وضع العمود الفقري مكتبة الببتيد دوري كما المحتملة ضد الطفيليات التداوي عن طريق الميكروويف تشعيع

Summary

تم تحديد طريقة بسيطة وعامة لتخليق الببتيدات الدورية باستخدام تشعيع الميكروويف. يتيح هذا الإجراء تخليق الببتيدات الدورية الأساسية مع مجموعة من المطابقات المختلفة مع الاحتفاظ بالسلاسل الجانبية والشقوق الدوائية., وبالتالي, يسمح بفحص التشكل النشط بيولوجيا.

Abstract

تفاعلات البروتين البروتين (مثبطات مضخة البروتون) هي المعنية عن كثب في جميع العمليات الحيوية تقريبا، وترتبط لكثير من الأمراض البشرية. ولذلك، هناك جهد كبير لاستهداف مثبطات مضخة البروتون في مجال البحوث الأساسية وصناعة الأدوية. واجهات البروتين البروتين عادة ما تكون كبيرة، شقة، وغالبا ما تفتقر إلى جيوب، تعقيد اكتشاف الجزيئات الصغيرة التي تستهدف هذه المواقع. نهج استهداف بديلة باستخدام أجسام مضادة لها قيود بسبب سوء التوافر الحيوي عن طريق الفم، وانخفاض الخلية النفاذية، وعدم كفاءة الإنتاج.

استخدام الببتيدات لاستهداف واجهات PPI ديها العديد من المزايا. الببتيدات لديها أعلى من المرونة بتكوين وزيادة الانتقائية، وعادة ما تكون غير مكلفة. ومع ذلك، الببتيدات لها حدودها الخاصة بما في ذلك سوء الاستقرار وعدم الكفاءة عبور أغشية الخلايا. للتغلب على هذه القيود، الببتيد cyclization لا يمكن أن يؤديها. وقد تجلى Cyclization لتحسين الببتيد الانتقائيةوالاستقرار الأيض، والتوافر البيولوجي. ومع ذلك، توقع التشكل النشطة بيولوجيا من الببتيد دوري ليست تافهة. للتغلب على هذا التحدي، واحدة نهج جذابة على الشاشة مكتبة مركزة على الشاشة فيه جميع الببتيدات الحلقية العمود الفقري لها تسلسل الأساسي نفسه، ولكنها تختلف في المعايير التي تؤثر على التشكل، مثل حجم الحلقة والموقف.

وصفنا بروتوكول مفصلة لتجميع مكتبة من العمود الفقري الببتيدات الحلقية التي تستهدف مثبطات مضخة البروتون الطفيلي محددة. باستخدام نهج التصميم الرشيد، وضعنا الببتيدات المستمدة من البروتين سقالة L eishmania مستقبلات لتنشيط C-كيناز (قلة). افترضنا أن تسلسل في LACK التي يتم حفظها في الطفيليات، ولكن ليس في homolog المضيف الثدييات، قد تمثل مواقع التفاعل البروتينات التي تعتبر بالغة الأهمية لبقاء الطفيليات. تم توليفها الببتيدات الحلقية باستخدام أشعة المايكروويف لتقليل زمن رد الفعل وزيادةكفاءة. تطوير مكتبة العمود الفقري الببتيدات الحلقية مع أحجام رنين مختلفة تسهل شاشة منهجية لالتشكل النشطة الأكثر البيولوجي. يوفر هذا الأسلوب بشكل عام، وبسرعة، والسطحية لتجميع الببتيدات الحلقية.

Introduction

تفاعلات البروتين البروتين (مثبطات مضخة البروتون) تلعب دورا محوريا في معظم العمليات الحيوية، من داخل الخلايا نقل الإشارة إلى خلية الموت ^1. وبالتالي، تستهدف مثبطات مضخة البروتون هي ذات أهمية أساسية لالبحوث الأساسية والتطبيقات العلاجية. مثبطات مضخة البروتون يمكن تنظيمها من قبل الأجسام المضادة محددة ومستقرة، ولكن الأجسام المضادة هي مكلفة وصعبة لتصنيع ويعانون من ضعف التوافر البيولوجي. بدلا من ذلك، مثبطات مضخة البروتون يمكن أن تكون مستهدفة من قبل الجزيئات الصغيرة. الجزيئات الصغيرة هي أسهل لتجميع وغير مكلفة بالمقارنة مع الأجسام المضادة. ومع ذلك، فهي نسبيا أقل مرونة وتناسب أفضل لتجاويف صغيرة بدلا من واجهات كبيرة من البروتين البروتين ^2،3. وقد أثبتت الدراسات المتنوعة التي الببتيدات، والتي هي أبسط وأرخص من الأجسام المضادة وأكثر مرونة من جزيئات صغيرة، يمكن ربط واجهات البروتين وتنظيم مثبطات مضخة البروتون ^4،5. وتقدر قيمة سوق الببتيد العلاجي العالمي حول 15000000000 دولار في عام 2013 وينمو 10.5٪ أنواLLY ^6. وعلاوة على ذلك، هناك أكثر من 50 الببتيدات تسويقها، نحو 270 الببتيدات في مراحل مختلفة من الاختبارات السريرية، وحوالي 400 الببتيدات في مراحل ما قبل السريرية المتقدمة ^7. على الرغم من أن العديد من الببتيدات تستخدم كأدوية، والببتيدات لا تزال تشكل العديد من التحديات التي تحد من تطبيق على نطاق واسع من بينها قلة التوافر البيولوجي والاستقرار، وعدم الكفاءة في أغشية الخلايا المعبر، والمرونة بتكوين ^8،9. بديل واحد لتجاوز هذه العوائق هو تطبيق تعديلات مختلفة مثل المحلي (حمض أميني-D و N-الألكلة) والعالمي (cyclization) القيود ^8،10-12. كما تحدث هذه التعديلات بشكل طبيعي. على سبيل المثال، السيكلوسبورين A، الببتيد الطبيعي دوري المناعة، ويحتوي على الأحماض الأمينية-D واحد ويخضع لتعديلات N-الألكلة ^13،14.

