مقالة منهجية

تتبع الخلايا في الزرد-GFP المعدلة وراثيا باستخدام نظام Photoconvertible PSmOrange

DOI:

10.3791/53604

⸱

فبراير 5, 2016

 ,  ,  , 
1Medical Faculty Mannheim, Department of Cell and Molecular Biology, Heidelberg University, 2COS and Nikon Imaging Center at the University of Heidelberg, Heidelberg University, 3Excellenzcluster CellNetworks, University of Heidelberg

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لقد أنشأنا نظام PSmOrange القابل للتحويل الضوئي كأداة قوية ومباشرة وغير مكلفة من حيث التكلفة لتتبع الخلايا في الجسم الحي في الخلفيات المعدلة وراثيا GFP. يصف هذا البروتوكول تطبيقه في نظام نموذج الزرد.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يسمح التطور السريع لأجنة الزرد الشفافة (Danio rerio) جنبا إلى جنب مع ملصقات الفلورسنت للخلايا والأنسجة بتصور عمليات النمو كما تحدث في الحي. يمكن تسمية الخلايا ذات الأهمية باستخدام محفز خاص بالأنسجة لدفع التعبير عن بروتين الفلورسنت (FP) لتوليد الخطوط المعدلة وراثيا. يسمح استخدام البروتينات الفلورية القابلة للتحويل الضوئي لهذا الغرض أيضا باتباع الهياكل المحددة بدقة داخل مجال التعبير. إن إضاءة البروتين في المنطقة محل الاهتمام ، يغير طيف انبعاثه ويسلط الضوء على خلية معينة أو مجموعة خلايا تاركة الخلايا المعدلة وراثيا الأخرى بلونها الأصلي. أحد القيودات الرئيسية هو عدم وجود محفزات معروفة لعدد كبير من الأنسجة في الزرد. على العكس من ذلك ، أنتجت شاشات مصيدة الجينات والمحسن موارد معدلة وراثيا هائلة تقوم بتسمية جميع الهياكل الجنينية حرفيا بشكل منفصل باستخدام GFP أو إلى نطاق أقل FPs حمراء أو صفراء. يتمثل النهج المتبع لاتباع الهياكل المحددة في مثل هذه الخلفيات المعدلة وراثيا في إدخال بروتين قابل للتحويل الضوئي في كل مكان ، والذي يمكن تحويله في الخلية (الخليات) ذات الأهمية. ومع ذلك ، فإن البروتينات القابلة للتحويل الضوئي المتاحة تتضمن حالة انبعاث خضراء و / أو أقل تكرارا1 ، وبالتالي لا يمكن استخدامها في كثير من الأحيان لتتبع الخلايا في خلفية FP للخطوط المعدلة وراثيا الموجودة. للتحايل على هذه المشكلة ، أنشأنا نظام PSmOrange لسمك الزرد2،3. الحقن المجهري البسيط للرنا المرسال الاصطناعي الذي يشفر شكلا نوويا من هذا البروتين يصنف جميع نوى الخلية بمضان برتقالي / أحمر. عند التحويل الضوئي المستهدف للبروتين ، يحول طيف انبعاثه إلى اللون الأحمر البعيد. تجعل الكفاءة الكمومية واستقرار البروتين من PSmOrange أداة رائعة لتتبع الخلايا لأسماك الزرد وربما أنواع أخرى من teleost.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يسمح تحسين تقنيات التصوير بشكل كبير بمتابعة العمليات التنموية على مدى فترات زمنية تصل إلى حوالي أربعة أياممتتالية 3. في أسماك الزرد والعديد من أنظمة النماذج الحيوانية الأخرى ، تتميز خلايا أو أنسجة أو هياكل محورية أو وعائية معينة ببروتينات فلورية معدلة وراثيا باللون الأخضر أو الأحمر أو الأصفر في بعض الأحيان لتسهيل التصور. ومع ذلك ، في معظم الخطوط المعدلة وراثيا ، لا يتم التعبير عن الجينات المعدلة وراثيا على وجه التحديد في الخلايا ذات الأهمية ولكن أيضا في الهياكل الإضافية ، مما يعيق التتبع الدقيق للخلايا المفردة أو مجموعات الخلايا على سبيل المثال.

