تحليل كمي للتعبير البروتين لدراسة النسب مواصفات في ماوس سابق للانغراس الأجنة

Summary

ويعرض هذا البروتوكول وسيلة لأداء الكمية، وحيدة الخلية في التحليل الموقعي للتعبير البروتين لدراسة مواصفات النسب في أجنة الفئران قبل الغرس. الإجراءات اللازمة لتحصيل الكيسات الأريمية، بكل جبل كشف مناعي للبروتينات، وصفت التصوير العينات على المجهر متحد البؤر، وتجزئة النووية وتحليل الصور.

Abstract

ويعرض هذا البروتوكول وسيلة لأداء الكمي، واحدة من الخلايا في الموقع تحليلات التعبير البروتين لدراسة مواصفات النسب في الأجنة قبل الغرس الماوس. ووصف الإجراءات اللازمة لتحصيل الجنين، المناعي، والتصوير على المجهر متحد البؤر، وتقسيم الصور وتحليلها. وتسمح هذه الطريقة الكميات من التعبير عن علامات نووية متعددة والمكانية (XYZ) تنسق جميع الخلايا في الجنين. ويستفيد من MINS، أداة البرمجيات تجزئة الصورة وضعت خصيصا لتحليل الصور مبائر من الأجنة قبل الغرس والخلايا الجذعية الجنينية المستعمرات (ESC). MINS ينفذ تجزئة النووية غير خاضعة للرقابة عبر X، Y و Z الأبعاد، وينتج من المعلومات حول موقف خلية في الفضاء ثلاثي الأبعاد، فضلا عن مستويات مضان النووية لجميع القنوات مع إدخال المستخدم الحد الأدنى. في حين تم تحسين هذا البروتوكول لتحليل الصورمن سابق للانغراس الأجنة مرحلة الماوس، ويمكن بسهولة أن تتكيف مع تحليل أي عينات أخرى اظهار جيدة نسبة الإشارة إلى الضوضاء وحيث الكثافة النووية العالية تشكل عقبة أمام تجزئة الصورة (على سبيل المثال، تحليل التعبير عن الخلايا الجذعية الجنينية (ESC ) المستعمرات، تمييز الخلايا في الثقافة والأجنة من الأنواع أو في مراحل أخرى، وما إلى ذلك).

Introduction

جنين الفأر سابق للانغراس هو نموذج لدراسة نشوء وصيانة تعدد القدرات في الجسم الحي، وكذلك نموذجا لدراسة مواصفات مصير الخلايا ودي نوفو الاندمال بتشكل النسيج الظهاري في الثدييات. حريصون على مراحل سابق للانغراس التنمية الثدييات لإنشاء الأنساب الخلية الثلاثة التي تشكل الكيسة الأريمية، وهي الأديم الظاهر المحفزة - الذي يؤدي إلى معظم الأنسجة الجسمية والخلايا الجرثومية - واثنين من الأنساب خارج الجنين، الأديم الظاهر الغاذي (TE) و الأديم الباطن البدائي (قبل) (الشكل 1A) ^1،2. يصف هذا البروتوكول إجراءات ل(1) الأجنة الحصاد وتحديد المرحلة سابق للانغراس الماوس، (2) أداء المناعي لتسمية البروتينات من الفائدة، (3) تنفيذ كامل جبل التصوير باستخدام المجهر متحد البؤر مع قدرات باجتزاء ض و (4) أداء تجزئة النووية من الصور مبائر ويحلل صورة الكمية اللاحقة. هذا الخط يسمح رانه متحيز قياس مستويات البروتين لتعيين هوية الخلية لوصف مجموعات سكانية فرعية من الخلايا في الموقع. يمكن أن يتم هذا البروتوكول في اقل من 3-4 أيام للحصول على القمامة واحدة (عادة ما يصل الى 10 أجنة الفئران)، من جمع الأجنة لتحليل البيانات (الشكل 1B). إن التحليل المتزامن لعدة جراء زيادة التصوير وتحليل البيانات عبء الزمن، وبالتالي تمديد الطول الإجمالي للبروتوكول.

الجنين قبل الغرس مرحلة الماوس هو نظام لين العريكة تجريبيا التي، نظرا لصغر حجم والتشكل النمطية ^3، هي مناسبة تماما لفي التصوير توتو من العمليات الخلوية لقرار وحيدة الخلية. لإجراء وتحليل غير متحيز على مستوى نظم عدد هام إحصائيا من الأجنة، وهو خط أنابيب التحليل الكمي الآلي هو مرغوب فيه. ولكن نظرا لكثافة النووية عالية من الكتلة الخلوية الداخلية (ICM) من الكيسة الأريمية ( الشكل 1A، 2D) ومنصات تقطيع الصورة التقليدية تفشل في توفير دقة كافية لإنشاء سير العمل الآلي أو شبه الآلي. من ناحية أخرى، وتجزئة اليدوية، في حين دقيقة، لا يسمح تجهيز أفواج كبيرة من الخلايا والأجنة، كما أنها مناسبة لاستنساخه، تقرير متحيز الهويات الخلية - وهو أمر بالغ الأهمية عند دراسة مراحل النمو حيث أنماط علامة والتعبير لم تحل بالكامل (على سبيل المثال، لا تظهر توزيع ثنائي عبر السكان). لقد وضعت مؤخرا والتحقق من صحة طريقة تقطيع الصورة مصممة لأجنة المرحلة الماوس سابق للانغراس والخلايا الجذعية الجنينية (المجالس الاقتصادية والاجتماعية) الذي يحقق دقة عالية، في حين تتطلب إدخال الحد الأدنى المستخدم ^4-8.

