Method Article

الكمي من الشلل الأوعية الدموية العمارة باستخدام ثنائي الفوتون المجهري في نموذج الفأر من Neuroinflammation التي يسببها فيروس نقص المناعة البشرية

DOI:

10.3791/53582

⸱

January 12th, 2016

 ,  ,  , 
1Department of Microbiology and Immunology, University of Rochester Medical Center, 2Department of Human Genetics, University of Chicago

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تصف هذه الورقة طريقة يمكن من خلالها قياس بنية الأوعية الدموية في الدماغ باستخدام الفحص المجهري ثنائي الفوتون في الجسم الحي وخارج الجسم الحي.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
غالبا ما تؤدي عدوى فيروس نقص المناعة البشرية < p class = 'jove_content'> فيروس نقص المناعة البشرية 1 (HIV-1) إلى اضطرابات الإدراك العصبية المرتبطة بفيروس نقص المناعة البشرية -1 (HAND) ، وتتميز بحالة التهابية عصبية مزمنة داخل الجهاز العصبي المركزي (CNS) ، ويعتقد أنها مدفوعة بشكل أساسي بالتنشيط الفيروسي للخلايا الدبقية الصغيرة والضامة المقيمة في الدماغ. يصاحب عدوى فيروس العوز المناعي البشري -1 أيضا تغيرات في تدفق الدم الدماغي الوعائي (CBF) ، مما يزيد من احتمال أن يؤدي الالتهاب العصبي المزمن المرتبط بفيروس العوز المناعي البشري إلى تغييرات في CBF و / أو في بنية الأوعية الدموية الدماغية. لمعالجة هذا السؤال ، استخدمنا نموذج فأر للالتهاب العصبي الناجم عن فيروس نقص المناعة البشرية ، واختبرنا ما إذا كان التعرض طويل الأمد لهذه البيئة الالتهابية قد يضر بالأوعية الدموية في الدماغ ويؤدي إلى ندرة الشبكات الشعرية. في هذه الورقة ، نصف طريقة لتحديد التغيرات في كثافة الشعيرات الدموية القشرية في نموذج الفأر لمرض الالتهاب العصبي (الفئران المعدلة وراثيا HIV-1 Tat). يستخدم هذا النهج القابل للتعميم في الجسم الحي التصوير ثنائي الفوتون للشعيرات الدموية القشرية من خلال نافذة قشرية رقيقة الجمجمة ، بالإضافة إلى التصوير خارج الجسم الحي ثنائي الفوتون للشعيرات الدموية القشرية في أقسام دماغ الفئران. تنتج هذه الإجراءات صورا وملفات z-stack للشبكات الشعرية ، على التوالي ، والتي يمكن إخضاعها بعد ذلك للتحليل الكمي من أجل تقييم التغيرات في بنية الأوعية الدموية الدماغية.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

فيروس نقص المناعة البشري 1 يغزو (HIV-1) في الدماغ أثناء المرحلة الحادة للعدوى الفيروس، ويصيب منتجة كلا الخلايا الدبقية الصغيرة والضامة المقيمين الدماغ، مما يؤدي إلى تفعيلها - وإطلاق سراح كل المستمدة من المضيفة وسطاء التهابات وذوبان HIV-1 virotoxins مثل تات وgp120 (إعادة النظر في 1،2). ونتيجة لذلك، يصبح قيام دولة neuroinflammatory المزمنة في الجهاز العصبي المركزي، والتي يعتقد أنها تساهم في التسبب في HIV-1 اضطرابات أسوشيتد العصبي (HAND) 3-5.

وقد تبين overexpression المزمن من HIV-1 تات أو انترلوكين (IL) -17A داخل الجهاز العصبي المركزي من الفئران أن يؤدي في الاوعية الدموية الدقيقة الفراغ 6،7. هذا يثير احتمال أن neuroinflammation المزمن يمكن أن تسهم في التسبب في HAND من خلال التأثير على الأوعية الدموية في الدماغ. من أجل مواصلة النظر في هذه المسألة، وقد وضعنا أساليب لقياس struc الأوعية الدموية الدماغيةدرجات.