البروتينات الفلورية القابلة للتحويل الضوئي مناسبة تماما لتتبع الخلايا أثناء التطور الجنيني. المتطلبات الأساسية لتطبيق هذه البروتينات هي طبيعة طويلة العمر ، ونطاق انبعاث منفصل جيدا عند التحويل والتألق الساطع. تشتمل البروتينات القابلة للتحويل الضوئية المتاحة على تلك التي تغير نطاق انبعاثها عند التحويل مثل Kaede4 أو KiGR5 أو mEos26 أو PS-CFP2 أو Dendra27 وغيرها من البروتينات التي تكون فلورية فقط عند تنشيطها الضوئي (PAmCherry8 أو PAGFP9 أو PATagRFP10). ومع ذلك ، فإن تطبيقاتهم لتتبع الخلايا في المعدلة وراثيا FP الحالية محدودة لأنها غالبا ما تنطوي على حالة فلورية خضراء أو لا تفي بجميع المعايير المذكورة أعلاه. في الآونة الأخيرة فقط ، أبلغ سوباخ وزملاؤه عن بروتين PSmOrange ، الذي يغير انبعاثه من برتقالي / أحمر إلى أحمر بعيد عند التحويل الضوئي وتم تطبيقه بنجاح في الخلايا في الثقافة والخلايا المستنبتة التي تم حقنها في الفئران2.

للتحقيق في ملاءمة البروتين لتتبع الخلايا في جنين حي ، قمنا بإنشاء بنية تعبير للحقن المجهري ل H2B-PSmOrange ذي العلامات النووية في أجنة الزرد. وجدنا أن البروتين يفي بجميع المتطلبات الأساسية لتتبع الخلايا بنجاح في الخلفيات المعدلة وراثيا GFP خلال أول 4 أيام (وربما أكثر) من التطور الجنيني لسمك الزرد. خلال هذا الوقت ، يتم الانتهاء من معظم أحداث هجرة الخلايا في الأسماك مما يجعل نظام PSmOrange إضافة ممتازة إلى مجموعة أدوات أسماك الزرد.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. H2B-PSmOrange مرنا في المختبر النسخ ومرنا تنقية

  1. خطي H2B-PSmOrange تحتوي على pCS2 + البلازميد باستخدام انزيم التقييد نوتي وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
    ملاحظة: تنفيذ الخطوات التالية باستخدام الحماية المناسبة مثل القفازات ومعطف المختبر لمنع التلوث مرنا والتدهور.
  2. تنقية الحمض النووي خطي باستخدام PCR عدة تنقية أو الفينول كلوروفورم الأساليب القائمة وفقا لبروتوكولات الصانعين.
  3. استخدام 1 ميكروغرام من الحمض النووي القالب خطي لSP6 مرنا النسخ وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
  4. إزالة الحمض النووي عن طريق إضافة 1.0 U ريبونوكلياز مجانا DNaseI لمدة 10-20 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
  5. تنظيف مرنا باستخدام الحمض النووي الريبي تنظيف عدة وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
  6. لزيادة نقاء مرنا والتركيز، ويعجل مرنا عن طريق إضافة 6 ميكرولتر خلات الصوديوم (3.0 M، ودرجة الحموضة 5.2) و 150 ميكرولتر 96٪ من الإيثانول. احتضان محل ixed في -20 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة على الأقل، وتصل إلى 24 ساعة.
  7. جمع مرنا من خلال الدوران الحل في 18.407 x ج لمدة 45 دقيقة على 4 درجات مئوية. تجاهل السائل و resuspend مرنا في 150 ميكرولتر الايثانول 70٪. خلط وأجهزة الطرد المركزي الحل لمدة 15 دقيقة إضافية في 4 درجات مئوية. تجاهل السائل، تجفيف بيليه لمدة 5 دقائق على الجليد و resuspend مرنا في 20 عالى النقاء ميكرولتر ريبونوكلياز المياه مجانا.
  8. تقييم التركيز والنقاء من مرنا من قبل قياس الضوئية من التخفيف 1: مرنا 100 (1 ميكرولتر مرنا في 99 ميكرولتر عالى النقاء ريبونوكلياز المياه مجانا).
  9. للتخزين على المدى القصير، والحفاظ على حل مرنا في -20 درجة مئوية. للتخزين على المدى الطويل، والحفاظ على مرنا في -80 درجة مئوية.

