مقالة منهجية

طريقة سريعة وفعالة لتنقية خلايا الأديم المولدة من الخلايا الجذعية الجنينية البشرية

8K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/53655

⸱

مارس 3, 2016

 ,  , 
1Institute of Clinical Biochemistry, Hannover Medical School

في هذه المقالة

ملخص

هنا، نحن تصف طريقة لتنقية الخلايا الجنينية البشرية المتباينة الجذعية التي ترتكب نحو الأديم الباطن نهائي لتحسين التطبيقات المصب ومزيد من التفرقة.

الملخص

قدرات تمايز الخلايا الجذعية المحفزة مثل الخلايا الجذعية الجنينية (المجالس الاقتصادية والاجتماعية) تسمح لتطبيق العلاجية المحتملة للعلاج استبدال الخلية. الميؤوس من شفائهم يمكن أن تستخدم أنواع الخلايا المتمايزة لعلاج العديد من الأمراض التنكسية. في المختبر التفريق بين هذه الخلايا نحو أنسجة الرئة والكبد والبنكرياس يتطلب كخطوة أولى توليد خلايا الأديم الباطن نهائية. هذه الخطوة من أجل مزيد من التمايز نحو أنواع الخلايا نضجت عضال مثل خلايا بيتا المنتجة للأنسولين، خلايا الكبد أو غيرها من أنواع الخلايا المشتقة الأديم معدل الحد. الخلايا التي ملتزمون تجاه السلالة الأديم تعبر عن درجة عالية من العديد من عوامل النسخ مثل FOXA2، SOX17، HNF1B، وأعضاء الأسرة غاتا، ومستقبلات سطح CXCR4. ومع ذلك، بروتوكولات التفريق نادرا فعالة 100٪. هنا، نحن تصف طريقة لتنقية سكان الخلية CXCR4 + بعد المفاضلةفي دي باستخدام ميكروبيدات المغناطيسية. هذا بالإضافة إلى تنقية يزيل خلايا الأنساب غير المرغوب فيها. طريقة تنقية لطيف سريع وموثوق بها ويمكن أن تستخدم لتحسين التطبيقات المصب والتفرقة.

المقدمة

الخلايا الجذعية المحفزة مثل الخلايا الجذعية الجنينية (المجالس الاقتصادية والاجتماعية) لديها القدرة على التمايز إلى تقريبا أي نوع من الخلايا في الجسم البشري. وهكذا، في المختبر بروتوكولات التمايز يمكن استخدامها لتوليد العديد من أنواع الخلايا الكبار مثل العضلية 1، 2 خلايا الكبد، وخلايا بيتا 3، الظهارية الرئة 4 أو الخلايا العصبية 5. وهذا يجعل المجالس الاقتصادية والاجتماعية أداة قيمة لعلاج المحتملة لمختلف الأمراض التنكسية 3.

التمايز في المختبر من المجالس الاقتصادية والاجتماعية نحو أنسجة البالغين في الرئة والكبد والبنكرياس يتطلب الزائفة تكون المعيدة إلى خلايا تشبه الأديم الباطن نهائي (DE) 6. منذ التمايز المصب نحو أنواع الخلايا الجسدية المذكورة أعلاه بشكل ملحوظ أقل كفاءة، ويعتبر أحد التمايز الأديم الباطن على النحو الأمثل معدل الحد 7. الخلايا التي ملتزمون تجاه السلالة الأديم الباطن تخضع تشاالتغييرات racteristic في التشكيل التعبير الجيني بهم. وأسفل تنظيم الجينات منظم تعدد القدرات الرئيسية، في حين أن التعبير عن عوامل النسخ الأخرى مثل FOXA2، SOX17، HNF1B، وأعضاء الأسرة GATA ومستقبلات سطح CXCR4 وupregulated للغاية 6، 8، ومن المعروف 9. CXCR4 أن transactivated التي كتبها SMAD2 / 3، المصب العقدية الإشارات / TGF-β وSOX17 بسبب مواقع محددة ملزمة في منطقة المروج لها (10). وهكذا هو علامة مناسبة جدا تستخدم في عدد من التقارير 6، 8، 11-13. هذه التغييرات التعبير يعكس حالة شبه تكون المعيدة، الذي المجالس الاقتصادية والاجتماعية أولا اكتساب خصائص بدائية سكان الخلية مثل خط والالتزام بعد ذلك إلى الأديم الجرثومية طبقة 6.

