Method Article

Bioprinting Cellularized التركيبات باستخدام الأنسجة محددة هيدروجيل Bioink

DOI:

10.3791/53606

⸱

April 21st, 2016

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Wake Forest Institute for Regenerative Medicine, Wake Forest Univeristy Health Sciences

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نحن تصف مجموعة من البروتوكولات التي توفر معا bioink هيدروجيل-محاكاة الأنسجة التي يبني أنسجة 3-D وظيفية وقابلة للحياة ويمكن bioprinted لاستخدامها في تطبيقات في المختبر فحص.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
ظهرت الطباعة الحيوية

كنهج تصنيع حيوي متعدد الاستخدامات لإنشاء تركيبات أعضاء هندسية الأنسجة. هذه التركيبات لها استخدام محتمل كبدائل للأعضاء للزرع في المرضى ، وأيضا عند إنشاؤها على نطاق أصغر كنموذج "عضمي" يمكن استخدامه في الأنظمة المختبرية لفحص الأدوية والسموم.

على الرغم من تطوير مجموعة متنوعة من أجهزة الطباعة الحيوية ، يمكن أن يكون تطبيق تقنية الطباعة الحيوية محدودا بسبب توافر المواد التي تسرع إجراءات الطباعة الحيوية وتدعم بقاء الخلية ووظيفتها من خلال توفير إشارات خاصة بالأنسجة. نصف هنا نظام هيدروجيل متعدد الاستخدامات (HA) والجيلاتين القائم على الجيلاتين يتكون من بروتوكول متعدد الروابط المتشابكة ومرحلتين ، والذي يمكن أن يوفر إشارات كيميائية حيوية خاصة بالأنسجة ويحاكي الخواص الميكانيكية للأنسجة في الجسم الحي. يتم توفير العوامل الكيميائية الحيوية < p class = 'jove_content'> من خلال دمج مواد المصفوفة خارج الخلية المشتقة من الأنسجة ، والتي تشمل عوامل نمو قوية. الخصائص الميكانيكية للأنسجة عبارة عن مجموعات خاضعة للرقابة من الروابط المتشابكة القائمة على PEG بأوزان جزيئية متفاوتة وأشكال هندسية (خطية أو متعددة الأذرع) والمجموعات الوظيفية لإنتاج أحبار حيوية قابلة للبثق وقيم صلابة قص البناء النهائي على نطاق واسع (100 باسكال إلى 20 كيلو باسكال). باستخدام هذه المعلمات ، تم استخدام أحبار هيدروجيل حيوية للطباعة الحيوية لكرويات الكبد الأولية في حبر حيوي خاص بالكبد لإنشاء تركيبات كبد في المختبر ذات قابلية عالية للخلايا وإخراج الألبومين واليوريا الوظيفي القابل للقياس. توفر هذه المنهجية إطارا عاما يمكن تكييفه للتخصيص المستقبلي للهلاميات المائية للتصنيع الحيوي لمجموعة واسعة من أنواع بناء الأنسجة.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في السنوات الأخيرة، أصبحت مجموعة متنوعة من التقنيات المتاحة التي تتناول الحاجة إلى مصادر بديلة للأعضاء وأنسجة وظيفية من خلال السعي لتصنيع، أو biofabricate، لهم. وقد برزت Bioprinting باعتبارها واحدة من أكثر واعدة من هذه التقنيات. Bioprinting يمكن النظر إليها على أنها شكل من أشكال تلفيق المضافة الروبوتية قطع البيولوجية، والتي يمكن استخدامها لبناء أو نمط قابل للتطبيق الهياكل الجهاز تشبه أو الأنسجة تشبه في 3 أبعاد. (1) في معظم الحالات، bioprinting توظف 3-الأبعاد (3 -D) جهاز الطباعة التي يتم توجيهها بواسطة جهاز كمبيوتر لإيداع الخلايا والحيوية في مواقع محددة، وبالتالي تلخص تشريحيا-يقلد أبنية الفسيولوجية. 2 هذه الأجهزة طباعة "bioink"، والتي يمكن أن تتخذ شكل مجاميع الخلايا، والخلايا مغلفة في الهلاميات المائية أو سوائل لزجة، أو ناقل دقيق خلايا المصنف، وكذلك البوليمرات خالية من الخلايا التي توفر هيكل ميكانيكي أو بمثابة جيش التحرير الشعبى الصينى خالية من الخلاياceholders. 3،4 في أعقاب عملية bioprinting، وهيكل الناتج يمكن نضجت في هياكل النسيج أو العضو وظيفية، واستخدامها لتطبيق نهاية المعد له. 5،6 وحتى الآن، لم يتم طباعتها جهاز بحجم الإنسان تعمل بكامل طاقتها كاملة، ولكن يبقى الهدف الرئيسي على المدى الطويل bioprinting البحث والتطوير. 2 ومع ذلك، على نطاق صغير يجري تنفيذ "عضي" يبني أنسجة حاليا في عدد من التطبيقات، بما في ذلك النمذجة علم الأمراض، وتطوير الأدوية، وفحص السموم.

