مقالة منهجية

رواية استراتيجية الجمع بين CGH الصفيف وتعاقب كل اكسومي وانهانسر في الرحم في القوارض لتحديد الجينات المسببة لتشوهات الدماغ

DOI:

10.3791/53570

⸱

ديسمبر 1, 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1University of Florence, 2INSERM INMED, 3Aix-Marseille University, 4Plateforme Biologie Moléculaire et Cellulaire INMED, 5Royal Children's Hospital, 6Murdoch Children's Research Institute, 7University of Melbourne, 8Plateforme postgenomique INMED, 9University of Pavia, 10Wellcome Trust Centre for Human Genetics, 11Oxford Radcliffe NHS Trust, 12IRCCS Casimiro Mondino Foundation, 13Research Institute of Molecular Pathology, 14IRCCS Stella Maris, 15Columbia University

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تلين عقيدية هيتيروتوبيا (هايتي) هو الشكل الأكثر شيوعاً لتشوه التنمية القشرية (MCD) في مرحلة البلوغ ولكن الأساس الجيني لا يزال غير معروف في بعض الحالات المتفرقة أكثر. مؤخرا قمنا بتطوير استراتيجية لتحديد الجينات المرشحة رواية ل MCDs وتؤكد على دور العامل المسبّب في فيفومباشرة.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

العيوب الخلقية التي تنطوي على قشرة الدماغ – المعروف أيضا التشوهات القشرية التنمية (MCD) – أهم أسباب الإعاقة الفكرية وحساب 20-40% من الصرع المقاوم للعقاقير في مرحلة الطفولة. ويسرت تصوير الدماغ عالية الدقة في فيفو تحديد مجموعة كبيرة من MCD تعمل. وعلى الرغم من التقدم الذي تحقق في تصوير الدماغ وتحليل الجينوم وتوليد نماذج حيوانية، سير عمل مباشرة إلى إعطاء الأولوية للجينات المرشحة بشكل منهجي واختبار الآثار الفنية للطفرات المفترضة مفقود. للتغلب على هذه المشكلة، ووضعت استراتيجية تجريبية لتمكين تحديد الجينات المسببة رواية ل MCD والتحقق من صحتها. وتقوم هذه الاستراتيجية على تحديد مناطق الجينوم المرشح أو الجينات عبر الصفيف CGH أو عزمي كل تسلسل ووصف آثار هذه المنظمة أو overexpression من طفرات محددة في تطوير أدمغة القوارض عن طريق الرحم انهانسر. أدى هذا النهج إلى تحديد الجينات C6orf70 ، الترميز لبروتين حويصلية المفترضة، أن الآلية المرضية لتلين عقيدية هيتيروتوبيا، MCD الناجمة عن هجرة الخلايا العصبية التالفة.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

قشرة الدماغ يلعب دوراً رئيسيا في العمليات الإدراكية والفكرية والمشاركة في التحكم العاطفي، فضلا عن التعلم والذاكرة. ولذلك فإنه ليس من المستغرب أن العديد من الأمراض العصبية والنفسية نتيجة للتشوهات القشرية التنمية (MCD). مسببات MCD معقدة منذ حصلت على حد سواء وتشارك العوامل الوراثية. انتشار نسبة مصممة وراثيا من MCD التراكمي هو حوالي 2% ومتفرقة في معظم الحالات. على سبيل المثال، قدرت حالات الإصابة بخلل الدماغ الخلقي تكون أعلى من 1 في المائة في السكان، ولوحظت بعض أشكال MCD في أكثر من 14 في المائة من جميع المرضى المصابين بالصرع، وفي 40% من الصرع الشديدة أو مستعصية على الحل1، 2.

تلين عقيدية هيتيروتوبيا (هايتي) هو واحد من MCDs الأكثر شيوعاً وهو الناجمة عن الهجرة غير طبيعي للخلايا العصبية من منطقة البطين (VZ) إلى قشرة الدماغ النامي. فشل الخلايا العصبية لترحيل النتائج في مجموعات من الخلايا العصبية هيتيروتوبيك على طول جدران البطينين الجانبية التي يمكن تصور عادة باستخدام "التصوير بالرنين المغناطيسي" (التصوير بالرنين المغناطيسي). السمات السريرية والتشريحية والتصوير ليتبعها غير متجانسة. قد تتراوح العقيدات الصغيرة والاحادية الثنائية ومتماثل. عقابيل السريرية شيوعاً تشمل الإعاقة الفكرية والصرع3. تم العثور على الطفرات في الجين A فيلامين (أو فلنا)، التي تقوم بتعيين في Xq28، في 100 في المائة أسر التي يتبعها الثنائية المرتبطة بالعاشر وفي 26% من المرضى متفرقة3،4. نموذج نادرة والمتنحية ليتبعها الناجم عن الطفرات في الجينات ARFGEF2 ، التي تقوم بتعيين في 20q13، أبلغ في اثنين من الأقارب الأسر5. مؤخرا، تم تحديد بياليليك الطفرات في الجينات ترميز زوج كادهيرين يجند مستقبلات DCHS1 و FAT4 في تسعة من المرضى المصابين باضطراب مولتيسيستيميك التي تتضمن يتبعها6. ارتبط أيضا يتبعها الهش × متلازمة7، متلازمة ويليامز8، متلازمة ميكروديليشن 22q119، والازدواجية في 5 ف 1510، الحذف في 1 ف 3611، 5q14.3-q1512, 6 ف 2513 و 6q حذف المحطة الطرفية متلازمة14،15،16،17،،من1819، مما يوحي بأن الجينات المسببة الإضافية متناثرة في جميع أنحاء الجينوم. ومع ذلك، يبقى الأساس الوراثي حوالي 74 في المائة من المرضى يتبعها متفرقة أن أوضحت17.

نهج تعيين الجينات الكلاسيكية مثل مصفوفة "التهجين الجينومي المقارن" (صفيف-CGH) أثبتت أن تكون أدوات قوية للكشف عن مجهرية دون تشوهات كروموسومية، بيد مناطق الجينوم وحدد استخدام هذا النهج كبيرة في كثير من الأحيان، وتحتوي على العديد من الجينات.

ظهور تقنيات ضخمة يسلسل موازية (أي كل عزمي التسلسل (ويس) وكل الجينوم تسلسل (WGS)) خفضت إلى حد كبير كل من التكلفة والوقت اللازم لتسلسل أكمله عزمي البشرية أو الجينوم. على الرغم من ذلك، يظل تفسير البيانات ويس والأفرقة العاملة للطعن في معظم الحالات، منذ لكل المتغيرات المريض عشرات إلى مئات (أو حتى الآلاف، واعتماداً من نوع التحليل) الخروج من تصفية البيانات.

