ويحدد هذا البروتوكول تصنيع على نطاق واسع، ثنائية الأبعاد DNA أو الأجسام المضادة مجموعة المضاعفة، مع التطبيقات المحتملة في الخلية دراسات الإشارات وكشف العلامات البيولوجية.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
تدفق نمط تلفيق إرشادية للعالي الكثافة الباركود الأجسام المضادة ميكروأري
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
المصفوفة الدقيقة للأجسام المضادة كتقنية متطورة ، تواجه حاليا تحديا من قبل عدد قليل من التقنيات الأخرى الراسخة أو الناشئة عالية الإنتاجية. في هذا التقرير ، نقوم بتجديد تقنية المصفوفات الدقيقة للأجسام المضادة باستخدام نهج جديد للتصنيع وإدخال ميزات جديدة. يتم تصنيع المصفوفة الدقيقة للأجسام المضادة عالية الكثافة من خلال نمط التدفق الموجه بشكل عمودي للحمض النووي أحادي الشريطة والتحويل اللاحق بوساطة اقترانات الأجسام المضادة للحمض النووي. يحدد هذا البروتوكول الخطوات الحاسمة في نمط التدفق للحمض النووي ، وإنتاج وتنقية اقتران الأجسام المضادة للحمض النووي ، وتقييم جودة المصفوفة الدقيقة المصنعة. يمكن مقارنة التوحيد والحساسية مع المصفوفات الدقيقة التقليدية ، في حين أن تصنيع المصفوفات الدقيقة لدينا لا يتطلب مساعدة طابعة المصفوفة ويمكن إجراؤها في معظم مختبرات الأبحاث. الميزة الرئيسية الأخرى هي أن حجم وحدات المصفوفات الدقيقة لدينا أصغر ب 10 مرات من حجم المصفوفات المطبوعة ، مما يوفر قدرة فريدة على تحليل البروتينات الوظيفية من الخلايا المفردة عند التفاعل مع تصميمات الرقائق الدقيقة العامة. يمكن استخدام تقنية الباركود هذه على نطاق واسع في الكشف عن المؤشرات الحيوية ، ودراسات إشارات الخلايا ، وهندسة الأنسجة ، ومجموعة متنوعة من التطبيقات السريرية.
المقدمة
وقد استخدمت المجهرية الأجسام المضادة على نطاق واسع في الدراسات البروتين لعقود من الزمن لدراسة وجود البروتينات المستهدفة، بما في ذلك المؤشرات الحيوية البروتين 1-3. على الرغم من أن هذا المجال يواجه حاليا تحديات كبيرة من تقنيات عالية الإنتاجية الأخرى مثل مطياف الكتلة (MS)، لا يزال هناك الكثير من الغرفة لفائدة ميكروأرس الأجسام المضادة، وذلك أساسا بسبب هذه الأجهزة تحمل تفسير البيانات بسيطة وسهلة واجهة مع فحوصات أخرى. في السنوات الأخيرة، وقد وفرت دمج المجهرية في السقالات رقاقة ميكروأري الأجسام المضادة فرصة جديدة للازدهار 4-7. على سبيل المثال، تم استخدام ميكروأري الباركود دمجها في رقاقة وحيدة الخلية في دراسات الا....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
تحذير: العديد من المواد الكيميائية المستخدمة في هذا البروتوكول هي المهيجات وخطرة في حالة ملامسة الجلد. استشارة بيانات سلامة المواد (MSDS) وارتداء معدات الوقاية الشخصية المناسبة قبل تنفيذ هذا البروتوكول. الحل البيرانا المستخدمة في الخطوة (1.1.1) غير ضارة للغاية ويجب بإضافة بيروكسيد ببطء إلى حامض مع الإثارة مستعدة. التعامل مع هذا الحل مع الحذر الشديد في غطاء الدخان. استخدام حماية العين المناسبة والقفازات المقاومة للحمض. Trimethylchlorosilane (TMCS) هو تآكل والكيميائية القابلة للاشتعال يستخدم في خطوة اختيارية بعد (1.1.6). التعامل مع هذه المادة الكيميائية في غطاء الدخان.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
ووضعت التصاميم لPDMS قوالب (الشكل 1A-1B) باستخدام برنامج CAD (أوتوكاد). تصميمين أظهرت قنوات ميزة لتنميط تدفق، واحدة الأفقي والرأسي واحد. أجزاء اليسار واليمين من كل تصميم متناظرة. أي منهما يمكن أن يكون مداخل أو مخارج. كل واحد من 20 قناة والمتعرجة واحدة من نهاية كل وسيلة إلى الطرف الآخر. طبعت كل تصميم على الضوئية الرئيسية الكروم (الشكل 1C). يظهر ملفقة SU-8 رئيسي على الرقاقة في الشكل 1D.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
تصميم نمط تدفق هو أول خطوة حاسمة في افتعال ميكروأري 2-D. لتوليد اثنين من تداخل أنماط الحمض النووي على ركيزة الزجاج، ويجب الميزات قناة للتصميم الأول أن يكون عمودي على تلك الثاني (الشكل 1A-B). النظر في التصاميم أيضا التطبيقات المصب ميكروأري. في حالة تحليل خلية واحدة، يتم استخدام ميكروأري للكشف عن البروتينات من خلايا مفردة المغلقة في microchambers، وبالتالي تتم أبعاد قناة متوافق مع microchambers التي تتماشى مع صفائف 2-D. يتم تقديم كل تصميم على الضوئ.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ليس لدى المؤلفين مصالح متنافسة للإفصاح عنها.