واحدة من العقبات الرئيسية التي واجهت الباحثين في مجال تطبيق تكنولوجيا bioprinting هو أن عدد قليل جدا من المواد قد وضعت لغرض واضح وهو bioprinting. أن تنجح بشكل فعال في bioprinting، يجب أن مادة بيولوجية تلبية 4 المتطلبات الأساسية. وبيولوجية تحتاج الى 1) الخواص الميكانيكية المناسبة لتمكين ترسب (سواء كان ذلك البثق من خلال فوهة كما هلام أو طnkjet كما قطرات)، 2) القدرة على الاحتفاظ بشكلها كعنصر من عناصر هيكل 3-D بعد الترسيب، 3) القدرة على التحكم المستخدم من الخصائص السابقة 2 و 4) صديقة للبيئة وداعمة خلية في كل مراحل الإجراء bioprinting 7 تاريخيا، bioprinting العمل وكثيرا ما حاولت أن توظف الحيوية التقليدية الموجودة في أجهزة bioprinting دون النظر لمدى توافقها، بدلا من تصميم مادة بيولوجية لديها خصائص اللازمة لbioprinting وتطبيقات ما بعد الطباعة اللاحقة.

وقد وضعت مجموعة متنوعة من bioinks مؤخرا إلى واجهة أفضل مع الأجهزة ترسب وتلفيق. نظم هيدروجيل القياسية تثير مشاكل كبيرة لأنها موجودة عموما إما السلائف حلول السوائل مع خصائص ميكانيكية كافية، أو الهلاميات المائية بلمرة أنه إذا المطبوعة يمكن أن تسد فوهات أو تصبح تفككت على عملية قذف. فريق العمل لدينا، وكذلك تنقية المياهالتمرير، واستكشفت الصيغ المختلفة هيدروجيل لمعالجة هذه المشاكل bioprinting، بما في ذلك الطباعة خلية كروي إلى ركائز هيدروجيل، 5،8 الخلية وخيوط هيدروجيل قذف من الأنابيب microcapillary، 9-11 extrudable حمض الهيالورونيك (HA) الهلاميات المائية جسيمات متناهية الصغر -gold مع خصائص ديناميكية يشابك 12 مراقبة الزمنية للصلابة هيدروجيل باستخدام photopolymerizable methacrylated HA والجيلاتين، 13 يشابك أساس الفيبرينوجين-الثرومبين، 14،15 التبادل الأيوني المواد الهلامية الجينات الكولاجين و 16 و مؤخرا تبلمر السريع الأشعة فوق البنفسجية (UV) يشابك -initiated، 17

هذه الأمثلة توضح جدوى من المواد التي يمكن أن تولد من قبل bioprinted على نحو فعال. ومع ذلك، بالإضافة إلى التكامل مع الأجهزة، لتوليد بنجاح يبني أنسجة 3-D قابلة للحياة وظيفية، يجب الحيوية تحتوي على منبهات الكيميائية الحيوية والميكانيكية التي تساعد في الحفاظ على الخلويسلامة وظيفة. هذه العوامل الإضافية، وملامح الكيمياء الحيوية والميكانيكية، يمكن أن يكون لها تأثير كبير على وظيفة ناجحة ليبني أنسجة bioprinted.

كل من الخلايا والمصفوفة خارج الخلية الأم (ECM) هي المسؤولة عن تقديم مجموعة واسعة من الجزيئات يشير مثل عوامل النمو وغيرها من السيتوكينات إلى خلايا أخرى. الجمع بين هذه الإشارات تختلف من الأنسجة إلى الأنسجة، ولكن يمكن أن تكون فعالة للغاية ومؤثر في تنظيم الخلايا والأنسجة السلوك. 18 توظيف مكونات ECM الأنسجة محددة من الأجهزة المختلفة وتنفيذ كما هيدروجيل أو كجزء من هيدروجيل تم استكشافها مع نجاح 19-21 هذا النهج، الذي يتألف من decellularizing نسيج معين، تحطيم ذلك، وحلها، ويمكن استخدامها لإنتاج الإشارات البيوكيميائية الأنسجة محددة من أي نوع من الأنسجة، ويمكن إدراجها في 3-D بنيات هيدروجيل 22