تعديل الأحماض الأمينية الطبيعية للحث على القيود المحلية، مثل D- وN-الألكلة، وغالبا ما يؤثر على الببتيد9؛ ق النشاط البيولوجي. ومع ذلك، cyclization، التي تتابع الفائدة يمكن أن يبقى كما هو، هو أكثر عرضة للحفاظ على النشاط البيولوجي. Cyclization هو وسيلة جذابة للغاية لتقييد مساحة بتكوين الببتيد عن طريق الحد من التوازن بين التشكل مختلفة. فإنه عادة ما يزيد من النشاط البيولوجي والانتقائية من خلال الحد من الببتيد إلى التشكل النشط الذي يتوسط وظيفة واحدة فقط. Cyclization أيضا يحسن الاستقرار الببتيد عن طريق الحفاظ على الببتيد في التشكل الذي أقل معترف بها من قبل الانزيمات المهينة. في الواقع، عرضت الببتيدات الحلقية قد تحسنت الاستقرار الأيض، التوافر البيولوجي، والانتقائية مقارنة مع نظرائهم الخطية ^15-17.

ومع ذلك، يمكن cyclization أن يكون سلاح ذو حدين لأنه في بعض الحالات قد يمنع تقييد الببتيدات من تحقيق التشكل النشطة بيولوجيا. للتغلب على هذه العقبة، مكتبة مركزة فيه جميع الببتيدات لديها نفس sequenc الأوليةيمكن توليفها الإلكترونية وبالتالي ثابتة pharmacophores. الببتيدات في المكتبة تختلف في المعايير التي تؤثر على هيكلها، مثل حجم الحلبة، والموقف، وذلك لفحص في وقت لاحق لالتشكل الأكثر النشطة بيولوجيا ^9،18.

الببتيدات يمكن توليفها في كل حل ونهج التوليف الببتيد الحالة الصلبة (SPPS)، والتي هي الآن نهج التوليف الببتيد أكثر انتشارا وسيجري بحثه باستفاضة. SPPS هو العملية التي تتم التحولات الكيميائية على دعم قوي من خلال رابط لإعداد مجموعة واسعة من المركبات الاصطناعية ^19. SPPS يتيح تجميع الببتيدات بواسطة اقتران التوالي من الأحماض الأمينية بطريقة متدرجة من C-المحطة، التي يتم تركيبها على دعم قوي، إلى N-المحطة. يجب أن ملثمين الحامض الجانب سلاسل N-α-الأمينية مع حماية الفئات التي هي مستقرة في ظروف التفاعل استخدمت خلال الببتيد استطالة لضمان إضافة حمض أميني واحد في كل شارعالجيش الشعبي. في الخطوة النهائية، يتم تحرير الببتيد من الراتنج والجانب سلسلة حماية الفئات تتم إزالة متزامنة. في الوقت الذي يجري تصنيعه الببتيد، يمكن إزالة جميع الكواشف القابلة للذوبان من الدعم مصفوفة الببتيد الصلبة عن طريق الترشيح وجرفت في نهاية كل خطوة اقتران. مع مثل هذا النظام، وفائض كبير من المواد الكيميائية في تركيز عال يمكن أن تدفع ردود الفعل اقتران على الانتهاء وجميع الخطوات التوليف لا يمكن أن يؤديها في السفينة نفسها دون أي نقل للمواد ^20.

على الرغم من SPPS بعض القيود مثل إنتاج ردود فعل غير مكتملة، التفاعلات الجانبية، الكواشف النجسة، فضلا عن الصعوبات رصد رد فعل ^21، جعلت من "المعيار الذهبي" لتخليق الببتيد مزايا SPPS. وتشمل هذه المزايا خيار دمج الأحماض الأمينية غير طبيعية، والأتمتة، وتنقية سهلة، والخسائر المادية مصغر، واستخدام الكواشف الزائدة، مما أدى إلىعوائد عالية. وقد تبين SPPS أن تكون مفيدة للغاية في تركيب سلاسل صعبة ^21،22، التعديلات الفلورسنت ^23، والمكتبات الببتيد ^24،25. SPPS هو أيضا مفيد جدا لغيرها من التجمعات بولي سلسلة مثل [أليغنوكليوتيد ^{26،27، 28،29} يغوساكاريدس، والببتيد الأحماض النووية ^30،31. ومن المثير للاهتمام، في بعض الحالات، تبين SPPS ليكون من المفيد لتجميع الجزيئات الصغيرة التي تتم عادة في حل ^32،33. يستخدم SPPS سواء في نطاق ضيق للبحث والتدريس ^34،35 وكذلك على نطاق واسع في صناعة ^36-38.

استراتيجيات تركيب اثنين من التي تستخدم بشكل رئيسي في منهجية SPPS لتركيب الببتيدات هي butyloxycarbonyl (بوك) و 9 fluorenylmethoxycarbonyl (Fmoc). كانت الاستراتيجية الأصلية قدم لSPPS بوك، الأمر الذي يتطلب شروط حمض قوية لإزالة جانب سلسلة حماية الفئات ويلتصق الببتيد من صESIN. التوليف الببتيد تستند Fmoc، ومع ذلك، يستخدم الظروف قاعدة المعتدلة ويعتبر بديل أكثر اعتدالا لحمض عطوب بروتوكول بوك ^39. استراتيجية Fmoc تستخدم المتعامدة تي بوتيل (TBU) حماية جانبية السلسلة التي تم إزالتها في الخطوة الأخيرة من التوليف بينما الشق الببتيد من راتنج تحت الظروف الحمضية.

ويرد المبدأ العام لتخليق الببتيد على دعم قوي في الشكل 1. والأحماض الأمينية الأولي، من قبل ملثمين مجموعة حماية مؤقتة على N-α-المحطة، يتم تحميل على الراتنج من C-المحطة. ويستخدم فريق حماية شبه دائمة لإخفاء سلسلة الجانب أيضا إذا لزم الأمر (الشكل 1، الخطوة 1). يتم تجميع توليف الببتيد الهدف من C-محطة إلى N-محطة بدورات متكررة من deprotection من مجموعة حماية N-α-مؤقتة (الشكل 1، الخطوة 2) واقتران المقبل الأحماض الأمينية المحمية (الشكل 1 أونج> الخطوة 3). بعد تحميل الماضي الأحماض الأمينية (الشكل 1، الخطوة 4)، هو المشقوق الببتيد من الدعم الراتنج وطرد الجماعات حماية شبه دائمة (الشكل 1، الخطوة 5).

