Method Article

تدفق نمط تلفيق إرشادية للعالي الكثافة الباركود الأجسام المضادة ميكروأري

DOI:

10.3791/53644

⸱

January 6th, 2016

 , 
1Department of Chemistry, University at Albany, State University of New York, 2Multiplex Biotechnology Laboratory, Cancer Research Center

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويحدد هذا البروتوكول تصنيع على نطاق واسع، ثنائية الأبعاد DNA أو الأجسام المضادة مجموعة المضاعفة، مع التطبيقات المحتملة في الخلية دراسات الإشارات وكشف العلامات البيولوجية.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المصفوفة الدقيقة للأجسام المضادة كتقنية متطورة ، تواجه حاليا تحديا من قبل عدد قليل من التقنيات الأخرى الراسخة أو الناشئة عالية الإنتاجية. في هذا التقرير ، نقوم بتجديد تقنية المصفوفات الدقيقة للأجسام المضادة باستخدام نهج جديد للتصنيع وإدخال ميزات جديدة. يتم تصنيع المصفوفة الدقيقة للأجسام المضادة عالية الكثافة من خلال نمط التدفق الموجه بشكل عمودي للحمض النووي أحادي الشريطة والتحويل اللاحق بوساطة اقترانات الأجسام المضادة للحمض النووي. يحدد هذا البروتوكول الخطوات الحاسمة في نمط التدفق للحمض النووي ، وإنتاج وتنقية اقتران الأجسام المضادة للحمض النووي ، وتقييم جودة المصفوفة الدقيقة المصنعة. يمكن مقارنة التوحيد والحساسية مع المصفوفات الدقيقة التقليدية ، في حين أن تصنيع المصفوفات الدقيقة لدينا لا يتطلب مساعدة طابعة المصفوفة ويمكن إجراؤها في معظم مختبرات الأبحاث. الميزة الرئيسية الأخرى هي أن حجم وحدات المصفوفات الدقيقة لدينا أصغر ب 10 مرات من حجم المصفوفات المطبوعة ، مما يوفر قدرة فريدة على تحليل البروتينات الوظيفية من الخلايا المفردة عند التفاعل مع تصميمات الرقائق الدقيقة العامة. يمكن استخدام تقنية الباركود هذه على نطاق واسع في الكشف عن المؤشرات الحيوية ، ودراسات إشارات الخلايا ، وهندسة الأنسجة ، ومجموعة متنوعة من التطبيقات السريرية.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد استخدمت المجهرية الأجسام المضادة على نطاق واسع في الدراسات البروتين لعقود من الزمن لدراسة وجود البروتينات المستهدفة، بما في ذلك المؤشرات الحيوية البروتين 1-3. على الرغم من أن هذا المجال يواجه حاليا تحديات كبيرة من تقنيات عالية الإنتاجية الأخرى مثل مطياف الكتلة (MS)، لا يزال هناك الكثير من الغرفة لفائدة ميكروأرس الأجسام المضادة، وذلك أساسا بسبب هذه الأجهزة تحمل تفسير البيانات بسيطة وسهلة واجهة مع فحوصات أخرى. في السنوات الأخيرة، وقد وفرت دمج المجهرية في السقالات رقاقة ميكروأري الأجسام المضادة فرصة جديدة للازدهار 4-7. على سبيل المثال، تم استخدام ميكروأري الباركود دمجها في رقاقة وحيدة الخلية في دراسات الاتصالات الخلوية 8،9. هذه التقنية لها مزايا مميزة على غيرها من التكنولوجيات ميكروأري المتاحة. ويضم عناصر مجموعة في 10-100 ميكرون، أصغر بكثير من نموذجي 150 ميكرون حجم المستخدمة في elemen ميكروأري التقليديةنهاية الخبر. ويتحقق بناء عناصر مجموعة أصغر باستخدام نهج تدفق الزخرفة المنهجية، وهذا يؤدي إلى ميكروأرس المدمجة التي يمكن الكشف عن البروتينات وحيدة الخلية تفرز الخلايا والبروتينات. ميزة أخرى هي استخدام بسيطة، خالية من أداة الإعداد. هذا مهم بشكل خاص، لأن معظم المعامل والشركات الصغيرة قد لا تكون قادرة على الوصول إلى المرافق الأساسية ميكروأري. هذا الباركود المجهرية الضد تشمل الخصائص المتطورة مقايسة الإنتاجية، ويمكن استخدامها لإجراء فحوصات المضاعفة كبير على الخلايا وحيدة حين تحقيق حساسية عالية وخصوصية مقارنة مع تلك التي التقليدي المرتبط بالإنزيم شطيرة الفحص المناعي (ELISA 8). وقد وجدت هذه التقنية العديد من التطبيقات في الكشف عن البروتينات من ورم أرومي 11/09، وخلايا T 12، وتعميم الخلايا السرطانية 13. بدلا من ذلك، ميكروأرس DNA الباركود وحده استخدمت في تحديد المواقع بدقة من الخلايا العصبية والخلايا النجمية لميميكجي التجميع في الجسم الحي من أنسجة المخ 14.