ومع ذلك، بروتوكولات التفريق نادرا 100٪ كفاءة عن عدد قليل من الخلايا قد تقاوم عملية التمايز أو التفريق نحو الأنساب أخرى غير مقصودة 14. هذه الخلايا قد لحالات الإنفلونزا سلبامزيد من التمايز NCE. وعلاوة على ذلك، خلايا غير متمايزة المتبقية تؤوي مخاطر كبيرة لاجراء تجارب زرع وقت لاحق وربما تؤدي إلى مسخي المبيض 15-17.

لإزالة هذه الخلايا غير المرغوب فيها في وقت مبكر على السطح علامة CXCR4 يمكن أن تستخدم لتنقية الخلايا التي ملتزمون تجاه DE 18. هنا، نحن تصف طريقة لاختيار إيجابية من CXCR4 + الخلايا من الثقافات التمايز DE. لهذا، لا بد من علامة CXCR4 السطح بواسطة الأجسام المضادة التي ثم بدوره يربط ميكروبيدات المغناطيسية. وخلافا لظروف قاسية خلال FACS الفرز، والخلايا DE مثل المسمى مغناطيسيا يمكن بعد ذلك بسهولة يمكن تنقيته في شكل الفوق باستخدام طريقة تنقية لطيف. يوفر هذا البروتوكول طريقة واضحة لإزالة السكان الخلية التي قاومت عملية التمايز DE.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1. تمايز ESC الإنسان نحو الأديم النهائي

  1. زراعة الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (المجالس الاقتصادية والاجتماعية) في حاضنة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2.
  2. معطف جديدة 6 جيدا وحة زراعة الخلايا مع 1 مل من مصفوفة الغشاء القاعدي واحتضان الثقافة وير لمدة 30 دقيقة على الأقل في RT. للحصول على تفاصيل محددة يرجى التوجه لتعليمات الشركة الصانعة فيما يخصه.
  3. تأكد من أن المجالس الاقتصادية والاجتماعية البشرية المستزرعة وصلت إلى 80٪ -90٪ confluency تحت المجهر باستخدام التكبير المنخفض (مثل 4X). نضح في المتوسط ​​من تسوس الأسنان عن طريق مص قبالة المتوسطة مع زجاجي معقم باستور الماصة. غسل خلايا مرة واحدة مع الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) حل. لهذا، إضافة 2 مل PBS إلى كل بئر بهدوء يهز لوحة وتمتص قبالة حل لإزالة الخلايا الميتة والحطام الخلية.
  4. إضافة 1 مل من خالية من إنزيم حل الركض كاشف عن التفكك طيف من مجموعات الخلايا. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية لد 5٪ CO 2 حتى تظهر الخلايا إشارات واضحة من الاضطراب في مجموعات صغيرة.
    ملاحظة: فترة حضانة يعتمد على كاشف المستخدمة. من أجل حل الركض خالية من إنزيم المذكورة في قسم المواد، وفترة حضانة هو تقريبا 7 دقائق.
  5. إضافة 1 مل DMEM / F-12 متوسطة وتعطيل المجاميع خلية المتبقية في الخلايا واحد من قبل pipetting صعودا وهبوطا باستخدام 1 مل ماصة. استخدم هذا لمطاردة خلايا من على سطح الأرض ونقل الخلايا إلى أنبوب الطرد المركزي. لاسترداد جميع الخلايا، ويغسل كل جيدا مع 1 مل من DMEM / F-12 متوسطة وإضافة وسيلة لأنبوب الطرد المركزي.
  6. الطرد المركزي الخلايا لمدة 5 دقائق في 300 × ز. نضح في وطاف resuspend الخلايا في 5 مل ES خلية ثقافة المتوسط ​​تحتوي على 10 ميكرومتر رو-كيناز (ROCK) المانع.
  7. عد الخلايا تحت المجهر باستخدام عدادة الكريات والبذور 150،000 - 400،000 الخلايا في 6 جيدا أو في تخطيط لوحة أخرى، اعتمادا على خط الخلية ES المستخدمة. استخدام طريق مسدود تلح تحتوي على المتوسط ​​10 ميكرومتر ROCK المانع لتجنب موت الخلايا المبرمج والثقافة الخلايا في حاضنة عند 37 درجة مئوية و CO 2 5٪.
  8. ما يقرب من 24 ساعة بعد البذر نضح المتوسطة مع العقيمة الماصة الزجاج باستور وإضافة 2 مل من بدائية المتوسطة خط الاستقراء.
    ملاحظة: هذه الوسيلة يحتوي على تركيزات النهائي من 1٪ الجلوتامين، 0.2٪ FCS، 5 ميكرومتر CHIR-99021 و 50 نانوغرام / مل activin وفي المتقدم المتوسطة RPMI-1640. عادة، استخدام 2 مل من المتوسط ​​للزراعة في 6 لوحات جيدا.
  9. 48 ساعة بعد البذر، استبدل على المديين المتوسط ​​والأديم المتوسط ​​الاستقراء. زراعة خلايا في هذه الوسيلة لمدة 48 ساعة أخرى مع تغيير المتوسطة اليومي.
    ملاحظة: هذه الوسيلة يحتوي على 1٪ الجلوتامين، 0.2٪ FCS و 50 نانوغرام / مل activin وفي المتقدم المتوسطة RPMI-1640. الخلايا التي ملتزمون تجاه الأديم الباطن نهائي تعبر عن علامة السطح CXCR4. تلطيخ من CXCR4 يمكن استخدامها لتحديد عدد الخلايا التي ارتكبت DE.

