مقالة منهجية

زراعة الخلايا الأولية الأديم الباطن طلائي من الكيس المحي غشاء اليابانية السمان الأجنة

8.3K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/53624

⸱

مارس 10, 2016

 ,  ,  , 
1Department of Animal Science and Technology, National Taiwan University

في هذه المقالة

ملخص

لدراسة آلية استخدام الدهون في أغشية كيس الصفار خلال المراحل المتأخرة من التطور الجنيني للطيور ، أنشأنا نظاما أساسيا لزراعة الخلايا الظهارية الجنينية للسمان الياباني.

الملخص

أنشأنا الظهارية نموذج خلية ثقافة الأديم الباطن (EEC) لدراسة وظيفة بعض الأنزيمات والبروتينات في التوسط في استخدام المواد الغذائية التي أجنة الطيور خلال التنمية. وحضنت المخصبة بيض السمان اليابانية عند 37 درجة مئوية لمدة 5 أيام ثم صفار جمعت أغشية الكيس (YSM) لإنشاء نظام ثقافة الجماعة الاقتصادية الأوروبية. نحن عزل طبقة الأديم الجنينية من YSM، وشرائح الغشاء إلى 2-3 قطع ملم ويهضم جزئيا مع كولاجيناز قبل البذر في لوحات ثقافة 24-جيدا. وEECS تتكاثر من النسيج ونحن على استعداد للدراسات ثقافة الخلية. وجدنا أن EECS كان الخصائص المميزة للYSM في الجسم الحي، على سبيل المثال، وتراكم قطرات الدهون، تعبيرا عن ستيرول O-ناقلة الأسيل والليباز البروتين الدهني. علاج الهضم جزئية زيادة كبيرة في معدل نجاح ثقافة السوق الأوروبية المشتركة. الاستفادة من EECS، أثبتنا أن التعبير عن SOAT1 ينظمها المخيم دبروتين كيناز ependent مسارا ذات الصلة. هذا النظام الثقافة السمان EEC الياباني الأساسي هو أداة مفيدة لدراسة نقل الدهون الجنينية وتوضيح دور الجينات المسؤولة في التوسط في استخدام المواد الغذائية في YSM أثناء التطور الجنيني الطيور.

المقدمة

المورد الغذائي الرئيسي للجنين الطيور هو صفار البيض، ويتألف من 33٪ والدهون، والبروتين 17٪، و 1٪ رماد. 1 أثناء التطور الجنيني، غشاء الكيس المحي (YSM) ينمو من داخل تجويف البطن الجنينية ويغطي تدريجيا صفار البيض سطح. ابتداء من اليوم الجنينية 2، يتم زيادة التعبير الجيني المرتبط التمثيل الغذائي للدهون والأوعية الدموية تدريجيا في YSM، وYSM يتطور ببطء التوقعات مثل الزغب. 8،9 هذه التوقعات زيادة امتصاص المواد الغذائية صفار البيض لدعم التطور الجنيني. وYSM هو الأنسجة خارج الجنين الذي يحتوي على ثلاث طبقات جرثومية، الأديم، الأديم المتوسط ​​والأديم الظاهر 14 في الأديم الظاهر الكيس المحي يواجه زلال والروابط مع الغشاء المحي لتغطية بلطف الكيس المحي. وتواجه الخلايا الظهارية الأديم الباطن مباشرة نحو صفار البيض وتكون بمثابة بوابات استخدام المغذيات. 6 ويوسع YSM، الخلايا الظهارية الأديم الباطن (EECS) يمكن تقسيمها من حالات العسر الشديده وظيفة إلى مجموعتين، منطقة المحي والوعائية للمنطقة. 7

وتتكون منطقة المحي من خلايا الأديم الباطن وغير بعيد من الجنين. وتتكون منطقة وعائية من خلايا أرومية متوسطة ويغطي EECS متباينة مع الأوعية الدموية والأنسجة الضامة. بعد يوم الجنينية 5، وتغطي صفار البيض تماما من الأديم الظاهر والأديم الباطن من YSM ومنطقة الأوعية الدموية قد نمت بسرعة. وYSM تمتص، recomposes والنشرات الدهون (كما الصفار المستمدة منخفضة جدا كثافة البروتين الدهني) والبروتينات في نظام الدورة الدموية الجنينية. 9، 2 لذلك، أنشأنا السمان الجنينية النظام الياباني الأساسي الأديم الباطن الظهارية زراعة الخلايا، لدراسة آليات الدهون استخدام في YSM أثناء التطور الجنيني الطيور.

