يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

تحريض الأم المناعي التنشيط في الفئران في مرحلة منتصف الحمل مع الفيروسية تقليد بولي (I: C)

19.2K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/53643

⸱

مارس 25, 2016

 ,  , 
1Division of Biology and Biological Engineering, California Institute of Technology, 2Harvard Medical School

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

التنشيط المناعي للأم (MIA) هو نموذج لعامل الخطر البيئي للتوحد والفصام. الهدف من هذه المقالة هو توفير إجراء خطوة بخطوة لكيفية تحفيز MIA في الفئران الحامل من أجل تعزيز قابلية استنساخ هذا النموذج.

الملخص

يحظى نموذج التنشيط المناعي للأمهات (MIA) بتقدير متزايد كنموذج للقوارض لعامل الخطر البيئي للاضطرابات النفسية المختلفة. أظهرت العديد من الدراسات أن نموذج MIA قادر على إظهار الوجه والبناء والصلاحية التنبؤية ذات الصلة بالتوحد والفصام. لنمذجة MIA ، غالبا ما يستخدم الباحثون البوليينوسينيك الفيروسي: حمض البولي سيتيديليك (بولي (I: C)) لتنشيط جهاز المناعة في القوارض الحامل. بشكل عام ، يظهر النسل من السد المنشط المناعي تشوهات سلوكية وتغيرات فسيولوجية مرتبطة بالتوحد والفصام. ومع ذلك ، فإن حقن بولي (I: C) بجرعات مختلفة وفي نقاط زمنية مختلفة يمكن أن يؤدي إلى نتائج مختلفة من خلال اضطراب نمو الدماغ في مراحل مختلفة. نقدم هنا طريقة مفصلة لتحفيز MIA عن طريق الحقن داخل الصفاق (IP) بمقدار 20 مجم / كجم بولي (I: C) في منتصف الحمل الجنيني 12.5 يوما (E12.5). لقد ثبت أن هذه الطريقة تحفز استجابة التهابية حادة في محور الأم والمشيمة والجنين ، مما يؤدي في النهاية إلى اضطرابات في الدماغ والأنماط الظاهرية السلوكية المرتبطة بالتوحد والفصام.

المقدمة

مفهوم التنشيط المناعي للأم (MIA) تنبع من الدراسات الوبائية على جمعية إصابة الأم بمرض التوحد وانفصام الشخصية 1. نظرا لعدم وجود مسببات الأمراض الفيروسية تكرار اكتشافها في المشيمة أو دماغ الجنين بعد عدوى فيروسية الأمهات 2،3، على فرضية تأثير الإصابة على ذرية أن يكون سبب تنشيط الجهاز المناعي للأم بدلا من مسببات الأمراض أنفسهم .

لإلقاء الضوء على العلاقة بين السبب والنتيجة بين وزارة الداخلية والاضطرابات النفسية، حقن تصنيعه كيميائيا، الفيروسية تقليد ضعف polyinosinic الحمض النووي الريبي RNA: حمض polycytidylic (بولي (I: C)) في القوارض الحوامل قد استخدمت على نطاق واسع في نموذج حيواني لMIA 4،5. ومن المسلم: (C I) التي تشبه عدد مستقبلات 3 (TLR3)، والإدارة الشاملة للبولي (I: C) بولي يدفع الفيروسية مثل الاستجابة الالتهابية الحادة. واحدة من الآليات التي بولي (I: C) العلاقات العامةالعامة oduces تشوهات وneuropathologies السلوكية في النسل هي التي تسبب اختلالا السيتوكينات الالتهابية المؤيدة والمناهضة في محور الأم والمشيمة، الجنين 6. وقد تبنت عدة مجموعات نموذج MIA لفهم مسببات الاضطرابات النفسية 7، ويرجع ذلك إلى المصالح المتنوعة بين المجموعات البحثية، وقد استخدمت نقاط زمنية مختلفة من تنشيط جهاز المناعة لتحقيق اضطرابات مختلفة على نمو الدماغ والسلوكيات 7.