خط أنابيب التحليل المقدم هنا يدور حول أداة تقطيع الصورة مقرها MATLAB-وحدات التفاعلية الإنقسام النووية (دقيقة) ^4. MINS صerforms تجزئة النووية غير خاضعة للرقابة على دفعات كبيرة من مبائر Z-مداخن بعد أنشأت المستعمل أقل عدد ممكن من خصائص الصورة، وذلك باستخدام واجهة المستخدم الرسومية (GUI) (الجدول 1) ^(4). وقد ثبت هذا الخط فعالة لتوليد بيانات عالية الإنتاجية على التعبير البروتين وتوطين خلية في كل من النوع البري، وتعامل بشكل تجريبي والمعدلة وراثيا الأجنة والمجالس الاقتصادية والاجتماعية ^5-7. في هذا البروتوكول، وصفنا تطبيق MINS إلى تقسيم الصور الجنين قبل الغرس المرحلة. للحصول على أمثلة من أداء MINS على المجالس الاقتصادية والاجتماعية، يرجى الرجوع إلى ^4،7. الخطوة تجزئة النووية الآلي يقلل بشكل ملحوظ من عبء الوقت عملية تحديد الهوية الخلية، في حين أن قياسات كثافة المكانية ومضان تسمح للتقرير متحيز الهويات خلية وتوليد خرائط ثلاثية الأبعاد من مجالات التعبير الجيني وموقف الخلايا في الجنين (الشكل 1C ). وعلاوة على ذلك، فإن قابلية هذا العمل يجعل من تطبيقها على تحليل الفضلات الفردية من خلال أفواج كبيرة من الأجنة تعامل تجريبيا، أو الأجنة من خلفيات وراثية مختلفة ^5،6. MINS غير متاحة بحرية في http://katlab-tools.org (البرنامج يتطلب ترخيص MATLAB).

أي نهج ضعت حتى الآن يسمح للجيل هذه البيانات متعمقة بشأن تعبير البروتين وتوطين الخلايا في أجنة الفئران قبل الغرس. كل المحاولات حتى الآن في قياس هذه الأنواع من البيانات قد يقتصر على تقرير اليدوية والكميات من أرقام الهواتف المحمولة لمجموعات سكانية مختلفة في الجنين (إما كليا يدويا، أو البرمجيات بمساعدة) ^9-19. وقد تم تصميم هذا النهج (دمج البرمجيات دقيقة) لواختبارها على الأجنة قبل الغرس الماوس والمجالس الاقتصادية والاجتماعية. ومع ذلك أدائها على أنظمة أخرى ذات الكثافة النووية عالية، على الرغم من بعد لم تختبر، ومن المتوقع أن يكون معادلا.

Protocol

بيان الأخلاق: كل عمل الحيوانية، بما في ذلك تربية، تربية والتضحية وتمت الموافقة من قبل لجنة ميموريال سلون كيترينج للسرطان في الحيوان الرعاية المؤسسية والاستخدام (IACUC)، بروتوكول # 03-12-017.

مجموعة 1. الأجنة

ملاحظة: يجب أن يكون قد وافق كل عمل الحيوانية السلطات المؤسسية والمحلية وتتوافق مع القواعد المحلية والمؤسسية.