الدهون مثل الدهون الثلاثية، ليستين، فوسفورية واستر الكولسترول (CE) هي مصادر الطاقة الأولية للأجنة الطيور. في المراحل المبكرة من التطور، والدهون صفار هي جomposed من 1.3٪ فقط م، وترتفع إلى 10-15٪ في منتصف المدة من التطور الجنيني الطيور 3، ويتم تصنيع 11. استر الكولسترول من الكولسترول بنسبة ستيرول O-ناقلة الأسيل 1 (SOAT1) في YSM جنين الطيور. 4

شكل تخزين الكوليسترول هو CE، ويتم CE في البروتينات الدهنية، ويتم نقل البروتينات الدهنية بواسطة الدورة الدموية إلى الأنسجة. 13 وقبل أسبوع يفقس هناك نمو السريع للأجنة الطيور. تقريبا يتم امتصاص 68٪ من محتويات الدهون المتبقية في صفار خلال هذه المرحلة. 10 الآلية التي صفار وتستخدم الدهون يمكن توضيحها من خلال نموذج البحث EEC. وتم إنشاء بروتوكول ثقافة EEC الدجاج لتحقيق هذا الهدف البحوث. 2، 9 ومع ذلك، ويرجع ذلك إلى انخفاض معدل النجاح من إإكسبلنتس الأنسجة، هناك حاجة إلى تحسين إجراءات زراعة الخلايا الجماعة الاقتصادية الأوروبية لدراسة وظيفة بعض الأنزيمات والبروتينات في التوسط في استخدام المواد الغذائية من قبل أجنة الطيور خلال التنمية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

ملاحظة: هذا الإجراء هو تعديل لبروتوكول ثقافة نموذج الدجاج التي وضعتها باور وآخرون عام 2013 وناكازاوا وآخرون، 2011. 2،9.

1. إعداد صحي الجنينية يوم 5 أجنة من السمان الياباني

  1. ضع 1 ذكر و 3 إناث ناضجة جنسيا السمان الياباني معا في نفس القفص. تغذية العرض والمياه libitum الإعلانية. ضبط الضوء في الغرفة الحيوان إلى 14 ساعة من الضوء و 10 ساعة من الظلام.
  2. جمع البويضات المخصبة في أكياس بلاستيكية كل يوم في فترة ما بعد الظهر والاحتفاظ بها في 16 درجة مئوية الثلاجة على تأخير معدل نمو الأجنة.
  3. بعد جمع عدد كاف من البيض خلال فترة أسبوعين، واحتضان البويضة الملقحة في الحاضنة 37 درجة مئوية مع التهوية الجيدة لمدة خمسة أيام.

2. إعداد متوسطة بصل وغسل حلول

  1. استخدام DMEM / F-12 متوسطة (معدلة لدرجة الحموضة 7.2) باعتبارها وسيلة النمو، ومكملا لهمع 10٪ جديد مصل العجل المولود ([نبكس])، و 1٪ القلم بكتيريا Ampho. الحل (PSA، البنسلين، 10 5 وحدات / L، ستربتومايسين، و 100 ملغم / لتر، الامفوتريسين، 0.25 ملغ / لتر).
  2. إعداد الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) حل في تركيز 10X لأغراض التخزين؛ استخدام الحل برنامج تلفزيوني 1X (التي تحتوي على كلوريد الصوديوم، 137.93 ملي، بوكل، 2.667 مم، KH 2 PO 4، 1،471 ملم، نا 2 هبو 4 -7H 2 O، 8.06 مم، ضبط لدرجة الحموضة 7.2) لغسل وترطيب غشاء الكيس المحي في حين فصل الأديم من صفار البيض والزلال.
  3. استخدام DMEM المتوسطة (معدلة لدرجة الحموضة 7.2) لاعادة تعليق الكريات الأديم.