وتصف هذه الورقة طريقة لتحديد عدد العقد الشعرية، شرائح الشعرية، يعني طول الجزء، يبلغ الطول الإجمالي الجزء، يعني قطرها الشعرية، وإجمالي حجم الشعرية استخدام في التصوير المجراة من الشبكات الشعرية من خلال نافذة القشرية الجمجمة رقيقة (معدلة من وصفه سابقا بروتوكولات) 8،9، وكذلك خارج الجسم الحي التصوير من أقسام الدماغ، وذلك باستخدام اثنين من الفوتون المجهري. ويوفر هذا النهج مجتمعة لتحديد الكميات شاملة من المعلمات الأوعية الدموية الدماغية، منذ رقيقة الجمجمة النافذة القشرية في الجسم الحي يسمح للحفاظ على البيئة الدماغية، في حين فيفو السابقين التصوير الشبكات الشعرية في شرائح الدماغ يمكن إعادة بناء كاملة، ثلاثي الأبعاد الشبكات الشعرية - ومن ثم يمكن كميا باستخدام البرمجيات المتاحة تجاريا.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وافقت جامعة جنة جامعة روتشستر على الثروة الحيوانية عن الإجراءات المتبعة في هذه الورقة.

1. إعداد ما قبل العمليات الجراحية (والفئران)

  1. إعداد المنطقة الجراحية مع كل المعدات المطلوبة. تعقيم جميع الأدوات المستخدمة أثناء الإجراء مسبقا باستخدام الايثانول 70٪. اختياريا، واستخدام تعقيم الزجاج حبة أو تعقيم لتعقيم الأدوات.
  2. ضع الماوس في غرفة الاستقراء الأيزوفلورين متصلة المرذاذ الأيزوفلورين. تحديد مستويات الأيزوفلورين إلى 4٪ بمعدل 1 لتر / دقيقة.
    ملاحظة: بالنسبة لتجارب ذكرت هنا والفئران مع الدوكسيسيكلين (DOX) محرض HIV-1 تات التحوير مدفوعا نجمية محددة البروتين ييفي الدبقية (GFAP) المروج (HIV تات-TG الفئران) كانت تستخدم 10 لدراسة تأثير فيروس نقص المناعة البشرية -1 يسببها neuroinflammation على الدماغي بنية الأوعية الدموية، كما هو موضح سابقا 7،10.
  3. بلطف ترجيح كفة غرفة تحريض لمراقبة الماوس &# 39؛ ق المنعكس المقوم. مرة واحدة وقد تم قمعها المنعكس المقوم، تعيين مستوى الأيزوفلورين إلى 2٪ وإعادة توجيه تدفق الهواء من غرفة تحريض للمخروط الأنف على مقاعد البدلاء الجراحي.
  4. بسرعة تحريك الماوس من غرفة تحريض على المياه التي غرست سادة التدفئة. الاستمرار في تطبيق الأيزوفلورين (1.5-2٪) من خلال مخروط الأنف. ضبط التخدير وفقا للتسامح الماوس الفردية تقييمها من خلال معدل التنفس (RR) الرصد.
    ملاحظة: الاكتئاب من RR يمكن التشويش على المعلمات غاز الفسيولوجية تغيير تدفق الدم إلى المخ والتقييم قطر السفينة. محاولة للحفاظ على RR بين 55-65 نفسا في الدقيقة. ويمكن أيضا أن معدل ضربات القلب (HR) أن تستخدم تقييم عمق التخدير. الحفاظ HR بين 300-450 نبضة في الدقيقة لمنع التغييرات الفسيولوجية لقطر السفينة. عادة، سوف التخدير تكون كافية بين 1،5-2،0٪ الأيزوفلورين في 1 لتر / دقيقة للماوس معين.
  5. تنفيذ قرصة أخمص القدمين إلى مزيد من التحقق من عمق التخدير. إذا لم يستجب الماوس، بالاتصالاتسينعقد العمليات الجراحية.