ويركز هذا البروتوكول فقط على الخطوات التجريبية وكتل تراكم من ثنائي الأبعاد (2-D) الباركود الأجسام المضادة ميكروأري التي لها تطبيقات محتملة في الكشف عن المؤشرات الحيوية في عينات الموائعية وفي زنازين انفرادية. وتستند هذه التقنية على عنونة احد الذين تقطعت بهم السبل، أحادية البعد (1-D) ميكروأري DNA شيدت باستخدام [أليغنوكليوتيد المتعامدة التي يتم نمط مكانيا على ركائز الزجاج. يتم تشكيل نمط 1-D عندما تستخدم قنوات تدفق موازية في خطوة تدفق الزخرفة، ويبدو مثل هذا النمط كما عصابات منفصلة مماثلة بصريا إلى 1-D رمز المنتج العالمي (UPC) الباركود. بناء 2-D (ن س م) الأجسام المضادة مجموعة - يذكرنا 2-D الاستجابة السريعة (QR) رمز المصفوفة - يحتاج استراتيجيات الزخرفة أكثر تعقيدا، ولكن يسمح لتجميد الأجسام المضادة في ارتفاع الكثافة 8،15. تلفيقيتطلب خطوتين الزخرفة DNA، مع النمط الأول عمودي على الثانية. نقاط تقاطع هذه الأنماط اثنين تشكل عناصر م ن خ المصفوفة. عن طريق اختيار استراتيجي تسلسل واحد الذين تقطعت بهم السبل الحمض النووي (ssDNA) المستخدمة في تدفق الزخرفة، يتم تعيين كل عنصر في مجموعة وإعطاء عنوان محدد. هذه الإشارة المكانية اللازمة في التمييز بين الإشارات مضان على الشريحة ميكروأري. تحويل مجموعة ssDNA في صفيف الأجسام المضادة من خلال إدراج تقارن-DNA الأجسام المضادة التكميلية، وتشكيل منصة تسمى مكتبة الأجسام المضادة ترميز الحمض النووي (DEAL 16).

يصف هذا البروتوكول الفيديو الخطوات الرئيسية في خلق صفائف nxm الأجسام المضادة والتي تشمل إعداد polydimethylsiloxane (PDMS) قوالب الباركود، وتدفق الزخرفة ssDNA في اثنين من التوجهات، وإعداد الأجسام المضادة النوكليوتيد تقارن DEAL، وتحويل مجموعة 3 × 3 DNA إلى 3× 3 الضد مجموعة.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تحذير: العديد من المواد الكيميائية المستخدمة في هذا البروتوكول هي المهيجات وخطرة في حالة ملامسة الجلد. استشارة بيانات سلامة المواد (MSDS) وارتداء معدات الوقاية الشخصية المناسبة قبل تنفيذ هذا البروتوكول. الحل البيرانا المستخدمة في الخطوة (1.1.1) غير ضارة للغاية ويجب بإضافة بيروكسيد ببطء إلى حامض مع الإثارة مستعدة. التعامل مع هذا الحل مع الحذر الشديد في غطاء الدخان. استخدام حماية العين المناسبة والقفازات المقاومة للحمض. Trimethylchlorosilane (TMCS) هو تآكل والكيميائية القابلة للاشتعال يستخدم في خطوة اختيارية بعد (1.1.6). التعامل مع هذه المادة الكيميائية في غطاء الدخان.

ملاحظة: إجراء تصنيع الشرائح الباركود وإجراءات تدفق الزخرفة حرجة في غرفة نظيفة للحد من التلوث عن طريق الجسيمات. قد يمنع جزيئات الغبار الموانئ وmicrochannels قوالب PDMS وتتداخل مع تدفق الزخرفة.