3. جمع من EECS الابتدائية من YSMs السمان اليابانية

  1. احتضان البيض التي تم جمعها لمدة 5 أيام (الخطوة 1.3). فحص البيض من قبل كاندلر البيض لتأكيد التطور الجنيني الطبيعي.
    ملاحظة: في يوم الجنينية 5، حدود YSM الأديم المتوسط ​​واضح جدا و3 طبقات الجنينية هي أقل مرتبطة بإحكام معا، لذلك فمن السهل أن أوبتين الأديم. فقط استخدام البيض تظهر تطوير الدورة الدموية الشعرية العادية للمجموعات YSM.
  2. تنظيف قشر البيض بعناية باستخدام المياه العذبة و 75٪ من الإيثانول. فتح قشر البيض من موقع خلية الهواء عن طريق زوج من مقص، بلطف قشر خارج وجمع YSM كله بواسطة ملقط ومكان في صحن الثقافة 10 سم مملوءة 37 ° C برنامج تلفزيوني 1X.
  3. باستخدام زوج من مقص إزالة الجنين، صفار وبياض البيض، وبلطف غسل YSM مع برنامج تلفزيوني 1X ثلاث مرات ووضع YSM في حل برنامج تلفزيوني في طبق ثقافة 10 سم.
  4. استخدام ملقط ومقص لإزالة الأديم الظاهر من YSM. 2 استخدام ملقط، واحدة لاعتقادا راسخا طبقة الخلايا الأديم الباطن، والآخر لعقد الأديم المتوسط ​​الشعرية.
  5. تحت المجهر تشريح، مزق وفصل الأديم من حافة الأديم المتوسط ​​في الاتجاه نحو الجنين. جمع الأديم ضوء أصفر في 50 مل أنابيب الطرد المركزي باستخدام قطارة والمكان في 15 مل من متوسط ​​النمو في 37 درجة مئوية واتحمام إيه حتى يتم الانتهاء من جميع المجموعات الأنسجة.

4. الهضم من الأديم شرائح من كولاجيناز الهضم

  1. الطازج حل 6.5 وحدة من النوع الرابع كولاجيناز في 10 مل من DMEM.
  2. أجهزة الطرد المركزي ال 50 مل أنابيب (3.4) في 130 x ج لمدة 3 دقائق على RT. نضح المتوسطة ووضع كل الأديم في طبق ثقافة 6 سم باستخدام ماصة. إضافة 1 مل من محلول كولاجيناز إلى هذا الطبق الثقافة.
  3. شريحة الأديم تم جمعها من 2 الأجنة السمان مع زوج من مقص منحني حتى حجم كل شريحة حوالي 2-3 ملم. استخدام قطارة، وجمع كل شرائح في أنبوب 50 مل الطرد المركزي جنبا إلى جنب مع 9 مل من محلول كولاجيناز جديدة.
  4. هضم الأنسجة مع كولاجيناز لمدة 30 دقيقة في 37 ° C حمام الماء تهتز في 175 دورة في الدقيقة. وتستخدم هذه الهضم الجزئي مع كولاجيناز لتحسين تكاثر الخلايا يزدرع.
  5. أجهزة الطرد المركزي في 130 x ج لمدة 3 دقائق على RT وإزالة بلطف الكسر طاف باستخدام ماصة. غسل بيليه معلق في 20 مل DMEM وإزالة جزء طاف بعد الطرد المركزي 130 x ج لمدة 3 دقائق.
  6. إعادة تعليق بيليه مع 12 مل من متوسط ​​النمو (DMEM / F12 مع 10٪ [نبكس] و 1٪ PSA) والبذور بلطف وعلى قدم المساواة في لوحة 24-جيدا (كل حل الخلية جيدا مع 500 ميكرولتر).
  7. احتضان إإكسبلنتس الأنسجة عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2 في الهواء لمدة 2 أيام للسماح للخلايا لتتكاثر من الأنسجة.
  8. احتضان الخلايا لمدة 2 أيام أخرى وتميز لبقاء الخلية عن طريق بروتوكول الفحص بقاء الخلية 15
    ملاحظة: الخلايا الحية الحفاظ على البيئة والحد داخل العصارة الخلوية. ريسازورين، العنصر النشط، هو غير سامة، وخلية مجمع نفاذية هذا هو الازرق في اللون وتقريبا غير الفلورسنت. عندما تضاف إلى مزارع الخلايا، ريسازورين هو انخفاض لresorufin في العصارة الخلوية بواسطة الإنزيمات الميتوكوندريا. Resorufin هو أحمر اللون والفلورية للغاية. تحويل خلايا قابلة للحياة باستمرار ريسازورين إلى resorufin، increasing مضان العام واللون من مستنبت الخلايا المحيطة.
  9. أداء الأديم الباطن الخلايا الظهارية الحمض النووي الريبي مجموع العزلة، عكس النسخ والكمي في الوقت الحقيقي PCR التعبير مرنا علامة الجين كما هو موضح. 16،17
    1. استخدام عكس PCR الناسخ للكشف عن SOAT1 مرنا (بمعنى: 5'-GAAGGGGCCTATCTGGAACG-3 '؛ العقاقير: 5'-ATCTGCACGTGACATGACCA-3'؛ PCR المنتج = 168 سنة مضت) كعلامة محددة لخلايا الجماعة الاقتصادية الأوروبية. استخدام بيتا أكتين مرنا (بمعنى: 5'- TGGTGAAGCTGTAGCCTCTC-3 '؛ العقاقير: 5'- GTGATGGACTCTGGTGATGG-3'؛ المنتج PCR = 151 سنة مضت) باسم الجينات التدبير المنزلي والرقابة الداخلية.
    2. استخدام هلام الكهربائي للكشف عن حجم المنتج من RT-QPCR. إعداد 1٪ agarose هلام، ومزيج 10 ميكرولتر QPCR المنتج مع 2 ميكرولتر صبغة تحميل. تحميل 10 ميكرولتر الخليط في كل بئر في هلام الاغاروز 1٪، وتشغيل الجل وذلك 100V لمدة 30 دقيقة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