1. ماتي الماوس الإناث البكر مع عشيق الذكور الخصبة من المورثات المطلوب.
   ملاحظة: إذا وضع التزاوج الطبيعي، واختيار الإناث في المرحلة شبق للدورة estral يزيد من فرص الجماع على التاريخ المطلوب. إذا حمل فرط الإباضة، يرجى الرجوع إلى البروتوكولات المذكورة في ^20.
2. تحقق من وجود المكونات المهبلي في الصباح باستخدام مسبار حادة. من الناحية المثالية، القيام بذلك قبل الظهر (12:00)، كما خسر المقابس الجماع طوال اليوم. النظر NOOن من الكشف عن يوم الجنينية المكونات المهبلية (E) 0.5.
3. في اليوم المطلوب والوقت من التطور الجنيني، الاحماء M2 أو احمرار عقد المتوسطة (FHM) إلى RT، أو يفضل، 37 درجة مئوية. ملاحظة: إما M2 أو FHM يمكن استخدامها لالتنظيف والتعامل مع الأجنة. عندما لا تكون قيد الاستعمال، وتخزين هذه الوسائط في 4 درجة مئوية. تقدير استخدام ~ 2 مل من المتوسط ​​لكل الرحم.
4. ذوبان المجمدة 4٪ بارافورمالدهيد (PFA) في الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) أو إعداد بعض حل جديد. تقدير 500 ميكرولتر من 4٪ حل PFA لكل بئر من لوحة 4 بشكل جيد. إصلاح القمامة واحدة على كل جانب من لوحة 4 بشكل جيد. ملاحظة: بدلا من ذلك، لوحة 96-جيدا يمكن أن تستخدم لإصلاح والأجنة المخزن. في حالة استخدام لوحة 96-جيدا، استخدم 100 ميكرولتر من محلول PFA لكل بئر.
5. سحب ماصة باستير الزجاج باستخدام اللهب المكشوف لرسم نهاية الشعرية على الحافة.
6. التضحية أنثى خلع عنق الرحم أو CO ₂ الاستنشاق، أو كما هو مطلوب من قبل الأنظمة المحلية والمؤسسية. غالبا ما يكون desirablالبريد لتأكيد القتل الرحيم للحيوان عن طريق خلع عنق الرحم.
7. رش بطن الحيوان مع الايثانول 70٪ للحد من سفك الشعر وإجراء شق في البطن، أولا من خلال الجلد وبعد ذلك من خلال جدار الجسم (البريتوني) لكشف الأحشاء.
   ملاحظة: تصف الخطوات التالية إجراء لجمع الكيسات الأريمية من رحم فئران الحوامل في أي مرحلة بين E3.25 وE4.5 (الشكل 1A). لبروتوكولات على مجموعة من الأجنة سابق للانغراس في وقت سابق من E3.25، راجع ^إلى 20.
8. حدد موقع الرحم وإزالة من الحيوان. عقد نهاية عنق الرحم مع زوج من ملقط، قطع طريق عنق الرحم وسحب ما يصل بلطف على امتداد كل من قرون الرحم.
9. خفض الدهون من الرحم، مع الحرص على عدم اختراق جدار الرحم. ويمكن القيام بذلك بسهولة في وقت الإزالة، في حين لا تزال تعلق على جسم الحيوان، كما يمكن أن تمتد الرحم خارج. بدلا من ذلك،ويمكن أن يتم في وقت لاحق، تحت المجهر تشريح، في RT برنامج تلفزيوني. لبروتوكول أكثر تفصيلا عن تشريح الرحم، انظر بروتوكولات 5 و 8 ²⁰
10. قطع فوق ناقلة البيضات، تحت المبيضين، للافراج عن الرحم بأكمله، وضعها على طبق بتري، وتغطي مع برنامج تلفزيوني.
    ملاحظة: هذه الخطوة كما يسمح غسل الدم الزائد أو غيرها من الحطام من الرحم، مما يسهل الحصاد الكيسة لاحق.
11. قرون منفصلة كلا الرحم من خلال قطع نهاية الداني، على كلا الجانبين من عنق الرحم والتخلص من عنق الرحم. فصل كل قناة البيض من الرحم عن طريق خفض تحت البرزخ الذي يربط منها (الشكل 1A). نقل كل من قرون إلى قطرة من التلاعب المتوسطة (إما M2 أو FHM) لجمع الأجنة والتلاعب.
12. تحت المجهر تشريح، الكيسات الأريمية دافق من الرحم وفي المتوسط ​​عن طريق إجبار 0،5-1 مل من M2 أو FHM خلال كل قرن الرحم من فتح عنق الرحم. استخدام 1مل حقنة بإبرة تحت الجلد. ملاحظة: إبرة يمكن قلل باستخدام الحجر الايداع لتجنب تمزق الرحم، على الرغم من أن هذه ليست حرجة. رسم تخطيطي مفصل عن التنظيف الرحم يمكن العثور عليها في ^21.
13. باستخدام مجهر تشريح، حدد موقع الكيسات الأريمية، والتي سوف تكون مبعثرة في جميع أنحاء قطرة من المتوسط. السماح تصل إلى 1-2 دقيقة لالكيسات الأريمية لتنزل الى قاع الطبق بعد التنظيف. باستخدام والزجاج ماصة باستير التي تسيطر عليها الفم مع نهاية الشعرية، وجمع كل الكيسات الأريمية ونقل إلى تراجع جديد من وسائل الإعلام.
14. شطف الكيسات الأريمية عن طريق نقلها من خلال 2-3 قطرات من M2 الطازجة أو FHM. نقل الأجنة في مجموعات من 5-10 الكيسات الأريمية في وقت واحد.
    ملاحظة: نقل مجموعات كبيرة في وقت واحد سوف تسرع هذه العملية، ولكنه سوف يزيد أيضا من فرص دون قصد تفقد العديد من الأجنة. إذا غير مدربين على استخدام ماصات التي تسيطر عليها الفم، وممارسة التلاعب الجنين ونقل ينبغي النظر فيها قبل بeginning التجربة.
15. إزالة المنطقة الشفافة (ZP) من الكيسات الأريمية لم يفقس (عموما
16. أخذ الحيطة والحذر عند التعامل مع الكيسات الأريمية الجرداء، كما أنها تلتزم بسهولة جدا على الزجاج والبلاستيك السطوح. التلاعب المتوسطة تحتوي على 4 ملغ / مل من الزلال المصل البقري (BSA) لمنع التعلق، ولكن حامض على تايرود أو برنامج تلفزيوني لا، لذلك، للحد من خطر وقوع أضرار أو خسائر الأجنة لا تلتقط أكثر من 2-5 الكيسات الأريمية الجرداء في الوقت الذي التلاعب بها في برنامج تلفزيوني BSA خالية أو خالية من المصل أو حامض في تايرود.
    ملاحظة: بدلا من ذلك، ومعطف ماصة الزجاج مع 1٪ BSA قبل استخدامها للحد من التزام الأجنة إلى سطح الزجاج.

معطف أسفل كل بئرمن 4 جيدا طبق زراعة الأنسجة مع طبقة رقيقة من 1٪ أجار، 0.9٪ كلوريد الصوديوم لمنع الأجنة من الانضمام إلى البلاستيك. بدلا من ذلك، إضافة 4 ملغ / مل من جيش صرب البوسنة في برنامج تلفزيوني (PBS-BSA).