1. البناء للdimensiona واحدةل DNA الباركود الشرائح

  1. إعداد سيد SU-8 لأنماط تدفق الباركود
    ملاحظة: يتم إنشاء رسومات لأنماط تدفق عمودي (الشكل 1A-B) باستخدام (CAD) برامج التصميم بمساعدة الكمبيوتر. يتم تقديم هذه الأنماط على الضوئية الرئيسية الكروم. مناطق شفافة من القناع تتوافق مع ملامح سيد SU-8.
    1. تنظيف رقاقة السيليكون (100 مم) بدقة في خليط من 3 H 2 SO 4: 1 30٪ H 2 O 2 (حل سمكة البيرانا) تسخينها إلى 96 درجة مئوية. غسل رقاقة مع الماء منزوع الأيونات وايزوبروبيل، تليها تجفيف بمسدس ضربة النيتروجين.
    2. صب حوالي 4 مل من SU-8 2025 مقاوم الضوء على الرقاقة. استخدام تدور المغطي للبرمجة لنشر موحد مقاوم الضوء على الرقاقة لمدة 10 ثانية في 500 دورة في الدقيقة، ثم 30 ثانية في 3000 دورة في الدقيقة. وهذا يخلق طبقة مقاومة للضوء مع سمك ~ 25 ميكرون. تدريجيا تسمح الغزل لإبطاء قبل أن تتوقف - وهذا هو إلى maintain حتى الطلاء على سطح الرقاقة ل.
    3. خبز الرقاقة المغلفة على موقد لمدة 1 دقيقة عند 65 درجة مئوية، ثم لمدة 5 دقائق عند 95 ° C. هذه الخطوة تسمح للطلاء ليصلب. بارد لRT لمدة 5 دقائق.
    4. وضع قناع الكروم (الشكل 1C) على معطف مقاومة للضوء. كشف ملامح قناع للضوء القريب للأشعة فوق البنفسجية (350-400 نانومتر، والطاقة التعرض 150-160 ميغا جول / سم 2) لمدة 20 ثانية.
      ملاحظة: التصميم على القناع الكروم يحتوي على 20 قنوات، كل منها 20 ميكرون واسع مع 50 ميكرون الملعب. القنوات يتم لف من طرف واحد من نمط إلى الطرف الآخر. وإجمالا، تغطي القنوات 20 منطقة مستطيلة بطول ~ 40 ملم وبعرض ~ 20 ملم. ويحيط كل قناة من قبل اثنين من الميزات دائرية والتي تتوافق إلى مدخل ومخرج. المداخل والمخارج قابلة للتبادل.
    5. خبز الرقاقة تعرض على موقد لمدة 5 دقائق عند 95 ° C. بارد لRT تدريجيا.
    6. تزج الرقاقة في SU-8 المطور مع الإثارةلمدة 5 دقائق. غسل رقاقة مع جزء صغير من جديد SU-8 المطور، تليها الإيزوبروبيل. تجفيف الرقاقة باستخدام بندقية ضربة النيتروجين. من الصعب خبز الرقاقة على موقد C 200 درجة لمدة 30 دقيقة، والسماح للرقاقة لتبرد تدريجيا إلى RT.
      ويمكن تنفيذ التنمية خارج لفترة أطول إذا لوحظ فيلم أبيض بعد الغسيل في هذه الخطوة: مذكرة.
      اختياري: Silanize سيد SU-8 عن طريق تعريضها لبخار trimethylchlorosilane في طبق بيتري مغلقة لمدة 10 دقيقة.
  2. إعداد القالب الباركود PDMS
    1. الجمع بين 40.0 غرام سيليكون قاعدة المطاط الصناعي مع 4.0 ز وكيل المعالجة. يحرك الخليط prepolymer بقوة لمدة 10 دقيقة. ديغا لمدة 20 دقيقة تحت فراغ.
      ملاحظة: كقاعدة عامة، استخدم 10: 1 (قاعدة: وكيل علاج) نسبة الجماعية.
    2. صب prepolymer في طبق بتري تحتوي على رقاقة السيليكون مع سيد SU-8 من نمط الباركود. ارتفاع مزيج PDMS يجب أن يكون حوالي 7.5 ملم فما فوق. ديغا الخليط في بيترط طبق للمرة الثانية لإزالة أي فقاعات المتبقية، ثم يخبز الخليط لمدة 1 ساعة على 75 درجة مئوية للسماح PDMS لعلاج.
      ملاحظة: من المهم للحفاظ على سمك ما يكفي من بلاطة PDMS في ~ 7.5 مم أو أعلى لتجنب إضافة الكثير من التوتر على السندات PDMS من الزجاج على ادراج دبابيس / الأنابيب من خلال ثقوب في القالب PDMS في الخطوة (1.3.3.1)
    3. باستخدام مشرط، وقطع بعناية حول منطقة بلاطة PDMS الذي يحتوي على ميزات العفن الباركود وقشر لوح من الرقاقة.
    4. تقليم حواف لوح لتحقيق الشكل المطلوب من العفن الباركود PDMS. لكمة ثقوب 20 (1.0 مم) من خلال القالب باستخدام لكمة خزعة مع الغطاس. تأكد من أن الثقوب تتماشى مع ميزات دائرية من نمط الباركود. هذه الثقوب بمثابة مداخل ومنافذ البيع.