الطبقة = "jove_title"> 2. تلطيخ CXCR4 + الأديم النهائي الخلايا لتحليل التدفق الخلوي

  1. للنهائية 24 ساعة ولكن لا يقل عن 1 ساعة قبل حصاد الخلايا تضيف 10 ميكرومتر ROCK المانع للثقافة المتوسط.
  2. معطف الخلية ثقافة وير التي سيتم استخدامها لإعادة البذر مع قبو غشاء المصفوفة، أي لوحات 12-جيدا للتحليل أو غرفة الشرائح QPCR لتلطيخ المناعي. احتضان لوحات أو الشرائح لمدة 30 دقيقة على الأقل في RT.
  3. نضح المتوسطة مع المعقمة الماصة الزجاج باستور من الآبار من خلايا متمايزة تستخدم لتلطيخ و / أو الفرز.
  4. إضافة 1 مل من خالية من إنزيم حل الركض كاشف للتفكك لطيف من مجموعات الخلايا. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2 حتى تظهر الخلايا إشارات واضحة من الاضطراب في مجموعات صغيرة.
    ملاحظة: فترة حضانة يعتمد على كاشف المستخدمة. من أجل حل الركض خالية من إنزيم المذكورة في العتادالقسم المرض، فترة حضانة هو تقريبا 7 دقائق.
  5. إضافة 1 مل DMEM / F-12 متوسطة وتعطيل المجاميع الخلية في الخلايا وحيدة المتبقية قبل pipetting صعودا وهبوطا باستخدام تلميح 1 مل. استخدم هذا لمطاردة خلايا من على سطح الأرض ونقل الخلايا إلى أنبوب الطرد المركزي. لاسترداد جميع الخلايا، ويغسل كل جيدا مع 1 مل من DMEM / F-12 متوسطة ث / س FCS وإضافة وسيلة لأنبوب الطرد المركزي.
  6. عد الخلايا تحت المجهر باستخدام عدادة الكريات. يجب أن الخلايا من ثلاثة آبار لوحة 6 جيدا يؤدي إلى 10-15 × 10 6 خلايا بعد ثلاثة أيام من التمايز. الطرد المركزي الخلايا لمدة 5 دقائق في 300 × ز.
    ملاحظة: إن العدد الدقيق للخلايا التي تم الحصول عليها تعتمد على خط الخلية المحفزة المستخدمة في التمايز.
  7. نضح في وطاف resuspend الخلايا في المخزن الجاهزة التي تحتوي على 10 ميكرومتر ROCK المانع. استخدام 100 ميكرولتر من هذا المخزن المؤقت لمدة تصل إلى 10 7 خلايا. إضافة 10 ميكرومتر ROCK المانع يوم stainiنانوغرام. استخدام هذا المخزن المؤقت لجميع التطبيقات المصب (المشار إليها باسم عازلة الجاهزة + RI).
    ملاحظة: عازلة الجاهزة يحتوي على 0.5٪ BSA و 2 ملي EDTA في برنامج تلفزيوني. إذا كان أكثر الخلايا لتكون ملطخة، وضبط حجم العازلة وفقا لذلك.
  8. إضافة 10 ميكرولتر من الأجسام المضادة CXCR4-APC في 10 7 خلايا في 100 ميكرولتر، وهذا يمثل ما يقرب من تخفيف 01:10.
    ملاحظة: استخدام الأجسام المضادة المرتبطة APC ليس إلزاميا. وبدلا من ذلك يمكن أن تكون بديلا اعتمادا على ميكروبيدات المستخدمة. إذا كان أكثر الخلايا لتكون ملطخة ضبط حجم الأجسام المضادة وفقا لذلك.
  9. مزيج من قبل التقليب بلطف أنبوب مع الأصابع واحتضان عند 4 درجات مئوية في الثلاجة لمدة 15 دقيقة. resuspend الخلايا مع العازلة الجاهزة 1-2 مل. الطرد المركزي الخلايا لمدة 5 دقائق في 300 × ز.
  10. نضح طاف مع زجاجي معقم باستور الماصة و resuspend بيليه الخلية في 80 ميكرولتر الجاهزة في 10 7 الخلايا وإضافة 20 ميكرولتر ميكروبيدات مكافحة APC.
    ملاحظة: إذا كان أكثر الخلايا لتكون ملطخة، وضبط حجم حبة صغيرة وفقا لذلك.
  11. مزيج من قبل التقليب بلطف أنبوب مع الأصابع واحتضان عند 4 درجات مئوية في الثلاجة لمدة 15 دقيقة. resuspend الخلايا مع 1-2 مل العازلة الجاهزة + RI. الطرد المركزي الخلايا لمدة 5 دقائق في 300 × ز. نضح المخزن المؤقت. resuspend في 500 ميكرولتر عازلة الجاهزة + RI.