بالإضافة إلى،تم توثيقه على نطاق واسع أن الأنسجة في الجسم تحتل مجموعة واسعة من التصلب. 23 وعلى هذا النحو، والقدرة على ضبط الخواص الميكانيكية للمواد حيوية، مثل مرونة معامل E 'أو القص مرونة معامل G'، هو أداة مفيدة في هندسة الأنسجة . كما هو موضح أعلاه، السيطرة على الخواص الميكانيكية bioink تسمح biofabrication القائم على قذف باستخدام هلام لينة، والتي يمكن بعد ذلك التلاعب مزيد من يشابك الثانوي في مرحلة لاحقة، والذي لا يمكن أن يتحقق مستويات معامل مرنة أن يتطابق مع نوع الجهاز المستهدف. على سبيل المثال، يمكن تخصيص المواد الحيوية لتتناسب مع صلابة من 5-10 كيلو باسكال مثل الكبد الأصلي، 23 أو تتطابق مع صلابة من 10-15 كيلو باسكال مثل الأنسجة القلبية الأم، 24،25 في نظرية زيادة قدرة هذه organoids للعمل في بطريقة مماثلة لنظرائهم الأنسجة الأصلية الخاصة بهم. وكان تأثير صلابة البيئية على النمط الظاهري خلية إكسبlored في السنوات الأخيرة، وخاصة فيما يتعلق الخلايا الجذعية. أظهرت إنجلر وآخرون أن مرونة الركيزة ساعد في قيادة الخلايا الجذعية الوسيطة (MSC) نحو الأنساب مع مرونة الأنسجة مطابقة أن الركيزة. 25 هذا المفهوم قد مواصلة استكشاف للتمايز في العضلات، وظيفة القلب، والنمط الظاهري الكبد، الجذعية المكونة للدم تكاثر الخلايا ، والحفاظ على الإمكانات العلاجية للخلايا الجذعية. 24،26-29 أن تكون قادرة على ضبط هيدروجيل إلى الرجوعية المرنة المختلفة هو سمة هامة من مادة بيولوجية التي سيتم استخدامها لbiofabricate بنيات الأنسجة. 30

نحن هنا وصف البروتوكول الذي يمثل نهج متعدد الاستعمالات يستخدم في مختبرنا لصياغة نظام هيدروجيل التي يمكن قذف bioprinted، ومصممة خصيصا ل1) تحتوي على الشخصية الكيمياء الحيوية من نوع الأنسجة معين و 2) تقليد معامل مرونة من هذا النوع الأنسجة . من خلال معالجة هذه الاحتياجات، ونحن نهدف إلى provide المواد التي يمكن تلخيص الخصائص الفيزيائية والبيولوجية في الجسم الحي الأنسجة. 31 نظام مركب هيدروجيل حدات الموصوفة هنا يستفيد من نهج يشابك متعددة لانتاج bioinks extrudable، ويسمح يشابك الثانوي لتحقيق الاستقرار ويزيد من تصلب المنتجات النهائية لمباراة مجموعة واسعة من أنواع الأنسجة. والتقى التخصيص الكيمياء الحيوية باستخدام مكونات ECM الأنسجة محددة. كما مظاهرة، ونحن توظيف مجموعة متنوعة الكبد محددة من هذا النظام هيدروجيل إلى bioprint الكبد وظيفي يبني عضي. يستخدم بروتوكول صفها مخصص 3-D جهاز bioprinting. بشكل عام، هذا البروتوكول يمكن تكييفها لمعظم الطابعات القائم على قذف، والمعلمات الطباعة محددة تختلف بشكل كبير لكل نوع من الجهاز وتتطلب اختبار من قبل المستخدم.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. هيدروجيل Bioink صياغات والتحضير

  1. من أجل تقديم لمحات الحيوية أنسجة محددة، وإعداد الأنسجة محددة ECM هضم الحلول كما هو موضح سابقا للكبد. 20
    ملاحظة: بشكل عام، وهذا ECM هضم تشكل 40٪ من حجم bioink هيدروجيل النهائي الذي يعمل. عدة مئات من مل من محلول ECM هضم يمكن إعداد، aliquoted، وتجميد في -80 درجة مئوية لاستخدامها في المستقبل.
  2. قبل هيدروجيل صياغة، بحل photoinitiator، 2-هيدروكسي-4 "- (2-hydroxyethoxy) -2-methylpropiophenone، في المياه عند 0.1٪ ث / ت.
    ملاحظة: أحجام التداول في نطاق 50-100 مل يمكن إعداد في وقت سابق وتخزينها محمية من الضوء في 4 درجة مئوية لمدة عدة أشهر.
  3. لتشكيل bioinks هيدروجيل، أولا بحل مكونات المادة الأساسية من مجموعات هيدروجيل حمض الهيالورونيك (ها) في حل المياه photoinitiator.
    1. حل الجيلاتين thiolated HA و thiolated بشكل منفصل في الماء فhotoinitiator الحل (الخطوة 1.2) لجعل 2٪ ث / حلول الخامس.
    2. حل diacrylate البولي ايثيلين جلايكول (PEGDA)، وcrosslinker في مجموعات هيدروجيل، في حل المياه photoinitiator (الخطوة 1.2) لجعل 8٪ ث / ت حل.
    3. حل البولي ايثيلين جلايكول (PEG) آلكاين 8 ذراع (10 كيلو دالتون ميغاواط) في المياه photoinitiator الحل (الخطوة 1.2) لجعل 8٪ ث / ت حل.
  4. بشكل عام، تشكل الهلاميات المائية باستخدام نظام التالية، على الرغم من أن التخصيص الإضافي ممكن.
    1. الجمع بين 4 أجزاء 2٪ thiolated HA، 4 أجزاء 2٪ thiolated الجيلاتين، 1 جزء crosslinker 1، 1 جزء crosslinker 2 مع 8 أجزاء ECM الأنسجة حل و2 أجزاء وسائل الإعلام ثقافة الكبدية (HCM) (أو 10 أجزاء من الماء باعتباره غير الأنسجة عامة هيدروجيل -specific).
      ملاحظة: معدلة إضافية HA أو الجيلاتين يمكن أن تضاف إلى جعل قذف bioink أكثر سلاسة. يوصف هذا أدناه.
  5. دوامة الخليط الناتج على ارتفاع (سرعة 10 من أصل 10) لمدة 10 ثانية لخلط قبل الاستخدام.
  6. استخدام bioink هيدروجيل
    1. البثق أو اختبار bioprinting، ونقل الخليط في المحاقن أو الطابعة خرطوشة والسماح لها تشعبي من تلقاء أنفسهم لمدة 30 دقيقة (المرحلة 1 يشابك) عند 37 درجة مئوية.
    2. لقياس الانسيابية، ونقل الخليط إلى 35 مم طبق بيتري والسماح لها تشعبي لمدة 30 دقيقة.
      ملاحظة: الخليط يبدأ على الفور إلى تشعبي من خلال تشكيل ثيول-اكريليت السندات وسوف تبدأ في الزيادة في اللزوجة. يجب نقل الخليط إلى حقنة، خرطوشة طباعة، أو موقع الهدف في غضون 10 دقيقة لتجنب انسداد ماصة أو حقنة أثناء النقل.
    3. عندما يكون المطلوب يشابك الثانوي (المرحلة 2)، أشرق المرحلة الهلام 1-crosslinked مع ضوء الأشعة فوق البنفسجية (365 نانومتر، 18 واط / سم 2) لبدء تفاعل البلمرة-ثيول آلكاين.
      ملاحظة: مدة إشعاع تعتمد على المساحة السطحية للمادة. بشكل عام، سنتيمتر مربع من المواد يتطلب سوى 1-2 ثانية من التعرض للأشعة فوق البنفسجية في هذه السلطة للأشعة فوق البنفسجية.