لتسريع عملية تحديد الجينات المسببة MCD الجديدة، استراتيجية منهجية رواية الجمع بين CGH صفيف، صمم ويس و في الرحم انهانسر (IUE) فحص الجينات المرشحة. يسمح IUE شكل انتقائي إلغاء تنشيط (أو أوفيريكسبريس) جينات معينة أو الطفرات في أدمغة القوارض، تمكين التقييم السريع لمشاركتهم في18،كورتيكوجينيسيس19. [رني] وساطة-ضربة قاضية أو overexpression من واحد أو أكثر من الجينات المرشحة يتوقع أن يتسبب، عندما يكون مرتبطاً بتطوير المرض، وعيوب مترجمة في الهجرة العصبية و/أو النضج الجينات. عند تحديد الجينات التي المنظمة (أو أوفيريكسبريشن) يستنسخ النمط الظاهري لوحظ في المرضى في القوارض، فإنه يصبح أحد المرشحين معلقة لفحص المرضى متفرقة مع MCD. باستخدام هذا النهج، ونحن مؤخرا كشفت مساهمة حاسمة من الجينات C6orf70 (يعرف أيضا باسم ارمارد) في يتبعها المرضية في المرضى إيواء العناصر المحذوفة الصبغية 6q2716.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

بيان الأخلاق: ويستار كانت تزاوج صيانتها واستخدامها في مرافق الحيوانات إينميد، باﻻتفاق مع تشريعات الاتحاد الأوروبي والفرنسي.

1. استخراج الحمض النووي والتحديد الكمي ل CGH الصفيف وويس

  1. استخراج "الحمض النووي" (جدنا) من الكريات البيضاء في الدم البشري من المرضى الذين يستخدمون روبوت الآلي في عزل الحمض النووي أو مجموعات استخراج الحمض النووي دليل المتاحة تجارياً وفقا للبروتوكول الخاص بالشركة المصنعة. قياس جميع العينات باستخدام جهاز المطياف الضوئي.

2-مجموعة-CGH البروتوكول

  1. الهضم التقييد من جدنا
    1. ضعف هضم 500 نانوغرام من جدنا المنقي من مريض وسيطرة بشرية متاحة تجارياً الحمض النووي مع رساي والوي ح 2 في 37 درجة مئوية. استخدام 0.5 ميكروليتر من إنزيم يو/ميكروليتر 10 لكل رد فعل. احتضان لمدة 20 دقيقة عند 65 درجة مئوية إلغاء تنشيط الإنزيمات ونقل أنابيب عينات الجليد.
  2. وضع نموذج العلامات
    1. إضافة وحدة التخزين المناسبة كبسولة تفجير عشوائي بحاجة لتنسيق ميكرواري في الاستخدام لكل أنبوبة رد فعل (مثلاً 5 ميليلتر لحزمة 1 و 2-حزمة 4-حزمة [ميكروارس]). مزيج جيد من قبل بيبيتينج إلى أعلى وأسفل برفق.
    2. نقل أنابيب عينة cycler حرارية. تبني على 95 درجة مئوية لمدة 3 دقائق ثم على 4 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
    3. إعداد سينين سينين 3 وواحدة واحدة 5 "ميكس ماجستير الوسم" على الجليد بمزج وحدات التخزين التالية: 10.0 ميليلتر 5 X رد فعل المخزن المؤقت، 5.0 ميليلتر 10 x dNTPs، ميليلتر 3.0 سينين 3-dUTP أو سينين 5-dUTP و 1.0 ميليلتر أكسو (-) الإنزيم كلينوو، ميليلتر 2.0 خالية من نوكلاس "المياه". اختر حجم كل كاشف وفقا للشكل ميكرواري قيد الاستخدام.
    4. إضافة "مزيج الرئيسي وضع العلامات" لكل أنبوبة رد الفعل الذي يتضمن جدنا. مزيج جيد من قبل بلطف بيبيتينج صعودا وهبوطاً.
    5. نقل أنابيب العينات إلى cycler حرارية واحتضان في 37 درجة مئوية ح 2، 65 درجة مئوية لمدة 10 دقائق وثم المحافظة على العينات عند 4 درجة مئوية.
  3. تنقية المسمى جدنا
    1. إضافة ميليلتر 430 1 x الشركة المصرية للاتصالات (pH 8.0) لكل أنبوبة رد فعل.
    2. ضع عمود تنقية في أنابيب جمع 2 مل وتسمية الأعمدة شكل مناسب. تحميل كل المسمى جدنا على عمود تنقية.
    3. أجهزة الطرد المركزي لمدة 10 دقيقة في 14,000 ز س في ميكروسينتريفوجي عند درجة حرارة الغرفة. تجاهل-التدفق عبر ومكان العمود مرة أخرى في أنبوب جمع 2 مل.
    4. إضافة ميليلتر 480 1 x الشركة المصرية للاتصالات (pH 8.0) لكل عمود. أجهزة الطرد المركزي لمدة 10 دقيقة في 14,000 ز س في ميكروسينتريفوجي عند درجة حرارة الغرفة. تجاهل في التدفق من خلال.
    5. عكس العمود إلى أنبوب جمع الطازجة 2 مل والطرد المركزي لمدة 1 دقيقة في 1,000 ز س في ميكروسينتريفوجي في درجة حرارة الغرفة لجمع العينات النقية.
    6. جعل حجم العينة التي طلبت لتنسيق ميكرواري في استخدام استخدام مركز أو إضافة 1 x TE (pH 8.0). على سبيل المثال، لإحضار ميكرواري 1-حزمة وحدة التخزين إلى 80.5 ميليلتر. احتضان العينة على الجليد لمدة 5 دقائق وثم "الماصة؛" الحل صعودا وهبوطاً 10 مرات.
  4. إعداد جدنا المسمى التهجين
    1. الجمع بين عينات الاختبار ومرجع باستخدام عينة المسمى 5 سينين المناسبة وعينه المسمى 3 سينين في أنبوب مل 1.5 جديدة خالية من رناسي. على سبيل المثال، ميكرواري حزمة 1 التأكد من أن وحدة التخزين النهائي 158 ميليلتر. اختر حجم كل عينة وفقا للشكل ميكرواري قيد الاستخدام.
    2. استخدام جهاز المطياف الضوئي قياس العائد، درجة من النشاط وضع العلامات أو محددة عن طريق قياس امتصاص في A260 شمال البحر الأبيض المتوسط (DNA) وشمال البحر الأبيض المتوسط A550 (سينين 3) A650 نانومتر (سينين 5).
      1. حساب العائد باستخدام الصيغة: [الحمض النووي concentration(ng/µl) x حجم العينة (ميليلتر)]/1,000 (نانوغرام/ميكروغرام). حساب "نشاط معين" استخدام الصيغة: بمول كل ميليلتر لصبغ/ميكروغرام كل ميليلتر جدنا.
        ملاحظة: على سبيل المثال، عن 0.5 ميكروغرام لإدخال الحمض النووي، العائد ينبغي ميكروغرام 8 إلى 11 والنشاط المحدد (pmol/ميكروغرام) ينبغي أن يكون 25 إلى 40 سينين-3 وصف العينة و 20 إلى 35 للعينة توسم سينين-5.
    3. إعداد مقدار ميكس ماجستير التهجين بحاجة لتنسيق ميكرواري في الاستخدام، مزيج الكواشف التالية: 50 ميليلتر عند استخدام سرير-1 "الحمض النووي" (1.0 ملغ/مل)، ميليلتر 52 10 × أكغ عامل حجب وميليلتر 260 2 × "العازلة التهجين" مرحبا-دورة في الدقيقة.
    4. إضافة ملائمة حجم ميكس ماجستير التهجين إلى أنبوب 1.5 مل خالية رناسي يحتوي على جدنا المسمى للحصول على الحجم الإجمالي المطلوب لتنسيق ميكرواري قيد الاستخدام. على سبيل المثال، ميكرواري حزمة 1، تأكد أن الحجم النهائي لكل رد فعل 362 ميليلتر.
    5. خلط العينة من بيبيتينج صعودا وهبوطاً، ثم بسرعة الطرد المركزي في 14,000 س ز واحتضان لمدة 3 دقائق على 95 درجة مئوية وعلى 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
  5. الجمعية الدوائر والتهجين
    1. تحميل شريحة طوقا نظيفة في قاعدة الدائرة مع التسمية طوقا مواجهة والانحياز في القسم مستطيلة بقاعدة الدائرة. التأكد من أن الشريحة طوقا دافق بقاعدة الدائرة وليس أجار.
    2. الاستغناء عن التهجين عينة المخلوط على البئر طوقا والتأكد من أن يتم توزيع النموذج موحد.
    3. إخماد شريحة ميكرواري على تقييم الشريحة طوقا أن ساندويتش-الزوج هو محاذاة بشكل صحيح. بعد ذلك، تجميع الدائرة رد فعل بوضع الغطاء على الشرائح تقع ومن ناحية شد المشبك.
    4. تأمين الشرائح ترطيب بتدوير الدائرة مجمعة رأسياً. تأكد من أن الفقاعات ليست موجودة في الدائرة. إذا لزم الأمر، انقر على الجمعية على سطح صلب لتحريك فقاعات ثابتة.
    5. وضعت الدوائر المجتمعة الشريحة على حامل المدورة لتدوير 20 لفة في الدقيقة. وضعت الدائرة التهجين في فرن وأداء التهجين عند 65 درجة مئوية ح 24 أو 40 وفقا للشكل ميكرواري قيد الاستخدام.
  6. ميكرواري الغسيل والمسح
    1. تتخذ الدائرة التهجين من الفرن وتغرق فإنه يغسل المخزن المؤقت 1. الشروع في التفكيك.
    2. إزالة الشريحة ميكرواري ووضعها بسرعة في حامل شريحة في المخزن المؤقت للمياه والصرف الصحي 1 في درجة حرارة الغرفة.
    3. تغسل الشريحة الصفيف لمدة 5 دقائق مع التحريك (استخدام برغوث ومحرض مغناطيسية). ضبط سرعة محرض لإعداد 4 (متوسط السرعة)، للحصول على جيد، ولكن خلط غير نشطة جداً.
    4. تغسل الشريحة الصفيف في المخزن المؤقت للمياه والصرف الصحي 2 للتحريك s 90. استعادة الشريحة بلطف من المخزن المؤقت (أنه ينبغي أن تظهر الجافة) وتحميله في حامل شريحة مع المعونة من حامية الشريحة.
    5. تحميل الشريحة في الماسح الضوئي الصفيف وإجراء المسح وفقا لإرشادات الشركة المصنعة الصفيف.
    6. تحليل النتائج باستخدام استخراج البرامج المتوفرة مع الماسح الضوئي في الاستخدام وفقا لإرشادات الشركة المصنعة (V.9.1.3.1).