3. الفصل المغناطيسي للCXCR4 + الخلايا

  1. ضع عمود المغناطيسي متوسطة الحجم في مجال مغناطيسي حسب تعليمات التصنيع. قبل شطف العمود مع العازلة 500 ميكرولتر الجاهزة + RI. تطبيق تعليق خلية بأكمله إلى العمود. جمع التدفق من خلال الخلايا وليس كل وربط العمود. تأكد من عدم تعكير صفو أعمدة لاسترجاع الأمثل للCXCR4 + الخلايا.
  2. غسل العمود ثلاث مرات مع 500 ميكرولتر عازلة الجاهزة + RI. جمع تدفق الأولى من خلال ودمجها مع الخلايا التي تم جمعها من الخطوة 3.1. إزالة العمود المغناطيسي من الحقل المغناطيسي للأرض ووضعه فيأنبوب جمع مناسبة. إضافة 1 مل العازلة الجاهزة + RI على العمود. إلى أزل الخلايا اضغط بشدة أسفل المكبس في العمود.
  3. اختياري: جمع كل التدفق من خلال عينات بشكل منفصل واستخدام 20 ميكرولتر كل لتحليل عدد من CXCR4 + الخلايا باستخدام التدفق الخلوي. يجب أن ينخفض ​​عددهم مع كل خطوة الغسيل.
    ملاحظة: لا يقل عن 2 × 10 4 قابلة للحياة، ينبغي أن يحسب الخلايا المغلقة عن نتائج يمكن الاعتماد عليها.
  4. كرر الخطوات من 3،1-3،3 مع تدفق التي تم جمعها من خلال عينة من الخطوة 3.1 وتدفق الأول من خلال عينة من الخطوة 3.2 باستخدام عمود جديد. لا إعادة استخدام العمود السابق. باستخدام الهواء الغطاس الضغط في العمود، الذي يمنع ذلك.
  5. عد الخلايا تحت المجهر باستخدام عدادة الكريات. اعتمادا على كفاءة التمايز تصل إلى 6 × 10 6 خلايا يمكن فرزها في البداية و 1 × 10 6 خلايا أخرى باستخدام العمود الثاني عند استخدام 10 7 خلايا لهذا الإجراء.
  6. الطرد المركزي الخلايا في 300 x ج لمدة 5 دقائق. نضح في وطاف مع الماصة باستور الزجاج معقمة وresuspend الخلايا في 1 مل الأديم الحث المتوسطة من الخطوة 1.9 مع إضافي 10 ميكرومتر ROCK المانع.
  7. عد الخلايا تحت المجهر باستخدام عدادة الكريات. البذور الخلايا في كثافة المناسبة، أي ~ 4 × 10 5 خلايا لكل بئر من لوحة ال 12 أيضا (التطبيق. 3.6 سم 2 السطح) أو ~ 1.5 × 10 5 خلايا لكل بئر من غرفة الشريحة 8 جيدا.

4. اختياري: تحليل تنقية سكان الأديم النهائي