2. H2B-PSmOrange مرنا حقن مكروي في الزرد الأجنة

  1. إعداد التزاوج أزواج الليلة قبل الحقن باستخدام TG (foxD3: GFP)؛ TG (FLH: GFP) الأسماك المعدلة وراثيا مزدوجة (أو أي GFP الأسماك المعدلة وراثيا أخرى). ترك الأسماك مفصولة وضع فاصلبينهما للسيطرة على وقت التزاوج.
  2. إزالة فاصل في الصباح الحقن وترك زميله الأسماك لمدة 20 دقيقة.
  3. أثناء التزاوج الوقت، يخفف من H2B-PSmOrange مرنا إلى تركيز النهائي من 130 جزء من الغرام / NL (في ريبونوكلياز المياه مجانا) ونقل 6 ميكرولتر حل الحقن في شعري حقن مكروي باستخدام طرف microloader. تحقق من حجم الحقن مع شريحة زجاجية معايرة. ضبط ضغط الحقن لحقن 2 حل مرنا نيكولا لانغ (260 خريج).
  4. جمع البيض في والبلاستيك طبق بتري معقمة تحتوي على 1X الأجنة (E3) متوسطة.
  5. نقل 20-30 الأجنة إلى طبق الحقن باستخدام ماصة باستور البلاستيك.
  6. حقن 2 مرنا نيكولا لانغ تحتوي على حل في الخلية أو أقل بقليل من الخلايا في صفار البيض في مرحلة خلية واحدة (11).
  7. نقل الأجنة المحقونة في طبق بتري تحتوي على 1X E3 المتوسطة، وإزالة الأجنة عادة وضع غير مخصبة أو لا، وتنمو لهم عند 28 درجة مئوية.
    ملاحظة: حماية ضوء سو الأجنة غير مطلوب في كافة مراحل التجربة.
  8. رفع الأجنة الزرد في 1X E3 المتوسطة وإضافة 0.2 ملي PTU (1-فينيل-2 ثيوريا) بعد المعيدة لمنع تصبغ. تغيير متوسطة مرتين في اليوم الواحد للحد من خطر التلوث الجرثومي.

3. الأجنة تضمين

  1. حدد GFP (الخضراء) وPSmOrange (البرتقالي / الأحمر) الأجنة، معربا عن المشترك باستخدام مجهر مجهر مجهزة مصباح مضان والمرشحات الانبعاثات المناسبة. نقل الأجنة الإيجابية في العقيمة طبق بتري تحتوي على 1X E3 المتوسطة.
  2. الأجنة Dechorionate تحت مجهر تشريحي باستخدام ملقط 12.
  3. نقل جنين واحد في أنبوب 1.5 مل تحتوي على 1.0 مل من قبل تحسنت 1.0٪ انصهار منخفضة الاغاروز (LMA) التي أعدت في الماء عالى النقاء باستخدام ماصة قطع رأس (P200). ملاحظة: قم بتدفئة LMA إلى 80 درجة مئوية ويبرد لمدة 3-5 دقيقة في RT قبل تضمين الجنين.
  4. نقل الأجنة في 150 ميكرولتر LMA إلىغرف ساترة وضبط التوجه الجنين، مثل الجانب الظهري أسفل في تجربة وصفها ليزر متحد البؤر مجهر المسح A1R مقلوب + (أو أي المجهر مناسبة أخرى)، وذلك باستخدام معلومات سرية البلاستيك على ما يرام. عندما LMA هو بلمرة، وملء الغرفة مع أسماك المياه التي تحتوي على 0.2 ملي PTU و 0.02٪ إيثيل 3-أمينوبنزوات methansulfonate (تريكين) للتخدير.
  5. قبل التصوير العينة، وانتظر 15 دقيقة للتأكد من تأثير تريكين. التخدير يمنع حركات الجنين، والتي يمكن رصدها باستخدام مجهر تشريحي مجهزة مع إضاءة brightfield.
    ملاحظة: غرف يمكن إعادة استخدامها مرتين.