من أجل تحقيق هدف إقامة نموذج خلية متسقة ومفيدة، ونحن بحاجة إلى توسيع واستقرار معدل انتشار وأداء EECS الطيور. قارنا حضانة مباشرة من الأديم الباطن مع عدم وجود انزيم الهضم مع الأديم هضمها جزئيا مع الإنزيمات المحللة للبروتين، مثل كولاجيناز أو كولاجيناز زائد 0.6 U من dispase. Dispase هو وسيلة ببتيداز داخلية الأمينية التي hydrolyzes السندات الببتيد N- محطة من بقايا الأحماض الأمينية غير القطبية. في حين أن العلاجات الهضم البروتيني زيادة تكاثر الخلايا مقارن...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

لأن النظام الثقافة السابق سوى نجاح محدود، هناك حاجة إلى نظام ثقافة أفضل. اليابانية الأديم السمان YSM يتطلب العلاج مع الإنزيمات المحللة للبروتين مثل كولاجيناز لتخفيف تقاطعات خلية خلية لتحقيق أداء أفضل نمو في إإكسبلنتس فيفو السابقين. وتشير البيانات المتوفرة لدينا أن أعداد الخلايا من العلاج الهضم جزئية كانت أكبر من من زراعة الأنسجة عسر الهضم بعد البذر لمدة 2 أيام (الشكل 1). ولذلك، فإن عملية الهضم بروتين الجزئي هو خطوة حاسمة لتحسين العائد خلية من YSM.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

لا توجد مصالح مالية متنافسة أو تضارب مصالح أخرى. لم نحصل على أي تمويل من أي شركة خاصة.

شكر وتقدير

ويدعم التمويل لتطوير البروتوكول الحالي بشكل خاص "الهدف لخطة جامعة أعلى" من جامعة تايوان الوطنية، تايوان (منحة ID-104R350144)، وكذلك وزارة العلوم والتكنولوجيا في تايوان (ID المنحة: MOST 104 -2313-B-002-039-MY3). نخص بالشكر مركز للتكنولوجيا الحيوية من جامعة تايوان الوطنية لتوفير غرفة الحيوان والفضاء مختبر لدراسة الحالية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
Dulbecco's Modified Eagle MediumGibco by Life technologies12800-017 10 X 1 Lلغسل كريات EECs
D-MEM / F-12Gibco by Life technologies12400-024 10 X 1 Lكوسيط قاعدي في زراعة EECs
NBCSGibco بواسطة Life technologies16010-159كمصل الإمداد في زراعة EECs
Pen-Strep Ampho. محلولBI (الصناعات البيولوجية)03-033-1B 100 مللتخفيف العدوى المحتملة   ؛
كولاجيناز النوع الرابعجيبكو من لايف تكنولوجيز17104-019 1 g  الكولاجيناز هو بروتياز ذو خصوصية للرابطة بين حمض أميني محايد (X) والجلايسين في التسلسل Pro-XGly-Pro. كبروتياز لتفكك الخلايا من الأنسجة الأولية.
24 بئر لوحةFALCON® < / sup>REF-353047بالنسبة ل EECs لتوصيل وتمديد
50 مل أنابيب الطرد المركزي PPCorning < sup> & reg ؛ < / sup> CentriStarTM< / sup>430829لنقل الأغشية وهضم الإنزيم
50 مل أنبوب مخروطي القاع مع غطاءPRO TECHCT-50-PL-TWلنقل الأغشية وهضم الإنزيم
حمام الاهتزاز المتبادلDEAGLESB302لتحسين الهضم الأنزيمي على الأغشية

