Method Article

تحليل كمي للتعبير البروتين لدراسة النسب مواصفات في ماوس سابق للانغراس الأجنة

DOI:

10.3791/53654

⸱

February 22nd, 2016

 ,  ,  ,  , 
1Developmental Biology Program, Sloan Kettering Institute

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويعرض هذا البروتوكول وسيلة لأداء الكمية، وحيدة الخلية في التحليل الموقعي للتعبير البروتين لدراسة مواصفات النسب في أجنة الفئران قبل الغرس. الإجراءات اللازمة لتحصيل الكيسات الأريمية، بكل جبل كشف مناعي للبروتينات، وصفت التصوير العينات على المجهر متحد البؤر، وتجزئة النووية وتحليل الصور.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويعرض هذا البروتوكول وسيلة لأداء الكمي، واحدة من الخلايا في الموقع تحليلات التعبير البروتين لدراسة مواصفات النسب في الأجنة قبل الغرس الماوس. ووصف الإجراءات اللازمة لتحصيل الجنين، المناعي، والتصوير على المجهر متحد البؤر، وتقسيم الصور وتحليلها. وتسمح هذه الطريقة الكميات من التعبير عن علامات نووية متعددة والمكانية (XYZ) تنسق جميع الخلايا في الجنين. ويستفيد من MINS، أداة البرمجيات تجزئة الصورة وضعت خصيصا لتحليل الصور مبائر من الأجنة قبل الغرس والخلايا الجذعية الجنينية المستعمرات (ESC). MINS ينفذ تجزئة النووية غير خاضعة للرقابة عبر X، Y و Z الأبعاد، وينتج من المعلومات حول موقف خلية في الفضاء ثلاثي الأبعاد، فضلا عن مستويات مضان النووية لجميع القنوات مع إدخال المستخدم الحد الأدنى. في حين تم تحسين هذا البروتوكول لتحليل الصورمن سابق للانغراس الأجنة مرحلة الماوس، ويمكن بسهولة أن تتكيف مع تحليل أي عينات أخرى اظهار جيدة نسبة الإشارة إلى الضوضاء وحيث الكثافة النووية العالية تشكل عقبة أمام تجزئة الصورة (على سبيل المثال، تحليل التعبير عن الخلايا الجذعية الجنينية (ESC ) المستعمرات، تمييز الخلايا في الثقافة والأجنة من الأنواع أو في مراحل أخرى، وما إلى ذلك).

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

جنين الفأر سابق للانغراس هو نموذج لدراسة نشوء وصيانة تعدد القدرات في الجسم الحي، وكذلك نموذجا لدراسة مواصفات مصير الخلايا ودي نوفو الاندمال بتشكل النسيج الظهاري في الثدييات. حريصون على مراحل سابق للانغراس التنمية الثدييات لإنشاء الأنساب الخلية الثلاثة التي تشكل الكيسة الأريمية، وهي الأديم الظاهر المحفزة - الذي يؤدي إلى معظم الأنسجة الجسمية والخلايا الجرثومية - واثنين من الأنساب خارج الجنين، الأديم الظاهر الغاذي (TE) و الأديم الباطن البدائي (قبل) (الشكل 1A) 1،2. يصف هذا البروتوكول إجراءات ل(1) الأجنة الحصاد وتحديد المرحلة سابق للانغراس الماوس، (2) أداء المناعي لتسمية البروتينات من ال....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

بيان الأخلاق: كل عمل الحيوانية، بما في ذلك تربية، تربية والتضحية وتمت الموافقة من قبل لجنة ميموريال سلون كيترينج للسرطان في الحيوان الرعاية المؤسسية والاستخدام (IACUC)، بروتوكول # 03-12-017.

مجموعة 1. الأجنة

ملاحظة: يجب أن يكون قد وافق كل عمل الحيوانية السلطات المؤسسية والمحلية وتتوافق مع القواعد المحلية والمؤسسية.

  1. ماتي الماوس الإناث البكر مع عشيق الذكور الخصبة من المورثات المطلوب.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لتسهيل تفسير البيانات وعرضها، ينبغي الحرص على عدم الإضرار الأجنة خلال جمع والتلاعب، بحيث يمكن تحليل كل الخلايا ومركزها النسبي الشكل 2A - يظهر D أمثلة من الكيسات الأريمية سليمة في مراحل مختلفة مع تجويف الموسع. يجب أن تلحق الضرر يحدث، ينبغي اتخاذ الحذر عند تحليل وتفسير النتائج.