3-ويس البروتوكول

  1. هدف الإثراء
    1. استخدام دسدنا فرع التحليل لتحديد تركيز العينة جدنا وفقا للبروتوكول الصك.
    2. تمييع 5 ميكروغرام من جودة عالية مزدوجة حبلا الحمض النووي مع 1 × العازلة TE منخفضة في أنبوب 1.5 مل ربط انخفاض في إجمالي حجم 50 ميليلتر.
    3. سونيكاتور ووضع microtube إلى محطة التحميل والتفريغ وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. الحفاظ الغطاء على الأنبوب.
    4. بطء نقل العينة 50 ميليلتر الحمض النووي عن طريق سيتا قبل الانقسام دون إدخال الفقاعات.
    5. قص الحمض النووي طبقاً لإعدادات اقترح من الشركة المصنعة سونيكاتور وتقييم الجودة باستخدام بيواناليزير وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. حجم جزء الحمض النووي والهدف هو 150 إلى 200 شركة بريتيش بتروليوم.
  2. ينتهي إصلاح الحمض النووي
    1. إعداد "مزيج رد فعل الإصلاح نهاية" بخلط 40 ميليلتر من "نهاية إصلاح إنزيم ميكس" مع 10 ميليلتر من نهاية إصلاح اليغو ميكس. تخلط جيدا في خلاط دوامة.
    2. احتضان هذه العينات في 20 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة في cycler حرارية وثم عقد لهم في 4 درجات مئوية. عدم استخدام غطاء دافئ.
    3. إضافة 50 ميليلتر من "مزيج رد فعل الإصلاح نهاية" إعدادها في الخطوة 3.2.1 لكل ميليلتر 50 المنفصمة عينة الحمض النووي أيضا. مزيج جيد من قبل بيبيتينج صعودا وهبوطاً أو بواسطة فورتيكسينج لطيف.
    4. تنقية العينة مع مجموعة تنقية خرز على أساس وفقا للشركة المصنعة للبروتوكول.
  3. وينتهي بوليادينيليشن من 3 '.
    1. إضافة 20 ميليلتر من مزيج ماجستير دا-تراجع إلى كل نهاية إصلاحه، وتنقية الحمض النووي عينة (حوالي 20 ميليلتر).
    2. مزيج جيد من قبل بيبيتينج صعودا وهبوطاً أو بواسطة فورتيكسينج لطيف.
    3. احتضان هذه العينات في 37 درجة مئوية في cycler حرارية والاحتفاظ بها ثم في 4 درجات مئوية. عدم استخدام غطاء دافئ.
  4. ربط محول التقاط ما قبل الفهرسة.
    1. إضافة 5 ميليلتر من مزيج الرئيسي ربط لكل عينة الذيل بالحمض النووي.
    2. إضافة 5 ميليلتر من الحل فهرس التقاط قبل المناسبة لكل عينة.
    3. ختم الآبار ومزيج دقيق من فورتيكسينج عن 5 س بإيجاز أجهزة الطرد المركزي هذه العينات.
    4. احتضان هذه العينات في 20 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة في cycler حرارية وثم اضغط على 4 درجة مئوية. عدم استخدام غطاء دافئ.
    5. تنقية العينات مع مجموعة تنقية خرز على أساس وفقا للشركة المصنعة للبروتوكول.
  5. تضخيم المكتبة المفهرسة.
    1. إعداد حجم مناسب قبل التقاط بكر رد فعل مزيج من طريق خلط 1 ميليلتر من "التمهيدي مزيج" و 25 ميليلتر من مزيج PCR ماجستير. تخلط جيدا في خلاط دوامة.
    2. الجمع بين 26 ميليلتر من خليط التضخيم في آبار منفصلة من صفيحة بكر وميليلتر 24 من كل عينة مكتبة جدنا المفهرسة.
    3. تشغيل برنامج PCR مع الخطوات التالية: 98 درجة مئوية لمدة دقيقة 2، 5 دورات في 98 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، 60 درجة مئوية لمدة 30 s و 72 درجة مئوية 1 دقيقة وتمديد نهائي في 72 درجة مئوية للحد الأدنى 10 عقد العينات عند 4 درجة مئوية.
    4. تنقية العينة مع مجموعة تنقية خرز على أساس وفقا للشركة المصنعة للبروتوكول.
    5. تقييم جودة مع بيواناليزير وفقا للشركة المصنعة للبروتوكول.
  6. تجميع عينات الحمض النووي مفهرس التهجين
    1. لكل تجمع رد فعل الالتقاط، تجمع بين ملائمة حجم كل عينة مكتبة جدنا المفهرسة في بئر واحدة من صفيحة PCR. على سبيل المثال، للإنسان أو مكتبات التقاط جميع إكسون الماوس، ضم مكتبات 8 كل مجموعة باستخدام 187.5 نانوغرام لكل مكتبة مفهرسة. تأكد من أن كل تجمع رد فعل الاستيلاء النهائي يحتوي على 1,500 نانوغرام جدنا المفهرسة.
    2. تقليل الحجم في كل جيدا إلى < ميليلتر 7 استخدام مركز فراغ. تجنب جفاف العينة تماما.
    3. أضف كمية كافية من المياه خالية من نوكلاس لكل تجمع جدنا مركزة لتحقيق حجم جيدا النهائي 7 ميليلتر ودوامه ثم لوحة تحتوي على جدنا لقوة الطرد المركزي س. 30 في زيادة أو نقصان الطرد المركزي أو لوحة صغيرة لجمع السائل في الجزء السفلي من الآبار.
  7. تهجين برك مكتبة جدنا إلى "مكتبة التقاط"
    1. لكل تجمع جدنا ميليلتر 7 مفهرسة، إضافة 9 ميليلتر لمنع المزيج. "الماصة؛" صعودا ونزولاً المزيج.
    2. كاب الآبار ونقل لوحة مختومة تحتوي على جدنا إلى cycler الحرارية واحتضان عند 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق، ثم أنه عقد في 65 درجة مئوية. تأكد من أن اللوحة يقام في 65 درجة مئوية لمدة 5 دقائق على الأقل.
    3. إعداد مناسبة إضعاف "كتلة رناسي"، استناداً إلى حجم المكتبة التقاط (10 ٪ تمييع لمكتبات < تمييع 3.0 ميغا بايت و 25% للمكتبات > 3.0 ميغابايت).
    4. وفقا "حجم المكتبة التقاط"، الجمع بين كمية مناسبة من "القبض على مكتبة" وتمييع الحل "كتلة رناسي" في صفيحة بكر أبقى على الجليد. مزيج جيد من قبل بيبيتينج. لمكتبات التقاط < 3.0 ميغابايت، استخدام 2 ميليلتر من مكتبة و 5 ميليلتر من "كتلة رناسي" في التخفيف 10 ٪. لالتقاط المكتبات > 3.0 ميغابايت، استخدام 5 ميليلتر من مكتبة و 2 ميليلتر من "كتلة رناسي" في تخفيف نسبة 25 في المائة.
    5. إضافة 37 ميليلتر من "التهجين المخزن المؤقت" لكل بئر يحتوي على 7 ميليلتر من مزيج "التقاط كتلة" المكتبة/رناسي. مزيج جيد من قبل بيبيتينج والطرد المركزي باختصار لوحة تحتوي على المزيج.