شغل أيضا واحدة من 4 جيدا طبق زراعة الأنسجة المغلفة مع 500 ميكرولتر من RT برنامج تلفزيوني (أو برنامج تلفزيوني BSA) وكذلك مع 500 ميكرولتر آخر من 4٪ PFA في برنامج تلفزيوني.

شطف الكيسات الأريمية في RT برنامج تلفزيوني وإصلاح في PFA 4٪ في برنامج تلفزيوني لمدة 10 دقيقة في RT. نقل إلى برنامج تلفزيوني (أو برنامج تلفزيوني BSA) بعد التثبيت.

إذا الأجنة لن تتم معالجتها فورا، تغطية برنامج تلفزيوني تحتوي على أجنة بطبقة من الزيت المعدني لمنع التبخر (مما يؤدي إلى جفاف العينة) وتخزين لوحة عند 4 درجات مئوية.
ملاحظة: طرق التثبيت مختلفة وأوقات يمكن استخدام اعتمادا على التجربة، والحواتم الفائدة والأجسام المضادة لاستخدامها. أيهما طريقة الاختيار، أن تكون متسقة في جميع أنحاء التجارب تعادل لتسهيل المقارنة اللاحقة من نتائج تلطيخ.
ملاحظة: وقفةويمكن تخزين الأجنة عند 4 درجات مئوية في برنامج تلفزيوني لمدة تصل إلى عدة أسابيع قبل الانتقال إلى الخطوة التالية: نقطة. ضمان PBS معقمة و / أو إضافة 100 U / مل من البنسلين + 100 ميكروغرام / مل الستربتوميسين (القلم بكتيريا) لمنع التلوث البكتيري (وخاصة عند استخدام برنامج تلفزيوني BSA) إذا توقع تخزين لفترات طويلة.

2. المناعي

1. أداء المناعي باستخدام أي بروتوكول الذي سبق اختبارها وثبت أن تكون قوية لالمناعي كله جبل. ملاحظة: نوصي تلك الموضحة في ^{22 و} 11. في هذه المادة سوف يمكن وصفها السابق. أيهما طريقة الاختيار، أن تكون متسقة في جميع أنحاء التجارب تعادل لتسهيل المقارنة بين نتائج تلطيخ.
2. استخدام مرنة، والبلاستيكية، واضحة، U-القاع 96-جيدا لوحة لتنفيذ خطوات متتابعة للبروتوكول المناعي. ملء كل جيدا مع 50-100 ميكرولتر من حل ونقل الأجنة من حل واحدإلى آخر باستخدام ماصة الفم على شكل حرف L. ملاحظة هذا النهج يقلل من استخدام المواد الكيميائية ويسهل تتبع الخطوات فضلا عن تلطيخ الموازي لعدة المجموعات التجريبية.
   1. اختياري: معطف أسفل الآبار مع طبقة رقيقة من 1٪ أجار، 0.9٪ كلوريد الصوديوم لمنع التصاق الأجنة إلى البلاستيك. لا تقم بإضافة BSA إلى حلول المناعي.
3. إعداد PBX (0.1٪ تريتون X-100 في برنامج تلفزيوني). إذا توقع أداء العديد من التجارب المناعي، وإعداد 50 مل من مقسم وتخزينها في 4 درجة مئوية بين التجارب.
4. يعد حل permeabilization (0.5٪ تريتون X-100، 100MM الجلايسين في برنامج تلفزيوني). جعل 1 مل (أو أي المبلغ اللازم) من حل permeabilization جديدة لكل تجربة.
5. إعداد عرقلة الحل (المصل 2٪ الحصان (HS) أو 20٪ مصل بقري جنيني (FBS) مع القلم بكتيريا في برنامج تلفزيوني). إعداد 10 مل وتخزينها في 4 درجة مئوية بين التجارب.
   1. وقد لوحظ عدم وجود فروق بين إمانوع من المصل، مع ذلك، أن تكون متسقة في اختيار عرقلة الحل المستخدمة للتجارب مماثلة.
6. شطف الأجنة ثابتة لمدة 5 دقائق على RT في PBX (~ 100 ميكرولتر).
7. Permeabilize الأجنة لمدة 5 دقائق على RT في حل permeabilization (~ 100 ميكرولتر).
8. شطف الأجنة لمدة 5 دقائق على RT في PBX (~ 100 ميكرولتر).
9. الأجنة كتلة لمدة 30 دقيقة إلى 1 ساعة على RT في ~ 100 ميكرولتر من عرقلة الحل. تغطية الحل مع طبقة من الزيوت المعدنية لمنع التبخر أو الاحتفاظ بها في غرفة ترطيب.
   ملاحظة: الأجنة يمكن أن يكون قد تم حظره لمدة تصل إلى O / N فترات في 4 درجة مئوية دون تحسن أو ضرر ملحوظ بالمقارنة مع 30 دقيقة الخطوات الحجب.
10. احتضان الأجنة O / N عند 4 درجات مئوية في الأجسام المضادة الأولية / الأجسام المضادة المخفف في عرقلة الحل (~ 100 ميكرولتر). تغطية الحل مع طبقة من الزيوت المعدنية لمنع التبخر أو الاحتفاظ بها في غرفة ترطيب.
    1. تحديد تخفيف الأمثل لكل الأجسام المضادة الأولية مسبقا. انظر دiscussion والمواد قسم للالتخفيفات اختبار عدد من الأجسام المضادة.
11. بعد O / N الحضانة، وشطف الأجنة 3X لمدة 5 دقائق كل في RT في PBX (~ 100 ميكرولتر).
12. الأجنة كتلة لمدة 30 دقيقة إلى 1 ساعة على RT في ~ 100 ميكرولتر من عرقلة الحل. تغطية الحل مع طبقة من الزيوت المعدنية لمنع التبخر أو الاحتفاظ بها في غرفة ترطيب.
13. احتضان الأجنة ل1-2 ساعة عند 4 درجات مئوية في الضد الثانوية / الأجسام المضادة المخفف في 4 ميكروغرام / مل في ~ 100 ميكرولتر من عرقلة الحل. تغطية الحل مع طبقة من الزيوت المعدنية لمنع التبخر أو الاحتفاظ بها في غرفة ترطيب.
14. شطف الأجنة 2X لمدة 5 دقائق كل في RT في مقسم.
15. نقل الأجنة إلى وصمة عار الحمض النووي المفضل. إذا باستخدام هويشت 33342، ويخفف إلى 5 ميكروغرام / مل في برنامج تلفزيوني. تغطية الحل مع طبقة من الزيوت المعدنية لمنع التبخر أو الاحتفاظ بها في غرفة ترطيب.
    ملاحظة: نقطة وقفة: إذا لم يتم تصوير الأجنة على الفور، فإنها يمكن أن تبقى لأجلك ..p لعدة أسابيع في حل تلطيخ النووي. في هذه الحالة، وضمان PBS معقمة و / أو إضافة القلم بكتيريا أو أزيد الصوديوم لمنع نمو البكتيريا والتلوث.