4. PSmOrange Photoconversion

  1. وضع العينة تحت المجهر متحد البؤر ومسح العينة لتحديد المنطقة لphotoconvert باستخدام 488 نانومتر و 561 نانومتر ليزر لتصوير GFP وPSmOrange على التوالي.
    ملاحظة: استخدم مقلوب ليزر متحد البؤر مجهر المسح A1R + على ستا مقلوبجنرال الكتريك TiEcontrolled بواسطة برنامج المجهر التصوير ومجهزة 488 نانومتر، 561 نانومتر و 640 نانومتر ليزر لphotoconversion والتصوير. ومع ذلك، بالتأكيد لا يقتصر التطبيق لهذا المجهر طالما هي خطوط ليزر للتحويل والتصوير المتاحة.
    1. وضع هدف الهواء 20X في مكانه (NA: 0.75، WD: 1.0 مم؛ فوف: 0.64 X 0.64 مم).
    2. استخدام الإعدادات المجهر التالية للكشف عن البروتين PSmOrange قبل photoconversion: 561 الليزر نانومتر، 0.74 ميغاواط قياس في الطائرة التركيز فوق الهدف.
      ملاحظة: هذا يتوافق مع 40٪ على هذا النظام (قياس في الطائرة التركيز هو السبيل الوحيد لتحديد قوة فعالة). ضبط قوة الليزر وفقا لاحتياجات التجريبية كما كفاءة الحقن H2B-PSmOrange يمكن أن تختلف.
    3. إضافة عوامل التكبير لتسليط الضوء على مجال الاهتمام. أعلى تكبير تقليل الوقت الحصول على الصور، وبالتالي الضيائية.
  2. الحصول على كومة ض تغطي هيكلالصورة ذات الاهتمام باستخدام 488 نانومتر و 561 نانومتر ليزر في وضع تسلسلي (وضع خط 1-> 4). إصلاح خطوة ض بين 1.0 و 2.0 ميكرون. متوسط ​​خط وتردد المسح يمكن استخدامها لتحسين جودة الصورة.
  3. مسح العينة وتحديد منطقة (ROI) أداة الفائدة لتسليط الضوء على المنطقة لphotoconvert. إصلاح العائد على الاستثمار مع منطقة التحفيز. حدد الوحدة النمطية صور التنشيط / التبييض، وتفعيل ليزر 488 نانومتر عن طريق التحقق من مربع منها، وتعيين ليزر 488 نانومتر إلى 80٪ (قوة الليزر 1 ميغاواط قياس في الهدف). ضبط سرعة المسح الضوئي إلى 0.5 ثانية / الإطار.
  4. فتح الأداة المساعدة photoconversion (ND تحفيز) وتحديد الإعدادات photoconversion.
    1. انقر على الأمر "إضافة" لتحديد بروتوكول photoconversion.
    2. ضبط "المرحلة" 1 في "اكتساب / تحفيز" القائمة على "شراء" وتشير إلى أن اكتسب عدد من الصور قبل photoconversion في القائمة "الحلقات".
    3. ضبط "المرحلة" 2 "لسانimulation "وأدخل عدد من الأحداث التحفيز التي يتعين القيام بها.
    4. ضبط "المرحلة" 3 كما هو موضح ل "المرحلة" 1. اختياريا، اضافة الى وجود الانتظار "المرحلة" بعد "المرحلة" 2 عن طريق إدخال وقت للانتظار قبل الجولة الأخيرة من التقاط صور.
    5. مرة واحدة يتم تعيين كافة المعلمات، تطبيق الإعداد التحفيز وتشغيل photoconversion.
      ملاحظة: قوة الليزر، وتواتر المسح الضوئي وعدد التكرارات لكل جولة من photoconversion يمكن أن تختلف وتختلف من جنين إلى الجنين. إعداد لبدء مع هو مبين في الجدول رقم 1.
  5. الحصول على ض المكدس النهائي باستخدام 488 نانومتر، 561 نانومتر و 640 نانومتر ليزر تطبيق الإعدادات على النحو الوارد أعلاه. تعيين ليزر 640 نانومتر لتصور PSmOrange تحويلها باستخدام قوة الليزر عالية (تصل إلى 4.5 ميغاواط).

5. إلغاء التحميل الأجنة من LMA

  1. إزالة الجنين تحتوي على غرفة من المجهر. بعناية إزالة الجنين من ش الاغاروزالغناء ملقط.
  2. نقل الجنين الى بلاستيكية معقمة طبق بتري جديد أو إلى تعقيم 6 جيدا لوحة تحتوي على 1X E3 و 0.2 ملي PTU. احتضان الجنين عند 28 درجة مئوية حتى المرحلة المطلوبة للتنمية.