الشكل 1. مخطط عام للنفايات الصلبة الببتيد مرحلة التوليف. ويرتكز هذا الحمض الأميني N-α محمية باستخدام مجموعة الكربوكسيل عن طريق رابط لالراتنج (الخطوة 1). يتم تجميعها الببتيد المطلوب بطريقة خطية من C-محطة إلى N-محطة بدورات متكررة من deprotection من مجموعة حماية مؤقتة (TPG) من N-α (الخطوة 2) واقتران الأحماض الأمينية (الخطوة 3). بعد إنجاز عملية التوليف (الخطوة 4)، وdeprotected المجموعات حماية شبه دائمة (SPG) أثناء الانقسام الببتيد (الخطوة 5).الحصول = "_ فارغة"> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

بعد تجميع سلسلة الببتيد كاملة، لا يمكن أن يتحقق cyclization عدة بدائل: (A) وجها لالذيل cyclization - وهذا هو وسيلة مريحة ولكن محدودة لأنها توفر خيار واحد فقط لcyclization (الشكل 2A)، (B) cyclization باستخدام الأحماض الأمينية من سلسلة من الفائدة التي تحتوي على المجموعات الوظيفية النشطة بيولوجيا - ومع ذلك، فإن استخدام هذه الأحماض الأمينية قد تؤثر على النشاط البيولوجي (الشكل 2B)، و (C) cyclization بإضافة الأحماض الأمينية (أو اللبنات الأخرى) من دون إزعاج تسلسل النشطة بيولوجيا. إدخال هذه الجزيئات هي على نطاق واسع لأنه يتيح إنتاج المكتبات تركز دون تعديل تسلسل الفائدة (الشكل 2C).

Figure 2. استراتيجيات cyclization الببتيد البديل (A) الرأس الى الذيل cyclization، من خلال السندات الببتيد بين C-محطة وN-محطة؛ (B) cyclization بين المجموعات الوظيفية مثل السندات ثاني كبريتيد بين السيستين المخلفات (1)، أو سندات أميد بين السلاسل الجانبية من ليسين لالأسبارتيك / حمض الجلوتاميك (2)، أو سلسلة جانبية لN- أو C-محطة (3 -4)؛ (C) cyclization بإضافة الأحماض الأمينية إضافية أو مشتقات الأحماض الأمينية أو الجزيئات الصغيرة، على سبيل المثال قبل (R0) وبعد (R7) تسلسل النشطة بيولوجيا. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

يستخدم توليف أشعة الميكروويف لتسخين ردود الفعل، وبالتالي تسريع الكيميائية العضوية التي يساعدها الميكروويف التحولات ^40،41. ويستند كيمياء الموجات الصغيرة على قدرة كاشف / مذيب لاستيعابالميكروويف الطاقة وتحويله إلى حرارة ^42. قبل أن تصبح هذه التكنولوجيا على نطاق واسع، وكان من العوائق الرئيسية التي يجب التغلب عليها، بما في ذلك التحكم واستنساخ بروتوكولات التوليف وعدم وجود نظم المتاحة لدرجة الحرارة والضغط ضوابط كافية ^43،44. وقد تم التقرير الأول من التوليف الببتيد بمساعدة الميكروويف باستخدام الميكروويف المطبخ لتجميع عدة الببتيدات قصيرة (7-10 الأحماض الأمينية) مع تحسن ملحوظ في كفاءة اقتران ونقاء ^45. وعلاوة على ذلك، وقد تبين طاقة الميكروويف إلى تقليل سلسلة التجميع، والحد من التفاعلات الجانبية، والحد من تروسم، وتحسين معدلات اقتران، وكلها حيوية لتسلسل صعبة وطويلة ^46-53.

حاليا استخدام الإشعاع الميكروويف لتركيب الببتيدات أو المركبات ذات الصلة على دعم قوي واسعة النطاق، بما في ذلك (A) التوليف في الماء بدلا من المذيبات العضوية ^54؛ (B) توليف الببتيدات معالتعديلات بعد متعدية المشتركة، مثل glycopeptides ^55-58 أو ^59-61 phosphopeptides، الذي التوليف يصعب عادة بسبب كفاءة اقتران منخفضة من إعاقة sterically مشتقات الأحماض الأمينية. (C) توليف الببتيد مع تعديل في العمود الفقري، مثل azapeptides، والتي يمكن أن يشكلها استبدال C (α) من بقايا الأحماض الأمينية مع ذرة النيتروجين ^62، أو peptoids، التي يتم توصيلها إلى سلسلة جانبية النيتروجين أميد بدلا من الذرة Cα ^63،64. (D) التوليف من الببتيدات الحلقية ^65-71. و (E) توليف المكتبات اندماجي ^51،72. وفي العديد من الحالات، ذكرت والكتاب كفاءة أعلى وتخفيض الوقت التوليف باستخدام أشعة الميكروويف بالمقارنة مع البروتوكول التقليدي.

باستخدام تصميم عقلاني ^73-75، وضعنا الببتيدات المضادة للالطفيلية التي كانت مستمدة من مستقبلات السقالة L eishmania في FOص تنشيط C-كيناز (قلة). LACK تلعب دورا هاما في المرحلة المبكرة من العدوى الليشمانيا ^76. الطفيليات معربا عن مستويات أدنى نقص تفشل في تتطفل حتى الفئران خطر المناعية ⁷⁷ كما تشارك نقص في عمليات الطفيلي يشير الأساسية وتخليق البروتين ^78. لذلك، وعدم هو بروتين سقالة الرئيسي ⁷⁹ وهدف المخدرات قيمة. التركيز على تسلسل في LACK التي يتم حفظها في الطفيليات، ولكن ليس في البلد المضيف الثدييات homolog RACK، حددنا من الأحماض الأمينية الببتيد 8 (RNGQCQRK) إنخفاضا الليشمانيا ليرة سورية. الجدوى في الثقافة.