3. متحد البؤر التصوير

ملاحظة: سوف تكوينات المجهر مبائر الفردية تتطلب المعلمات الاستحواذ محددة إلى تعديل للنظام والبرامج في المكان. ومع ذلك، يوفر القسم التالي مجموعة من القواعد العامة لمتابعة التي ينبغي أن تنطبق على أي تركيب معين.

1. باستخدام ماصة الفم الجميلة، وجعل microdrops من برنامج تلفزيوني أو حل وصمة عار النووي على سطح الزجاج من صحن زجاج القاع 35MM، وتغطي مع الزيوت المعدنية. وكبديل لذلك، استخدام ساترة منتظمة مع فواصل سيليكون لتجنب إتلاف الأجنة، وتغطي مع شريحة المجهر والزجاج. ملاحظة: عند استخدام ساترة العادية والأجنة لا يمكن بعد ذلك إعادة وضع أو استردادها لالتنميط الجيني، وبالتالي فإننا نوصي بشدة استخدام الزجاج أسفلأطباق.
2. مكان الأجنة في microdrops وترتيب بطريقة متناسقة، ويفضل أن يكون مع الحركة الدستورية الإسلامية تجويف محور مواز لسطح الزجاج. إعداد طبق على حامل المجهر. ملاحظة: الصور التي تم الحصول عليها في المسح الضوئي ليزر المجاهر مبائر تعاني من فقدان المرتبطة محور Z من كثافة مضان. لذلك، والاتساق في الترتيب مهم لمقارنة الكثافات بين المناطق تعادل على الأجنة المختلفة.
3. إعداد المعلمات مرجع باستخدام أجنة نوع البرية التي لم تكن تخضع لأي نوع من العلاج الذي قد يغير التعبير الجيني.
   1. الحصول على صور باستخدام الهدف عالية التكبير (أي 40X أو أعلى) من أجل الحصول على البيانات التي من شأنها تسهيل تجزئة دقيقة باستخدام أداة MINS ^4.
      ملاحظة: استخدام التكبير الرقمي على هدف 20X لن تسفر عن الصور من قرار الكافي للتجزئة باستخدام MINS. ينبغي للمرء أن نلاحظ أيضا المسافة العمل (WD) لهذا الهدف، كما يجب أن تكونكافية للسماح الاستحواذ على Z كومة التي تمتد على الكيسة كلها، بالتالي WD طويل (~ 130-150 ميكرون) هدف ضروري عادة. تم الحصول على 4 باستخدام 40X / NA الهدف الغمر 1.30 النفط مع مسافة العمل من 210 ميكرون - الصور المبينة في الشكلين 2.
   2. استخدام انتاج الليزر أدنى أن يوفر نسبة قوية إشارة إلى الضوضاء دون تبيض fluorophores.
   3. ضبط الربح وتعويض للحصول على أوسع نطاق ديناميكي دون تعريض العينة. فضح صور لتغطية معظم، أو تمتد وكامل، رمادي نطاق جدول تسهيل الكشف عن الفروق الصغيرة في كثافة بين الصور.
   4. استخدام صغيرة (1 ميكرون) Z-خطوة، منذ محور Z قرار حاسم للتجزئة دقيقة مع MINS.
      ملاحظة: أبعاد XY لا تؤثر على عملية تجزئة النووية، إلا أن حجم ملف الصورة. عموما، 512 × 512 بكسل هو قرار XY كافية للصور ذات جودة المنشور دون compromiالغناء مساحة القرص الصلب.
   5. خطوة حاسمة: حافظ التصوير المعلمات متسقة داخل وعبر جلسات التصوير لنفس التجربة وذلك لتكون قادرا على مقارنة عينات.
4. التصوير دفعات من الأجنة:
   1. مجموعة صورة متماسكة (الفضلات، والتجارب) في جلسة واحدة كلما أمكن ذلك.
   2. الحفاظ المعلمات متسقة داخل وعبر جلسات التصوير ليعيد نفس التجربة.
   3. الأجنة صورة في جميع أنحاء (كله محور Z) للقبض على كل خلية.
      ملاحظة: إذا رغبت في ذلك، ويمكن أن يتم الجنين التنميط الجيني بعد التصوير كما هو موضح في ^23. الحاجة إلى متداخل PCR لابد من تحديد تجريبيا وسوف تعتمد على مكان ليتم تحليلها والاشعال المستخدمة.
5. تأكد من أن تكون قادرة على المباراة الأجنة إلى صور بأثر رجعي.