    6. الحفاظ على لوحة تجمع جدنا عند 65 درجة مئوية أثناء استخدام ماصة متعددة القنوات نقل ميليلتر 44 أسرة "مكتبة التقاط" خليط من الخطوة 3.7.5 لكل نموذج جيد لصفيحة بركة جدنا. مزيج جيد من قبل بيبيتينج ببطء صعودا وهبوطاً 8 إلى 10 مرات.
    7. ختم الآبار مع قبعات قطاع القبة. تأكد من أن يتم إغلاق جميع الآبار تماما. ضع حصيرة ضغط على لوحة بكر في cycler الحرارية.
    8. احتضان هذا الخليط التهجين عن 24 ساعة عند 65 درجة مئوية. ملاحظة: العينات قد تهجين ليصل إلى 72 ساعة، ولكن يجب التحقق من أن التهجين الموسعة لا يسبب تبخر واسعة في الآبار عينة.
  8. إعداد حبات مغناطيسية المغلفة ستريبتافيدين
    1. بريوارم أغسل المخزن المؤقت 2 عند 65 درجة مئوية في كتلة مياه حمام أو الحرارة.
    2. قوة ريسوسبيند الخرز المغناطيسية ستريبتافيدين في خلاط دوامة. تسوية الخرز المغناطيسي أثناء التخزين.
    3. لكل عينة التهجين، إضافة 50 ميليلتر من الخرز ريسوسبينديد إلى الآبار لصفيحة PCR.
    4. أغسل الخرز وريسوسبيند لهم في 200 ميليلتر من "المخزن المؤقت ملزم".
  9. التقاط من الحمض النووي المهجن استخدام الخرز ستريبتافيدين.
    1. تقدير وسجل حجم الحل التهجين التي لا تزال بعد الحضانة ح 24.
    2. الحفاظ على لوحة التهجين عند 65 درجة مئوية، واستخدام ماصة متعددة القنوات لنقل وحدة التخزين بأكملها (حوالي 60 ميليلتر) من كل خليط التهجين إلى الآبار صفيحة تحتوي على 200 ميليلتر من حبات ستريبتافيدين غسلها. مزيج جيد من قبل بيبيتينج ببطء صعودا وهبوطاً 3 إلى 5 مرات.
    3. كاب الآبار واحتضان لوحة الالتقاط في خلاط نوتاتور أو ما يعادلها لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. تأكد من بشكل صحيح يتم خلط العينات في الآبار.
    4. الطرد المركزي باختصار لوحة الالتقاط في زر الزيادة ونقصان للطرد المركزي أو لوحة صغيرة.
    5. وضع لوحة الالتقاط في فاصل مغناطيسي لجمع الخرز من التعليق. إزالة وتجاهل المادة طافية.
    6. ريسوسبيند الخرز في 200 ميليلتر ليغسل المخزن المؤقت 1. مزيج من بيبيتينج صعودا وهبوطاً حتى حراكه الخرز الكامل.
    7. بإيجاز للطرد المركزي في زر الزيادة ونقصان للطرد المركزي أو لوحة صغيرة.
    8. وضع اللوحة في الفاصل المغناطيسي.
    9. انتظر الحل لمسح، ثم إزالة وتجاهل المادة طافية.
  10. بعد التقاط عينة معالجة لتسلسل متعدد
    1. إعداد حجم مناسب من مزيج تفاعل PCR بخلط ما يلي: المياه خالية من نوكلاس ميليلتر 9، 25 ميليلتر ميكس ماجستير و 1 ميليلتر التمهيدي مزيج وفقا للعدد من إيضاحات مسهبة. خلط جيدا باستخدام خلاط دوامة والحفاظ على الجليد.
    2. لكل رد فعل التضخيم، ضع 35 ميليلتر من خليط تفاعل PCR من الخطوة 3.10.1 في آبار صفيحة PCR.
    3. ماصة كل العينات تجمع مكتبة تم التقاطها حبة زمنياً صعودا وهبوطاً للتأكد من أن تعليق حبة متجانسة.
    4. إضافة 15 ميليلتر من كل تعليق حبة بركة مكتبة تم التقاطها إلى الخليط تفاعل PCR المناسبة جيدا. مزيج دقيق من بيبيتينج حتى يتم تعليق حبة متجانسة.
    5. ضع لوحة أعدت في النقطة 3.10.2 في cycler حرارية وتشغيل البرنامج التضخيم PCR التالية: 98 درجة مئوية لمدة دقيقة 2, 8 إلى 11 دورات في 98 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، 60 درجة مئوية عن 30 ثانية و 72 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة، متبوعة بملحق نهائي في 72 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. عقد العينات عند 4 درجة مئوية.
    6. تنقية العينة مع تنقية خرز على أساس وفقا للشركة المصنعة للبروتوكول.
    7. تقييم جودة مع بيواناليزير وفقا للشركة المصنعة للبروتوكول.
  11. إعداد العينات لمتعدد التسلسل
    ملاحظة: العينات المخصب النهائية التي تحتوي على تجمعات المكتبات المفهرسة أما 8 أو 16، استناداً إلى حجم "مكتبة التقاط" وينتج عن ذلك قبل التقاط تجميع استراتيجية. إجمالي عدد المكتبات المفهرسة التي قد يكون متعدد في ممر تسلسل واحد يتحدد بمواصفات الإنتاج من منهاج العمل المستخدمة، جنبا إلى جنب مع كمية تسلسل البيانات المطلوبة "المكتبة التقاط".
    1. حساب عدد الفهارس التي يمكن الجمع بين كل حارة، وفقا لقدرة النظام الأساسي. إجمالي عدد المكتبات المفهرسة التي قد يكون متعدد في ممر تسلسل واحد يتحدد بمواصفات الإنتاج من منهاج العمل المستخدمة، جنبا إلى جنب مع كمية تسلسل البيانات المطلوبة "المكتبة التقاط". على سبيل المثال، لمكتبة v5 "إكسون جميع البشر"، هو 4 غيغا بايت من "البيانات تسلسل أوصى" كل "مكتبة مفهرسة" وأوصى تسلسل البيانات كل "تجمع" ما قبل التقاط 32 جيجابايت (8-فهرس برك).
  12. التسلسل في المكتبات.
    1. تحميل المكتبات على منصة تسلسل الجيل القادم لاختيار وتنفيذ تسلسل تشغيل وفقا لمواصفات الصك.
  13. تحليل عزمي تسلسل البيانات.
    1. تشغيل خط الأنابيب والبرنامج المفضل للاتصال الأساسي. على سبيل المثال، استخدم ستامبي لخريطة ما يلي:20، وإزالة التكرارات مع بيكار (http://broadinstitute.github.io/picard/) وتحديد النوكليوتيدات واحدة مجمع الأشكال المتعددة والإدراج أو الحذف من القواعد (إينديلس) مع خلد الماء21. تصفية المتغيرات مترادفين، وتلك التي لوحظت في تردد اليل < 5% والبيانات مقارنة مع تلك من اكسوميس الوالدين لتحديد المتغيرات حيثياته .

