., Girault, H. H., Liu, B. Gold nanoparticle assembly microfluidic reactor for efficient on-line proteolysis. Mol. Cell. Proteomics. 6 (8), 1428-1436 (2007).
  10. Wu, H., Tian, Y., Liu, B., Lu, H., Wang, X., Zhai, J., Jin, H., Yang, P., Xu, Y., Wang, H. Titania and alumina sol-gel-derived microfluidics enzymatic-reactors for peptide mapping: design, characterization, and performance. J. Proteome Res. 3 (6), 1201-1209 (2004).
  11. Ji, J., Zhang, Y., Zhou, X., Kong, J., Tang, Y., Liu, B. Enhanced protein digestion through the confinement of nanozeolite-assembled microchip reactors. Anal. Chem. 80 (7), 2457-2463 (2008).
  12. Hustoft, H. K., Brandtzaeg, O. K., Rogeberg, M., Misaghian, D., Torsetnes, S. B., Greibrokk, T., Reubsaet, L., Wilson, S. R., Lundanes, E. Integrated enzyme reactor and high resolving chromatography in "sub-chip" dimensions for sensitive protein mass spectrometry. Scientific Reports. 3 (3511), 1-7 (2013).
  13. Pramanik, B. N., Mirza, U. A., Ing, Y. H., Liu, Y. H., Bartner, P. L., Weber, P. C., Bose, A. K. Microwave-enhanced enzyme reaction for protein mapping by mass spectrometry: A new approach to protein digestion in minutes. Protein Sci. 11 (11), 2676-2687 (2002).
  14. Olszowy, P. P., Burns, A., Ciborowski, P. S. Pressure-assisted sample preparation for proteomic analysis. Anal. Biochem. 438 (1), 67-72 (2013).
  15. Lord, G. A., Gordon, D. B., Myers, P., King, B. W. Tapers and restrictors for capillary electrochromatography and capillary electrochromatography-mass spectrometry. J. Chromatogr. A. 768, 9-16 (1997).
  16. Lazar, I. M., Kabulski, J. L. Microfluidic LC Device with Orthogonal Sample Extraction for On-Chip MALDI-MS Detection. Lab Chip. 13 (11), 2055-2065 (2013).
  17. Harrison, D. J., Manz, A., Fan, Z. H., Ludi, H., Widmer, H. M. Capillary electrophoresis and sample injection systems on a planar glass chip. Anal. Chem. 64 (17), 1926-1932 (1992).
  18. Jacobson, S. C., Hergenroder, R., Koutny, L. B., Warmack, R. J., Ramsey, J. M. Effects of Injection Schemes and Column Geometry on the Performance of Microchip Electrophoresis Devices. Anal. Chem. 66 (7), 1107-1113 (1994).
  19. Armenta, J. M., Perez, M. J., Yang, X., Shapiro, D., Reed, D., Tuli, L., Finkielstein, C. V., Lazar, I. M. Fast Proteomic Protocol for Biomarker Fingerprinting in Cancerous Cells. J. Chromatogr. A. 1217, 2862-2870 (2010).
  20. Doucette, A., Craft, D., Li, L. Mass Spectrometric Study of the Effects of Hydrophobic Surface Chemistry and Morphology on the Digestion of Surface-Bound Proteins. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 14, 203-214 (2003).
  21. Lazar, I. M., Trisiripisal, P., Sarvaiya, H. A. Microfluidic Liquid Chromatography System for Proteomic Applications and Biomarker Screening. Anal. Chem. 78 (15), 5513-5524 (2006).
  22. Lazar, I. M., Karger, B. L. Multiple Open-Channel Electroosmotic Pumping System for Microfluidic Sample Handling,". Anal. Chem. 74 (24), 6259-6268 (2002).
  23. Lazar, I. M., Rockwood, A. L., Lee, E. D., Sin, J. C. H., Lee, M. L. High-speed TOFMS Detection for Capillary Electrophoresis. Anal. Chem. 71 (13), 2578-2581 (1999).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Enzymatic DigestionFlow through MicroreactorProtein DigestionTrypsin SolutionC18 ParticlesMass SpectrometryCapillary ColumnElectrospray IonizationPeptide ElutionSample Analysis

Related Articles