  3. الزخرفة ذات بعد واحد من بولي-L-ليسين (PLL)
    1. إزالة أي غبار على سطح شريحة الزجاج المطلي بولي-L-يسين باستخدام بندقية ضربة النيتروجين. أتاكح العفن PDMS إلى شريحة زجاجية نظيفة. تأكد من أن حواف القالب وشريحة والانحياز.
    2. تخبز لمدة 1.5 ساعة عند 75 ° C لتعزيز العلاقة بين القالب PDMS وشريحة PLL المغلفة. وفي الوقت نفسه، وإعداد 20 قطعة من مرونة أنابيب البولي ايثيلين (3- إلى قطع 4 بوصة، مع قطرها الداخلي 0.5 ملم وقطرها الخارجي من 1.5 ملم).
      ملاحظة: عدد من قطع أنابيب مساويا لعدد من مداخل في قالب الباركود PDMS. يخدم أنابيب لزوجين من القنوات على القالب الباركود PDMS إلى خزان غاز النيتروجين مجهزة منظم الضغط.
    3. إلى نهاية واحدة من كل قطعة من الأنابيب، وإرفاق الفولاذ المقاوم للصدأ دبوس جوفاء (1 مم). نضح العقيمة التي تمت تصفيتها بولي-L-يسين حل من خلال دبوس، حتى يمتلئ 1 سم على الأقل من الأنبوب مع الحل.
      1. ربط المسامير (متصلة مليئة حل الأنابيب) إلى مداخل القالب الباركود PDMS (الشكل 1E). نعلق على الطرف الآخر من الأنابيب لدبابة النيتروجين الضغط ينظم انشاء. يسمح الحل لتتدفق من خلال القالب باستخدام مجموعة ضغط من 0.5-1 رطل لمدة لا تقل عن 6 ساعة.
        ملاحظة: يرجى الرجوع إلى الخطوة (1.3.3) لجميع إجراءات تدفق الزخرفة.
  4. الزخرفة ذات بعد واحد من ssDNA 14
    ملاحظة: يتم إعداد الفوسفات المالحة (PBS) مخزنة المستخدمة في الخطوات اللاحقة من 137 ملي كلوريد الصوديوم، و 10 ملي نا 2 هبو 4، و 2 ملي KH 2 PO 4. الرقم الهيدروجيني للالعازلة هي 7.4.
    1. إعداد 2 مم مكرر (sulfosuccinimidyl) suberate (BS3) حل في برنامج تلفزيوني. إعداد 300 ميكرومتر حلول من A، B، C وssDNA (5'-أمين تعديل، 80 النيوكليوتيدات) في برنامج تلفزيوني أو الماء عالى النقاء.
      ملاحظة: استخدام الحل BS3 في غضون نحو 30 دقيقة بعد إعداد لأن N -hydroxysuccinimide استر يخضع بسهولة المائي.
    2. الجمع بين 2.5 ميكرولتر من 300 ميكرومتر A، B، C أو ssDNA مع 2.5 ميكرولتر من 2 مكررا ملي (sulfosuccinimتصنف موضوع ملائم) suberate في برنامج تلفزيوني لكل قناة. A، B، C وDNA لقنوات 1، 2، و 3، على التوالي. يتم تطبيق هذا النظام أيضا إلى مجموعات المتبقية من 3 قنوات (الشكل 2A).
    3. نفذ الخطوة (1.3.3). هذه المرة، نضح الحلول BS3 / DNA 5 ميكرولتر من خلال دبابيس الفولاذ المقاوم للصدأ وإلى أنابيب البولي ايثيلين، ثم زوجين العفن PDMS إلى مصدر النيتروجين. السماح للحل BS3 / DNA لتتدفق من خلال القالب الباركود لحوالي 40 دقيقة أو حتى في تمتلئ القنوات.
    4. وقف تدفق تمتلئ مرة واحدة كل القنوات، ثم احتضان الحل BS3 / DNA في الباركود في RT لمدة 2 ساعة. لا تسمح الحل لتجف. يخبز القالب PDMS مع شريحة الباركود المرفق لمدة 1 ساعة على 75 درجة مئوية.
      ملاحظة: لتسهيل التوافق في لاحقة الخطوات التدفق الزخرفة، قد تكون الخطوط العريضة لحواف نمط القناة على الشريحة الباركود. يتم ذلك عن طريق الخدش بعناية سطح الزجاج باستخدام scrib الماسه لتوليد علامات التوافق على الجزء السفلي من شريحة زجاجية. المحاذاة في مراحل لاحقة من بروتوكول يمكن فحص تحت المجهر.
    5. إزالة العفن PDMS من الشريحة الباركود. غسل الشريحة بلطف مع 0.01٪ SDS مرة واحدة وثلاث مرات مع الماء عالى النقاء.
      1. تجف الشريحة الباركود باستخدام الدوار شريحة المجهر. تخزين الشريحة الباركود في نظيفة 50 مل أنبوب الطرد المركزي لاستخدامها لاحقا.