جودة وموثوقية البيانات التي تم إنشاؤها .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يصف هذا البروتوكول وسيلة لإجراء التحليل الكمي من كامل جبل المناعي على سابق للانغراس الأجنة مرحلة الماوس. ويتبع بروتوكول المناعي القوي 22 من ذات الدقة العالية، كلها جبل التصوير متحد البؤر وتجزئة الصورة باستخدام قطعة مصممة من برنامج 4. في حين أن اختيار بروتوكول المناعي ليست حرجة، نجد أن واحدة المعروضة هنا 22 لتكون سريعة وموثوق بها، وتوفير إشارة قوية لكثير من الأجسام المضادة اختبرناها. بروتوكولات أخرى يمكن اتباعها، شريطة تطبيقها متناسقة عبر تجارب مماث.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعلن المؤلفون عدم وجود تضارب في المصالح.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يود المؤلفون أن يشكروا ستيفانو دي تاليا وألبرتو بوليافيتو وفينكاترامان سيشان وباناجيوتيس زينوبولوس ، على المدخلات في معالجة البيانات وتحليلها وتمثيلها ، وبيرينيكا بلوس للمساعدة في تصميم بروتوكول التألق المناعي واختبار الأجسام المضادة وأعضاء مختبر Hadjantonakis للتعليقات على المخطوطة وتطوير هذا البروتوكول. يتم دعم العمل في مختبرنا من قبل المعاهد الوطنية للصحة R01-HD052115 و R01-DK084391 ، و NYSTEM N13G-236.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
مسبار <قوي > مجموعة الأجنة < / قوي >
حاد لفحص القابسRobozRS-9580
ملقطRobozRS-4978
مقص الجراحةRobozRS-5910
ماصات زجاجية باستورفيشر13-678-20C
شفاط مجمعة مسبقا و / لسان حالSigmaA5177
أطول أنابيب مطاطيةفيشر14-178-2AA   ؛    
M2MilliporeMR-015-D
FHMMilliporeMR-024-D
محلول حمض TyrodeMilliporeMR-004-D
البنسلين / StreptomycinGibco15140
ألبومين مصل الأبقار SigmaA9647
4 ألواح آبارNunc / Thermo-Fisher12-566-300   ؛    
<قوي > تألق مناعي < / قوي >
96 جيدا ألواح Uالسفلية فيشر14-245-73
تريتون X-100سيجماT8787
جلايسينسيجماG7403
مصل الحصانسيجماH0146
<قوي > الأجسام المضادة الأولية < / قوي><قوي>تركيز< قوي>
CDX2BiogenexAM392-5M1: 200
GATA6R & DAF17001:100
GATA4سانتا كروزsc-90531:100 ، 10 دقائق تثبيت
GATA4سانتا كروزsc-12371:100 ، تثبيت O / N
SOX17R & DAF19241:100
NanogReproCELLRCAB0002P-F1:500
OCT4Santa Cruzsc-52791:100 ، 10 دقائق إلى تثبيت O / N
DAB2BD-6104641:200
الأجسام المضادة الثانويةتقنيات الحياةالمختلفة1: 500
Hoechst 33342Life TechnologiesH3570
أطباق <قوية > تصوير < / قوية >
35 مم ذات قاع زجاجيMatTekP35G-1.5-14-C
Segmentation< / strong>
كمبيوتر يعمل بنظام التشغيل64 بت N / aتحقق من الحد الأدنى من متطلبات النظام في http://katlab-tools.org وفي Lou et al. ، (2014) تقارير الخلايا الجذعية
MATLAB (برنامج)Mathworksn / a
MINS (برنامج)مجانيغيرhttp://katlab-tools.org
أنبوب Windows OS

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Saiz, N., Plusa, B. Early cell fate decisions in the mouse embryo. Reproduction. 145 (3), R65-R80 (2013).
  2. Schrode, N., Xenopoulos, P., Piliszek, A., Frankenberg, S., Plusa, B., Hadjantonakis, A. -K. Anatomy of a blastocyst: cell behaviors driving cell fate choice and....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Protein Expression AnalysisMouse Preimplantation EmbryosConfocal Microscopy ImagingImage Segmentation AnalysisMINS Software ToolNuclear Marker QuantificationImmunofluorescence ProtocolEmbryo Collection ProcedureBlastocyst Isolation MethodSingle Cell Resolution

Related Articles