  1. لتلطيخ المناعي إصلاح خلايا النقاء من الخطوة 3.7 تقريبا 24 ساعة بعد البذر مع 4٪ لامتصاص العرق وصمة عار لالأديم الباطن نهائي (DE) و / أو البروتينات تعدد القدرات علامة.
    ملاحظة: تشمل يشيع استخدامها علامات DE FOXA2 وSOX17، وتشمل تستخدم عادة علامات تعدد القدرات OCT3 / 4، NANOG وSOX2 6 و 8.
  2. فوتحليل ص RT-QPCR، حصاد الخلايا النقاء مباشرة أو 24 ساعة بعد البذر، استخراج مجموع الحمض النووي الريبي وعكس نسخ كدنا] من العينات الكلي الحمض النووي الريبي المستخرج. استخدام 10 كدنا] نانوغرام كقالب في RT-QPCR رد فعل (يثلث) لتحليل التعبير عن DE والجينات تعدد القدرات علامة 6، 8.
    ملاحظة: يتم ذكر الجينات علامة يشيع استخدامها في الخطوة 4.1. شروط الدورة هي 5 دقائق في درجة حرارة 95 درجة مئوية و 40 دورات من 15 ثانية في 95 درجة مئوية و 1 دقيقة في 60 درجة مئوية، تليها ذوبان تحليل المنحنى.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

على التمايز المجالس الاقتصادية والاجتماعية تخضع لتغييرات جذرية في الجينات والبروتينات الشكل 1 يصور الجينات علامة النموذجية التي يمكن استخدامها للتحقق من تمايز الأديم ناجحة. الاهداف الرئيسية لتحليل التعبير الجيني هي GSC، FOXA2، وSOX17. وفي تحليل التعبير الجيني النسبي تزداد خصوصا FOXA2 وSOX17 بواسطة> 2000 أضعاف بالمقارنة مع المجالس الاقتصادية والاجتماعية غير متمايزة. ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

بروتوكولات التمايز المستخدمة حاليا نادرا ما يؤدي إلى خلايا متمايزة 100٪. وذلك لأسباب لا تزال بحاجة الى معالجة بعض الخلايا تقاوم عملية التمايز. اعتمادا على كفاءة بروتوكول التمايز المستخدمة والميل للESC خط لوحظ عدد معين من الخلايا المحفزة المتبقية عادة حتى بعد التمايز إلى الأديم الباطن نهائي. هذه الخلايا المتبقية قد تضعف التفرقة المصب أو مزيد من التحليل مثل transcriptomics، البروتينات، وتحليل التعبير ميرنا. قد الخلايا المحفزة المتبقية أو غيرها من الأنساب غير المرغوب فيها أيضا يحمل آ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

يعلن المؤلفون أنه ليس لديهم مصالح مالية متنافسة.