4-بلازميد الحمض النووي التحضير انهانسر في الرحم

  1. تصميم عدة دبوس الشعر القصير الكشف (شرناس) تستهدف أما تسلسل الترميز أو 3 ' UTR الجينات المرشحة كما هو موضح سابقا22.
  2. لمنع إيقاف الهدف اختبار آثار خصوصية شرناس بالبحث عن الانفجار ضد قواعد البيانات باستخدام الطرق القياسية. استبعاد شرناس عرض أكثر من 50% تكامل مع جينات الفئران الأخرى.
  3. النوكليوتيد استنساخ تعتيق إلى ناقل mU6-برو كالموصوفة سابقا23.
  4. تنقية بلازميد الحمض النووي مع ماكسي الإعدادية طبقاً لإرشادات الشركة المصنعة، وجعل تركيز نهائي من 3 ميكروغرام/ميليلتر.
  5. الكوة ميليلتر 20 من الحمض النووي (0.5 ملغ/مل بكاجس-التجارة والنقل أما وحدها أو مع 1.5 ملغ/مل من شرنا بناء) وإضافة 2 ميليلتر من سرعة الخضراء صبغة (2 مغ/مل) للسماح بالرصد البصري للحقن.

5- في الرحم انهانسر

  1. إجراء العمليات الجراحية
    1. تخدير E15.5 الحوامل إناث الفئران (E0 يعرف أنه يوم تأكيد للتوصيل المهبلية الحاملات للحيوانات المنوية)، باستخدام مزيج مع خليط من الكيتامين/إكسيلازيني (0.1 و 0.01 ملغ في الجسم الوزن، على التوالي)، الذي يعطي عن طريق داخل حقن مخدر التعريفي.
    2. تأكد من أن الحيوان تخديره هو تماما بملاحظة اختفاء منعكس قرصه أخمص القدمين.
    3. يحلق أسفل البطن للحيوان باستخدام ماكينة إزالة الفراء. تطهير الجلد باستخدام الدعك بوفيدون والكحول 70%. تطبيق مرهم طبيب بيطري في العيون لمنع جفاف بينما تحت التخدير.
    4. ضع الحيوان على مصدر حرارة ووضع ثني عقيمة (مع نافذة مفتوحة من 4-5 سم في الوسط) عبر موقع شق. ارتداء معطف مختبر وقبعات، فاسيماسكس والقفازات الجراحية المعقمة. الاحتفاظ بالعقم حتى نهاية عملية جراحية.
    5. باستخدام مقص حاد شق عمودي (2-2.5 سم) في الجلد على طول خط الوسط في البطن والذيلية وتجعل ثم شق جدار العضلات تحت الجلد – أيضا من 2.5 سم – على طول خط الوسط.
    6. كشف القرن الرحم واحد من تجويف البطن بعناية. إسقاط 37 درجة مئوية قبل حرارة المحلول الملحي العادي لترطيب الأجنة. إبقاء الرحم رطبة طوال الوقت.
  2. حقن الحمض النووي وانهانسر
    1. عقد واحد من قرون الرحم بلطف مع الملقط الحلقية وادفع واحد الجنين بجدار الرحم. عقد الجنين في جهة ومع إدراج اليد الأخرى بعناية الزجاج الشعيرات الدموية 1 مم من خط الوسط في البطين الجانبي الأيسر (2-3 مم العميق) وتضخ حوالي 1 ميليلتر من الحمض النووي مع "الأخضر سريع" للسماح بالرصد البصري لاستخدام حقن ميكروينجيكتور.
    2. قطره المحلول الملحي العادي على سطح الأقطاب الكهربائية2 3 × 7 ملم. ضع مسرى العقيمة الإيجابية على الجانب المحقون (البطين الجانبي الأيسر) ومسرى العقيمة السلبية في البطين الأيمن. تسليم النبضات الكهربائية 5 في فترات 950 مللي ثانية مع دواسة القدم تسيطر (4000 وسط مكثف تحمل 40 الخامس مع اليكتروبوراتور).
  3. إجراءات انهانسر بوست
    1. إعادة وضع ابواق الرحم إلى تجويف البطن، وإضافة قطرات المحلول الملحي العادي إلى تجويف للسماح للأجنة في وضع أكثر من الطبيعي وحساب فقدان السوائل الموضعية.
    2. إغلاق جدار البطن العضلات مع خيوط جراحية قابلة للامتصاص، ثم الجلد باستخدام غرزة توقف بسيطة.
    3. وضع الفئران مرة أخرى إلى القفص ومراقبة الحيوان حتى يتضح من التخدير.
    4. لعلاج الآلام إدارة البوبرينورفين (0.03 مغ/كغ) للحيوان عن طريق حقن تحت الجلد كل ح 8-12، ليصل إلى 48 ساعة.