6. تحليل مصير Photoconverted PSmOrange البروتين معربا عن الخلايا

  1. إعادة تضمين الجنين كما هو موضح تحت نقاط 3.3 و 3.4.
  2. وضع العينة تحت المجهر متحد البؤر ومسح العينة لتحديد الخلايا photoconverted (640 نانومتر) في بنية GFP المعدلة وراثيا من الفائدة (488 نانومتر).
  3. الحصول على كومة ض تغطي الهياكل ذات الاهتمام باستخدام 488 نانومتر، 561 نانومتر و 640 نانومتر ليزر في وضع تسلسلي (وضع خط 1-> 4). إصلاح خطوة ض بين 1.0 و 2.0 ميكرون. متوسط ​​خط وتردد المسح يمكن استخدامها لتحسين جودة الصورة.
  4. استخدم إحدى الطرق التالية لتحديد الخلايا التي GFP شارك السريع والبروتين photoconverted.
    1. حسب الطلب التلقائي فيجي صورةJ 3 ماكرو
      1. لف كومة الأصلي باستخدام "GaussianBlur" المساعد (→ عملية → مرشحات → GaussianBlur) وطرح رزمة سلسة من الأصل باستخدام "صورة حاسبة" المساعد (→ عملية → صورة حاسبة). استخدم هذه الخطوة لتصور هياكل الفائدة وتقليل الوقت الحسابية للتحليل.
      2. تطبيق عتبات محددة لقنوات خضراء وبعيدة الحمراء من أجل تسليط الضوء على الخلايا photoconverted (→ صورة → ضبط → عتبة). استخدام أداة "تحليل الجزيئات" للكشف عن المناطق عتبة مع إعداد مناسب (→ تحليل → تحليل الجزيئات).
      3. فتح "صورة حاسبة" المساعد وعرض رويس تداخل في القناة الخضراء وحتى الحمراء في الصفراء (→ عملية → حاسبة صورة).
    2. برامج التصوير المجهر لتقييم بيانات 3D
      1. عرض المكدس في3D باستخدام الخيار إظهار حجم (→ 3D التصور القائمة → مشاهدة حجم عرض). استخدام واجهة رسومية لتحديد قنوات خضراء وحمراء وبعيدا الحمراء، وضبط السطوع والتباين واقتصاص كومة 3D لتسليط الضوء على منطقة photoconverted (الشكل 1).
        ملاحظة: أساليب مماثلة لتحليل هي البيانات المتاحة في معظم البرامج المشتركة لتحليل الصور.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويوضح الشكل 1 مثالا للنظام PSmOrange photoconversion. مجمع الصنوبرية هو هيكل محفوظ في الدماغ البيني الظهرية الفقاريات. كما هو الحال في كثير من الفقاريات الأخرى، ويتكون هذا المجمع من الجهاز الصنوبرية في وسط الدماغ البيني والخلايا صنيبري اليسرى جانب واحد. وأظهرت التجارب uncaging أنيقة ولكن تستغرق وقتا طويلا أن الخلايا صنيبري تنشأ في الجزء الأمامي من الجهاز الصنوبرية (13). في TG (foxD3: GFP)؛ TG (FLH: GFP) ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد ساعدت الأجنة وراثيا تحمل صحفيين الفلورسنت أساسا لفهم التطور الجنيني. ومع ذلك، لا يزال هناك حاجة ضرورية لالمروجين لتسهيل التصور محدد هياكل معينة. في غيابهم، يعتمد الباحثون على تقنيات مثل photoconversion من البروتينات الفلورية لمعرفة المزيد عن أصل وتطور هيكلها من الفائدة. وهذا بدوره هو شرط أساسي لتحديد الآليات الجزيئية المشاركة في تنميتها. التقدم التقني في مجال الزرد يسمح الآن لتحل محل FP في خطوط المعدلة وراثيا مع، على سبيل المثال، والبروتينات photoconvertible باستخدام كريسبر-Ca...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نشكر O. Subach على توفير بلازميد H2B-PSmOrange الأصلي وفريق منشأة الأسماك لدينا لرعاية الأسماك. نحن ممتنون لمركز نيكون للتصوير في جامعة هايدلبرغ للوصول إلى معدات الفحص المجهري وبرامج التحليل. نحن نقدر دعم المنشأة الأساسية لتصوير الخلايا الحية في مانهايم في CBTM (DFG INST: 91027 / 10-1 FUGG). تم دعم هذا العمل من قبل Excellenzcluster CellNetworks ، والتنسيق المكاني والزماني EcTop لعمليات الإشارات (EcTop 2) ، وجامعة هايدلبرغ إلى C.A.B. وكلية الطب مانهايم بجامعة هايدلبرغ و DFG (ل 1036/2 و 298 / 3-1 و 298 / 6-1) إلى M.C.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
طقم تنقية PCRQiagen28104
mMESSAGE mMACHINE SP6 طقم النسخAmbionAM1340
RNeasy MiniElute Cleanup KitQiagen74204
مختبراتباستور ألفا البلاستيكيةLW4000
الأصلي H2B-PSmOrange PlasmidAddgene31920البلازميد الموصوف في الورقة هو متوفر في مختبر كارل
FemtoJet MicroinjectorEppendorf5247 000.013
ملقط (5 Inox)NeoLab2-1633
Lab-Tek II Chambered # 1.5 German Coverglass System Nunc155382
Nikon A1R +Nikon GmbH ألمانياNo Number
Nikon PLAN Apo & lambda; 20X air objective Nikon GmbH ألمانياNo Number
NIS عناصر AR Software (الإصدار 4.30.02)Nikon GmbH ألمانيا / رقم التصوير
المختبري رقم

