Method Article

طريقة سريعة وفعالة لتنقية خلايا الأديم المولدة من الخلايا الجذعية الجنينية البشرية

DOI:

10.3791/53655

⸱

March 3rd, 2016

 ,  , 
1Institute of Clinical Biochemistry, Hannover Medical School

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا، نحن تصف طريقة لتنقية الخلايا الجنينية البشرية المتباينة الجذعية التي ترتكب نحو الأديم الباطن نهائي لتحسين التطبيقات المصب ومزيد من التفرقة.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

قدرات تمايز الخلايا الجذعية المحفزة مثل الخلايا الجذعية الجنينية (المجالس الاقتصادية والاجتماعية) تسمح لتطبيق العلاجية المحتملة للعلاج استبدال الخلية. الميؤوس من شفائهم يمكن أن تستخدم أنواع الخلايا المتمايزة لعلاج العديد من الأمراض التنكسية. في المختبر التفريق بين هذه الخلايا نحو أنسجة الرئة والكبد والبنكرياس يتطلب كخطوة أولى توليد خلايا الأديم الباطن نهائية. هذه الخطوة من أجل مزيد من التمايز نحو أنواع الخلايا نضجت عضال مثل خلايا بيتا المنتجة للأنسولين، خلايا الكبد أو غيرها من أنواع الخلايا المشتقة الأديم معدل الحد. الخلايا التي ملتزمون تجاه السلالة الأديم تعبر عن درجة عالية من العديد من عوامل النسخ مثل FOXA2، SOX17، HNF1B، وأعضاء الأسرة غاتا، ومستقبلات سطح CXCR4. ومع ذلك، بروتوكولات التفريق نادرا فعالة 100٪. هنا، نحن تصف طريقة لتنقية سكان الخلية CXCR4 + بعد المفاضلةفي دي باستخدام ميكروبيدات المغناطيسية. هذا بالإضافة إلى تنقية يزيل خلايا الأنساب غير المرغوب فيها. طريقة تنقية لطيف سريع وموثوق بها ويمكن أن تستخدم لتحسين التطبيقات المصب والتفرقة.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الخلايا الجذعية المحفزة مثل الخلايا الجذعية الجنينية (المجالس الاقتصادية والاجتماعية) لديها القدرة على التمايز إلى تقريبا أي نوع من الخلايا في الجسم البشري. وهكذا، في المختبر بروتوكولات التمايز يمكن استخدامها لتوليد العديد من أنواع الخلايا الكبار مثل العضلية 1، 2 خلايا الكبد، وخلايا بيتا 3، الظهارية الرئة 4 أو الخلايا العصبية 5. وهذا يجعل المجالس الاقتصادية والاجتماعية أداة قيمة لعلاج المحتملة لمختلف الأمراض التنكسية 3.

التمايز في المختبر من المجالس الاقتصادية والاجتماعية نحو أ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. تمايز ESC الإنسان نحو الأديم النهائي

  1. زراعة الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (المجالس الاقتصادية والاجتماعية) في حاضنة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2.
  2. معطف جديدة 6 جيدا وحة زراعة الخلايا مع 1 مل من مصفوفة الغشاء القاعدي واحتضان الثقافة وير لمدة 30 دقيقة على الأقل في RT. للحصول على تفاصيل محددة يرجى التوجه لتعليمات الشركة الصانعة فيما يخصه.
  3. تأكد من أن المجالس الاقتصادية والاجتماعية البشرية المستزرعة وصلت إلى 80٪ -90٪ confluency تحت....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

على التمايز المجالس الاقتصادية والاجتماعية تخضع لتغييرات جذرية في الجينات والبروتينات الشكل 1 يصور الجينات علامة النموذجية التي يمكن استخدامها للتحقق من تمايز الأديم ناجحة. الاهداف الرئيسية لتحليل التعبير الجيني هي GSC، FOXA2، وSOX17. وفي تحليل التعبير الجيني النسبي تزداد خصوصا FOXA2 وSOX17 بواسطة> 2000 أضعاف بالمقارنة مع المجالس الاقتصادية والاجتماعية غير متمايزة. .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

بروتوكولات التمايز المستخدمة حاليا نادرا ما يؤدي إلى خلايا متمايزة 100٪. وذلك لأسباب لا تزال بحاجة الى معالجة بعض الخلايا تقاوم عملية التمايز. اعتمادا على كفاءة بروتوكول التمايز المستخدمة والميل للESC خط لوحظ عدد معين من الخلايا المحفزة المتبقية عادة حتى بعد التمايز إلى الأديم الباطن نهائي. هذه الخلايا المتبقية قد تضعف التفرقة المصب أو مزيد من التحليل مثل transcriptomics، البروتينات، وتحليل التعبير ميرنا. قد الخلايا المحفزة المتبقية أو غيرها من الأنساب غير المرغوب فيها أيضا يحمل آ.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعلن المؤلفون أنه ليس لديهم مصالح مالية متنافسة.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