2. طابعة اختبار التوافق

  1. قبل اختبار التكامل مع أجهزة bioprinting، وخصائص اختبار قذف على مقاعد البدلاء المختبر مع الاختبارات قذف بسيطة باستخدام الحقن القياسية والصغيرة نصائح إبرة قياس (20-30 قياس).
    1. دفع bioink من خلال حقنة القياسية لتحقيق خيوط مقذوف بسلاسة من هيدروجيل مع عدد قليل أو أي عقبات. البثق خطوط أو أنماط بسيطة غير كافية لتحديد النجاح.
  2. للتكامل bioprinter، تحميل bioink الاستعدادات من قبل pipetting لهم في الطابعة خراطيش، والسماح 30 دقيقة لbioink للخضوع عفوية المرحلة 1 يشابك داخل خرطوشة.
    ملاحظة: حجم bioink يعتمد على تطبيق معين وينبغي أن تحدد من قبل المستخدم. خراطيش الطابعة قد تشبه أو أن يكون الحقن التي تتوافق مع الجهاز bioprinter.
  3. تقييم التوافق قذفلbioprinting عن طريق طباعة نمط بسيط باستخدام bioink. على سبيل المثال، طباعة نمط 7 × 7 مم تتألف من خطوط متوازية. الضغط (على سبيل المثال، 20 كيلو باسكال ضغط هوائي) في حين أن تحركات رأس الطباعة في الطائرة XY في سرعة ما يقرب من 300 مم / دقيقة.
    ملاحظة: قطر فوهة رأس الطباعة من مختلف الأحجام يمكن استخدامها، ولكن فوهات المخروطية مع فتحات بقطر 400-500 ميكرومتر هي الأمثل لطباعة الكروية في نطاق 250-350 ميكرون.
    1. إذا كانت المواد مقذوف هي العقدي أو غير منتظمة، راجع الخطوة 2.4، أو تقليل كمية PEGDA لتليين المواد crosslinked المرحلة 1. تركيبات bioink أعدت بشكل صحيح قذف بسلاسة، والسماح ترسب الدقيق في أنماط المطلوب أو أبنية.
      ملاحظة: الإجراءات bioprinting استخدام وصف مخصص 3-D جهاز bioprinting مصممة في منزل خصيصا للأنسجة بناء الطباعة 32 وهذه المعالم الطباعة ومحددة تختلف بشكل كبير لكل نوع من الجهاز وتتطلب testin.ز من قبل المستخدم.
  4. لتحسين خصائص البثق، تكملة معدلة HA والجيلاتين إلى bioinks (1.5 ملغ / مل و 30 ملغ / مل، على التوالي).