4. صورة تحليل وبيانات ما قبل المعالجة

1. تحميل وتثبيت MINS ⁴ من http: // katlab-tools.org (رخصة MATLAB المطلوبة).
2. أداء تقطيع الصورة:
   1. اتبع اجهة المستخدم الرسومية (GUI) من دقائق لتحميل صورة مبائر أو كومة من القرص الصلب، وكشف عن ونوى وجزء من الصورة. تحميل كامل Z-كومة من البيانات الخام التي تم إنشاؤها بواسطة المجهر (.lsm، .lif، .oif، وما إلى ذلك). انظر الجدول 2 للاطلاع على تفاصيل كل خطوة والتعليمات الموجودة على http://katlab-tools.org ^و 4. وبمجرد الانتهاء، عرض نتائج كل خطوة بالضغط على 'عرض' الزر المقابل. علامة صفراء فوق زر يشير إلى عملية في العملية، علامة خضراء تشير إلى إكمال العملية.
      ملاحظة: MINS حاليا لا يدعم ملفات .czi و tiff تسلسل أو ملفات متعددة موقف - كل Z كومة يجب أن يكون ملف مستقل.
   2. بعد تجزئة مرضية، حفظ خط أنابيب تم إنشاؤها بحيث يمكن استخدامها مباشرة للأجنة أو الفضلات الأخرى.
3. ، وضع دفعة تجزئة:
   ملاحظة: سيملفات ngle يمكن أن تكون مجزأة بشكل فردي. ومع ذلك، بالنظر إلى أن الأجنة داخل القمامة أو التجربة بشكل عام من مرحلة قابلة للمقارنة، يمكن MINS تطبيق خط أنابيب تجزئة لخلق صورة واحدة إلى مجموعة منهم دون إشراف.
   1. من القائمة دفعة-وضع تشغيل، انقر فوق "إضافة ملفات" وتحميل كافة الملفات التي سيتم تجهيزها في وقت واحد. ملاحظة: يمكن إضافة الملفات من مصادر مختلفة إلى قائمة انتظار تجزئة.
   2. انقر على "ابدأ دفعة-وضع تشغيل 'وإتاحة الوقت للبرنامج لمعالجة الملفات. ملاحظة: سيتم حفظ الانتاج الإنقسام في نفس الدليل حيث الملفات الأصلية حيث تقع.
4. تقييم تقسيم والتصحيح اليدوي
   ملاحظة: MINS شرائح الصور مع دقة عالية جدا (> 85٪)، ومع ذلك، ونوعية من تلطيخ والتصوير، فضلا عن مرحلة من مراحل الجنين، قد تؤثر على أداء MINS. عموما، والكثافة النووية العليا داخل الجنين، فإن أخطاء تجزئة أكثر عرضة تأخذ PLACه (أرقام 2D و 3). وبالتالي، يجب أن يتم تقييم دقة تجزئة لكل عينة وتصحيح يدويا إذا لزم الأمر. نوعين من الأخطاء تحدث عادة: الإفراط في تجزئة وتحت تجزئة.
   1. حل الإفراط في تجزئة:
      1. تحديد ايجابيات كاذبة - الحويصلات أفكارك (الشكل 3A أ، ب، د، العلامات النجمية) أو غيرها من العناصر التي ليست نواة سليمة، ولكن الذي قد تم التعرف على هذا النحو من قبل MINS.
         ملاحظة: هذه عموما المغلوطة لديهم حجم أصغر من نواة حقيقية ويمكن، في معظم الحالات، يكون من السهل التعرف وفرزها على جدول البيانات. ومع ذلك، ينصح بشدة الفحص البصري، كما في كثير من الأحيان نوى قد تكون مجزأة بشكل جزئي فقط، مما أدى إلى، ولكن حجم مجزأة صحيح أصغر (الشكل 3A ب، رأس السهم).
      2. حذف السجلات المطابقة للايجابيات كاذبة من ملف * statistics.csv. الحفاظ على إحصاءات * الأصليملف csv للرجوع إليها في المستقبل وتحرير فقط على نسخة منه.
      3. إذا كانت نواة الإفراط في مجزأة وقدم إلى 2 أو أكثر من نوى (الشكل 3A ج، السهم والسهام)، إما دمج السجلات عن طريق حساب متوسط ​​مستوى حدتها، أو إذا ما شابه ذلك، تبقى أحد السجلات لتلك الخلية وتجاهل راحة.
   2. حل دون تجزئة:
      1. تحديد الأحداث حيث فشلت دقيقة للكشف عن الحدود بين اثنين أو أكثر من نوى وبالتالي مجزأة بها باعتبارها نواة واحدة (الشكل 3A د، السهم و3B). ملاحظة: هذا يشكل مشكلة بالنسبة لعدد خلايا دقيقة، ولكن الأهم من ذلك، لقياس مستويات البروتين، لأن مستويات قياس سيكون متوسط ​​الخلايا التي تم دمجها بشكل خاطئ، والتي قد تنتمي إلى أنساب مختلفة.
      2. تحديد الأحداث حيث فشلت دقيقة للكشف نواة تماما.
      3. في هذه الحالات (4.4.2.1 و4.4.2.2)، قياس متوسط ​​مستويات الرمادي وأو كل قناة في الخلية الناقصة أو غير مجزأة (ق) باستخدام أداة بديلة، مثل يماغيج (http://imagej.nih.gov/ij/)، وتحل محل سجل خاطئ مع المستويات الصحيحة. الحفاظ على ملف * statistics.csv الأصلي للرجوع إليها في المستقبل وتعديل فقط على نسخة منه. القيام بذلك باستخدام يماغيج، اتبع الخطوات التالية:
         1. فتح كومة متعددة القنوات ذات الصلة على يماغيج واستيراد المقابلة * ملف overlaid.tiff الناتجة عن MINS كما كومة الظاهري ( 'ملف'> 'استيراد'> 'TIFF كومة الظاهري ...').
         2. العثور على قسم وسطي من نواة الناقصة أو من الامم المتحدة ومجزأة.
         3. باستخدام أداة التحديد مرفوعة الخطوط العريضة لمحيط النواة الناقصة أو من الامم المتحدة ومجزأة على قناة الحمض النووي وصمة عار.