واعترف بالمساعدة التقنية الماهرة من ياسمين Kresse العرفان.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Hues8 خط الخلايا الجذعية الجنينية البشريةقسم الخلايا الجذعية والبيولوجيا التجديدية بجامعة هارفاردخط خلية مناسب لجيل الأديم
S1860
Advanced RPMI 1640Life Technologies12633012
CD184 (CXCR4) -APC ،Miltenyi Biotecالبشري 130-098-357
المضادة ل APC MicroBeadsMiltenyi Biotec130-090-855   ؛
فاصل OctoMACSMiltenyi Biotec130-042-109المجال المغناطيسي
Y-27632Selleck ChemicalsS1049ROCK مثبط
CHIR-99021Tocris Bioscience4423
Activin APeprotech120-14
كاشف تفكك الخلايا اللطيفتقنيات الخلايا الجذعية7174خالية من الإنزيم حل المرور ، البديل: Trypsin / EDTA
Matrigel *مصفوفةالقاعدي Corning 354277
* حل وتخزين في aliquots عند -80 درجة ؛ (ج) على النحو المبين في دليل الموردين. عند الاستخدام ، قم بإذابة الثلج ، وتخفيف 25 مل بالضربة القاضية الباردة DMEM / F-12.
أضف 1 مل إلى كل بئر من 6 آبار واحتضنه لمدة 45 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
قم بإزالة matrigel واستخدمه على الفور.
أعمدة MSMiltenyi Biotec30-042-201
فاصل MACSMiltenyi Biotec130-042-302
الإنسان FOXA2 FW
gggagcggtgaagatgga		Life TechnologiesNA
Human FOXA2 REV
tcatgttgctcacggaggagta		Life Technologies
Human GSC FW
gaggagaaagtggaggtctggtt		Life تقنيات
الإنسان GSC REV
ctgatgaggaccgcttctg		Life Technologies
SOX17 TaqMan الفحصالأنظمة الحيوية التطبيقيةHs00751752_s1
الإنسان SOX7 FW
gatgctgggaaagtcgtggaagg		تقنيات الحياة
البشرية SOX7 REV
tgcgcggccggggttggtgtag		تقنيات الحياة
الإنسان POU5F1 FW
cttgctgcagaagtgggtggggagg		تقنيات الحياة
البشرية POU5F1 REV
ctgcagtgtgggtttcgggca		تقنيات الحياة
البشرية nanog FW
ccgaggcacatcatcc		تقنيات الحياة
البشرية nanog REV
ccatccactgccacatcttct		تقنيات الحياة
البشرية TBP FW
caa CAG cct gcc acc tta cgc tc		Life Technologies
Human TBP REV
agg ctg tggt cag tcc agt g		Life Technologies
Human TUBA1A FW
ggc agt gtt tgt aga ctt gga acc c		Life Technologies
Human TUBA1A REV
tgt gat aag ttg ctc agg gtg gaa g Life		Technologies
Human G6PD FW
agg ccg tca cca aga aca ttc a		تقنيات الحياة
البشرية G6PD REV
cga tga tgc ggt tcc agc cta t Life 		Technologies
Anti-SOX2Santa Cruz Biotechnologysc-17320
Anti-FOXA2MerckMillipore07-633
Anti-SOX17R & أنظمة DAF1924
الباطن Hes3 خط الخلايا الجذعية الجنينية البشرية ES Cell International خط خلية مناسب وقوي لجيل الأديم الباطن mTeSR1 تقنيات الخلايا الجذعية 5850 ESC وسط ثقافة FCS Biowest الغشاء

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Sharma, A., Li, G., Rajarajan, K., Hamaguchi, R., Burridge, P. W., Wu, S. M. Derivation of Highly Purified Cardiomyocytes from Human Induced Pluripotent Stem Cells Using Small Molecule-modulated Differentiation and Subsequent Glucose Starvation. J Vis Exp. (97), (2015).
  2. Sgodda, M., et al.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Endoderm Cell PurificationHuman Embryonic Stem CellsCXCR4 Positive CellsMagnetic Bead SeparationDefinitive Endoderm DifferentiationFlow Cytometry AnalysisBasement Membrane CoatingROCK Inhibitor SupplementationCell Surface MarkerEndoderm Induction Medium

Related Articles