6-إعداد نموذج الدماغ

  1. أسلوب التثبيت
    1. التضحية الفئران الحوامل 5 أيام بعد العملية الجراحية باستخدام غاز التخدير (إيسوفلوراني) متبوعاً تفكك سريع عنق الرحم.
    2. جعل شق عمودي لإعادة فتح تجويف البطن.
    3. فضح ابواق الرحم وإزالة الأجنة من الرحم وقطع رأس لهم باستخدام مقص حاد.
    4. إزالة الدماغ مع الحد الأدنى من الضرر للأنسجة: باستخدام مقص حاد، جعل شق صغير على طول الخلفي (المخيخ)/المحور الأمامي (لمبات أولفاكتيفي) رئيس لاختراق الجلد والجمجمة، ثم باستخدام زوج من الملقط قشر خارج الجمجمة لفضح الدماغ وإزالته باستخدام ملعقة صغيرة.
    5. تزج العقول بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية في نسبة 4% بارافورمالدهيد في 1 × الفوسفات خفف المحلول الملحي (PBS).
  2. تقطيع الدماغ
    1. غسل أدمغة في 1 x برنامج تلفزيوني لمدة 10 دقائق.
    2. تضمين العقول في أجار 4 ٪ في تضمين قوالب من البلاستيك.
      1. إعداد 50 مل أجار 4% في برنامج تلفزيوني x 1 لتضمين أدمغة الأجنة 5. التأكد من أن [اغروس] الذائبة في أي أكثر من 50 درجة مئوية.
    3. تبقى العقول في [اغروس] بلمرة ح 1 على الأقل في 4 درجات مئوية. إزالة الزائدة [اغروس] حول الدماغ.
    4. الصق في الدماغ للصفيحة القاعدية فيبرتوم، موجهة نحو ذلك المحور الأمامي/الخلفي للدماغ عمودي على الشفرة. انتظر لبضع دقائق للغراء لتجف ووضع اللوحة بالدماغ ملتصقاً في قاعة فيبرتوم.
    5. ملء فيبرتوم مع برنامج تلفزيوني 1 x. شريحة 100 ميكرومتر سميكة المقاطع.
    6. نقل شرائح المخ على الشرائح وإزالة السائل الزائد وإضافة بضع قطرات من تصاعد المتوسطة ومكان ساترة على رأس العقول

7-[كنفوكل] التصوير والتحليل الكمي

  1. واسمحوا تصاعد الجافة المتوسطة بين عشية وضحاها من قبل التصوير. أقسام الصورة في 10 X في مجهر مسح ليزر [كنفوكل].
  2. باستخدام البرمجيات لتحليل الصورة الكمية، تحويل الصورة في 8-بت، حدد خلية واحدة على الممثل بروتينات فلورية خضراء إيجابية فلورسنت ويدويًا تحديد شكله. للقيام بذلك، انقر فوق "التقدير" ورسم حدود الخلية باستخدام أداة التحديد اليدوي. في هذا يتم الاحتفاظ طريقة القطر وعتبة كثافة الخلية تلقائياً من قبل البرنامج.
  3. انقر فوق "البحث عن خلايا" للسماح للبرنامج لتعريب transfected الخلايا في جميع أنحاء القشرة. ثم، إذا لزم الأمر، يدوياً إزالة المغلوطة.
  4. تقسيم كامل سمك القشرة إلى 8 مجالات الاهتمام التي طبعت في المقاطع الفردية. لتحقيق هذا الهدف، انقر فوق "أداة المنطقة"، حدد "خطوط المنطقة" 8 حيث الأول (1) وآخر (8) تتوافق مع المشارب VZ والجزء العلوي من حزب المحافظين على التوالي. انقر فوق "تطبيق" للسماح للبرنامج لحساب الموضع النسبي للتجارة والنقل transfected الخلايا في قشرة كله. وأخيراً انقر على "حفظ التحديد الكمي" لتصدير البيانات في ملف Excel للتحليل.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هو لخص استراتيجية تجريبية تهدف إلى التعرف على الجينات المسببة MCD الجديدة في الشكل 1.

قبل تنفيذ CGH الصفيف في مجموعة مرضى 155 بتشوهات الدماغ إنمائية مغايرة الجمع بين يتبعها (الشكل 2A)، وخلل تكون كلثوم الإحضار، كولبوسيفالي، ونقص تنسج الدماغ وبوليميكروجيريا المرتبطة بالصرع، ترنح و ضعف الإدراك، وقد حددنا حذف حرجة دنيا 1.2 ميغا بايت في 6q27 تتقاسمها 12 مريضا (الشكل 2)