2. إعداد الجمجمة نافذة رقيقة الجمجمة

  1. تطبيق الاصطناعي هلام المسيل للدموع لعيون الماوس. تماما إزالة الشعر من فروة الرأس من الفأرة باستخدام مقص أو الحلاقة الكهربائية.
  2. تعقيم فروة الرأس من خلال تطبيق حل بوفيدون اليود. السماح ليجف. ثم، تحت المجهر ضوء، وإزالة الجلد من فروة الرأس من الفأرة، وفضح تماما العظام الجدارية والعظام الأمامية الذيلية، ووضع العلامات bregma.
  3. تطبيق كمية صغيرة من 10٪ من محلول كلوريد الحديديك إلى الجمجمة من أجل تجفيف الأغشية لإزالة سهلة. إزالة الأغشية المجففة مع # 5/45 ملقط عن طريق كشط بلطف الجمجمة.
  4. تطبيق طبقة رقيقة من الغراء حول نافذة headplate. اضغط بلطف headplate ضد الجمجمة من الفأرة، والحفاظ على المنطقة من اهتمام في وسط النافذة. تطبيق قطرة من الاسمنت الأسنان إلى headplate لبلمرة الغراء.
  5. تطبيق طبقة رقيقةمن الغراء على طول حافة النافذة headplate لإنشاء خزان الذي عقد المالحة. مرة واحدة قد جفت الغراء، المسمار headplate في تسخير الماوس headplate.
    ملاحظة: تسخير الماوس headplate المستخدمة في هذا الإجراء هو بنية ذات قاعدة معدنية وأعمدة معدنية اثنين. على كل عمود هناك ربيع واحد والجوز الجناح. يتم وضع headplate على رأس النبع، وتشديد الجوز الجناح حتى الرأس وعلى مستوى لا يتحرك.
  6. إزالة أي الغراء من نافذة headplate باستخدام مثقاب تعلق على الحفر microtorque وضعت في 6000 دورة في الدقيقة. وقف كل 10-15 ثانية لمنع ارتفاع درجة حرارة الماوس الجمجمة التي يمكن أن تؤدي إلى أضرار هيكلية للسفن.
    1. باستخدام مثقاب الجديد، ضع microtorque الحفر 1.5 ملم أفقيا من خط الوسط (ثلث القطر من النافذة headplate). تبدأ رقيقة الجمجمة حول هذا الموقع في 4000 دورة في الدقيقة. نقل حفر بلطف عبر الجمجمة مع عدم وجود ضغط هبوطي المباشر.
    2. وقف دريللينغ كل 10-15 ثانية لمنع الانهاك الجمجمة الماوس. خلال هذا الوقت، وإزالة الغبار المتراكم الجمجمة باستخدام اسطوانة الهواء المضغوط.
    3. استخدام قطرات من RT المالحة لتبريد الجمجمة لمدة 5-10 ثانية. بلطف إزالة جميع السوائل مع الأنسجة الرخوة لمواصلة الجمجمة رقيق.
  7. لترقق النهائي من الجمجمة، ضع كمية صغيرة من المياه المالحة في الخزان headplate وبخفة اكتساح microblade الأسنان فوق منطقة الفائدة حتى السفن الصغيرة هي واضحة للعيان.