3. التحقق من Bioprinting مع الكبد التركيبات الابتدائية

  1. إعداد 3-D الكروية الأساسي خلايا الكبد شنقا أساليب انخفاض باعتبارها العنصر الخلوي 33
    ملاحظة: لا يمكن أن يؤديها Bioprinting دون الكروية، ولكن بدلا من ذلك مع الخلايا الفردية معلقة في bioinks هيدروجيل كذلك. ويعمل الكروية هنا لتسريع التفاعلات خلية خلية وبناء وظيفة. يعتمد عدد الكروية أو خلايا يعملون على تطبيق معين وينبغي أن تحدد من قبل المستخدم. يجب أن يتم تنفيذ هذه الخطوات تحت ظروف معقمة، وذلك باستخدام مواد معقمة.
    1. إعداد HCM بإضافة محتويات إذابة للHCM عدة عنصر مكمل لوسائل الإعلام الكبدية القاعدية (HBM) وتصفية العقيمة.
      1. ذوبان الجليد في الامم المتحدة مكونات الملحقسمسم السائل.
      2. إضافة مكونات ملحق (حمض الاسكوربيك، 0.5 مل، ألبومين المصل البقري [الأحماض الدهنية الحرة]، 10 مل، جنتاميسين سلفات / الأمفوتريسين B، 0.5 مل، الهيدروكورتيزون 21 hemisuccinate، 0.5 مل، الانسولين، 0.5 مل، عامل نمو البشرة المؤتلف الإنسان 0.5 مل، نقل، 0.5 مل) إلى HBM 500 مل.
      3. تصفية العقيمة من خلال 0.45 ميكرون أو 0.22 ميكرون تصفية باستخدام زجاجة أعلى وحدة تصفية أو تصفية حقنة طرف.
    2. تحديد كثافة خلية من خلايا الكبد الأولية الإنسان، خلايا كوبفر، والخلايا النجمية التي تعول على عدادة الكريات بعد أن تم إذابة كل نوع من الخلايا وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
    3. الجمع بين خلايا الكبد الأولية الإنسان، خلايا كوبفر، والخلايا النجمية في نسبة 80:10:10 بواسطة عدد الخلايا في وسائل الإعلام HCM التي تم تحسنت إلى 37 درجة مئوية في أنبوب مخروطي الشكل.
      ملاحظة: حجم وسائل الاعلام لاستخدامها يعتمد على عدد الخلايا الإجمالي المحدد للتطبيق ويجب ان يحدده عشرالبريد المستخدم.
    4. الطرد المركزي تعليق خلية لمدة 5 دقائق في 520 x ج عند 20 درجة مئوية.
    5. نضح طاف، وترك وراء بيليه الخلية.
    6. resuspend الكرية خلية في وسائل الإعلام HCM لتسفر عن التعليق الخلية التي تحتوي على 1000 خلية لكل ميكرولتر 40 وسائل الإعلام. اجمالى حجم يعتمد على عدد من الأجسام الشبه الكروية التي يتم إنتاجها.
    7. نقل تعليق خلية لوحات قطرة شكل اعدام 96-جيدا. إضافة ما مجموعه حوالي 1000 خلايا إلى كل بئر في الرابع والحفاظ على 37 درجة مئوية، في 5٪ CO 2 لمدة 3 أيام خلالها تشكل الأجسام الشبه الكروية المتعددة الخلايا.
    8. جمع الكروية الكبد من لوحة قطرة شنقا باستخدام pipettor. نقل إلى العقيمة 15 مل أنبوب مخروطي الشكل.
  2. الكروية الكبد Bioprint في الكبد محدد هيدروجيل bioink
    1. إعداد صياغة الكبد التي تحتوي على ECM هيدروجيل bioink كما هو موضح في الخطوة 1، وتوظيف 8٪ PEGDA و 8٪ 8-الذراع PEG آلكاين كما crosslinkers. استخدام هذا المزيج لقدرتها في دورة الفتشوبlting في هيدروجيل وثيق في معامل مرونة القص لأنسجة الكبد الأم.
    2. دع الكروية تترسب في قاع الأنبوب المخروطية التي تم وضعها في الخطوة 3.1.7. يختلف هذا استنادا إلى حجم كروي وكثافة، ولكن يحدث عادة في غضون 1-2 دقيقة. إزالة كافة وسائل الإعلام بواسطة الشفط بعناية أو مع pipettor.
    3. نقل حجم المطلوب من الطازجة حل هيدروجيل bioink إلى أنبوب مخروطي يحتوي على الأجسام الشبه الكروية. عموما، حجم مناسب هو 10٪ -25٪ أكبر من حجم بناء 3-D المراد طباعتها. ماصة بعناية صعودا وهبوطا ل resuspend الكروية في حل هيدروجيل bioink. نقل على خرطوشة bioprinter باستخدام pipettor أو ماصة المصلية.
    4. داخل خرطوشة bioprinter، والسماح للحل للخضوع المرحلة الأولى يشابك (ثيول-اكريليت رد فعل) لمدة 30 دقيقة.
      ملاحظة: اعتمادا على حجم كروي، قد يحتاج خرطوشة أن يكون ببطء استدارة أو قد تحتاج إلى أن تكون مختلطة مع محتوياتملعقة معقمة للحفاظ على الكروية توزع في جميع أنحاء bioink خلال يشابك المرحلة 1. وهذا هو أقل من ضرورة لbioinks أعدت مع خلايا مع وقف التنفيذ بدلا من الكروية.
      ملاحظة: بعد مرحلة 1 يشابك، يكون لدى المستخدمين نافذة التشغيل لعدة ساعات. ومع ذلك، فمن المستحسن لتنفيذ عملية bioprinting بسرعة لتحسين بقاء الخلية.
    5. وبعد مرحلة 1 يشابك، استخدام جهاز bioprinting إلى إنشاء هياكل هيدروجيل المرجوة التي تحتوي على الأجسام الشبه الكروية الكبد الأولية (أو الخلايا الأخرى).
      ملاحظة: توفر هذه التقنية نظام لbiofabricating مجموعة واسعة من الهياكل. المعلمات مثل إجمالي حجم وعدد الخلايا أو الأجسام الشبه الكروية، هندسة هيكل المطبوعة، والركيزة التي تطبع يبني تعتمد اعتمادا كبيرا على أهداف للمستخدم.
    6. بعد الترسيب في تكوين المطلوب، إدارة الأشعة فوق البنفسجية لمدة 2-4 ثانية لبدء آلية يشابك الثانوية، وتحقيق الاستقرار والتعاونnstructs وزيادة صلابة إلى المستوى المطلوب.
      ملاحظة: إن تركيز PEG-آلكاين، وبالتالي فإن كثافة يشابك النهائية الشاملة، يتحكم في المقام الأول على صلابة بناء النهائية.
    7. كرر الخطوات 3.2.4 و3.2.5 من أجل إنشاء بنيات متعددة الطبقات.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