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lombardo, V. A., Sporbert, A., Abdelilah-Seyfried, S. Cell Tracking Using Photoconvertible Proteins During Zebrafish Development. J. Vis. Exp. (4350), (2012).
  2. Subach, O. M., et al. A photoswitchable orange-to-far-red fluorescent protein, PSmOrange. Nature Methods. 8, 771-777 (2011).
  3. Beretta, C. A., Dross, N., Bankhead, P., Carl, M. The ventral habenulae of zebrafish develop in prosomere 2 dependent on Tcf7l2 function. Neural Development. 8, 19(2013).
  4. Ando, R., Hama, H., Yamamoto-Hino, M., Mizuno, H., Miyawaki, A. An optical marker based on the UV-induced green-to-red photoconversion of a fluorescent protein. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 12651-12656 (2002).
  5. Habuchi, S., Tsutsui, H., Kochaniak, A. B., Miyawaki, A., van Oijen, A. M. mKikGR, a monomeric photoswitchable fluorescent protein. PLoS One. 3, e3944(2008).
  6. McKinney, S. A., Murphy, C. S., Hazelwood, K. L., Davidson, M. W., Looger, L. L. A bright and photostable photoconvertible fluorescent protein. Nature Methods. 6, 131-133 (2009).
  7. Chudakov, D. M., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. Tracking intracellular protein movements using photoswitchable fluorescent proteins PS-CFP2 and Dendra2. Nature Protocols. 2, 2024-2032 (2007).
  8. Subach, F. V., et al. Photoactivatable mCherry for high-resolution two-color fluorescence microscopy. Nature Methods. 6, 153-159 (2009).
  9. Patterson, G. H., Lippincott-Schwartz, J. A photoactivatable GFP for selective photolabeling of proteins and cells. Science. 297, 1873-1877 (2002).
  10. Subach, F. V., Patterson, G. H., Renz, M., Lippincott-Schwartz, J., Verkhusha, V. V. Bright monomeric photoactivatable red fluorescent protein for two-color super-resolution sptPALM of live cells. J Am Chem Soc. 132, 6481-6491 (2010).
  11. Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J Vis Exp. (25), e1115(2009).
  12. JoVE Science Education Database. Essentials of Biology 2: Mouse, Zebrafish, and Chick. Zebrafish Breeding and Embryo Handling. , JoVE. Cambridge, MA. Available from: http://www.jove.com/science-education/5150/zebrafish-breeding-and-embryo-handling (2015).
  13. Concha, M. L., et al. Local tissue interactions across the dorsal midline of the forebrain establish CNS laterality. Neuron. 39, 423-438 (2003).
  14. Auer, T. O., Duroure, K., Concordet, J. P., Del Bene, F. CRISPR/Cas9-mediated conversion of eGFP- into Gal4-transgenic lines in zebrafish. Nature Protocols. 9, 2823-2840 (2014).
  15. Auer, T. O., Duroure, K., De Cian, A., Concordet, J. P., Del Bene, F. Highly efficient CRISPR/Cas9-mediated knock-in in zebrafish by homology-independent DNA repair. Genome Research. 24, 142-153 (2014).
  16. Keller, P. J., Schmidt, A. D., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. Reconstruction of zebrafish early embryonic development by scanned light sheet microscopy. Science. 322, 1065-1069 (2008).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Z Image J Fiji NIS Elements

مقالات ذات صلة