3. رصد معلمات الفسيولوجي

  1. بمجرد ضعفت الجمجمة تماما، فصل الماوس من حامل ووضعها على ظهرها. الشريط بلطف إلى أسفل ساقيه الخلفيتين لفضح بوضوح الفخذين وسطي.
  2. إزالة الشعر على حد سواء الفخذين وسطي مع مقص أو آلة الحلاقة الكهربائية. تطهير موقع الجراحية من خلال تغطية الفخذين مع بوفيدون اليود.
  3. قرصة الجلد على الفخذ الأيمن وسطي فوق الوريد الفخذيوالشريان باستخدام ملقط # 5. برفق الجلد صعودا واستخدام المقص لقطع وإزالة الجلد.
    ملاحظة: محجوز الفخذ الأيسر في حالة المضاعفات الجراحية (الشذوذ الأوعية الدموية والأوعية تمزق).
  4. تطبيق ما يقرب من 3-5 قطرات من المياه المالحة 0.9٪ إلى موقع الجراحية. وهذا يسمح لأكبر التكبير من السفن، وكذلك الحفاظ على موقع رطب ومنع جفاف السفن. فصل الوريد الفخذي من الشريان عن طريق تشريح بصراحة في حزمة وعائية عصبية الفخذ باستخدام اثنين # 5/45 ملقط.
  5. وضع اثنين، 3 قطع سم من الخيط الجراحي تحت الشريان الفخذي حوالي 1 سم عن بعضها البعض. تطور في اتجاه عقارب الساعة خياطة العلوي لإنشاء وقف النزف الوعائي التي من شأنها أن تساعد في منع فقدان الدم بصورة مفرطة خلال القسطرة.
  6. إجراء شق صغير في الشريان الفخذي باستخدام مقص الربيع. وضع القسطرة في الشريان من خلال شق والتقدم حتى القسطرة آمن داخل الشريان.
    7. لفك جديلة خياطة العليا (وقف النزف) لتقييم للكشف عن التسربات ووضع القسطرة السليم. تأمين القسطرة في الشريان الفخذي من خلال ربط اثنين من عقدة حول القسطرة داخل الوعاء باستخدام الخيوط الجراحية.
  7. ضخ 10 ميكرولتر من الهيبارين (100 وحدة دولية / مل) من خلال القسطرة لمنع تخثر الدم. ثم، جراحيا إغلاق الفخذ الأيمن عن طريق خياطة الجلد مع خياطة 4-0 في نمط توقف بسيط.
  8. ضخ 50 ميكرولتر من يوريتان (1.2 ملغ / غ) البريتونى في الربع السفلي الأيمن. أكرر بعد خمس دقائق مع حقنة أخرى 50 ميكرولتر إلى الربع السفلي الأيسر ليصبح المجموع 100 ميكرولتر من يوريتان داخل الصفاق. خفض ببطء مستويات الأيزوفلورين إلى ما يقرب من 0.25٪ في حين إعادة فحص بالتزامن الماوس لعمق التخدير.
    ملاحظة: حافظ على إبرة سطحية داخل التجويف البريتوني على طول جدار البطن الخلفي بحيث لا خرم الأمعاء. ويمكن تحقيق ذلك عن طريق معسر المستقيمة مو البطنscles بعيدا عن الأحشاء ثم عن طريق الحقن.
  9. باستخدام الأنابيب الشعرية، وجمع عينة 40 ميكرولتر من الدم الشرياني من القسطرة. إرفاق القسطرة إلى محول ضغط الدم مزودة محبس رباعية مليئة المالحة ومليئة الهيبارين حقنة.
  10. الشريط محول ضغط الدم إلى جهاز جراحي لمنع إزالة غير مقصودة من القسطرة. بدء رصد الضغط الشرياني يعني.
  11. إدراج أنبوب الدم الشعرية شغل في منفذ دخول محلل غازات الدم. مرة واحدة وقد تم استخراج كافة الدم، وإزالة أنبوب شعري من ميناء الدخول. سوف تظهر مستويات O 2 و CO غاز 2 الدم على ورقة مطبوعة من محلل غازات الدم.

4. حقن من صبغ نيون

  1. قرصة الجلد على الفخذ الأيسر وسطي باستخدام ملقط # 5. برفق الجلد صعودا واستخدام المقص لقطع وإزالة الجلد. إعداد ديكستران مترافق الحمراء التي تنبعث منها رودامين صبغ(70 كيلو دالتون) (10 ملغم / كغم الذائبة في المياه المالحة).
  2. تحديد الفخذ vein.Using حقنة 1 مل مع 30 G إبرة المرفقة، رسم الحل أعدت مسبقا من صبغة الفلورسنت المناسب للتصوير على خط 130 ميكرولتر من الحقنة. إزالة جميع فقاعات الهواء عن طريق رسم الصبغة تماما في حقنة ويسددها بقوة الجدار حقنة.
    1. ثني G 30 إبرة في وحوالي 30 درجة زاوية عن طريق الضغط عليه ضد سطح صلب الجانب شطبة تصل. شغل الإبرة مع الصبغة وتجاهل أي السائل الزائد، وترك العينة 100 ميكرولتر.
  3. حقن العينة 100 ميكرولتر من صبغ ببطء في الوريد الفخذي. بعد إزالة الإبرة، وتطبيق ثابت والضغط برفق لموقع الحقن لوقف أي نزيف. السماح للصبغ أن تعمم لمدة 5 دقائق.
    ملاحظة: بدلا من ذلك، الوريد الفخذي الأيمن يمكن أن تستخدم بدلا من ذلك لحقن صبغة الفلورسنت لمنع المزيد من فقدان الدم من خلال إنشاء موقع الجراحة أخرى. وبالإضافة إلى ذلك، إذا كانالحيوان ينزف دون حسيب ولا رقيب من موقع الجراحية، وهذا قد يكون دليلا على أن الكثير من الهيبارين أعطيت لطرد القسطرة. إذا لم يكن هناك تخثر في غضون 10-15 دقيقة والفأر لا يزال ينزف، والنظر في إعادة التجربة مع ماوس جديد.
  4. إغلاق الفخذ اليسرى عن طريق خياطة الجلد جنبا إلى جنب مع خياطة 4-0، ثم الوجه بعناية الماوس على المعدة لها، ووضعه في تسخير الماوس headplate.