هنا، نحن تصف بروتوكول لتركيب العمود الفقري دوري الببتيدات المستمدة من تسلسل البروتين LACK المذكورة أعلاه. تم توليفها الببتيدات على دعم قوي باستخدام الميكروويف التدفئة عن طريق منهجية SPPS مع بروتوكول Fmoc / TBU. تم مترافق الببتيدات إلى TAT _47-57 (YGRKKRRQRRR) الناقل الببتيد من خلال السندات أميد كماجزء من SPPS. وقد استخدم النقل استنادا TAT من مجموعة متنوعة من البضائع إلى داخل الخلايا لأكثر من 15 عاما، وقد تم تأكيد تسليم البضائع إلى العضيات التحت خلوية ^80. أربعة linkers مختلفة، السكسينيك وأنهيدريد الغلوتاريك وكذلك الأديبيك وحمض البيميليك، استخدمت لأداء cyclization لتوليد linkers حمض الكربوكسيلية من 2-5 الكربون. وقد تم Cyclization باستخدام طاقة الميكروويف، وأجريت الانقسام وجنبا إلى سلسلة خطوات deprotection النهائية يدويا بدون طاقة الميكروويف. استخدام المزج الميكروويف الآلي تحسين نقاء المنتج، وزيادة المحصول المنتج، وتخفيض مدة التوليف. ويمكن تطبيق هذا البروتوكول العام للدراسات الأخرى التي تستخدم الببتيدات لفهم الآلية الجزيئية مهمة في المختبر والمجراة وتطوير العقاقير المحتملة لعلاج أمراض الإنسان.

Protocol

معدات 1. وتحضير الكواشف

1. معدات إعداد
   1. تنفيذ كافة الخطوات داخل غطاء الدخان استخدام معدات الوقاية الشخصية المناسبة.
   2. توليف كيميائيا الببتيدات على دعم قوي باستخدام الميكروويف الببتيد مركب مع وحدة إضافية من اكتشاف مجهزة الألياف الضوئية مسبار درجة الحرارة للسيطرة على تسليم الميكروويف السلطة في وعاء التفاعل تفلون (30 مل، مع فريت الزجاج) أو في البولي بروبلين القابل للتصرف خرطوشة (12 مل، مع فريت الخشنة).
   3. لخلط الصحيح، توصيل التيار النيتروجين في وعاء التفاعل، أو بدلا من ذلك ختم طرفي خرطوشة البولي بروبلين، ووضع على شاكر دوارة.
   4. لاستنزاف خليط من رد فعل أو يغسل، الاتصال فراغ المنزل عن طريق فخ النفايات.
   5. وضع مسبار الألياف الضوئية إلى وعاء التفاعل.
2. إعداد الكواشف
   1. إعداد الراتنج وزنها عن طريق تزلج أميد الراتنج AM 100-200 شبكة (0.204 ملغ)إضافة 5 مل 1: 1 خليط من N، N -dimethylformamide (DMF) / ثنائي كلورو ميثان (DCM) إلى رد فعل خرطوشة السفينة / البولي بروبلين لغسل الراتنج أسفل، يهز لمدة 2-4 ساعة إلى تضخم بشكل صحيح، واستنزاف.
   2. إعداد 0.2 M 9-fluorenylmethoxycarbonyl (Fmoc) -amino الحلول الحمضية عن طريق إذابة المقابلة حمض Fmoc-الأمينية في DMF ودوامة الخليط حتى تذوب الأحماض الأمينية (الجدول 1).
   3. إعداد 0.45 M المنشط مزيج حل عن طريق إذابة 18.96 ز O - (benzotriazol-1-يل) - N، N، N، N 'يذوب hexafluorophosphate -tetramethyluronium (HBTU) في 100 مل DMF وvortexing لالخليط حتى صلب (الجدول 1).
   4. إعداد 2 M قاعدة المنشط مزيج حل من خلال الجمع بين 34.8 مل N، N -diisopropylethylamine (DIEA) مع 65.2 مل 1-ميثيل-2-pyrrolidinone (NMP) (الجدول 1).
   5. إعداد 0.1 M deprotection مزيج حل عن طريق إذابة هيدرات 3.37 ز 1-hydroxybenzotriazole (HOBt)في 250 مل من 20٪ ت / ت حل تأكسد في DMF وvortexing لالخليط حتى يذوب الصلبة (الجدول 1).