2. التحقق من نمط واحد الابعاد على الشريحة الباركود

ملاحظة: يمكن أيضا أن تتكيف هذا البروتوكول المصادقة لاستخدامه في تقييم نوعية لاحقة الخطوات الزخرفة التدفق.

  1. حجب الشريحة
    1. إعداد 1٪ ألبومين المصل البقري (BSA) في برنامج تلفزيوني. تصفية هذا الحل من خلال مرشح حقنة 0.45 ميكرون قبل الاستخدام. باستخدام طرف جل التحميل، وتطبيق 50 ميكرولتر من 1٪ محلول BSA إلى حافة واحدة من الشرائح الباركود.
    2. احتضان 1٪ BSA solutايون لمدة 1 ساعة على RT.
  2. الحضانة مع Cyanine 3 (CY3) -conjugated DNA التكميلي
    1. إعداد كوكتيل من A '، B، C وأليغنوكليوتيد]' مترافق إلى CY3 في نهاية واحدة. تسلسل A '، B، C و"هي مكملة لA، B، C و، على التوالي. تركيز العمل للDNA CY3 0.05 ميكرومتر في 0.1٪ BSA.
    2. إزالة الحل BSA من الشريحة من قبل pipetting، ثم تطبيق 30 ميكرولتر من الحل كوكتيل DNA على نفس حافة الشريحة. احتضان كوكتيل CY3-DNA على الشريحة في RT لمدة 1 ساعة. تنفيذ هذه الخطوة الحضانة في الظلام لحماية شاردة CY3 من photobleaching من.
  3. تحليل كثافة مضان
    1. ماصة من كوكتيل CY3-DNA وغسل الشريحة في 1٪ BSA، PBS، وأخيرا في برنامج تلفزيوني المخفف (1 عالفن PBS مع 50 أجزاء عالى النقاء الماء). تجف الشريحة باستخدام الدوار.
    2. مراقبة مضان (الشكل 2B) باستخدام مجهر مضان أو ماسح ضوئي ميكروأري. عند استخدام ماسح ضوئي ميكروأري، تعيين الطول الموجي انبعاث الليزر ل532 نانومتر، وحجم البكسل في 5 ميكرون، أنبوب مضخم (PMT) مكاسب في 450 والطاقة بنسبة 15٪.

3. تصنيع صفيف 2-الأبعاد (3X3) DNA 14

  1. إعداد القالب الباركود PDMS
    1. أداء الإجراء (1.1) لبناء SU-8 رئيسي آخر، ولكن هذه المرة استخدام قناع الكروم مع نمط تدفق عمودي على أن من أول تصميم. أداء الإجراء (1.2) لبناء العفن PDMS جديد مع نمط عمودي.
  2. ثنائية الأبعاد الزخرفة تدفق ssDNA
    1. لمجموعة 3 × 3، وإعداد 150 ميكرومتر الحلول الأسهم من A'-I، B '، الجزء الثاني، C'والثاني والثالث، A'-IV، B' الخامس، C'الى السادس، A'السابع، B"DNA -viii، وC'-التاسع في 3٪ BSA / برنامج تلفزيوني. هذه أليغنوكليوتيد بمثابة "تسلسل سد" (الشكل 2A). الجمع بين الحلول النوكليوتيد (حلول 1-3) هذه أن تركيز العمل هو 50 ميكرومتر لكل النوكليوتيد. استخدام دليل الواردة في الجدول 1.
    2. تتدفق 3٪ BSA / PBS عرقلة الحل في جميع القنوات 20 لمدة 1 ساعة في 0.5-1 رطل.
    3. حلول تدفق 1، 2، و 3 إلى قنوات 1، 2، و 3، على التوالي. اتباع هذا النظام لمجموعات لاحقة من 3 قنوات. عادة ما يتم تدفق في حوالي 40 دقيقة. احتضان الحلول DNA في RT لمدة 2 ساعة للسماح للDNA لهجن.
    4. تتدفق 3٪ BSA / PBS عرقلة الحل في جميع القنوات 20 لمدة 1 ساعة في 0.5-1 رطل لإزالة DNA الغير مهجنة. تقشر بلاطة PDMS، وغسل الناتجة الشريحة ميكروأري الحمض النووي عن طريق غمس شريحة زجاجية إلى 3٪ BSA / PBS مرة واحدة وPBS مرتين، تليها المخفف PBS (1 جزء PBS و 50 أجزاء من الماء عالى النقاء). دراي الشريحة باستخدام الدوار شريحة المجهر.
    5. تنفيذ الخطوة الثانية التحقق من صحة (الشكل 2C) مماثلة لتلك التي في القسم 2. استخدام أليغنوكليوتيد] ط 'إلى التاسع "التي هي CY3 مترافق. تخزين مجموعة الشرائح 3 × 3 في أنبوب الطرد المركزي 50 مل لاستخدامها لاحقا.
      ملاحظة: يمكن تخزين متطورة للحمض النووي في RT في مجفف لمدة شهور.