5. في فيفو ثنائي الفوتون التصوير

  1. نقل جهاز جراحي لالمجهر ثنائي الفوتون، مع التأكد من الحفاظ على مستويات التخدير مستمرة. وضع كمية صغيرة من المياه المالحة 0.9٪ إلى الخزان headplate وانخفاض الهدف المجهر بحيث يأتي في اتصال مع المياه المالحة. تحديد المنطقة ذات الاهتمام باستخدام الهدف-عرض brightfield
  2. ضبط الليزر الإثارة ثنائي الفوتون إلى الطول الموجي المناسب لصبغة الفلورسنت. بدء اثنين من الفوتون التصوير باستخدام 25X سbjective.
    لاحظ أنه في هذه التجارب استخدمنا ديكستران مترافق إلى أحمر ينبعث منها صبغة رودامين الذي كان متحمس عند طول موجي 780 نانومتر ل. A 607/36 ممر الموجة مرشح الانبعاثات للكشف عن مضان من الصبغة، و480/20 ممر الموجة مرشح الانبعاثات كانت تستخدم للكشف عن تألق ذاتي الشرايين
  3. تحديد موقع الشعرية سرير على شاشة عرض، وتضخيم هذا المجال باستخدام زووم بصري 2. صور اكتساب من الشعيرات الدموية باستخدام برامج التصوير ثنائي الفوتون.
  4. بعد اكتمال التصوير، تضحية الماوس بواسطة الخلع عنق الرحم تليها قطع الرأس.