2. Fmoc المحمية الأحماض الأمينية اقتران

1. اقتران الأحماض الأمينية
   1. إضافة الأحماض الأمينية (2.5 مل) / المنشط (1 مل) / قاعدة المنشط (0.5 مل) إلى رد فعل خرطوشة السفينة / البولي بروبلين، والسماح للرد فعل المضي قدما لمدة 300 ثانية (25 W، 75 ° C، الجدول 2). استنزاف الحل.
   2. غسل الراتنج مع DMF. إضافة DMF إلى الراتنج لمدة 120 ثانية (7 مل، 0 W، RT) واستنزاف الحل. كرر خمس مرات.
2. deprotection Fmoc
   1. إضافة 7 مل من 20٪ تأكسد في DMF مع 0.1 M HOBt إلى رد فعل خرطوشة السفينة / البولي بروبلين واحتضان لمدة 30 ثانية (45 W، 75 ° C، الجدول 2).
   2. استنزاف خليط التفاعل.
   3. إضافة 7 مل من 20٪ تأكسد في DMF مع 0.1 M HOBt إلى رد فعل خرطوشة السفينة / البولي بروبلين واحتضان لمدة 180 ثانية (45 W، 75 ° C، الجدول 2).
   4. استنزاف خليط التفاعل.
   5. غسل الراتنج مع DMF. إضافة DMF إلى الراتنج لمدة 120 ثانية (7 مل 0 W، غ)، واستنزاف الحل. كرر خمس مرات.
      ملاحظة: اختياريا، وقفة الإجراء هنا وتستأنف في وقت لاحق.
3. بعد الأحماض الأمينية خطوة اقتران، وغسل الراتنج مع DCM ومخزن لعدة أيام على الأقل في 4 ° C (لمتجر فترة أطول الراتنج في - 20 ° C).
   1. نقل الراتنج من وعاء التفاعل على خرطوشة البولي بروبلين.
   2. غسل الراتنج مع DCM. إضافة DCM إلى الراتنج لمدة 120 ثانية (7 مل، 0 W، غ)، واستنزاف الحل. كرر ثلاث مرات.
   3. ختم خرطوشة البولي بروبلين بإحكام مع الغطاء العلوي ومحبس.
   4. قبل البدء في تركيب جديد، تنتفخ الراتنج لمدة 3-4 ساعة في DMF (7 مل).
4. رصد التوليف
   1. استخدام اختبار كايزر (النينهيدرين) أو الكلورانيل اختبار لتحديد بسرعة التقدم للالتوليف. اختياريا، نفذ رد فعل الانقسام على نطاق صغير لتحديد النقاء وكتلة الببتيد توليفها. انظر القسم 9.
      ملاحظة: لمزيد من استكشاف الأخطاء وإصلاحها انظر الجدول 3.
5. كرر الخطوات من 2.1 و 2.2 كما هو مطلوب لتجميع الببتيد المستهدفة: Arg(Pbf)-Asn(Trt)-Gly-Gln(Trt)-Cys(Trt)-Gln(Trt)-Arg(Pbf)-Lys(Boc)-Lys(Mtt)-Gly-Gly-Tyr(But)-Gly-Arg(Pbf)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Gln(Trt)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf).

3. الاندريد / حمض اقتران

1. اقتران أنهيدريد
   1. غسل الراتنج مع NMP. إضافة NMP إلى الراتنج لمدة 120 ثانية (7 مل، 0 W، غ)، واستنزاف الحل. كرر ثلاث مرات.
   2. حل 10 يعادله من أنهيدريد المقابلة في NMP (5 مل)، إضافة 1 أي ما يعادل 4-Dimethylaminopyridine (DMAP) و 10 في حكمه DIEA إلى حل (الجدول 1).
   3. إضافة 10: 10 خليط من الخل / DMAP / DIEA إلى الراتنج واحتضان لمدة 300 ثانية (25: 1W، 75 ° C، الجدول 2). استنزاف الحل.
   4. غسل الراتنج مع NMP. إضافة NMP إلى الراتنج لمدة 120 ثانية (7 مل، 0 W، غ)، واستنزاف الحل. كرر ثلاث مرات.
2. حمض اقتران
   1. غسل الراتنج مع DMF. إضافة DMF إلى الراتنج لمدة 120 ثانية (7 مل، 0 W، غ)، واستنزاف الحل. كرر ثلاث مرات.
   2. حل 10 يعادله من حمض ثنائي الكربوكسيل المقابلة في DMF (5 مل). إضافة 1 DMAP أي ما يعادل 10 في حكمه وN، N '-Diisopropylcarbodiimide (DIC) إلى حل (الجدول 1).
   3. قبل تفعيل الخليط عن طريق خلط لمدة 30 دقيقة.
   4. إضافة الخليط إلى الراتنج واحتضان لمدة 300 ثانية (25 W، 75 ° C، الجدول 2)، واستنزاف الحل.
   5. غسل الراتنج مع DMF. إضافة DMF إلى الراتنج لمدة 120 ثانية (7 مل، 0 W، غ)، واستنزاف حل. كرر الخطوة ثلاث مرات.

4. N-methyltrityl (الإنتقالي العسكري) حماية المجموعة Deprotectأيون

ملاحظة: تم محمية سلسلة الجانب يسين مع N-methyltrityl (الإنتقالي العسكري) ^81، وهي مجموعة حماية التي يمكن deprotected بشكل انتقائي في ظل ظروف عطوب الحمضية ^82،83. Deprotect الإنتقالي العسكري حماية مجموعة يدويا على شاكر بدون طاقة الميكروويف.

1. نقل الراتنج على خرطوشة البولي بروبلين مجهزة المكونات الغطاء ومحبس.
2. غسل الراتنج مع DCM. إضافة DCM إلى الراتنج لمدة 120 ثانية (7 مل، 0 W، غ)، واستنزاف الحل. كرر ثلاث مرات.
3. إضافة 15-25 مل من خليط من 1٪ حمض Trifluoroacetic (TFA)، و 5٪ Triisopropylsilane (TIS)، و 94٪ DCM لخرطوشة البولي بروبلين في غرام واحد من الراتنج.
   ملاحظة: TFA هو حمض قوي وتآكل وغير مزعجة للغاية على الجلد والعينين، وأنسجة الرئة.
   1. الحفاظ حلول مركزة من TFA في غطاء محرك السيارة في جميع الأوقات.
   2. استخدام معدات الوقاية الشخصية المناسبة (حماية العين، معطف المختبر وقفازات) والعمل في غطاء جيد التهوية. تغيير القفازات فوراإذا كانت تأتي في اتصال مع TFA وتنظيف فورا أي تسرب. اذا كانت بشرتك أو عينيك تأتي في اتصال مع الحامض، مسح المنطقة المصابة على الفور بالماء ويغسل لمدة 15 دقيقة إضافية.
4. وضع خرطوشة البولي بروبلين على شاكر ويهز لمدة 5 دقائق على RT.
5. استنزاف الحل من خرطوشة البولي بروبلين من خلال تطبيق فراغ.
6. كرر الخطوات من 4،3-4،5، ثلاث مرات.
7. غسل الراتنج مع DCM. إضافة DCM إلى الراتنج لمدة 120 ثانية (7 مل، 0 W، غ)، واستنزاف الحل. كرر خمس مرات.