شكر وتقدير

واعترف بالمساعدة التقنية الماهرة من ياسمين Kresse العرفان.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
Hues8 خط الخلايا الجذعية الجنينية البشريةقسم الخلايا الجذعية والبيولوجيا التجديدية بجامعة هارفاردخط خلية مناسب لجيل الأديم
S1860
Advanced RPMI 1640Life Technologies12633012
CD184 (CXCR4) -APC ،Miltenyi Biotecالبشري 130-098-357
المضادة ل APC MicroBeadsMiltenyi Biotec130-090-855   ؛
فاصل OctoMACSMiltenyi Biotec130-042-109المجال المغناطيسي
Y-27632Selleck ChemicalsS1049ROCK مثبط
CHIR-99021Tocris Bioscience4423
Activin APeprotech120-14
كاشف تفكك الخلايا اللطيفتقنيات الخلايا الجذعية7174خالية من الإنزيم حل المرور ، البديل: Trypsin / EDTA
Matrigel *مصفوفةالقاعدي Corning 354277
* حل وتخزين في aliquots عند -80 درجة ؛ (ج) على النحو المبين في دليل الموردين. عند الاستخدام ، قم بإذابة الثلج ، وتخفيف 25 مل بالضربة القاضية الباردة DMEM / F-12.
أضف 1 مل إلى كل بئر من 6 آبار واحتضنه لمدة 45 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
قم بإزالة matrigel واستخدمه على الفور.
أعمدة MSMiltenyi Biotec30-042-201
فاصل MACSMiltenyi Biotec130-042-302
الإنسان FOXA2 FW
gggagcggtgaagatgga		Life TechnologiesNA
Human FOXA2 REV
tcatgttgctcacggaggagta		Life Technologies
Human GSC FW
gaggagaaagtggaggtctggtt		Life تقنيات
الإنسان GSC REV
ctgatgaggaccgcttctg		Life Technologies
SOX17 TaqMan الفحصالأنظمة الحيوية التطبيقيةHs00751752_s1
الإنسان SOX7 FW
gatgctgggaaagtcgtggaagg		تقنيات الحياة
البشرية SOX7 REV
tgcgcggccggggttggtgtag		تقنيات الحياة
الإنسان POU5F1 FW
cttgctgcagaagtgggtggggagg		تقنيات الحياة
البشرية POU5F1 REV
ctgcagtgtgggtttcgggca		تقنيات الحياة
البشرية nanog FW
ccgaggcacatcatcc		تقنيات الحياة
البشرية nanog REV
ccatccactgccacatcttct		تقنيات الحياة
البشرية TBP FW
caa CAG cct gcc acc tta cgc tc		Life Technologies
Human TBP REV
agg ctg tggt cag tcc agt g		Life Technologies
Human TUBA1A FW
ggc agt gtt tgt aga ctt gga acc c		Life Technologies
Human TUBA1A REV
tgt gat aag ttg ctc agg gtg gaa g Life		Technologies
Human G6PD FW
agg ccg tca cca aga aca ttc a		تقنيات الحياة
البشرية G6PD REV
cga tga tgc ggt tcc agc cta t Life 		Technologies
Anti-SOX2Santa Cruz Biotechnologysc-17320
Anti-FOXA2MerckMillipore07-633
Anti-SOX17R & أنظمة DAF1924
الباطن Hes3 خط الخلايا الجذعية الجنينية البشرية ES Cell International خط خلية مناسب وقوي لجيل الأديم الباطن mTeSR1 تقنيات الخلايا الجذعية 5850 ESC وسط ثقافة FCS Biowest الغشاء