6. التصوير فيفو السابقين ثنائي الفوتون

  1. باستخدام مقص غرامة اضافية، وجعل شق في فروة الرأس من العظام الجداريين في العظام الأمامية من الفأرة. تأمين الجلد على جانبي الجمجمة مع إصبع مؤشر والإبهام.
  2. وضع مقص غرامة اضافية تحت العظم الجداري وسطي وقطع الجمجمة على طول الدرز السهمي. وقف قطع الجمجمة حوالي 3 ملم بعد bregma علامات.
    ملاحظة: تطبيق الضغط التصاعدي عندما قطع الجمجمة لمنع قطع الدماغ.
  3. باستخدام ملقط # 5، فصل الجمجمة من الدماغ وإزالة بعناية أي السحايا من سطح الدماغ. يمكن السحايا المتبقية ممزق بالصدفه الدماغ. وينبغي اتخاذ الحذر الشديد لتجنب ذلك. الشريحة بلطف # 5 ملقط تحت المخ تتقدم ببطء إلى الأمام حتى الدماغ خالية من الجمجمة.
    ملاحظة: هذا الضغط النزولي ينبغي أن تستخدم من أجل تجنب ثقب الدماغ.
  4. وضع الدماغ في أداة الدماغ باجتزاء محددة للفئران. غسل الدماغ عن طريق تطبيق قطرات من السائل النخاعي المفتعل حول الدماغ.
  5. إزالة 2 مم قسم الاكليلية من الدماغ من bregma 0 إلى bregma -2. وضع قسم الاكليلية على شريحة زجاجية مقعرة تحتوي على السائل المخي الشوكي الاصطناعي مع 0 bregma (معظم جزء من الجمجمة القسم) التي تواجه صعودا. تغطية بلطف SL الدماغكريم مع زلة غطاء زجاجي.
    ملاحظة: تجنب الضغط على الزجاج مرة واحدة وضعت في قسم المخ لأن هذا قد تشوه بنية الأوعية الدموية.
  6. نقل الشريحة إلى مرحلة المجهر ووضع كمية صغيرة من المياه المالحة 0.9٪ على زلة غطاء. انخفاض الهدف المجهر حتى يأتي في اتصال مع المياه المالحة. تحديد موقع خط الوسط من الدماغ باستخدام الهدف brightfield.
  7. بدء التصوير ثنائي الفوتون وتحديد خط الوسط مرة أخرى باستخدام الهدف 25X. تحقيق هذا من خلال البحث عن الشق الطولي على السطح القشري من قسم الاكليلية. وضع الحافة اليمنى من الشاشة التصوير على خط الوسط وتحريك الشاشة أفقيا المشاهد على ثلاثة إطارات كاملة (حوالي 1.5 مم من خط الوسط).
    لاحظ أنه في هذه التجارب، وكانت المعلمات التصوير مماثلة لتلك المذكورة في المذكرة في الخطوة 5.2.
  8. تحديد العمق الذي الشعيرات الدموية هي بالكاد مرئية على الشاشة الرأي. خفض الطائرة من التركيز إضافي 20ميكرون لتحديد الجزء العلوي من ض المكدس.
  9. تعيين سمك الصورة ل1 ميكرون. خفض شاشة عرض 100 ميكرون وضبط قوة الليزر مثل جميع أنحاء أن أقل من 1٪ من وحدات البكسل مشبعة.
    ملاحظة: يتم تجميع الصور ض المكدس من سلسلة من 100 500x500x1 التوالي الصور ميكرومتر. وكلما زاد ض المكدس فإن أكثر دقة الحسابات مرحلة ما بعد المعالجة تكون. عموما، محاولة لجمع ض المكدس من 100 ميكرون أو أكبر.
  10. اضغط على أيقونة XY كرر يليه رمز XY المجاور. وبمجرد أن ض المكدس كاملة، اضغط على أيقونة سلسلة حررت وحفظ الملف.