المختبر بول ه باترسون في معهد كاليفورنيا للتكنولوجيا يتبنى استراتيجية حقن بولي (I: C) في الفئران الحوامل في الجنينية 12.5 يوما (E12.5)، الذي أثبت بنجاح أن وزارة الداخلية غير قادرة على إحداث السلوكية والعصبية، والتغيرات المناعية في النسل التي ترتبط مع مرض التوحد والفصام 8-11. تظهر أعمالنا السابقة التي MIA ذرية عرض الانحرافات السلوكية (على سبيل المثال، impairmen الاجتماعيةر، العجز الاتصالات، وتكرار السلوك، والسلوك للقلق مثل، والكامنة العجز تثبيط 8،10،12)، المناعي التقلبات والسيتوكينات الخلل 8،13،14، تغيير الجنين التعبير الجيني الدماغ 15، وفقدان الخلايا العصبية في فصيص السابع المخيخ 11، تغيير خصائص متشابك في قرن آمون 9، جين العاشر بيئة التفاعل 13، تغيير نفاذية الأمعاء، والقناة الهضمية تكوين الجراثيم 16. وعلاوة على ذلك، يتم تطوير استراتيجيات علاجية وقائية أيضا من هذا 13،16،17 نظام نموذجي. عن طريق حفز MIA في E12.5، وقد أظهرت آخرون أن MIA تنتج تنشيط الجنين دبقية والتغيير التنموي الكوليني في الدماغ الأمامي القاعدية 18، سلالة معينة التفاعل 19، الدماغ الشلل synaptosomal تشوهات التركيبية، والشلل الميتوكوندريا التنفسي abnormalties سلسلة فرط الوظيفة، downregulation من جزيئات synaptosomal الدماغية 17 ،السلوكيات الاكتئاب مثل، وضعف في الإدراك وقرن آمون التقوية على المدى الطويل (الكمونية)، والعجز من البالغين الخلايا العصبية الحصين 20.

هنا، ونحن نقدم طريقة مفصلة لكيفية إحداث MIA في E12.5 التي كتبها بولي (I: C)، وكذلك نماذج لكيفية تطبيق هذا النموذج لدراسة مسببات مرض التوحد وانفصام الشخصية. ومن المهم الإشارة إلى أن وزارة الداخلية هو أحد عوامل الخطر لمجموعة متنوعة من الاضطرابات 4، ونتائجها حساسة للغاية للوقت وطريقة الاستقراء وكذلك تربية السدود الحوامل. على هذا النحو، حتى التناقضات الثانوية بين المختبرات في كثير من الأحيان يؤدي إلى استنساخ منخفض و / أو الظواهر المختلفة في النسل. تم تصميم طريقة لدينا خصيصا للراغبين في دراسة MIA كعامل خطورة البيئي لمرض التوحد وانفصام الشخصية، وصفا مفصلا تقديمها سوف يساعد الباحثين على تحسين استنساخ البيانات الخاصة بهم.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

وأجريت جميع البروتوكولات بموجب موافقة من معهد كاليفورنيا للجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسي التكنولوجيا (IACUC).

1. التحضير للأزواج موقوت التزاوج

  1. استخدام لا يقل عن 6 سدود للتجارب السلوكية و 3 لتحليل التعبير الجيني.
    ملاحظة: استخدام ضعف عدد إناث الفئران المقدرة، كما سيتم توصيله فقط حوالي 50٪ من الفئران من توقيت التزاوج.
  2. استخدام إناث الفئران مع عدم وجود الحمل السابقة وفي 8-16 أسابيع من العمر.
    ملاحظة: أنثى الفئران التي لديها التعرض الجنسي قبل ذكور الفئران لكن لم تكن حاملا مقبولة.
  3. بيت الفئران الإناث معا ووضع أقفاص بجانب بعضها البعض من أجل مزامنة دورتهم داقية. استخدام قفص الفئران القياسية مع ارتفاع أكثر من 5.5 بوصة والطابق الداخلية 75 بوصة مربعة للسماح الإسكان من 5 فئران بالغة. تسمية كل فئران باستخدام لكمة الأذن.

2. إعداد موقوت حصيرةجي زوج

  1. إعداد توقيت التزاوج 0-2 ساعة قبل أن تبدأ دورة الظلام. وضع اثنين من الفئران الإناث في كل قفص. إخراج الفئران ووزن لهم بشكل فردي. تسجيل وزن الجسم كل الماوس الإناث.
  2. ضع الماوس واحد من الذكور في كل قفص مع اثنين من الفئران الإناث. استخدام الثلاثي التزاوج للحد من تأثير الأب يتيه.

3. المهبل التوصيل تحقق (E0.5)

  1. تحقق من الإناث الفئران 0-4 ساعة بعد انتهاء دورة الظلام. رفع بلطف الماوس الإناث من قاعدة الذيل والسماح الماوس للاستيلاء على شبكة الأسلاك، وقفص أعلى، أو حافة القفص.
  2. البحث عن علامات المكونات المهبلية: المكونات المهبل هو كتلة بيضاء واضحة في فتحة المهبل. إذا المكونات ليست واضحة، إدراج بلطف ماصة 200 ميكرولتر في فتحة المهبل. المقاومة من التخثر تؤكد تشكيل المكونات المهبلية. تحقق من المكونات المهبلية مرة واحدة يوميا.
    ملاحظة: المكونات المهبلي فقط مؤشرا على أن الجماع قد حدث، وبالتالي لا زحمل ذلك uarantee. قد تكون المكونات المهبل من الصعب تحديد في سلالات معينة من الفئران. طلب المساعدة من الرعاية الفئران من ذوي الخبرة لزيادة دقة تحديد المكونات.
  3. نقل الفئران توصيله إلى قفص جديد ومجموعة إيوائهم. تحديد يوم من ظهور المكونات المهبلية كما الجنينية 0.5 يوم (E0.5).