4. تحويل الحمض النووي صفيف 3 × 3 في صفيف الأضداد

  1. إعداد الأجسام المضادة النوكليوتيد (DEAL) تقارن
    1. إعداد الحلول من 200 ملي succinimidyl-4-formylbenzoate (S-4FB) و 40 ملي succinimidyl-6-hydrazinonicotinamide (S-HyNic) في اللامائية N، N -dimethylformamide (DMF).
    2. إعداد ما يصل إلى 7 حلول منفصلة من الأجسام المضادة القبض على (1 ملغ / مل) في برنامج تلفزيوني.
      ملاحظة: إذا كانت الحلول الأسهم الضد تحتوي على الصوديوم أزيد كابح الجراثيم، نفذ الصرف عازلة مع PBS باستخدام تدور تحلية جolumns مع 7 كيلو دالتون الوزن الجزيئي قطع (MWCO).
    3. إعداد منفصلة 400 ميكرومتر حلول ط '، والثاني'، الثالث، الرابع، الخامس، السادس، السابع وDNA ". تعيين كل التقاط الأجسام المضادة لتسلسل قليل النوكليوتيد واحد. الجمع بين 40 ميكرولتر من 400 ميكرومتر DNA مع 12.25 ميكرولتر من DMF في أنابيب microcentrifuge وتدور باستمرار لتخلط جيدا.
      1. على كل حل DNA / DMF، إضافة 2.3 ميكرولتر من 200 ملي S-4FB في DMF. مقابل كل 100 ميكروغرام من التقاط الأجسام المضادة، إضافة 2.25 ميكرولتر من 40 ملي S-HyNic في DMF.
    4. احتضان الضد / S-HyNic وDNA / S-4FB حلول لمدة 4 ساعة على RT.
    5. استعدادا للتفاعل اقتران-DNA الأجسام المضادة، وإعداد الأعمدة تدور تحلية جديدة (واحد لكل حل DNA واحد لكل الأجسام المضادة) من خلال غسلها مع العازلة سيترات في درجة الحموضة 6.
    6. بعد 4 ساعات من الحضانة، نفذ الصرف عازلة لكل الأجسام المضادة / S-HyNic وحل DNA / S-4FB. الجمع بين S-4FB، مترافق ط 'والثاني'، الثالث، الرابع، الخامس، السادس 'وأليغنوكليوتيد السابع "مع تقارن الضد-S-HyNic. احتضان خلطات لمدة 2 ساعة على RT.
    7. احتضان رد فعل O / N عند 4 درجات مئوية.
  2. تنقية الأجسام المضادة النوكليوتيد (DEAL) تقارن
    ملاحظة: لتنقية تقارن الأجسام المضادة النوكليوتيد، أداء سريع البروتين اللوني السائل (FPLC) على نظام FPLC قياسي مجهزة عمود GL Superose 6 10/300.
    1. تعيين الطول الموجي للكشف عن الأشعة فوق البنفسجية من نظام FPLC إلى 280 نانومتر. استخدام تدفق isocratic من برنامج تلفزيوني (الرقم الهيدروجيني 7.4) في 0.3 مل / دقيقة لفصل تقارن الأجسام المضادة قليل النوكليوتيد من S-4FB-DNA الزائد.
    2. تجميع الكسور التي تحتوي على المكورات والتركيز الكسور إلى وحدة تخزين 150 ميكرولتر باستخدام مرشحات تدور مع 10 كيلو دالتون MWCO.
  3. الزخرفة ثنائية الأبعاد من الأجسام المضادة
    1. إعداد قالب PDMS آخر مع microchambers أو الآبار الصغرى لناجي الإجراءات تلفيق في الخطوة (1.2). قد يحتوي القالب PDMS ميكروليتر إلى آبار نانولتر لالمناعية.
      ملاحظة: للكشف عن العلامات البيولوجية عام في عينات الموائعية، تزاوج العفن PDMS مع آبار متعددة مع الشريحة مجموعة. ملامح القالب PDMS تعتمد على نظام قيد الدراسة. على سبيل المثال، والكشف عن البروتينات من التجارب خلية واحدة لا يمكن أن يؤديها مع قالب PDMS تحتوي على microchambers مع وحدات التخزين 0.15-NL.
    2. (اختياري) العنوان العفن PDMS إلى البلازما تنظيف (18 W) لمدة 1.5 دقيقة لتقديم محبة للماء على سطح منقوشة. قبل تنظيف البلازما، واستخدام شريط لاصق لمنع جميع الأسطح الأخرى التي سيتم المستعبدين مباشرة إلى مجموعة الشرائح 3 × 3.
      ملاحظة: الخطوة (4.3.2) هو اختياري ولكن عادة ما يتم إجراء عندما يكون القصد القالب PDMS لاستخدامها في التجارب خلية واحدة.
    3. تزاوج العفن PDMS مع مجموعة الشرائح 3 × 3، ثم منع الانزلاق مع 1٪ BSA في برنامج تلفزيوني. احتضان لمدة 1 ساعة على RT. Meanwhiجنيه، وإعداد الكوكتيل (200 الحجم النهائي ميكرولتر) من تقارن الأجسام المضادة قليل النوكليوتيد. تركيز عمل كل المترافقة هو 10 ميكروغرام / مل في 1٪ BSA / برنامج تلفزيوني.
    4. إضافة كوكتيل الضد النوكليوتيد، ثم احتضان لمدة 1 ساعة على 37 درجة مئوية للسماح شاردة قليل النوكليوتيد من تقارن لهجن مع وجود بقع محددة على 3 × 3 المصفوفات، وبالتالي تحويل مجموعة الحمض النووي لمجموعة الأجسام المضادة.