5. Cyclization من الخطي الببتيد

1. غسل الراتنج مع DCM. إضافة DCM إلى الراتنج لمدة 120 ثانية (7 مل، 0 W، غ)، واستنزاف الحل. كرر خمس مرات.
2. في 50 مل أنبوب البولي بروبلين، ويحل 5 حكمه Benzotriazole-1-لاي-أوكسي تريس، pyrrolidinophosphonium hexafluorphosphate (PyBOP) في Dibromomethane (DBM، 5 مل)، وإضافة 10 المعادل DIEA إلى حل (الجدول 1).
إضافة الخليط إلى الراتنج واحتضان لمدة 300 ثانية (25 W، 75 ° C، الجدول 2). استنزاف الحل.
3. غسل الراتنج مع DCM. إضافة DCM إلى الراتنج لمدة 120 ثانية (7 مل، 0 W، غ)، واستنزاف الحل. كرر ثلاث مرات.

6. الشق وDeprotection من المجموعات الجانبية سلسلة

1. غسل الراتنج مع DCM وايثر.
   1. إضافة DCM إلى الراتنج لمدة 120 ثانية (7 مل، 0 W، غ)، واستنزاف الحل. كرر مرتين.
   2. إضافة ايثر إلى الراتنج لمدة 120 ثانية (7 مل، 0 W، غ)، واستنزاف الحل. كرر مرتين.
2. تجفيف الراتنج في فراغ مجفف في RT لا يقل عن 3 ساعة على هيدروكسيد البوتاسيوم (KOH، 1-10 ز).
3. تزن الراتنج المجففة وتحويلها إلى خرطوشة البولي بروبلين.
4. إضافة 10 مل من تبريده قبل trifluoroacetic حمض (TFA) انشقاق كوكتيل (على سبيل المثال، 90٪ TFA 2.5٪ ماء، 2.5٪ TIS و 5٪ الفينول) إلى كل غرام واحد من الراتنج.
5. يهز لمدة 3 ساعاتفي RT.
6. جمع الحل انشقاق TFA من خلال تصفية الراتنج في أنبوب البولي بروبلين 50 مل. لوالترشيح، واستخدام فريت التي هي في خرطوشة البولي بروبلين 12 مل.
7. إضافة ايثر الباردة (35 مل) إلى أنبوب.
8. أجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 1207 x ج في 4 درجات مئوية.
9. صب طبقة الأثير.
10. كرر الخطوة 6،7-6،9، خمس مرات.

7. تجفيف العمود الفقري دوري الببتيد

1. الحفاظ على الببتيد عجلت في نفس الأنبوب وتجف في غطاء محرك السيارة لمدة 30 دقيقة.
2. حل الببتيد في 1: 1 خليط من الماء والأسيتونتريل (ACN).
3. تجميد الحل المنتج النهائي في النيتروجين السائل.
4. يجفد المنتج النهائي.

8. تميز العمود الفقري دوري الببتيد

1. حل عينة صغيرة (1 ملغ) من الناتج في الماء (400 ميكرولتر).
2. حقن ببتيد المنحل (10-200 ميكرولتر) إلى مرحلة العكسي عالية الأداء chromatograp السائلHY (RP-HPLC) نظام لاختبار الببتيد نقاء ^34.
3. تحقق كتلة الببتيد باستخدام مطياف الكتلة مصفوفة بمساعدة الليزر الامتزاز التأين (MS-MALDI) ^84.
   1. مزيج 1 ميكرولتر (100 ميكرومتر) الببتيد في 1: 1 (ت / ت) خليط من الأسيتونتريل: الماء مع 1 ميكرولتر من المصفوفة (حمض 5 ملغ / مل، α-cyano-4-hydroxycinnamic) في 1: 1 (الخامس / V) خليط من الأسيتونتريل: المياه مع TFA (0.1٪).
   2. بقعة 1 ميكرولتر على لوحة MS-MALDI.
   3. تجفيف العينات ووضعه في مطياف الكتلة.
4. تزن الببتيد وحساب العائد في المئة.
5. تخزين في درجة حرارة -20 درجة مئوية.

9. رصد التجميعي

1. كايزر (النينهيدرين) اختبار ⁸⁵
   1. إعداد الحلول كاشف.
      1. إعداد الحل A عن طريق إذابة 16.5 ملغ من البوتاسيوم السيانيد (KCN) في 25 مل من الماء المقطر. تمييع 1 مل من محلول أعلاه مع 49 مل من البريدين.
      2. إعداد الحل Bعن طريق إذابة 1 غرام من النينهيدرين في 20 مل من الايثانول.
      3. إعداد الحل C عن طريق إذابة 40 جم فينول في 20 مل ايثانول.
   2. استخدام اختبار كايزر للتحقق من إنجاز اقتران الأحماض الأمينية أو deprotection من مجموعة حماية.
      1. نقل بضع حبات من الراتنج إلى أنبوب اختبار.
      2. إضافة ثلاث قطرات (~ 100 ميكرولتر) من كل حل (A، B و C) وتخلط.
      3. حرارة أنبوب الاختبار على كتلة التدفئة في 110 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
         ملاحظة: الخرز الملون الأزرق (نتيجة إيجابية) إلى رد فعل اقتران كاملة أو deprotection من Fmoc مجموعة حماية.
2. الكلورانيل اختبار ⁸⁶
   1. إعداد الكواشف التالية جديدة لكل اختبار.
      1. تحضير محلول 2٪ الكلورانيل في DMF، حل A.
      2. تحضير محلول 2٪ الأسيتالديهيد في DMF، حل B.
   2. إجراء اختبار الكلورانيل للتحقق من إنجاز اقتران الأحماض الأمينية أو تيانه deprotection من مجموعة حماية.
      1. مزيج 100 ميكرولتر من محلول A مع 100 ميكرولتر من محلول B في أنبوب 1.5 مل.
      2. إسقاط حبات في ويهز بلطف لمدة 5 دقائق.
         ملاحظة: الخرز الملون البني الداكن (نتيجة إيجابية) تشير deprotection من مجموعة حماية Fmoc أو رد فعل اقتران غير مكتملة.
3. رد فعل الانقسام على نطاق صغير
   1. إزالة كمية صغيرة من الراتنج لخرطوشة البولي بروبلين 3 مل مجهزة المكونات الغطاء ومحبس.
   2. علاج بمزيج 2 مل من 95٪ TFA، و 2.5٪ و 2.5٪ ماء TIS.
   3. يهز الخليط لمدة 30 دقيقة في RT.
   4. إزالة الراتنج عن طريق الترشيح باستخدام فريت من خرطوشة البولي بروبلين وتتبخر المذيبات من قبل تيار من النتروجين.
   5. حل هذه البقايا في الماء وتحليل المنتج باستخدام HPLC و / أو MS.