         4. الصحافة CRL + M (كمد + M على ماكنتوش) أو اذهب إلى قائمة تحليل واختر "قياس". هذا العمل سوف يسجل قيمة الرمادي متوسط ​​للمنطقة المذكورة وسيعرض على نافذة جديدة. انتقل إلى 'تحليل'>9؛ مجموعة القياسات ... 'وتأكد "يعني قيمة الرمادي' تم اختياره. تحديد أي معايير أخرى للقياس.
         5. باستخدام نفس المنطقة المذكورة في الخطوة 4.4.2.3.3، كرر قياس لكل من القنوات مضان من الفائدة. سيتم إلحاق نتائج لسابقتها في نافذة القياسات "نتائج".
         6. استخدام القياسات التي تم الحصول عليها لتحل محل السجلات الخاطئة في ملف * statistics.csv. إذا لم مجزأة النواة، إدراج صف جديد، عين له هوية خلية جديدة وإدخال القيم التي تم الحصول عليها في ImageJ تحت العمود المقابل لكل قناة. وهذه الخلية لم يكن لديك الإحداثيات المكانية (X، Y والقيم Z). إذا كان قد تم undersegmented النواة، مكررة خلافها، تعيين معرفات خلية مختلفة إلى كل خلية جديدة وإدخال القيم التي تم الحصول عليها في ImageJ تحت العمود المقابل. في هذه الحالة، فإن كلا الخلايا تبادل الإحداثيات المكانية.
            ملاحظة: إذا كان التوزيع المكاني ليتم تحليلها، نحن صecommend باستثناء XYZ إحداثيات هذه الخلايا، لأنها سوف تتداخل. تحقيقا لهذه الغاية، عند إنشاء سجلات جديدة، تعيين معرفات خلية لها أن تتميز بسهولة من تلك الأصلي (للأرقام سبيل المثال، غير صحيح).
   3. يسجل تقسيم الخلايا. ملاحظة: MINS يكشف الإنقسامية وكذلك نواة الطور البيني، ولكن لا يمكن التمييز بينهما.
      1. إذا نوى الإنقسامية التي يتعين النظر فيها بشكل منفصل في التحليل، يدويا تسجيل هذه وإضافة هذه المعلومات إلى ملف البيانات. لتسجيل الخلايا الإنقسامية، إضافة متغير جديد (عمود) إلى ملف * بيانات statistics.csv وتعيين قيم مختلفة لالإنقسامية والبيني نوى.
5. بيانات ما قبل المعالجة.
   ملاحظة: مرة واحدة وقد تم تصحيح جداول البيانات لفوق وتحت تجزئة انهم مستعدون ليتم تحليلها. فإن عملية تحليل وعرض البيانات تعتمد على تجربة محددة. ومع ذلك، وفيما يلي بعض التحولات البيانات العامةنوصي تنفيذ قبل التحليل:
   1. تحويل قيم الكثافة مضان إلى اللوغاريتم أو الجذر التربيعي للحد من تشتت البيانات. وهذا يساعد أيضا التصور، كما تميل البيانات الخام إلى التركيز بالقرب من محاور مؤامرة (انظر الشكل 4B، C).
   2. تصحيح التوهين المصاحب Z مضان:
      ملاحظة: شدة الإسفار في المسح الضوئي ليزر الصور المجهري متحد البؤر يقلل من أعمق على محور Z يقع على شريحة (الشكل 4E، F).
      1. إذا كان أحد الحواتم المكتشفة في العينات هو علامة النووية في كل مكان، وأعرب عن متجانس التدبير المنزلي، وتطبيع كثافة مضان من الحواتم أخرى بقسمة قيمها في كل خلية من القيمة المطابقة للعلامة التدبير المنزلي.
      2. في حالة عدم وجود مثل هذه علامة مرجعية، تعويض الخسائر المرتبطة Z من مضان على النحو التالي:
         1. رسم القيم من كل علامة (Yمحور الرسم البياني) في أكثر من موقف Z (X محور الرسم البياني) لتصور انخفاض في شدة على Z - مؤامرة معا القيم للجميع للتحكم، نوع البرية الأجنة (الشكل 4F).
         2. تناسب النموذج الخطي (منحنى الانحدار) في المؤامرة التي تم الحصول عليها في الخطوة السابقة (تقدر كثافة على Z) لكل علامة (الشكل 4F).
         3. تصحيح كل القيم لكل علامة باستخدام الصيغة التالية:
            سجل (القيمة الأصلية) + Z * المنحدر من طراز (الشكل 4D، G).
            ملاحظة: الخطوات المحددة لإجراء هذا التصحيح سوف تعتمد على برامج التحليل المستخدمة (R، MATLAB، وما إلى ذلك). في حالة استخدام R، تشغيل الصيغة التالية لتتناسب مع نموذج خطي لبيانات:
            > ل م (سجل (قناة) ~ Z، البيانات = dataframe)
            حيث، القناة هي قناة مضان إلى تصحيح، Z هو Z تنسيق وdataframe هو الجدول الذي يحتوي على كافة القيم الجنين المطلوب (ق) (و* القانون الأساسيistics.csv الملفات التي تم إنشاؤها من قبل MINS أو تعديل عليه).
            ملاحظة: سيتم إخراج الصيغة أعلاه يكون الشكل التالي:
            (اعتراض) Z
            4.76373 -0،01947
            حيث وZ القيمة المنحدر من خط الانحدار للأن مجموعة البيانات التي يجب أن تستخدم القيمة المطلقة لتعديل القيمة الأصلية مع الصيغة الواردة في 4.5.2.2.3 (انظر الشكل 4G للحصول على مثال).