4. في E10.5-11.5، التحقق من وجود الحمل

  1. رفع بلطف قاعدة الذيل والسماح الماوس للاستيلاء على شبكة الأسلاك، وقفص أعلى، أو حافة القفص. مراقبة منطقة البطن للتحقق من علامات الحمل، على سبيل المثال، انتفاخ في البطن (الشكل 1).
    ملاحظة: علامة الحمل هو دائما أكثر وضوحا في E11.5 من في E10.5.
  2. وزن الفئران للتحقق من الحمل. يزن الماوس حامل عموما أثقل حوالي 20٪ في E10.5 و 30٪ أثقل في E12.5 مقارنة مع الماوس غير الحوامل (الشكل 2). بيت واحد الفئران الحوامل في أقفاص نظيفة.

5. 20 ملغ /كغ بولي (I: C) إعداد

  1. استخدام لا يقل عن 6 سدود في كل مجموعة للتجارب السلوكية و 3 لكل مجموعة لتحليل التعبير الجيني. إعداد المبلغ المقابل من بولي (I: C) حل.
  2. تزن بولي (I: C) مسحوق في 50 مل أنبوب مخروطي الشكل لجعل تركيز النهائي من 40 ملغ / مل. من أجل تقليل وتوحيد التوتر الناجم عن حجم الحقن، حقن 5 ميكرولتر من بولي (I: C) حل لكل غرام من وزن جسم الفأر (5 ميكرولتر / ز، أو 5 مل / كغ). للحث وزارة الداخلية، ونحن حقن 20 ملغ من بولي (I: C) للكيلوغرام الواحد.
    ملاحظة: إن تركيز بولي (I: C) الحل المطلوب هو (20 ملغ / كلغ) / (5 مل / كغ) = 4 ملغ / مل. منذ بولي (I: C) مسحوق يحتوي على 10٪ بولي (I: C)، ونحن بحاجة لجعل تركيز النهائي من / مل من بولي (4 ملغ / مل) /0.1= 40 ملغ (الأول: C) حل.
    تنبيه: إن بولي (I: C) مسحوق خفيف جدا. يجب الحرص على عدم فقدان أي مسحوق في حين نقل من ملعقة إلى أنبوب مخروطي الشكل.
  3. إضافة حجم المقابلة من 0.9٪ كلوريد الصوديوم (المالحة) في حوض مخروطيالبريد وأغلق الغطاء. حل المسحوق بلطف المتداول الحبرية المالحة على بولي (I: C) مسحوق حتى حل واضح. أجهزة الطرد المركزي أنبوب مخروطي الشكل في 800 x ج لمدة 1 دقيقة (الشكل 3C). تصفية بولي (I: C) حل بنسبة 0.22 ميكرون فلتر. نقل بولي (I: C) حل لأنبوب 1.5 أو 2 مل microcentrifuge ل. اختياري: استخدام معمل لقياس نسبة 260/280 من بولي (I: C) حل. ضمان النسبة بين 1،54-1،82 (الشكل 3) كما هو موضح من قبل الشركة المصنعة. ملاحظة: المالحة استخدامه لإذابة بولي (I: C) مسحوق وتكون بمثابة حقن السيطرة يجب أن تكون درجة معقمة والصيدلانية.

6. المالحة أو بولي (I: C) حقن في E12.5

  1. وزن الماوس على نطاق ووضعها مرة أخرى في قفص. استخدام الصيغة التالية لحساب حجم حقن لكلا المالحة وبولي (I: C) الفئران: وزن الجسم (ز) مضروبا في 5 = المرجوة حجم الحقن (ميكرولتر). استخدام insul 0.3 ملفي حقنة لوضع حجم تحسب من المياه المالحة أو 20 ملغ / كغ بولي (I: C) حل، على سبيل المثال، 150 ميكرولتر لمدة 30 ز الماوس.
  2. اختيار برفق الماوس عن طريق قاعدة الذيل ووضعه على رأس من القفص. التعامل مع الماوس بلطف لتجنب آثار الخلط الناجم عن التوتر. ادخال الإبرة، شطبة تصل، في حوالي 20 درجة بالنسبة إلى الماوس في وسط اثنين من الحلمات العليا في (الشكل 4)، وحقن (الأول: C) المالحة أو بولي حل. ملاحظة: يجب أن يتم استبدال إبرة لكل الماوس بعد الحقن.
  3. ضع الماوس مرة أخرى إلى قفص وطنه. وضع الأقفاص في غرفة حركة هادئة، منخفضة لتجنب الآثار التباس أخرى.