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

MCDs أهم أسباب الإعاقة الفكرية وحساب 20-40 في المائة من الطفولة المقاوم للأدوية الصرع1،2. وقد تزايد الاهتمام ب MCDs هائلة خلال العقد الماضي نتيجة لعاملين رئيسيين. الأول هو التحسن في الدماغ التصوير (لا سيما التصوير بالرنين المغناطيسي)، الذي يسمح للأطباء والعلماء تصور العديد من التشوهات في الدماغ التي لا يعترف بها سابقا. والآخر هو تطور أدوات الجينية التي تسمح تحديد العديد من الجينات المسببة MCD رواية. وهذا قد طرأ تحسن معرفتنا بالآليات التي تكمن وراء نمو الدماغ ووظي...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ونحن نشكر الدكتور غ. مكجيليفراي، العلاقات العامة. ج. كلايتون-سميث، دوبينس البنك الدولي العلاقات العامة.، ستريانو ص العلاقات العامة.، و "العلاقات العامة أي" شيفر، روبرستون ل. س العلاقات العامة. والأمير S.F. بركوفيتش لتزويد المرضى MCD. ونشكر الدكتور ميشال واو ودال مي للمشورة التقنية والمساعدة. هذا العمل كانت مدعومة بتمويل من "البرنامج الإطاري سبعة" من الاتحاد الأوروبي، والرغبة في المشروع، والعقد رقم: الصحة-F2-602531-2013، (إلى الخامس، النمو الحقيقي، أ. ر.، والعربية، وجيم)، INSERM (إلى أ. ر. وجيم)، ومؤسسة جيروم لوجون (R13083AA A.F و E.P.P و C.C) و منطقة بروفنس الب كوت دازور (APO2014-DEMOTIC A.A.D وجيم). D.A.K هو "محقق الشباب التطريز" ومعتمد من قبل FWF المنح (I914 و P24367).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
Picospritzer IIIParker Hannifin CorpP / N 051-0500-900أنظمة توزيع الحقن الدقيق داخل الخلايا
Fast Green FCFSigma-AldrichF7252أخضر سريع يسمح بالمراقبة البصرية للحقن
BTX ECM 830 المثقور الكهربائيBTX Harvard Apparatus45-0002ECM 830 هو مولد نبض الموجة المربعة المصمم للتطبيقات
في المختبر وفي الجسم الحيMicrotome HM 650 VMicrom10076838Microtome HM 650 V اهتزاز 240 فولت 50/60 هرتز مع شفرة اهتزازية
FluoView 300OlympusOlympus Olympus FluoView TM 300 عبارة عن مجهر مسح ضوئي للنقاط وكشف النقاط ومجهر المسح الضوئي بالليزر متحد البؤر مصمم لتطبيق أبحاث علم الأحياء
برنامج eCELLenceGlance Vision TechnologieseCELLence هو برنامج مصمم للتحليل الكمي لهجرة الخلايا
مجموعة مجموعة الماسح
ل 1 × 244K أو 2 × 105K أو 4 × 44K أو 8 × 15KAgilentAgilent p / n G4900DA أو G2565CA أو G2565BA
ل 1 × 1 متر أو 2 × 400 كيلو أو 4 × 180 كيلو أو 8 × 60 كيلوAgilentAgilent p / n G4900DA أو غرفة تهجين G2565CA
، غرفة غير قابلة للصدأAgilentAgilent p / n G2534Aلتهجين
المصفوفة CGHشرائح حشية غرفة التهجين ، حشية من 5 عبواتلتهجين المصفوفة CGH
للمصفوفات الدقيقة المكونة من 1 عبوة أوAgilentAgilent p / n G2534-60003
للمصفوفات الدقيقة المكونة من عبوتين أوAgilentAgilent p / n G2534-60002
للمصفوفات الدقيقة المكونة من 4 عبوات أوAgilentAgilent p / n G2534-60011
للمصفوفات الدقيقة المكونة من 8 عبواتAgilentAgilent p / n G2534-60014
فرن التهجينAgilent Agilentp / n G2545A
دوار فرن التهجين لغرف التهجين AgilentAgilentp / n G2530-60029
Cycler الحراري بغطاء ساخنAgilentAgilent p / n G8800A أو ما يعادلهTermal cycler للحضانات
1.5 مل أنبوب Microfuge خال من RNaseAmbionp / n AM12400 أو ما يعادلهامن أجهزة الطرد المركزي
الدقيقة قضيب التحريك المغناطيسيCorningp / n 401435 أو ما يعادلهاأداة لتحريك
Qubit FluorometerLife Technologiesp / n Q32857أداة لقياس كمية الحمض
النووي Qubit dsDNA BR Assay Kit ، للاستخدام مع مقياس الفلور QubitInvitrogenp / n Q32850Kit لمقياس الفلور الكيوبيت
UV-VIS مقياس الطيفالضوئي Thermo ScientificNanoDrop 8000 أو 2000 ، أو ما يعادلهامن أداة لقياس الحمض النووي
P10 و P20 و P200 و P1000 ماصاتPipetman أو ما يعادلهامن الإغناء عن الحمض
النووي مكثف فراغThermo Scientificp / n DNA120-115 أو
أداة مكافئة		لتركيز الحمض النووي
SureTag مجموعة كاملة لوضع العلامات على الحمضالنووي Agilentp / n 5190-4240طقم وضع العلامات على الحمض النووي (للعينات البشرية) أعمدة
التنقية (50 وحدة)وضع العلامات على الحمض النوويAgilentp / n 5190-3391
AutoScreen A ، 96 بئر لوحةGE Healthcarep / n 25-9005-98مجموعة وضع العلامات على الحمض النووي (للعينات البشرية)
GenElute PCRSigma-Aldrichp / n NA1020(للعينات البشرية)
الجينوم البشري مجموعة وضع العلامات على الحمض النوويp / n G1521(للعينات البشرية)
للمصفوفات الدقيقة CGH:Promega(أنثى) أو p / n G1471 (ذكر)الحمض النووي للتحكم في المصفوفة
CGH للمصفوفات الدقيقة CGH + SNP:Coriellp / n NA18507 أو NA18517 أو NA12891 أو NA12878 أو NA18579صفيف CGH التحكم في الحمض النووي
Oligo aCGH / ChIP-on-chip Wash Buffer Kit أوAgilentp / n 5188-5226تهجين وغسيل مصفوفة CGH
Oligo aCGH / ChIP-on-chip Wash Buffer 1 وAgilentp / n 5188-5221تهجين وغسيل مصفوفة CGH وغسل
Oligo aCGH / ChIP-on-chip Wash Buffer 2Agilentp / n 5188-5222Array CGH تهجين وغسل
حل التثبيت والتجفيفAgilentp / n 5185-5979تهجين وغسيل مصفوفة CGH
التهجين Oligo aCGH / ChIP-on-chipAgilentp / n 5188-5220 (25) أو p / n 5188-5380 (100)تهجين مصفوفة CGH وغسل
Human Cot-1 DNAAgilentp / n 5190-3393تهجين مصفوفة CGH وغسل
الماسح الضوئي Agilent C الماسحAgilentلشرائح المصفوفة CGH
SureSelect XT2 Reagent Kitلتخصيب
الهدف منصة HiSeq (HSQ) ، 16 عينةAgilentp / n G9621A
منصة HiSeq (HSQ) ، 96 عينةAgilentp / n G9621B
منصة HiSeq (HSQ) ، 480 عينةAgilentp / n G9621C
منصة MiSeq (MSQ) ، 16 عينةAgilentp / n G9622A
منصة MiSeq (MSQ) ، 96 عينةAgilentp / n G9622B
منصة MiSeq (MSQ) ، 480 عينةAgilentp / n G9622C
DNA 1000Kit Agilentp / n 5067-1504لفصل وتحديد حجم وقياس شظايا dsDNA من 25 إلى 1000 نقطة أساس.
مجموعة الحمض النووي عالية الحساسيةAgilentp / n 5067-4626Kit لتحليل مكتبات الحمض النووي أو الحمض النووي المجزأة.
أدوات AMPure XPلتنقية PCR الآلية.
5 ملAgencourtp / n A63880
60 ملAgencourtp / n A63881
450 ملAgencourtp / n A63882
Dynabeads MyOne Streptavidin T1عزل ومعالجة الأحماض النووية البيوتينيل
2 ملLife TechnologiesCat # 65601
10 ملLife TechnologiesCat # 65602
مجموعة فحص Quant-iT dsDNA BR ، لقياس الحمض النووي لمقياس
100 فحوصات ، 2-1000 نانوغرامLife TechnologiesCat #Q32850
500 فحوصات ، 2-1000 نانوغرامLife TechnologiesCat #Q32853
أنابيب فحص كيوبيت LifeTechnologiesp / n Q32856تكميم الحمض
النووي SureSelec tXT2 مكتبات الالتقاطAgilentاعتمادا على مجموعة التجربةللمكتبات تلتقط
SureCycler 8800 Thermal CyclerAgilentp / n G8800Aتضخيم الحمض النووي
96 وحدة لوحة بئر ل SureCycler 8800 Thermal CyclerAgilentp / n G8810Aتضخيم الحمض النووي
SureCycler 8800 متوافقة مع لوحات 96 بئرAgilentp / n 410088تضخيم الحمض النووي
الشريط البصري قبعاتAgilentp / n 401425تضخيم الحمض النووي
شرائط غطاء الأنبوب ، مقببAgilentp / n 410096تضخيم الحمض النووي
حصائر ضغطAgilentp / n 410187تضخيم الحمض النووي
2100 Bioanalyzer حزمة الكمبيوتر المحمولAgilentp / n G2943CAتضخيم الحمض النووي
2100 مجموعة الرحلان الكهربائي المحللالحيوي Agilentp / n G2947CAتضخيم الحمض النووي
نظام تحضير العينة Covaris ، السلسلة E أو S-seriesCovarisقص الحمض النووي
Covaris حامليp / n 520078قص الحمض النووي
خلاط لوحة nutatorBD Diagnosticsp / n 421105 أو ما يعادلهاخلاط الألواح
GaIIxIlluminaآلة تسلسل الجيل التالي
شرائح الضوئي الدقيقة Agilent Microarray مجموعة (للعينات البشرية) مجموعة تنظيف مجموعة أدوات وضع العلامات على الحمض النووي مجموعة الضوئي مجموعة مجموعة الفلور الكيوبيت العينات