Results

لتسهيل تفسير البيانات وعرضها، ينبغي الحرص على عدم الإضرار الأجنة خلال جمع والتلاعب، بحيث يمكن تحليل كل الخلايا ومركزها النسبي الشكل 2A - يظهر D أمثلة من الكيسات الأريمية سليمة في مراحل مختلفة مع تجويف الموسع. يجب أن تلحق الضرر يحدث، ينبغي اتخاذ الحذر عند تحليل وتفسير النتائج.

جودة وموثوقية البيانات التي تم إنشاؤها ...

Discussion

يصف هذا البروتوكول وسيلة لإجراء التحليل الكمي من كامل جبل المناعي على سابق للانغراس الأجنة مرحلة الماوس. ويتبع بروتوكول المناعي القوي ²² من ذات الدقة العالية، كلها جبل التصوير متحد البؤر وتجزئة الصورة باستخدام قطعة مصممة من برنامج ^4. في حين أن اختيار بروتوكول المناعي ليست حرجة، نجد أن واحدة المعروضة هنا ²² لتكون سريعة وموثوق بها، وتوفير إشارة قوية لكثير من الأجسام المضادة اختبرناها. بروتوكولات أخرى يمكن اتباعها، شريطة تطبيقها متناسقة عبر تجارب مماث...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
مسبار <قوي > مجموعة الأجنة < / قوي >
حاد لفحص القابس	Roboz	RS-9580
ملقط	Roboz	RS-4978
مقص الجراحة	Roboz	RS-5910
ماصات زجاجية باستور	فيشر	13-678-20C
شفاط مجمعة مسبقا و / لسان حال	Sigma	A5177
أطول أنابيب مطاطية	فيشر	14-178-2AA   ؛
M2	Millipore	MR-015-D
FHM	Millipore	MR-024-D
محلول حمض Tyrode	Millipore	MR-004-D
البنسلين / Streptomycin	Gibco	15140
ألبومين مصل الأبقار	Sigma	A9647
4 ألواح آبار	Nunc / Thermo-Fisher	12-566-300   ؛
<قوي > تألق مناعي < / قوي >
96 جيدا ألواح U	السفلية فيشر	14-245-73
تريتون X-100	سيجما	T8787
جلايسين	سيجما	G7403
مصل الحصان	سيجما	H0146
<قوي > الأجسام المضادة الأولية < / قوي>			<قوي>تركيز< قوي>
CDX2	Biogenex	AM392-5M	1: 200
GATA6	R & D	AF1700	1:100
GATA4	سانتا كروز	sc-9053	1:100 ، 10 دقائق تثبيت
GATA4	سانتا كروز	sc-1237	1:100 ، تثبيت O / N
SOX17	R & D	AF1924	1:100
Nanog	ReproCELL	RCAB0002P-F	1:500
OCT4	Santa Cruz	sc-5279	1:100 ، 10 دقائق إلى تثبيت O / N
DAB2		BD-610464	1:200
الأجسام المضادة الثانوية	تقنيات الحياة	المختلفة	1: 500
Hoechst 33342	Life Technologies	H3570
أطباق <قوية > تصوير < / قوية >
35 مم ذات قاع زجاجي	MatTek	P35G-1.5-14-C
Segmentation< / strong>
كمبيوتر يعمل بنظام التشغيل		64 بت N / a	تحقق من الحد الأدنى من متطلبات النظام في http://katlab-tools.org وفي Lou et al. ، (2014) تقارير الخلايا الجذعية
MATLAB (برنامج)	Mathworks	n / a
MINS (برنامج)	مجاني	غير	http://katlab-tools.org