    5. كرر الخطوة (3.2.4) لتنظيف وتجفيف الشريحة. ويمكن تحقيق أعلى حساسية إذا تم استخدام مجموعة الأجسام المضادة فورا. التخزين لفترات طويلة قد يؤدي إلى فقدان الحساسية.
  4. الكشف عن البروتينات
    1. إعادة تشكيل البروتينات المؤتلف أو إعداد عينة الخلايا التي تمت تصفيتها.
    2. تتزاوج ميكروأري مع رقاقة مصممة خصيصا، ومنع السطح مع 3٪ BSA في برنامج تلفزيوني لمدة 1 ساعة. ثم إزالة الحل BSA، وتطبيق العينات واحتضان لمدة 2 ساعة.
    3. يغسل العينات باستخدام 3٪ BSA في برنامج تلفزيوني ثلاث مرات، وهود ثم إضافة الأجسام المضادة كشف بتركيز المقدمة من ورقة البيانات المنتج. احتضان لمدة 2 ساعة.
    4. يغسل الأجسام المضادة الكشف عن طريق 3٪ BSA في برنامج تلفزيوني ثلاث مرات، ثم قم بإضافة Cyanine 5 (Cy5) -streptavidin في 1 ميكروغرام / مل، تليها الحضانة لمدة 1 ساعة.
    5. كرر الخطوة (3.2.4) لتنظيف وتجفيف الشريحة للمسح الضوئي.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ووضعت التصاميم لPDMS قوالب (الشكل 1A-1B) باستخدام برنامج CAD (أوتوكاد). تصميمين أظهرت قنوات ميزة لتنميط تدفق، واحدة الأفقي والرأسي واحد. أجزاء اليسار واليمين من كل تصميم متناظرة. أي منهما يمكن أن يكون مداخل أو مخارج. كل واحد من 20 قناة والمتعرجة واحدة من نهاية كل وسيلة إلى الطرف الآخر. طبعت كل تصميم على الضوئية الرئيسية الكروم (الشكل 1C). يظهر ملفقة SU-8 رئيسي على الرقاقة في الشكل 1D.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تصميم نمط تدفق هو أول خطوة حاسمة في افتعال ميكروأري 2-D. لتوليد اثنين من تداخل أنماط الحمض النووي على ركيزة الزجاج، ويجب الميزات قناة للتصميم الأول أن يكون عمودي على تلك الثاني (الشكل 1A-B). النظر في التصاميم أيضا التطبيقات المصب ميكروأري. في حالة تحليل خلية واحدة، يتم استخدام ميكروأري للكشف عن البروتينات من خلايا مفردة المغلقة في microchambers، وبالتالي تتم أبعاد قناة متوافق مع microchambers التي تتماشى مع صفائف 2-D. يتم تقديم كل تصميم على الضوئ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين مصالح متنافسة للإفصاح عنها.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يود المؤلفون الاعتراف بتمويل بدء التشغيل من جامعة ولاية نيويورك ألباني والوصول إلى المرافق في مركز أبحاث السرطان بجامعة ألباني.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Sylgard 184 قاعدة مطاط معدني من السيليكونDow Corning3097366-1004
Sylgard 184 عامل معالجة مطاط مطاط السيليكونDow Corning3097358-1004
SU-8 2025 مقاوم للضوءMicroChemY111069
رقائق السيليكون   ؛رقائق الجامعة452
شرائح زجاجية مطلية ب Poly-L-lysineThermo ScientificC40-5257-M20
Oligonucleotidesتقنيات الحمض النووي* مطلوبة حسب الطلب من تقنيات الحمض النووي المتكاملة ، انظر <قوي>الجدول 2< / قوي>.
بولي إل ليسين محلول مخزون لاصقالوافد الجديدالعرض 1339
مكرر (سلفوسوكسينيديل) سوبيرات   (بكالوريوس 3)Thermo Scientific21585
1x محلول ملحي مخزن بالفوسفات ، درجة الحموضة 7.4جودة بيولوجية114-058-101
& Auml ؛ نظام KTA Explorer 100 Fast Protein Liquid Chromatography (FPLC)GE (Amersham Pharmacia)  18-1112-41
Superose 6 10/300 GL عمودGE Healthcare LifeSciences 17-5172-01
التقاط الأجسام المضادةالمختلفة* يعتمد اختيار الأجسام المضادة على التطبيق
Succinimidyl-6-hydrazino-nicotinamide (S-HyNic) SolulinkS-1002
Succinimidyl-4-formylbenzamide (S-4FB) SolulinkS-1004
N ، N < / em >-ثنائي ميثيل فورماميدسيجما ألدريتش227056
حامض الستريك ، اللامائيAcros42356
هيدروكسيد الصوديومفيشر ScientificS318
Amicon Ultra مرشح الدوران 10 كيلو دالتون MWCOEMD MilliporeUFC201024
Spin coaterLaurell TechnologiesWS-650-MZ
لكمة خزعة مع مكبس (قطر 1.0 مم)شركة تيد بيلا15110-10
كاتب الماس (النمط 60)SPI يزود6004
ثلاثي ميثيل كلوروسيلانسيجما ألدريتش92361
المتكاملة