7. يوم بعد بولي (I: C) حقن (E13.5)

  1. تحقق من حقن الفئران في صباح اليوم التالي. استخدام مقياس لقياس وزن الجسم.
    ملاحظة: بولي (I: C) حقن الفئران الحوامل عادة تكتسب وزنا أقل من المياه المالحة حقن الفئران في اليوم التالي ينجection.
  2. لا تخل الفئران حتى ولدت ابنا.

8. مقياس من MIA النسل

  1. من أجل تقليل آثار الخلط من MIA التعريفي، واتباع المبادئ التوجيهية الواردة أدناه لقياس استخدام MIA ذرية.
    1. استبعاد الفضلات من الخدج أو تأخر الولادة، أو إذا كان حجم القمامة هو أصغر من 5.
    2. الموت ببطء الجراء المفرطة من قبل CO 2 إذا كان حجم القمامة أكبر من 10.

9. اختياري: دراسة الاستجابة الالتهابية الحادة بعد MIA

  1. التضحية الحوامل الفئران 3 ساعة بعد المالحة أو بولي (I: C) الحقن باستخدام الطريقة الموصوفة في رعاية الحيوان بروتوكول وافقت عليها لجنة المؤسسة.
    ملاحظة: غالبا ما يفضل خلع عنق الرحم كما أنها تقلل من تأثير ثاني أكسيد الكربون المخدرات 2 / القتل الرحيم على السد والجنين.
  2. جمع الطحال من الفئران الحوامل الكبار وعزل المشيمة والجنين الصدريةفي ظل مجهر تشريحي.
    1. لجمع الطحال، وضع الماوس على لوحة التشريح ورذاذ الايثانول 70٪ في منطقة البطن من الفئران الحوامل. استخدام زوج من مقص العقيمة لاجراء خفض الرأسي في وسط منطقة البطن تحت القفص الصدري من خلال الجلد.
    2. يجلس الطحال في اليسرى رباعي البطن متفوقة. استخدام ملقط لعزل الطحال. لفة الطحال على مساحات مهمة حساسة لإزالة الأنسجة الدهنية حول الجهاز. جمع ما يقرب من 50 ملغ من أنسجة الطحال ووضعها بشكل فردي في أنابيب إيبندورف مع 500 ميكرولتر الحمض النووي الريبي استقرار عازلة أو TRIzol لمنع تدهور الحمض النووي. تخزين العينات في الفريزر -80 درجة مئوية حتى الاستخدام.
    3. لجمع المشيمة، وسحب بلطف خارج قرون الرحم من الجسم. وضع قرون الرحم في طبق بتري مليئة المالحة الفوسفات تعقيمها مخزنة (PBS) وترك الطبق على الجليد. استخدام اثنين ملقط المسيل للدموع مفتوحة في جدار الرحم وفضح الكيس الأمنيوسي.
      1. بعناية استخدام ملقط لفتح الكيس الذي يحيط بالجنين دون الإضرار المشيمة والجنين. فصل المشيمة عن الجنين وقطع الحبل السري وعلى مقربة من المشيمة ممكن. ازالة الانقاض الكيس السلوي من المشيمة. وضع المشيمة بشكل فردي في أنابيب إيبندورف مع 500 RNA ميكرولتر استقرار عازلة أو TRIzol. تخزين العينة في الثلاجة -80 درجة مئوية حتى الاستخدام.
    4. لجمع دماغ الجنين، وتخزين الجنين في الحمض النووي الريبي استقرار عازلة من الخطوة 9.2.2 حتى تشريح. ندف خارج الغشاء حنوني من البطين من الدماغ باستخدام دقيقة # 5 ملقط تحت مجهر تشريحي. إزالة بعناية كل غشاء من دماغ الجنين. ضع مخ الجنين بشكل فردي في أنابيب إيبندورف مع 500 RNA ميكرولتر استقرار عازلة أو TRIzol. تخزين العينة في الثلاجة -80 درجة مئوية حتى الاستخدام.
  3. استخراج الحمض النووي الريبي من الأنسجة وتحويل الحمض النووي الريبي لكدنا]. تحليل التعبير الجيني Il6 في كدنا] بواسطة تي الحقيقيIME PCR.
  4. استخراج الحمض النووي الريبي من الأنسجة باتباع بروتوكول تصنيع TRIzol. إذا تم تخزين الأنسجة العازلة في استقرار الحمض النووي الريبي. ذوبان الجليد العينة وتدور باستمرار المخزن المؤقت. نقل الأنسجة من طرف إلى آخر إيبندورف مع 500 ميكرولتر TRIzol ومواصلة استخراج الحمض النووي الريبي.
  5. استخدام معمل لقياس تركيز، 260/280 و 260/230 نسبة من الحمض النووي الريبي. ضمان النسب فوق 2.0.
  6. القضاء على التلوث الحمض النووي عن طريق التعامل مع RNA مع الدناز أولا اخلطي 1 ميكروغرام RNA، 1 ميكرولتر 10X العازلة رد فعل، 1 ميكرولتر ريبونوكلياز مجانا الدناز، وnuclease خالية من المياه إلى الحجم النهائي من 10 ميكرولتر. احتضان مزيج الرئيسي عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. إضافة 1 ميكرولتر الحل محطة الدناز لإنهاء رد فعل. احتضان الخليط عند 65 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة.
  7. عكس نسخ الحمض النووي الريبي لكدنا]. استخدام 20 ميكرولتر ردود الفعل، وتصل إلى 1 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي مجموع في رد الفعل. خلط 4 ميكرولتر 5X عكس العازلة النسخ (RT) مزيج رد فعل، 1 ميكرولتر مراجعةERSE الناسخ، 11 ميكرولتر قالب RNA بعد العلاج مع الدناز أنا و 4 ميكرولتر nuclease خالية H 2 O لجعل الحل النهائي 20 ميكرولتر. برمجة شروط cycler الحرارية لRT. وهناك شرط العامة ما يلي: الخطوة 1: 25 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. خطوة 2: 42 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. خطوة 3: 85 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. الخطوة 4: عقد في 4 درجات مئوية. تمييع [كدنا 5 مرات. للتخزين على المدى القصير، وتخزين كدنا] في 4 درجات مئوية. للتخزين على المدى الطويل، وتجميد [كدنا] في -20 درجة مئوية.
  8. تحليل التعبير الجيني Il6 في كدنا] بواسطة PCR الوقت الحقيقي وتطبيع التعبير الجيني Il6 لبيتا الأكتين التعبير الجيني.
    1. جعل مزيج الرئيسي لIl6 وكشف-β الأكتين. استخدام 25 ميكرولتر رد فعل، مزيج الرئيسي لكل الجينات يشمل 12.5 ميكرولتر SYBR الأخضر ميكس، 0.5 ميكرولتر من 10 ميكرومتر التمهيدي إلى الأمام، 0.5 ميكرولتر من 10 ميكرومتر التمهيدي العكسي و 6.5 ميكرولتر nuclease خالية H 2 O.
    2. ضع 5 ميكرولتر 5X المخفف [كدنا لر الجزء السفلي من بئر البصرية لوحة رد فعل 96-جيدا. ماصة 20 ميكرولتر من مزيج الرئيسي إلى كل بئر لجعل 25 ميكرولتر مزيج PCR النهائي. ثلاث نسخ كل الجينات لكل عينة. ختم لوحة باستخدام لاصق فيلم البصرية. تدور باستمرار لوحة في 800 x ج لمدة 3 دقائق في 4 درجات مئوية استخدام البرنامج القياسية في الوقت الحقيقي PCR: الخطوة 1: 50 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة. خطوة 2: 95 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة. خطوة 3: 40 دورات من 95 درجة مئوية لمدة 15 ثانية ودرجة الحرارة 60 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة. إضافة خطوة إضافية لمنحنى تفارق.