عندما يتم اتباع الإجراءات المذكورة أعلاه بشكل صحيح، يجب أن تحتوي الهلاميات المائية لمحة البيوكيميائية محددة لنوع النسيج المستهدف، 20 تسمح للحصول على درجة عالية من السيطرة على bioprinting ومعامل المرونة النهائي، 34 ودعم خلايا وظيفية قابلة للحياة في بنيات الأنسجة.

هيدروجيل التخصيص
إلى أفضل الكبد الأصلي المق...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هناك العديد من المكونات التي تعتبر حاسمة في الاعتبار عند محاولة biofabricate 3-D بنيات الأنسجة، لاستخدامها في نهاية المطاف في البشر أو في المختبر تطبيقات الفرز. توظيف المكونات الخلوية المناسبة يحدد وظيفة محتملة نهاية، في حين أن جهاز biofabrication نفسه يحدد منهجية عامة للوصول إلى بناء النهاية. أما العنصر الثالث، وبيولوجية، هو نفس القدر من الأهمية، لأنه يحقق الأدوار المزدوجة. على وجه التحديد، يجب أن يكون عنصر بيولوجية متوافق مع كل من الأجهزة biofabrication (أي bio...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

والكتاب الامتنان التمويل من قبل وكالة خفض التهديد الدفاع (اثناء اجتماع السلطة) تحت الفضاء والأنظمة البحرية الحروب مركز المحيط الهادئ (SSC PACIFIC) العقد رقم N6601-13-C-2027. لا يشكل نشر هذه المواد موافقة الحكومة للنتائج أو استنتاجات هنا.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
حمض الهيالورونيكسيجما53747
الجيلاتينسيجماG6144
2-هيدروكسي -4 & برايم ؛ - (2-هيدروكسي إيثوكسي) -2-ميثيل بروبيوفينونسيجما410896
حمض الهيالورونيك ومجموعة هيدروجيل الجيلاتين (HyStem-HP) تحتويESI-BIOGS315على مكونات هيبراسيل (حمض الهيالورونيك الثيولي والهيبارين) ، الجيلين S (ثيوله الجيلاتين) ، و Extralink (PEGDA) PEG
8-Arm Alkyne ، 10 & nbsp ؛ kDaCreative PEGWorksPSB-887
خلايا الكبد البشرية الأوليةمختبرات أبحاث المثلثHUCPM6
الخلايا النجمية الأولية للكبد البشريScienCell5300
خلايا Kupffer البشرية الأوليةالحياة HUKCCS
الكبد القاعدية (HBM)LonzaCC-3199
وسائط خلايا الكبد مجموعة المكملاتالغذائية LonzaCC-3198HCM SingleQuot Kits (تحتوي على حمض الأسكوربيك ، 0.5   ؛ مل; ألبومين مصل الأبقار [خالي من الأحماض الدهنية] ، 10 & nbsp ؛ مل; كبريتات الجنتاميسين / أمفوتريسين ب ، 0.5   ؛ مل; هيدروكورتيزون 21-هيميسوكسينات ، 0.5   ؛ مل; الأنسولين ، 0.5   ؛ مل; عامل نمو البشرة المؤتلف البشري ، 0.5 & nbsp ؛ مل; التحويل, 0.5  مل)
Triton X-100SigmaT9284الشركات المصنعة الأخرى على ما يرام.
هيدروكسيد الأمونيومفيشر ScientificA669الشركات المصنعة الأخرى على ما يرام.
مناديل جثة الخنازير الطازجةn / an / a
Lyophilizerأيمطحنة تجميد n /
الطابعةالحيوية
n / an / aالطابعة الحيوية الموضحة هنا تم بناؤها خصيصا في المنزل. بشكل عام ، تكون الأجهزة الأخرى كافية بشرط أن تدعم الطباعة القائمة على البثق التي يتم التحكم فيها بواسطة الكمبيوتر لمواد الهيدروجيل.
لوحة ثقافة الخلايا المتساقطة المعلقةInSpheroCS-06-001InSphero GravityPlus 3D Culture Platform
مجموعة تقنيات خلايا a