7. معالجة البيانات

  1. فتح في الجسم الحي الصورة الشعرية في برنامج يماغيج. تعيين بكسل إلى نسبة المسافة على أساس القيم التي تم الحصول عليها من برنامج ثنائي الفوتون يدويا.
    1. حدد * * التوالي أيقونة من القائمة أدوات. رسم خط يمتد من جدار الشعيرات الدموية واحد إلى ممن لهمموقع جدار الشعيرات الدموية، وسجل طول المقدمة من يماغيج.
      لاحظ أنه قد يكون من الضروري لتكبير الصورة من أجل وضع تصور واضح حواف جدران الشعيرات الدموية.
    2. كرر الخطوة 7.1.1 في مواقع مختلفة على طول شعري، فضلا عن الشعيرات الدموية متعددة في الصورة.
  2. فتح ملف ض المكدس في البرنامج التحليلي مثل أميرة. حدد رمز الشعيرة محرر من شريط الأدوات التطبيق الفرعية
    1. تعيين سمك المشاهد إلى ما يقرب من 20. نقل المشاهد إما إلى أعلى أو أسفل ض المكدس.
    2. حدد رمز تتبع وتحريك المؤشر فوق الصورة المحملة. مكان العقد على الشعيرات الدموية في المواقع المذكورة في الشكل 2C. سوف تظهر تلقائيا قطاعات بين العقد المجاورة. تتبع الشعيرات الدموية في جميع أنحاء كامل ض المكدس.
      ملاحظة: سوف يكون من الضروري وضع العقد في بين نقطة النهاية ونقطة فرع من أجل تتبع الشعيرات الدموية عبتيoughout ض المكدس.
    3. لإزالة هذه العقد، انقر فوق رمز إزالة المتوسط.
      ملاحظة: هذا يمكن أن تخلق شرائح الخاطئة يحلق التي يجب إزالتها يدويا عن طريق اختيار حلقة باستخدام اختر رمز واحد، ومن ثم اختيار أيقونة إزالة مختارة. إذا استمرت حلقات لتظهر في نفس المنطقة خلال تتبع، فمن المرجح أن وضعت العقد على الشعيرات الدموية المختلفة.
    4. مرة واحدة تعقب اكتمال، حدد رمز الرسم البياني معلومات لفتح جدول بيانات تحتوي على المعلمات الأوعية الدموية استخراج تلقائيا. وهي متاحة على شاشة العرض الرئيسية عدد العقد والقطاعات.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يسمح النافذة القشرية رقيقة الجمجمة في الجسم الحي اثنين الفوتون التصوير من الشعيرات الدموية القشرية (الشكل 1). منطقة مناسبة لصورة تظهر عديدة، الشعيرات الدموية متميزة (الشكل 1A). في نفس مجال الرؤية، ليس هناك الشرايين جدار الخلية تألق ذاتي، وربما تكون هناك إشارات الفلورسنت الأخرى، مثل الكولاجين مضان، الناجم عن الجيل التوافقي الثاني 11 (الشكل 1B).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الطريقة الموصوفة هنا يمكن تطبيقها على تحليل الهياكل الاوعية الدموية الدقيقة في الدماغ في مجموعة واسعة من النماذج التجريبية / الإعدادات. لنجاح هذا الأسلوب، يجب أن يتقن ثلاث خطوات حاسمة. أولا، يجب على نافذة رقيقة الجمجمة لا ضرر الجمجمة أو الدماغ الكامنة. فمن السهل أن ثقب في الجمجمة خلال رقيق، أو التسبب في الحرارة الناجم عن تسرب الأوعية الدموية. هذا يمكن أن تتداخل مع التصوير مثل صبغة الفلورسنت سوف يتسرب إلى الطائرة من التركيز وتحجب الشعيرات الدموية. إذا الجمجمة كثيرا ما يكسر أثناء إع...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نشكر ماريا جيبسون والدكتورة بايفي جوردان والدكتورة ليندا كالاهان في جامعة روتشستر Multiphoton Core على المشورة الفنية طوال فترة الانتهاء من هذا البروتوكول. كما نشكر الدكتور تشانغيونغ فنغ على المشورة الإحصائية المتخصصة، والدكتور مايكين نيدرجارد من المركز الطبي بجامعة روتشستر على تصميم الغطاء الأمامي المستخدم في هذه الورقة. تم دعم هذا العمل جزئيا من خلال المنح T32GM007356 و R01DA026325 من المعاهد الوطنية للصحة (NIH). ومن قبل مركز جامعة روتشستر لأبحاث الإيدز P30AI078498 منحة (NIH).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
شركة Leica MicroscopeLeica Inc.MZ8
عالية الكثافة مضيئةدولان جينر180
وسادة التدفئةسترايكر TP3E
T / PUMPGaymar Industries، Inc.TP-500
TEC-4 Isoflurane VaporizerDatex Ohmeda447
جل الدموع الاصطناعيButler AHS7312
محلول بوفيدون اليود  Aplicare52380-1855-9
لمقص بون الفائقالدقة 14084-08
دوموت # 5العلوم الدقيقة11295-10
دومون # 5/45العلوم الدقيقة11251-35
محلول كلوريد الحديديكشركة ريكا للكيماويات3120-16
لوكتايت 454 جل لاصق فوري بريزمHenkel45404
Dental CementStoelting51459
Microtoruqe II HandpiecePearson DentalR14-0002
005 Burr لأدوات العلوم الدقيقة للحفر الصغير19007-05
نورلاند (شفرة دقيقة للأسنان)Salvin Dental6900
UrethaneSigma-AldrichU2500المجموعة 2 ب مادة مسرطنة
مضفر خياطةEthicon735G
Vannas الربيع مقصأدوات العلوم الدقيقة15000-03
  القسطرة الشريانيةSAI Infusion TechnologiesMAC-01تم تمديد نهاية القسطرة يدويا من أجل تقليل قطرها.
الدم MoniterWorld Precision IntrumentsSYS-BP1
محول ضغط الدم وكابلالعالم الدقة INTRUMENTSBLPR2
RAPIDLab محلل غاز الدم  سيمنز 248
40 & ل أنبوب شعريVWR15401-413
تكساس ريد ديكستران (70،000 ميجاوات ، 10 مجم / كجم مذاب في محلول ملحي)InvitrogenD-1830
مصفوفة قطاعة دماغ الفأر البالغZivic InstrumentsBSMAS001-1
أوليمبوس فلوفيو 1000 AOM-MPM مجهر متعدد الفوتونOlypmusFV-1000 MPE
MaiTai HP DeepSee Ti: Sa ليزرأطياف الفيزياء
المعاهد الوطنية للصحة(NIH) ImageJمتوفر على
http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html Amira SoftwareVisage Imaging 
أدوات العلوم الدقيقة أدوات الملقط أدوات الملقط Kit شفرة ضغط Software (NIH)