10. دراسة الانحرافات السلوكية في النسل MIA الكبار (اختياري):

  1. إجراء اختبارات السلوك في سن 8-12 أسابيع. تغيير الفراش قفص قبل 3 أيام على الأقل الاختبار. تأقلم الفئران إلى غرفة الاختبار السلوكية لا يقل عن 30 دقيقة قبل الاختبار.
  2. لتثبيط prepulse (PPI)، وكبح جماح الفئران في اسطوانة شبكي مع جهاز استشعار بيزو كهربائي تحته. تأقلم الفئران لمؤشر أسعار المنتجينغرفة لمدة 5 دقائق. فضح الفئران مع 6 محاكمات 120 ديسيبل من الضوضاء البيضاء (جفل).
  3. ثم تعرض الفئران مع خليط عشوائي من 14 محاكمات الضوضاء الخلفية، 14 محاكمات باغت، 14 محاكمات prepulse 5 ديسيبل (5 ديسيبل أعلى من الضوضاء في الخلفية) + باغت (PPI5)، و 14 محاكمة prepulse 15 ديسيبل (15 ديسيبل أعلى من الضوضاء في الخلفية + باغت (PPI15).
  4. متوسط ​​الاستجابة جفل ل6 المحاكمات الأولى من 120 محاكمات ديسيبل. متوسط ​​الاستجابة جفل لالتحفيز الفردية الأخرى. سرية القيمة إلى تثبيط prepulse التي كتبها (باغت - PPI5 أو PPI15) / باغت.
  5. لاختبار حقل مفتوح، ضع الماوس في زاوية ساحة مربعة مفتوحة (50 × 50 × 50 سم 3). تسجيل مسار الماوس لمدة 10 دقيقة من خلال كاميرا مثبتة على السقف. تحديد وسط الساحة كما في منطقة المركز (17 × 17 سم 2). قياس المسافة المقطوعة، ومداخل منطقة الوسط، والوقت الذي يقضيه في منطقة مركزية يدويا أو بواسطة برنامج التحليل الآلي الصورة القائمة.
  6. للرخام اختبار دفن، تأقلم الماوس لقفص اختبار مع 5CM مضغوط عميق، نظيفة، أسبن الفراش الصنوبر لمدة 10 دقيقة. عودة الماوس إلى homecage لها. وضع بلطف 20 الأزرق الداكن 1.5 سم الرخام قطر الزجاج في الأزياء من 4 × 5 الترتيب. ضع الماوس إلى القفص اختبار مع الرخام لمدة 10 دقيقة. عدد الرخام التي تم دفنها في اختبار مدته 10 دقيقة.