10. الليشمانيا الدونوفانية المشيقة الجدوى في الثقافة الفحص

<لى> الليشمانيا الدونوفانية (L. اللشمانيا الحشوية) ظروف النمو والعلاج
1. ثقافة L. الطور السوطي اللشمانيا الحشوية في تعديل Dulbecco والنسر والمتوسطة (DMEM) مع 4.5 جم / L الجلوكوز، L-الجلوتامين، والبيروفات الصوديوم في 26 ° C.
2. علاج L. اللشمانيا الحشوية الطور السوطي مع الببتيدات الحلقية (100 ميكرومتر) لمدة 24 ساعة على 26 ° C.
1. الليشمانيا الدونوفانية (L. اللشمانيا الحشوية) الجدوى فحص
   1. تقييم الجدوى الطفيلي مع 20 ميكرولتر alamarBlue وفقا لبروتوكول الشركة الصانعة.
   2. تحديد الحد alamarBlue عن طريق قياس مضان (في 570 نانومتر الإثارة و 590 نانومتر الانبعاثات). قيم مضان أعلى تشير إلى زيادة نشاط الأيض وزيادة قابلية الطفيلي.

Results

نحن هنا وصف وضع مكتبة صغيرة مركزة من العمود الفقري الببتيدات الحلقية التي تستهدف على وجه التحديد مثبطات مضخة البروتون حيوية للطفيل الليشمانيا وبمثابة وكلاء ضد الطفيليات (للمراجعة عن الببتيدات التي تستهدف مثبطات مضخة البروتون كعوامل مضادة للطفيليات ^87). من خلال تركيب العمود الفقري رواية الببتيدات الحلقية، يتم حفظها pharmacophores في سقالة من حجم قابلة للتمديد. قوة المكتبة المركزة المقترحة هنا هي القدرة على تغيير أحجام الببتيد سقالة في حين يسمح بدرجة محدودة من حر...