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Visconti, R. P., et al. Towards organ printing: engineering an intra-organ branched vascular tree. Expert Opin Biol Ther. 10, 409-420 (2010).
  2. Derby, B. Printing and prototyping of tissues and scaffolds. Science. 338, 921-926 (2012).
  3. Fedorovich, N. E., et al. Hydrogels as extracellular matrices for skeletal tissue engineering: state-of-the-art and novel application in organ printing. Tissue Eng. 13, 1905-1925 (2007).
  4. Mironov, V., Boland, T., Trusk, T., Forgacs, G., Markwald, R. R. Organ printing: computer-aided jet-based 3D tissue engineering. Trends Biotechnol. 21, 157-161 (2003).
  5. Boland, T., Mironov, V., Gutowska, A., Roth, E. A., Markwald, R. R. Cell and organ printing 2: fusion of cell aggregates in three-dimensional gels. Anat Rec A Discov Mol Cell Evol Biol. 272, 497-502 (2003).
  6. Mironov, V., Kasyanov, V., Drake, C., Markwald, R. R. Organ printing: promises and challenges. Regen Med. 3, 93-103 (2008).
  7. Skardal, A., Atala, A. Biomaterials for integration with 3-d bioprinting. Ann Biomed Eng. 43, 730-746 (2015).
  8. Mironov, V., et al. Organ printing: tissue spheroids as building blocks. Biomaterials. 30, 2164-2174 (2009).
  9. Norotte, C., Marga, F. S., Niklason, L. E., Forgacs, G. Scaffold-free vascular tissue engineering using bioprinting. Biomaterials. 30, 5910-5917 (2009).
  10. Skardal, A., Zhang, J., Prestwich, G. D. Bioprinting vessel-like constructs using hyaluronan hydrogels crosslinked with tetrahedral polyethylene glycol tetracrylates. Biomaterials. 31, 6173-6181 (2010).
  11. Bertassoni, L. E., et al. Direct-write bioprinting of cell-laden methacrylated gelatin hydrogels. Biofabrication. 6, 024105(2014).
  12. Skardal, A., Zhang, J., McCoard, L., Oottamasathien, S., Prestwich, G. D. Dynamically crosslinked gold nanoparticle - hyaluronan hydrogels. Adv Mater. 22, 4736-4740 (2010).
  13. Skardal, A., et al. Photocrosslinkable hyaluronan-gelatin hydrogels for two-step bioprinting. Tissue Eng Part A. 16, 2675-2685 (2010).
  14. Skardal, A., et al. Bioprinted amniotic fluid-derived stem cells accelerate healing of large skin wounds. Stem Cells Transl Med. 1, 792-802 (2012).
  15. Xu, T., et al. Hybrid printing of mechanically and biologically improved constructs for cartilage tissue engineering applications. Biofabrication. 5, 015001(2013).
  16. Xu, T., et al. Complex heterogeneous tissue constructs containing multiple cell types prepared by inkjet printing technology. Biomaterials. 34, 130-139 (2013).
  17. Murphy, S. V., Skardal, A., Atala, A. Evaluation of hydrogels for bio-printing applications. J Biomed Mater Res A. 101, 272-284 (2013).
  18. Badylak, S. F. The extracellular matrix as a biologic scaffold material. Biomaterials. 28, 3587-3593 (2007).
  19. Freytes, D. O., Tullius, R. S., Valentin, J. E., Stewart-Akers, A. M., Badylak, S. F. Hydrated versus lyophilized forms of porcine extracellular matrix derived from the urinary bladder. J Biomed Mater Res A. 87, 862-872 (2008).
  20. Skardal, A., et al. Tissue specific synthetic ECM hydrogels for 3-D in vitro maintenance of hepatocyte function. Biomaterials. 33, 4565-4575 (2012).
  21. Johnson, T. D., Braden, R. L., Christman, K. L. Injectable ECM scaffolds for cardiac repair. Methods Mol Biol. 1181, 109-120 (2014).
  22. Pati, F., et al. Printing three-dimensional tissue analogues with decellularized extracellular matrix bioink. Nat comm. 5, 3935(2014).
  23. Vanderhooft, J. L., Alcoutlabi, M., Magda, J. J., Prestwich, G. D. Rheological properties of cross-linked hyaluronan-gelatin hydrogels for tissue engineering. Macromol Biosci. 9, 20-28 (2009).
  24. Engler, A. J., et al. Embryonic cardiomyocytes beat best on a matrix with heart-like elasticity: scar-like rigidity inhibits beating. J Cell Sci. 121, 3794-3802 (2008).
  25. Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126, 677-689 (2006).
  26. Chaudhuri, T., Rehfeldt, F., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Preparation of collagen-coated gels that maximize in vitro myogenesis of stem cells by matching the lateral elasticity of in vivo muscle. Methods Mol Biol. 621, 185-202 (2010).