11. دراسة أمراض الأعصاب مخيخي في النسل MIA الكبار (اختياري):

  1. الموت ببطء المالحة وMIA ذرية بالغة عن طريق التخدير. يروي الماوس مع 50 مل برنامج تلفزيوني وبعد ذلك 50 مل 4٪ امتصاص العرق من خلال نظام القلب والأوعية الدموية.
  2. إزالة الدماغ بعناية وبوستفيكس الدماغ في 4٪ بارافورمالدهيد بين عشية وضحاها في 4 ° C. شطف الدماغ مع برنامج تلفزيوني ثلاث مرات وتخزينها في الدماغ في برنامج تلفزيوني مع 0.02٪ أزيد الصوديوم في 4 درجات مئوية الثلاجة حتى الاستخدام.
    ملاحظة: يمكن تخزين الدماغ postfixed في برنامج تلفزيوني مع 0.02٪ الاحمقأزيد البوتاسيوم في الثلاجة لمدة تصل الى شهر واحد.
  3. قسم المخ إلى 50 ميكرون شرائح رقيقة sagittally باستخدام vibratome. جمع أقسام الدماغ باستخدام فرشاة لينة من ركلة جزاء. إنهاء النشاط البيروكسيداز الذاتية التي يحتضنها المقاطع في 0.6٪ بيروكسيد الهيدروجين لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  4. احتضان المقاطع في الأجسام المضادة لمكافحة calbindin المخفف في عازلة تمنع (10٪ مصل الماعز بنسبة 0.1٪ تريتون X-100 و 0.02٪ أزيد الصوديوم في برنامج تلفزيوني) بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة. ثم احتضان المقاطع في المقابلة الضد الثانوية المعقدة البيروكسيديز المخفف في عرقلة العازلة لمدة 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
  5. احتضان المقاطع في DH أفيدين - البيروكسيديز عازلة H مجمع البيروكسيديز للكشف عن البيوتين لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة. تطوير أقسام باستخدام البيروكسيديز الركيزة لتصور للمستضد. غسل المقاطع مع برنامج تلفزيوني ثلاث مرات في فترة ما بين الخطوات. جبل المقاطع على الشرائح المجهر. صورة الأقسام تحت المجهر.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

حقن 20 ملغ / كغ بولي (I: C) في E12.5 يمكن أن تثير استجابة التهابية حادة في محور الأم والمشيمة والجنين ويعجل له تأثير المزمن لنمو الدماغ والظواهر السلوكية 12،13. مستويات مرتفعة من proinflammatory سايتوكاين، انترلوكين (IL) -6، هو مؤشر موثوق من الاستجابة الالتهابية الحادة بعد MIA. وقت الذروة للتعبير الجين Il6 في المشيمة ودماغ الجنين هو في 3 ساعات بعد بولي (I: C) حقن 12،13. لقد أثبتنا أن بولي (I: C) يدفع أعلى التعبي...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

MIA الحث على نوافذ زمنية مختلفة، يشوش الأحداث نمو المخ المختلفة في القوارض، وبالتالي يؤدي إلى تشوهات وneuropathologies سلوكية مختلفة في النسل. هنا، وصفنا بروتوكول للحث وزارة الداخلية في الفئران مع بولي (I: C) الحقن في E12.5. هذا الأسلوب من MIA تحريض يؤدي إلى السلوكية والعصبية، المناعية، وتشوهات في الجهاز الهضمي المرتبطة التوحد والفصام في النسل 8،10،11،16. من المهم أن نلاحظ أن، لأن وزارة الداخلية هو عامل المخاطر البيئية، ومن المتوقع أن يكون الاختلاف أعلى من الفئران من ال...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