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Alhamdani, M. S. S., Schroder, C., Hoheisel, J. D. Oncoproteomic profiling with antibody microarrays. Genome Med. 1 (7), (2009).
  2. Angenendt, P. Progress in protein and antibody microarray technology. Drug Discov Today. 10 (7), 503-511 (2005).
  3. Sun, H. Y., Chen, G. Y. J., Yao, S. Q. Recent advances in microarray technologies for proteomics. Chem Biol. 20 (5), 685-699 (2013).
  4. Fan, R., et al. Integrated barcode chips for rapid, multiplexed analysis of proteins in microliter quantities of blood. Nat Biotechnol. 26 (12), 1373-1378 (2008).
  5. Chattopadhyay, P. K., Gierahn, T. M., Roederer, M., Love, J. C. Single-cell technologies for monitoring immune systems. Nat Immunol. 15 (2), 128-135 (2014).
  6. Varadarajan, N., et al. Rapid, efficient functional characterization and recovery of HIV-specific human CD8(+) T cells using microengraving. Proc Natl Acad Sci USA. 109 (10), 3885-3890 (2012).
  7. Ma, S., et al. Electroporation-based delivery of cell-penetrating peptide conjugates of peptide nucleic acids for antisense inhibition of intracellular bacteria. Integr Biol-Uk. 6 (10), 973-978 (2014).
  8. Wang, J., et al. Quantitating cell-cell interaction functions with applications to glioblastoma multiforme cancer cells. Nano Lett. 12 (12), 6101-6106 (2012).
  9. Kravchenko-Balasha, N., Wang, J., Remacle, F., Levine, R. D., Heath, J. R. Glioblastoma cellular architectures are predicted through the characterization of two-cell interactions. Proc Natl Acad Sci USA. 111 (17), 6521-6526 (2014).
  10. Xue, M., et al. Chemical methods for the simultaneous quantitation of metabolites and proteins from single cells. J Am Chem Soc. 137 (12), 4066-4069 (2015).
  11. Shi, Q. H., et al. Single-cell proteomic chip for profiling intracellular signaling pathways in single tumor cells. Proc Natl Acad Sci USA. 109 (2), 419-424 (2012).
  12. Ma, C., et al. A clinical microchip for evaluation of single immune cells reveals high functional heterogeneity in phenotypically similar T cells. Nat Med. 17 (6), 738-743 (2011).
  13. Deng, Y., et al. An integrated microfluidic chip system for single-cell secretion profiling of rare circulating tumor cells. Sci Rep. 4, 7499(2014).
  14. Vermesh, U., et al. High-density, multiplexed patterning of cells at single-cell resolution for tissue engineering and other applications. Angew Chem Int Ed. 50 (32), 7378-7380 (2011).
  15. Yu, J., et al. Microfluidics-based single-cell functional proteomics for fundamental and applied biomedical applications. Annu Rev Anal Chem. 7, 275-295 (2014).
  16. Bailey, R. C., Kwong, G. A., Radu, C. G., Witte, O. N., Heath, J. R. DNA-encoded antibody libraries: A unified platform for multiplexed cell sorting and detection of genes and proteins. J Am Chem Soc. 129, 1959-1967 (2007).
  17. Alegria-Schaffer, A. General protein-protein cross-linking. Methods Enzymol. 539, 81-87 (2014).
  18. Ahmad, H., et al. A robotics platform for automated batch fabrication of high density, microfluidics-based DNA microarrays, with applications to single cell, multiplex assays of secreted proteins. Rev Sci Instrum. 82, 094301(2011).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Flow PatterningAntibody MicroarrayDNA Antibody ConjugatesPDMS Mold FabricationSingle Cell AnalysisSU 8 MasterPerpendicular Flow PatternMicroarray ValidationBiomarker DetectionCell Signaling Studies

Related Articles