المراجع

  1. Sharma, A., Li, G., Rajarajan, K., Hamaguchi, R., Burridge, P. W., Wu, S. M. Derivation of Highly Purified Cardiomyocytes from Human Induced Pluripotent Stem Cells Using Small Molecule-modulated Differentiation and Subsequent Glucose Starvation. J Vis Exp. (97), (2015).
  2. Sgodda, M., et al. Improved hepatic differentiation strategies for human induced pluripotent stem cells. Curr Mol Med. 13 (5), 842-855 (2013).
  3. Naujok, O., Burns, C., Jones, P. M., Lenzen, S. Insulin-producing surrogate beta-cells from embryonic stem cells: are we there yet. Mol Ther. 19 (10), 1759-1768 (2011).
  4. Katsirntaki, K., et al. Bronchoalveolar sublineage specification of pluripotent stem cells: effect of dexamethasone plus cAMP-elevating agents and keratinocyte growth factor. Tissue Eng Part A. 21 (3-4), 669-682 (2015).
  5. Abranches, E., et al. Neural differentiation of embryonic stem cells in vitro: a road map to neurogenesis in the embryo. PLoS One. 4 (7), e6286(2009).
  6. Naujok, O., Diekmann, U., Lenzen, S. The generation of definitive endoderm from human embryonic stem cells is initially independent from activin A but requires canonical Wnt-signaling. Stem Cell Rev. 10 (4), 480-493 (2014).
  7. D'Amour, K. A., et al. Production of pancreatic hormone-expressing endocrine cells from human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 24 (11), 1392-1401 (2006).
  8. Diekmann, U., Lenzen, S., Naujok, O. A reliable and efficient protocol for human pluripotent stem cell differentiation into the definitive endoderm based on dispersed single cells. Stem Cells Dev. 24 (2), 190-204 (2015).
  9. Kim, P. T., Ong, C. J. Differentiation of definitive endoderm from mouse embryonic stem cells. Results Probl Cell Differ. 55, 303-319 (2012).
  10. Katoh, M., Katoh, M. Integrative genomic analyses of CXCR4: transcriptional regulation of CXCR4 based on TGFbeta, Nodal, Activin signaling and POU5F1, FOXA2, FOXC2, FOXH1, SOX17, and GFI1 transcription factors. Int J Oncol. 36 (2), 415-420 (2010).
  11. Nostro, M. C., et al. Stage-specific signaling through TGFbeta family members and WNT regulates patterning and pancreatic specification of human pluripotent stem cells. Development. 138 (5), 861-871 (2011).
  12. Rezania, A., et al. Maturation of human embryonic stem cell-derived pancreatic progenitors into functional islets capable of treating pre-existing diabetes in mice. Diabetes. 61 (8), 2016-2029 (2012).
  13. Bruin, J. E., et al. Maturation and function of human embryonic stem cell-derived pancreatic progenitors in macroencapsulation devices following transplant into mice. Diabetologia. 56 (9), 1987-1998 (2013).
  14. Fu, W., Wang, S. J., Zhou, G. D., Liu, W., Cao, Y., Zhang, W. J. Residual undifferentiated cells during differentiation of induced pluripotent stem cells in vitro and in vivo. Stem Cells Dev. 21 (4), 521-529 (2012).
  15. Hentze, H., Soong, P. L., Wang, S. T., Phillips, B. W., Putti, T. C., Dunn, N. R. Teratoma formation by human embryonic stem cells: evaluation of essential parameters for future safety studies. Stem Cell Res. 2 (3), 198-210 (2009).
  16. Herberts, C. A., Kwa, M. S., Hermsen, H. P. Risk factors in the development of stem cell therapy. J Transl Med. 9, 29(2011).
  17. Naujok, O., Kaldrack, J., Taivankhuu, T., Jörns, A., Lenzen, S. Selective removal of undifferentiated embryonic stem cells from differentiation cultures through HSV1 thymidine kinase and ganciclovir treatment. Stem Cell Rev. 6 (3), 450-461 (2010).
  18. Pan, Y., Ouyang, Z., Wong, W. H., Baker, J. C. A new FACS approach isolates hESC derived endoderm using transcription factors. PLoS One. 6 (3), 17536(2011).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

CXCR4 ROCK

مقالات ذات صلة