ونود أن تكريم الراحل الدكتور بول ه باترسون لإسهاماته في تقدم نموذج MIA، والتوحد، والبحوث الفصام. ونحن نعترف سركيس ك Mazmanian على دعمه الكبير على هذا البروتوكول. روبن م بايون، وإيفيت غارسيا فلوريس، كارين جيم Lencioni، وليزلي نيومان A. للحصول على المساعدة الإدارية؛ علي Khoshnan ويان جيم كو للمساعدة على تصوير. إلين Y. هسياو وناتاليا Malkova للحصول على المشورة على MIA الاستقراء. جيفري كوكرين، خواكين جوتيريز، كوان واو لي، خايمي رودريجيز، لورينا جيم ساندوفال، وناتالي A. فيردوزكو لتربية الحيوانات الخبراء الخاصة بهم. وأيد هذا العمل من قبل جائزة المعاهد الوطنية للصحة كونتي مركز (NIH 5P50MH086383-04، إلى بول ه باترسون)؛ التوحد يتحدث (# 7670، إلى بول ه باترسون)؛ مؤسسة سيمونز (# 322839، سركيس ك Mazmanian)؛ المعاهد الوطنية للصحة تدريب جرانت (NIH / NRSA T32GM07616 لك-HC)؛ معهد كاليفورنيا للتكنولوجيا الصيفية الجامعية زمالة أبحاث (SURF) (لZY)؛ أمجين برنامج المنح الدراسية في معهد كاليفورنيا للتكنولوجيا (لZY)؛ والاب زمالة بعد الدكتوراةمجلس أوم الوطنية للعلوم، تايوان (NSC 101-2917-I-564-039، إلى دبليو-LW).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
بولينوسينيك– ملح البوتاسيوم بحمض البولي سيتيديليكSIGMAP9582
0.9٪ كلوريد الصوديوم INJ. USPHOSPIRANDC 0409-4888-10
MONOJECT insuline syrinage 3/10 مل 29 جم × 1/2 "COVIDIEN8881600145
50 مل أنابيب غطاء لولبي مخروطي الولاياتالمتحدة الأمريكية SCIENTIFIC1500-1211
Nanodrop 1000 مقياس الطيفالضوئي THERMO SCIENTIFIC1000مجهر مجهر مجسمة اختياري
Wild HeerbruggM5Aاختياري
Dumont # 5 ملقط Inox Tip Size .10 X .06 mmRobozRS-5045
RNAlater اختياري كاشف تثبيت الحمض النووي الريبيQiagen76104
كاشف TRIzolتقنيات الحياة15596-026  اختياري
RQ1 DNase PromegaM610Aالاختياري
iScript cDNA مجموعةتوليف Bio-Rad170-8891اختياري
FastStart العالمي SYBR الأخضر المزيج مع ROX & nbsp ؛Roche4913922001اختياري
الوقت الحقيقي PCRABI7300التمهيدي الاختياري
: Il6 إلىالأمام Life TechnologiesTAGTCCTTCCTACCCCAATTTCCالتمهيدي الاختياري
: Il6 ReverseLife TechnologiesTTGGTCCTTAGCCACTCCTTCالتمهيدي الاختياري
: beta-actin إلى الأمامLife TechnologiesAGAGGGAAATCGTGCGTGACاختياري
التمهيدي: تقنيات الحياة العكسية بيتا الأكتينCAATAGTGATGACCTGGCCGTاختياري
MicroAmp البصري 96 بئر لوحةالتفاعل تقنيات الحياة4306737
لاصق بصري Optionl MicroAmp  لايف تكنولوجيز4311971Optionl
EthoVision NoldusEthoVisionOptionl
SR-LAB الجهاز (PPI) ساندييغو إنسترومنتس SR-LABOptionl
MarblesPENN-PLAXأحجار الأحجار الكريمة الزرقاء رخامOptionl
Dulbecco's Phosphate-Buffered Salt (DPBS)Life Technologies21600-069Optionl
ParaformaldehydeMACRON2621-59Optionl
VibratomeLeicaVT1000 SOptionl
Sodium azideSigmaS2002Optionl
Triton x-100SigmaX100Optionl
محلول بيروكسيد الهيدروجينSigma18312Optionl
مصل الماعزVector LaboratoriesS-1000
Optionl Rabbit الأجسام المضادة للكالبندينAbcamab11426Optionl
البيوتينيات الماعز المضادة للأرانب IgGantibodyVector LaboratoriesBA-1000Optionl
VECTASTAIN ABC KitVector LaboratoriesPK-4000Optionl
الاختياري في فيلم