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kraft-Terry, S. D., Buch, S. J., Fox, H. S., Gendelman, H. E. A coat of many colors: neuroimmune crosstalk in human immunodeficiency virus infection. Neuron. 64 (1), 133-145 (2009).
  2. Ghafouri, M., Amini, S., Khalili, K., Sawaya, B. E. HIV-1 associated dementia: symptoms and causes. Retrovirology. 3, 28(2006).
  3. Antinori, A., et al. Updated research nosology for HIV-associated neurocognitive disorders. Neurology. 69 (18), 1789-1799 (2007).
  4. Clifford, D. B., Ances, B. M. HIV-associated neurocognitive disorder. The Lancet. Infectious diseases. 13 (11), 976-986 (2013).
  5. Lindl, K. A., Marks, D. R., Kolson, D. L., Jordan-Sciutto, K. L. HIV-associated neurocognitive disorder: pathogenesis and therapeutic opportunities. Journal of neuroimmune pharmacology : the official journal of the Society on NeuroImmune Pharmacology. 5 (3), 294-309 (2010).
  6. Zimmermann, J., et al. CNS-targeted production of IL-17A induces glial activation, microvascular pathology and enhances the neuroinflammatory response to systemic endotoxemia. PloS one. 8 (2), e57307(2013).
  7. Silva, J. N., et al. Chronic central nervous system expression of HIV-1 Tat leads to accelerated rarefaction of neocortical capillaries and loss of red blood cell velocity heterogeneity. Microcirculation. 21 (7), 664-676 (2014).
  8. Marker, D. F., Tremblay, M. E., Lu, S. M., Majewska, A. K., Gelbard, H. A. A thin-skull window technique for chronic two-photon in vivo imaging of murine microglia in models of neuroinflammation. Journal of visualized experiments : JoVE. (43), (2010).
  9. Kleinfeld, D., Mitra, P. P., Helmchen, F., Denk, W. Fluctuations and stimulus-induced changes in blood flow observed in individual capillaries in layers 2 through 4 of rat neocortex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (26), 15741-15746 (1998).
  10. Bruce-Keller, A. J., et al. Morphine causes rapid increases in glial activation and neuronal injury in the striatum of inducible HIV-1 Tat transgenic mice. Glia. 56 (13), 1414-1427 (2008).
  11. Zoumi, A., Yeh, A., Tromberg, B. J. Imaging cells and extracellular matrix in vivo by using second-harmonic generation and two-photon excited fluorescence. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (17), 11014-11019 (2002).
  12. Silva, J., et al. Transient hypercapnia reveals an underlying cerebrovascular pathology in a murine model for HIV-1 associated neuroinflammation: role of NO-cGMP signaling and normalization by inhibition of cyclic nucleotide phosphodiesterase-5. Journal of neuroinflammation. 9, 253(2012).
  13. Farber, N. E., et al. Region-specific and agent-specific dilation of intracerebral microvessels by volatile anesthetics in rat brain slices. Anesthesiology. 87 (5), 1191-1198 (1997).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Two photon MicroscopyCortical Capillary DensityHIV induced NeuroinflammationMouse Brain SectionsCapillary Network AnalysisIn Vivo ImagingEx Vivo ImagingCerebral Vascular ArchitectureHIV 1 Tat Transgenic MiceCapillary Morphological Parameters

Related Articles