شكر وتقدير
يود المؤلفون الاعتراف بتمويل بدء التشغيل من جامعة ولاية نيويورك ألباني والوصول إلى المرافق في مركز أبحاث السرطان بجامعة ألباني.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| Sylgard 184 قاعدة مطاط معدني من السيليكون | Dow Corning | 3097366-1004 | |
| Sylgard 184 عامل معالجة مطاط مطاط السيليكون | Dow Corning | 3097358-1004 | |
| SU-8 2025 مقاوم للضوء | MicroChem | Y111069 | |
| رقائق السيليكون ؛ | رقائق الجامعة | 452 | |
| شرائح زجاجية مطلية ب Poly-L-lysine | Thermo Scientific | C40-5257-M20 | |
| Oligonucleotides | تقنيات الحمض النووي | * مطلوبة حسب الطلب من تقنيات الحمض النووي المتكاملة ، انظر <قوي>الجدول 2< / قوي>. | |
| بولي إل ليسين محلول مخزون لاصق | الوافد الجديد | العرض 1339 | |
| مكرر (سلفوسوكسينيديل) سوبيرات (بكالوريوس 3) | Thermo Scientific | 21585 | |
| 1x محلول ملحي مخزن بالفوسفات ، درجة الحموضة 7.4 | جودة بيولوجية | 114-058-101 | |
| & Auml ؛ نظام KTA Explorer 100 Fast Protein Liquid Chromatography (FPLC) | GE (Amersham Pharmacia) | 18-1112-41 | |
| Superose 6 10/300 GL عمود | GE Healthcare Life | Sciences 17-5172-01 | |
| التقاط الأجسام المضادة | المختلفة | * يعتمد اختيار الأجسام المضادة على التطبيق | |
| Succinimidyl-6-hydrazino-nicotinamide (S-HyNic) Solulink | S-1002 | ||
| Succinimidyl-4-formylbenzamide (S-4FB) Solulink | S-1004 | ||
| N ، N < / em >-ثنائي ميثيل فورماميد | سيجما ألدريتش | 227056 | |
| حامض الستريك ، اللامائي | Acros | 42356 | |
| هيدروكسيد الصوديوم | فيشر Scientific | S318 | |
| Amicon Ultra مرشح الدوران 10 كيلو دالتون MWCO | EMD Millipore | UFC201024 | |
| Spin coater | Laurell Technologies | WS-650-MZ | |
| لكمة خزعة مع مكبس (قطر 1.0 مم) | شركة تيد بيلا | 15110-10 | |
| كاتب الماس (النمط 60) | SPI يزود | 6004 | |
| ثلاثي ميثيل كلوروسيلان | سيجما ألدريتش | 92361 |
المراجع
- Alhamdani, M. S. S., Schroder, C., Hoheisel, J. D. Oncoproteomic profiling with antibody microarrays. Genome Med. 1 (7), (2009).
- Angenendt, P. Progress in protein and antibody microarray technology. Drug Discov Today. 10 (7), 503-511 (2005).
- Sun, H. Y., Chen, G. Y. J., Ya....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