المراجع

  1. Brown, A. S. Epidemiologic studies of exposure to prenatal infection and risk of schizophrenia and autism. Dev Neurobiol. 72 (10), 1272-1276 (2012).
  2. Fatemi, S. H., et al. The viral theory of schizophrenia revisited: abnormal placental gene expression and structural changes with lack of evidence for H1N1 viral presence in placentae of infected mice or brains of exposed offspring. Neuropharmacology. 62 (3), 1290-1298 (2012).
  3. Shi, L., Tu, N., Patterson, P. H. Maternal influenza infection is likely to alter fetal brain development indirectly: the virus is not detected in the fetus. Int J Dev Neurosci. 23 (2-3), 299-305 (2005).
  4. Knuesel, I., et al. Maternal immune activation and abnormal brain development across CNS disorders. Nat Rev Neurol. 10 (11), 643-660 (2014).
  5. Meyer, U. Prenatal poly(i:C) exposure and other developmental immune activation models in rodent systems. Biol Psychiatry. 75 (4), 307-315 (2014).
  6. Meyer, U., Feldon, J., Yee, B. K. A review of the fetal brain cytokine imbalance hypothesis of schizophrenia. Schizophr Bull. 35 (5), 959-972 (2009).
  7. Boksa, P. Effects of prenatal infection on brain development and behavior: a review of findings from animal models. Brain Behav Immun. 24 (6), 881-897 (2010).
  8. Hsiao, E. Y., McBride, S. W., Chow, J., Mazmanian, S. K., Patterson, P. H. Modeling an autism risk factor in mice leads to permanent immune dysregulation. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (31), 12776-12781 (2012).
  9. Ito, H. T., Smith, S. E., Hsiao, E., Patterson, P. H. Maternal immune activation alters nonspatial information processing in the hippocampus of the adult offspring. Brain Behav Immun. 24 (6), 930-941 (2010).
  10. Smith, S. E., Li, J., Garbett, K., Mirnics, K., Patterson, P. H. Maternal immune activation alters fetal brain development through interleukin-6. J Neurosci. 27 (40), 10695-10702 (2007).
  11. Shi, L., et al. Activation of the maternal immune system alters cerebellar development in the offspring. Brain Behav Immun. 23 (1), 116-123 (2009).
  12. Hsiao, E. Y., Patterson, P. H. Activation of the maternal immune system induces endocrine changes in the placenta via IL-6. Brain Behav Immun. 25 (4), 604-615 (2011).
  13. Wu, W. L., et al. The interaction between maternal immune activation and alpha 7 nicotinic acetylcholine receptor in regulating behaviors in the offspring. Brain Behav Immun. , (2015).
  14. Garay, P. A., Hsiao, E. Y., Patterson, P. H., McAllister, A. K. Maternal immune activation causes age- and region-specific changes in brain cytokines in offspring throughout development. Brain Behav Immun. 31, 54-68 (2013).
  15. Garbett, K. A., Hsiao, E. Y., Kalman, S., Patterson, P. H., Mirnics, K. Effects of maternal immune activation on gene expression patterns in the fetal brain. Transl Psychiatry. 2, e98(2012).
  16. Hsiao, E. Y., et al. Microbiota modulate behavioral and physiological abnormalities associated with neurodevelopmental disorders. Cell. 155 (7), 1451-1463 (2013).
  17. Naviaux, R. K., et al. Antipurinergic therapy corrects the autism-like features in the poly(IC) mouse model. PLoS One. 8 (3), e57380(2013).
  18. Pratt, L., Ni, L., Ponzio, N. M., Jonakait, G. M. Maternal inflammation promotes fetal microglial activation and increased cholinergic expression in the fetal basal forebrain: role of interleukin-6. Pediatr Res. 74 (4), 393-401 (2013).
  19. Schwartzer, J. J., et al. Maternal immune activation and strain specific interactions in the development of autism-like behaviors in mice. Transl Psychiatry. 3, e240(2013).
  20. Khan, D., et al. Long-term effects of maternal immune activation on depression-like behavior in the mouse. Transl Psychiatry. 4, e363(2014).
  21. Workman, A. D., Charvet, C. J., Clancy, B., Darlington, R. B., Finlay, B. L. Modeling transformations of neurodevelopmental sequences across mammalian species. J Neurosci. 33 (17), 7368-7383 (2013).
  22. Abazyan, B., et al. Prenatal interaction of mutant DISC1 and immune activation produces adult psychopathology. Biol Psychiatry. 68 (12), 1172-1181 (2010).
  23. Meyer, U., et al. Adult behavioral and pharmacological dysfunctions following disruption of the fetal brain balance between pro-inflammatory and IL-10-mediated anti-inflammatory signaling. Mol Psychiatry. 13 (2), 208-221 (2008).
  24. Vuillermot, S., et al. Prenatal immune activation interacts with genetic Nurr1 deficiency in the development of attentional impairments. J Neurosci. 32 (2), 436-451 (2012).
  25. Bechard, A., Nicholson, A., Mason, G. Litter size predicts adult stereotypic behavior in female laboratory mice. J Am Assoc Lab Anim Sci. 51 (4), 407-411 (2012).
  26. Harvey, L., Boksa, P. A stereological comparison of GAD67 and reelin expression in the hippocampal stratum oriens of offspring from two mouse models of maternal inflammation during pregnancy. Neuropharmacology. 62 (4), 1767-1776 (2012).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

Poly I C 12 5 Il6
تحريض الأم المناعي التنشيط في الفئران في مرحلة منتصف الحمل مع الفيروسية تقليد بولي (I: C)
اتصل بنا
أوصِ بها للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

2026 © حقوق الطبع والنشر MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.