Discussion

يوصف تركيب مكتبة مركزة من العمود الفقري الببتيدات الحلقية المستمدة من البروتين عدم وجود طفيل الليشمانيا في استخدام المزج الميكروويف مؤتمتة بالكامل. وقد وضعت مكتبة مركزة من الببتيدات الحلقية مع pharmacophores التمايز ومختلف linkers. إضافة linkers مختلفة مثل أنهيدريد الغلوتاريك، السكسينك، حمض الأديبيك وحمض البيميليك، ليسين، الأورنيثين، واللبنات الأخرى يمكن استخدامها لزيادة متنوعة من مساحة بتكوين من الببتيدات الحلقية. تركيب مكتبة الببتيدات الحلقية مركزة يسمح للباحثين للكشف ع...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
<قوي > كواشف < / قوي >
دعم قوي ، راتنج Rink Amide AM ML	CBL	BR-1330	التحميل: 0.49 مليمول / جم
Fmoc-Ala-OH	Advanced Chemtech	FA2100
Fmoc-Arg (Pbf) -OH	Advanced Chemtech	FR2136
Fmoc-Asn (Trt) -OH	Advanced Chemtech	FN2152
Fmoc-ASP (OBut) -OH	Advanced Chemtech	FD2192
Fmoc-Cys (TRT) -OH	Advanced Chemtech	FC2214
Fmoc-Gln (TRT) -OH	Advanced Chemtech	FQ2251
Fmoc-Glu (OtBu) -OH	Advanced Chemtech	FE2237
Fmoc-Gly-OH	Advanced Chemtech	FG2275
Fmoc - His (TRT) -OH	Advanced Chemtech	FH2316
Fmoc-Ile-OH	Advanced Chemtech	FI2326
Fmoc-Leu-OH	Advanced Chemtech	FL2350
Fmoc-Lys(Boc) -OH	Advanced Chemtech	FK2390
Fmoc-Met-OH	Advanced Chemtech	FM2400
Fmoc-Phe-OH	Advanced Chemtech	FF2425
Fmoc-Pro-OH	Advanced Chemtech	FP2450
Fmoc-Ser- (tBu) -OH	Advanced Chemtech	FS2476
Fmoc-Thr (tBu) -OH	Advanced Chemtech	FT2518
Fmoc-Trp (Boc) -OH	Advanced Chemtech	FW2527
Fmoc-Tyr (لكن) -OH	Advanced Chemtech	FY2563
Fmoc-Val-OH	Advanced Chemtech	FV2575
1-ميثيل -2-بيروليدينون (NMP)	سيجما	328634	<قوي > حذر < / قوي > سام / شديد الاشتعال / مهيج.
<م > ن ، ن < م > ثنائي ميثيل فورماميد (DMF) ألفا	إيسار	43465	<قوي > تحذير < / قوي > سام.< / > استخدم DMF عالي الجودة للتخلص من التفاعلات الجانبية مثل إزالة Fmoc نتيجة لآثار ثنائي ميثيل أمين من تحلل DMF.
ثنائي كلورو ميثان (DCM)	سيجما	D65100	<قوي > تحذير < قوي >
بروموميثان ضار (DBM)	سيجما	D41868	<قوي > حذر < / قوي >
حمض ثلاثي فلورو أسيتيك ضار (TFA)	سيجما	T62200	<قوي > تحذير < / قوي >
حمض ثلاثي فلورو أسيتيك تآكل / سام ، درجة HPLC (TFA)	سيجما	91707	<قوي > تحذير < / قوي > تآكل / سام
ثنائي إيثيل إيثر	سيجما	31690	<قوي > حذر < / قوي > ثلاثي إيزوبروبيل سيلان شديد الاشتعال / ضار
(TIS)	سيجما	233781	<قوي > حذر < / قوي > مهيج / قابل للاشتعال
، HPLC درجة	سيجما	270733
أسيتونيترويل ، درجة HPLC (ACN)	فيشر Scientific	A998-4	<قوي > تحذير < / قوي > قابل للاشتعال / مهيج / ضار
< م > N ، N < / em > ثنائي isopropylethylamine (DIEA)	Sigma	3440	<قوي > تحذير < / قوي > تآكل / شديد الاشتعال
بيبيريدين	سيجما	W290807	<قوي > تحذير < / قوي > سام / شديد الاشتعال
بيريدين	سيجما	270970	<قوي > تحذير < قوي >
الاشتعال / ضار (EtOH)	سيجما	459844	<قوي > تحذير < / قوي > شديد الاشتعال / مهيج
1-هيدروكسي بنزوتريازول هيدرات (HOBt)	سيجما	157260	<قوي > حذر < قوي > شديد الاشتعال / مهيج / ضار
O< / em>-(Benzotriazol-1-yl)-N,N,N′,N′,N′ < / em>- رباعي ميثيل يورونيوم سداسي فلورو فوسفات (HBTU)	سيجما	12804	<قوي > تحذير < / قوي > مهيج / ضار
بنزوتريازول -1-ليك-أوكسي تريس بيروليدينوفوسفونيوم سداسي فلور فوسفات (PyBOP) Advanced	Chemtech	RC8602	<قوي > الحذر < / قوي > مهيج
نينهيدرين	سيجما	454044	<قوي > الحذر < / قوي > ضار
فينول	سيجما	P3653	<قوي > تحذير < / قوي >
(KCN)	سيجما	11813	<قوي > الحذر < / قوي >
هيدروكسيد البوتاسيوم شديد السمية (KOH)	سيجما	221473	<قوي > الحذر < / قوي > سام
< م > ن ، ن ' < / م > ثنائي الأيزوبروبيل كاربوديميد (DIC)	سيجما	38370	<قوي > الحذر < / قوي > قابل للاشتعال / سام
4-ثنائي ميثيل أمينوبيريدين (DMAP)	سيجما	522805	<قوي > تحذير < / قوي >
أنهيدريد جلوتاريك	سيجما	G3806	<قوي > تحذير < / قوي > قابل للاشتعال / مهيج / ضار
أنهيدريد السكسينيك	سيجما	239690	<قوي>الحذر< القوي> مهيج / ضار
حمض أديبيك	سيجما	A26357	<قوي>الحذر< القوي> سام/مهيج
حمض بيميليك	سيجما	P45001	<قوي>الحذر سام / مهيج
الكلورانيل	سيجما	23290	<قوي>الحذر< القوي> سام/مهيج
أسيتالديهايد	سيجما	402788	<قوي > الحذر < / قوي > قابل للاشتعال / سام
< قوي > المعدات < / قوي >
جهاز طرد مركزي	بيكمان كولتر	أليجرا 6R جهاز
مجفف	المياه Labconco	المنطقة الحرة 4.5
فراغ	فرانكلين إلكتريك	موديل 1101101416 مع 3/4 حصان	الكاتيل مضخة مع فرانكلين موتور
خرطوشة البولي بروبلين 12 مل	الفصل التطبيقي	2419
قابس الغطاء لخرطوشة البولي بروبلين 12 مل	الفصل التطبيقي	8157
خرطوشة البولي بروبلين 3 مل	الفصل التطبيقي	2413
قابس الغطاء لخرطوشة البولي بروبلين 3 مل	الفصل التطبيقي	8054
إيقاف الديوك PTFE	الفصل التطبيقي	2406
أنابيب مسطحة ، 50 مل	VWR	21008-240
مشعب استخراج ، 20 نقاط البيع ، أنابيب 16 × 100 مم	ووترز	WAT200609
شاكر ، BD adams خلاط المغذيات	فيشر العلمي	22363152
Nalgene HDPE زجاجات IP2 ضيقة الفم ، 125 & nbsp ؛ مل	فيشر العلمي	03-312-8
قارورة Erlenmeyer	فيشر Scientific	FB-501 ، 500 مل
كتلة تسخين	Thermolyne	1760 حمام
أنابيب زجاجية من البورسليكات يمكن التخلص منها بنهاية عادية	فيشر Scientific	14-961-25
ماصات دقيقة ونصائح Finnpipette	Thermo	20 & ndash ؛ 200 و 100 & - - - 1,000 مو ؛ ل
قوارير HPLC - مايكرو VL PP 400 & مايكرو ؛ ل PK100   ؛	VWR	69400-124
قارورة HPLC- غطاء أزرق Snap-It	VWR	66030-600
عمود HPLC التحليلي	Peeke Scientific	U1-5C18Q-JJ	ultro 120 5 & micro ؛ م C18Q ، معرف 4.6 مم 150 مم
عمود HPLC الإعدادي ، XBridge & nbsp ؛	ووترز	OBD C18 5 & مايكرو ؛ م العمود	19 مم & 150 مم
مطياف الكتلة	Applied Biosystems	Voyager DE-RP & nbsp ؛
مجفف
أسطوانة
نظام RP-HPLC التحليلي Shimadzu LC-20			مجهز بما يلي: وحدة تحكم في نظام CBM-20A ، كاشف SPD-20A ، فرن عمود CTO-20A ، وحدة توصيل المذيبات LC-20AD ، جهاز أخذ العينات الآلي SIL-20AC ، مزيل الغازات DGU-20A5 (شيمادزو ، دكتوراه في الطب ، الولايات المتحدة الأمريكية).
نظام RP-HPLC التحضيري Shimadzu LC-20			مجهز بما يلي: وحدة تحكم في نظام CBM-20A ، كاشف SPD-20A ، فرن عمود CTO-20A ، وحدة توصيل المذيبات LC-6AD 2 × ومجمع الكسر FRC-10A (Shimadzu ، MD ، الولايات المتحدة الأمريكية).