  27. Lozoya, O. A., et al. Regulation of hepatic stem/progenitor phenotype by microenvironment stiffness in hydrogel models of the human liver stem cell niche. Biomaterials. 32, 7389-7402 (2011).
  28. Holst, J., et al. Substrate elasticity provides mechanical signals for the expansion of hemopoietic stem and progenitor cells. Nat Biotechnol. 28, 1123-1128 (2010).
  29. Skardal, A., Mack, D., Atala, A., Soker, S. Substrate elasticity controls cell proliferation, surface marker expression and motile phenotype in amniotic fluid-derived stem cells. J Mech Behav Biomed Mater. 17, 307-316 (2013).
  30. Rutz, A. L., Hyland, K. E., Jakus, A. E., Burghardt, W. R., Shah, R. N. A multimaterial bioink method for 3D printing tunable, cell-compatible hydrogels. Adv Mater. 27, 1607-1614 (2015).
  31. Malda, J., et al. 25th anniversary article: Engineering hydrogels for biofabrication. Adv Mater. 25, 5011-5028 (2013).
  32. Integrated organ and tissue printing methods, system and apparatus. US Patent. , 2012/00889238 A1 (2011).
  33. Drewitz, M., et al. Towards automated production and drug sensitivity testing using scaffold-free spherical tumor microtissues. Biotechnol J. 6, 1488-1496 (2011).
  34. Skardal, A., et al. A hydrogel bioink toolkit for mimicking native tissue biochemical and mechanical properties in bioprinted tissue constructs. Acta Biomater. 25, 24-34 (2015).
  35. Peattie, R. A., et al. Stimulation of in vivo angiogenesis by cytokine-loaded hyaluronic acid hydrogel implants. Biomaterials. 25, 2789-2798 (2004).
  36. Flynn, L., Prestwich, G. D., Semple, J. L., Woodhouse, K. A. Adipose tissue engineering with naturally derived scaffolds and adipose-derived stem cells. Biomaterials. 28, 3834-3842 (2007).
  37. Flynn, L., Prestwich, G. D., Semple, J. L., Woodhouse, K. A. Adipose tissue engineering in vivo with adipose-derived stem cells on naturally derived scaffolds. J Biomed Mater Res A. 89, 929-941 (2009).
  38. Duflo, S., Thibeault, S. L., Li, W., Shu, X. Z., Prestwich, G. Effect of a synthetic extracellular matrix on vocal fold lamina propria gene expression in early wound healing. Tissue Eng. 12, 3201-3207 (2006).
  39. Duflo, S., Thibeault, S. L., Li, W., Shu, X. Z., Prestwich, G. D. Vocal fold tissue repair in vivo using a synthetic extracellular matrix. Tissue Eng. 12, 2171-2180 (2006).
  40. Liu, Y., Shu, X. Z., Prestwich, G. D. Osteochondral defect repair with autologous bone marrow-derived mesenchymal stem cells in an injectable, in situ, cross-linked synthetic extracellular matrix. Tissue Eng. 12, 3405-3416 (2006).
  41. Liu, Y., et al. Accelerated repair of cortical bone defects using a synthetic extracellular matrix to deliver human demineralized bone matrix. J Orthop Res. 24, 1454-1462 (2006).
  42. Zhang, J., Skardal, A., Prestwich, G. D. Engineered extracellular matrices with cleavable crosslinkers for cell expansion and easy cell recovery. Biomaterials. 29, 4521-4531 (2008).
  43. Serban, M. A., Scott, A., Prestwich, G. D. Unit 10.14, Use of hyaluronan-derived hydrogels for three-dimensional cell culture and tumor xenografts. Curr Protoc Cell Biol. Chapter 10, (2008).
  44. Xu, X., Prestwich, G. D. Inhibition of tumor growth and angiogenesis by a lysophosphatidic acid antagonist in an engineered three-dimensional lung cancer xenograft model. Cancer. 116, 1739-1750 (2010).
  45. Liu, Y., Shu, X. Z., Prestwich, G. D. Tumor engineering: orthotopic cancer models in mice using cell-loaded, injectable, cross-linked hyaluronan-derived hydrogels. Tissue Eng. 13, 1091-1101 (2007).
  46. Skardal, A., Devarasetty, M., Rodman, C., Atala, A., Soker, S. Liver-Tumor Hybrid Organoids for Modeling Tumor Growth and Drug Response In Vitro. Ann Biomed Eng. , (2015).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

BioprintingHydrogel BioinkTissue specific HydrogelExtracellular MatrixLiver SpheroidsConfocal MicroscopyUV CrosslinkingPEG CrosslinkersHyaluronic AcidGelatin based Hydrogel

Related Articles