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Meencke, H. J., Veith, G. Migration disturbances in epilepsy. Epilepsy Res. 9, 31-39 (1992).
  2. Shorvon, S., Stefan, H. Overview of the safety of newer antiepileptic drugs. Epilepsia. 38 (1), 45-51 (1997).
  3. Parrini, E., et al. Periventricular heterotopia: phenotypic heterogeneity and correlation with Filamin A mutations. Brain. 129 (7), 1892-1906 (2006).
  4. Fox, J. W., et al. Mutations in filamin 1 prevent migration of cerebral cortical neurons in human periventricular heterotopia. Neuron. 21 (6), 1315-1325 (1998).
  5. Sheen, V. L., et al. Mutations in ARFGEF2 implicate vesicle trafficking in neural progenitor proliferation and migration in the human cerebral cortex. Nat Genet. 36 (1), 69-76 (2004).
  6. Cappello, S., et al. Mutations in genes encoding the cadherin receptor-ligand pair DCHS1 and FAT4 disrupt cerebral cortical development. Nat Genet. 45 (11), 1300-1308 (2013).
  7. Moro, F., et al. Periventricular heterotopia in fragile X syndrome. Neurology. 67 (4), 713-715 (2006).
  8. Ferland, R. J., Gaitanis, J. N., Apse, K., Tantravahi, U., Walsh, C. A., Sheen, V. L. Periventricular nodular heterotopia and Williams syndrome. Am J Med Genet A. 140 (12), 1305-1311 (2006).
  9. van Kogelenberg, M., et al. Periventricular heterotopia in common microdeletion syndromes. Mol Syndromol. 1 (1), 35-41 (2010).
  10. Sheen, V. L., et al. Periventricular heterotopia associated with chromosome 5p anomalies. Neurology. 60 (6), 1033-1036 (2003).
  11. Neal, J., Apse, K., Sahin, M., Walsh, C. A., Sheen, V. L. Deletion of chromosome 1p36 is associated with periventricular nodular heterotopia. Am J Med Genet A. 140 (15), 1692-1695 (2006).
  12. Cardoso, C., et al. Periventricular heterotopia, mental retardation, and epilepsy associated with 5q14.3-q15 deletion. Neurology. 72 (9), 784-792 (2009).
  13. Cellini, E., et al. Periventricular heterotopia with white matter abnormalities associated with 6p25 deletion. Am J Med Genet A. 158 (7), 1793-1797 (2006).
  14. Bertini, V., De Vito, G., Costa, R., Simi, P., Valetto, A. Isolated 6q terminal deletions: an emerging new syndrome. Am J Med Genet A. 140 (1), 74-81 (2006).
  15. Dobyns, W. B., et al. Consistent chromosome abnormalities identify novel polymicrogyria loci in 1p36.3, 2p16.1-p23.1, 4q21.21-q22.1, 6q26-q27, and 21q2. Am J Med Genet A. 146 (13), 1637-1654 (2008).
  16. Conti, V., et al. Periventricular heterotopia in 6q terminal deletion syndrome: role of the C6orf70 gene. Brain. 136 (11), 3378-3394 (2013).
  17. Sheen, V. L., et al. Etiological heterogeneity of familial periventricular heterotopia and hydrocephalus. Brain Dev. 26 (5), 326-334 (2004).
  18. Jaglin, X. H., et al. Mutations in the beta-tubulin gene TUBB2B result in asymmetrical polymicrogyria. Nat. Genet. 41 (6), 746-752 (2009).
  19. Falace, A., et al. TBC1D24 regulates neuronal migration and maturation through modulation of the ARF6-dependent pathway. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (6), 2337-2342 (2014).
  20. Lunter, G., Goodson, M. Stampy: a statistical algorithm for sensitive and fast mapping of Illumina sequence reads. Genome Res. 21 (6), 936-939 (2011).
  21. Pagnamenta, A. T., et al. Exome sequencing can detect pathogenic mosaic mutations present at low allele frequencies. J Hum Genet. 57 (1), 70-72 (2012).
  22. Yu, J. Y., DeRuiter, S. L., Turner, D. L. RNA interference by expression of short-interfering RNAs and hairpin RNAs in mammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 99 (9), 6047-6052 (2002).
  23. Bai, J., et al. RNAi reveals doublecortin is required for radial migration in rat neocortex. Nat Neurosci. 6 (12), 1277-1283 (2003).
  24. Carabalona, A., et al. A glial origin for periventricular nodular heterotopia caused by impaired expression of Filamin-A. Hum Mol Genet. 21 (5), 1004-1017 (2012).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

C6orf70

مقالات ذات صلة