المراجع

  1. Abeyrathne, E. D., Lee, H. Y., Ahn, D. U. Egg white proteins and their potential use in food processing or as nutraceutical and pharmaceutical agents--a review. Poult Sci. 92 (12), 3292-3299 (2013).
  2. Bauer, R., Plieschnig, J. A., Finkes, T., Riegler, B., Hermann, M., Schneider, W. J. The developing chicken yolk sac acquires nutrient transport competence by an orchestrated differentiation process of its endodermal epithelial cells. J Biol Chem. 288 (2), 1088-1098 (2013).
  3. Ding, S. T., Nestor, K. E., Lilburn, M. S. The concentration of different lipid classes during late embryonic development in a randombred turkey population and a subline selected for increased body weight at sixteen weeks of age. Poult Sci. 74 (2), 374-382 (1995).
  4. Ding, S. T., Lilburn, M. S. The developmental expression of acyl-coenzyme A: cholesterol acyltransferase in the yolk sac membrane, liver, and intestine of developing embryos and posthatch turkeys. Poult Sci. 79 (10), 1460-1464 (2000).
  5. Ding, S. T., Lilburn, M. S. The ontogeny of fatty acid-binding protein in turkey (Meleagridis gallopavo) intestine and yolk sac membrane during embryonic and early posthatch development. Poult Sci. 81 (7), 1065-1070 (2002).
  6. Kanai, M., Soji, T., Sugawara, E., Watari, N., Oguchi, H., Matsubara, M., Herbert, D. C. Participation of endodermal epithelial cells on the synthesis of plasma LDL and HDL in the chick yolk sac. Microsc Res Tech. 35 (4), 340-348 (1996).
  7. Mobbs, I. G., McMillan, D. B. Structure of the endodermal epithelium of the chick yolk sac during early stages of development. Am J Anat. 155 (3), 287-309 (1979).
  8. Mobbs, I. G., McMillan, D. B. Transport across endodermal cells of the chick yolk sac during early stages of development. Am J Anat. 160 (3), 285-308 (1981).
  9. Nakazawa, F., Alev, C., Jakt, L. M., Sheng, G. Yolk sac endoderm is the major source of serum proteins and lipids and is involved in the regulation of vascular integrity in early chick development. Dev Dyn. 240 (8), 2002-2010 (2011).
  10. Noble, R. C., Cocchi, M. Lipid metabolism and the neonatal chicken. Prog Lipid Res. 29 (2), 107-140 (1990).
  11. Shand, J. H., West, D. W., McCartney, R. J., Noble, R. C., Speake, B. K. The esterification of cholesterol in the yolk sac membrane of the chick embryo. Lipids. 28 (7), 621-625 (1993).
  12. Speier, J. S., Yadgary, L., Uni, Z., Wong, E. A. Gene expression of nutrient transporters and digestive enzymes in the yolk sac membrane and small intestine of the developing embryonic chick. Poult Sci. 91 (8), 1941-1949 (2012).
  13. Walzem, R. L., Hansen, R. J., Williams, D. L., Hamilton, R. L. Estrogen Induction of VLDLy Assembly in Egg-Laying Hens. J Nutr. 129 (2), 467S-472S (1999).
  14. Yoshizaki, N., Soga, M., Ito, Y., Mao, K. M., Sultana, F., Yonezawa, S. Two-step consumption of yolk granules during the development of quail embryos. Dev Growth Differ. 46 (3), 229-238 (2004).
  15. alamarBlue Cell Viability Assay Protocol. , Source: https://www.lifetechnologies.com/us/en/home/references/protocols/cell-and-tissue-analysis/cell-profilteration-assay-protocols/cell-viability-with-alamarblue.html#4 (2008).
  16. Lin, H. Y., Chen, C. C., Chen, Y. J., Lin, Y. Y., Mersmann, H. J., Ding, S. T. Enhanced Amelioration of High-Fat Diet-Induced Fatty Liver by Docosahexaenoic Acid and Lysine Supplementations. Biomed Res Int. 2014 (1), 310981(2014).
  17. Lin, Y. Y., et al. Adiponectin receptor 1 regulates bone formation and osteoblast differentiation by GSK-3β/β-Catenin signaling in mice. Bone. 64, 147-154 (2014).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

RT qPCR SOAT1 cAMP

مقالات ذات صلة